RODRIGO PORTES URESHINO
ESTUDO DA SINALIZAÇÃO GLUTAMATÉRGICA,
ESTRESSE OXIDATIVO E MORTE CELULAR EM
CÉREBROS DE RATOS DURANTE O
ENVELHECIMENTO.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de
Mestre em Ciências
RODRIGO PORTES URESHINO
ESTUDO DA SINALIZAÇÃO GLUTAMATÉRGICA,
ESTRESSE OXIDATIVO E MORTE CELULAR EM
CÉREBROS DE RATOS DURANTE O
ENVELHECIMENTO.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de
Mestre em Ciências
Orientadora: Profª Drª Soraya Soubhi Smaili
Co-orientadora: Profª Drª Guiomar Silva Lopes
Agradecimentos
À minha querida esposa, companheira e futura mamãe. Pelos momentos de incentivo, persistência e felicidade que me propiciou nessa trajetória. Minha conquista é ver o brilho de alegria em seu olhar.
Aos meus pais e irmã, que sempre me deram amor e carinho e que, acima de tudo, que acreditaram em mim. Amo vocês!
À Profª Drª Soraya S. Smaili, pela oportunidade, paciência e tempo dedicado à concretização deste trabalho. Pelo incentivo e experiência, com os quais tenho aprendido a suplantar os obstáculos.
À Profª Drª Guiomar S. Lopes, pelos ensinamentos, sugestões e críticas, necessários para confecção do trabalho.
Aos meus amigos e companheiros de bancada: Hanako, Priscila, Mari, Jú, Ana Paula, Karen, Tati, Alessandra, Fernanda, Daniel, Luciane, Leandro, Vivian, Sabrina, Michele, Regiane, Janaína, Kleber, etc. Espero que minha amizade e carinho que tenho por vocês possam retribuir o quanto me auxiliaram, principalmente nas etapas finais de conclusão da tese.
Aos meus camaradas Vitor, Cícero, Jean, Kleber, etc., pelos bons momentos, risadas e dificuldades que compartilhamos.
Aos colaboradores deste trabalho, com os quais tive a felicidade de aprender diversas técnicas e que foram imprescindíveis para a finalização desta tese: Profª Drª Maria José Fernandes (imunofluorescência), Profª Drª Clélia R. Bertoncini (RT-PCR), Profª Drª Rita Sinigaglia-Coimbra (microscopia eletrônica), Prof Dr Fernando M. F. Abdalla e Profª Drª Catarina S. Porto (Western-Blot).
À Drª Ana Leonor (Instituto Butantan), por ter cedido os antagonistas para receptor de glutamato, utilizados para as medidas de cálcio.
À Profª Drª Maria C. W. Avellar, pelo auxílio e uso dos equipamentos para realização de RT-PCR. À Luciana, o qual me ajudou imensamente nestes experimentos.
Aos professores membros da banca (Profª Drª Alicia Kowaltowski, Prof Dr José Buratini Jr., Prof Dr Cristóforo Scavone) pela dedicação à leitura da tese e sugestões feitas durante o exame de qualificação, que foram cuidadosamente consideradas durante a correção.
Aos professores do Depto. de Farmacologia e aos colegas de pós-graduação que, direta ou indiretamente, participaram desse período de aprendizado e trabalho.
Aos técnicos, técnicas e secretárias do laboratório, pelo apoio, companheirismo e serviços, indispensáveis para concretização deste trabalho.
À FAPESP pela bolsa concedida e ao CNPq/ CAPES pelo apoio financeiro.
“O real não está na saída nem na chegada:
Resumo
O envelhecimento é um processo multi-fatorial associado a déficits funcionais, sendo que o cérebro é um dos órgãos com maior susceptibilidade a doenças crônico-degenerativas. Dentre essas, as doenças de Alzheimer e de Parkinson apresentam maior prevalência na população global e levam à incapacitação severa do indivíduo. Assim, o entendimento dos mecanismos dessas doenças que estão relacionados com o envelhecimento é importante para a busca de alternativas de tratamento. Há evidências de que, em doenças neurodegenerativas, ocorrem alterações na homeostase do cálcio (Ca2+), o que pode contribuir para a morte celular por apoptose. No presente trabalho, buscamos investigar fenômenos envolvidos com a tríade Ca2+-mitocôndria-EROs (espécies reativas do oxigênio) (TOESCU, 2005) e a apoptose em corpo estriado de ratos no envelhecimento. Foram avaliadas a sinalização intracelular dinâmica (em tempo real) e estática (biologia molecular), a morfologia celular e ultraestrutural, a morfometria e bioenergética. Utilizando fatias cerebrais de ratos, observamos que os animais senescentes apresentaram um aumento de Ca2+ citosólico maior que os animais jovens, após a estimulação glutamatérgica. Em seguida, utilizamos antagonistas parciais das duas classes de receptores, os metabotrópicos do grupo I e os ionotrópicos (NMDAR), para estudar os componentes desse aumento de Ca2+. Avaliamos também o aumento de Ca2+ citosólico mediado por agentes que mobilizam esse íon do retículo endoplasmático e da mitocôndria, mostrando que esses estoques de Ca2+ podem estar aumentados no envelhecimento. As medidas do ∆Ψm basal mostraram que há uma
diminuição deste parâmetro no envelhecimento, sendo estas alterações condizentes com a inibição mais acentuada do complexo I da cadeia transportadora de elétrons e do aumento na produção de EROs. As alterações funcionais não implicaram em mudanças ultraestruturais da mitocôndria. Foram investigados a expressão gênica e o conteúdo protéico de Bax e Bcl-2, mostrando um aumento da expressão de bax e uma redução de proteínas Bcl-2, o que pode ter
uma relação com o aumento de apoptose encontrado no estriado dos animais senescentes. Desse modo, os resultados indicam que, no envelhecimento, existem alterações no controle intracelular de sinalização de Ca2+ e na bioenergética, que podem contribuir para o aumento de apoptose.
Abstract
Aging is a multi-factorial process which can be associated with several functional and structural deficits, and the brain is one of the most affected systems by chronic and degenerative diseases. Among them, Alzheimer’s and Parkinson’s diseases are the most prevalent and cause the most severe impairments. Therefore, it is necessary to study and increase the knowledge about the age-related risk factors and the possible mechanisms involved in brain damage and future perspectives for protection and therapeutics. There are several evidences showing that in neurodegenerative disorders alterations in Ca2+ homeostasis occurs, which may contribute to apoptotic cell death. In the present work we investigated some phenomena concerning the triad Ca2+-mitochondria-ROS (reactive oxygen species)
(TOESCU, 2005) and apoptosis in striatum of aged rats. In the present work we evaluated the intracellular signaling, cell morphology and ultrastructure, morphometry and bioenergetics. Using rat brain slices, we observed that aged animals displayed a greater cytosolic Ca2+ rise after a glutamate challenge, compared to controls. Using partial antagonists of two classes of glutamate receptors, group I metabotropic and ionotropic (NMDAR), we studied the components of this Ca2+ rise. We further evaluated the cytosolic Ca2+ elevation caused by drugs that induces mobilization of Ca2+ from stores, like the endoplasmic reticulum and mitochondria, suggesting that these may be increased in aged animals. During aging, that there is a reduction of basal mitochondrial membrane potentials, accompanied by an enhanced inhibition of complex I from the electron transport chain and an elevation of ROS. The functional alterations do not point to mitochondrial ultrastructure modifications. We investigated gene expression and encoded protein contents of Bax and Bcl-2, showing that there is an increase in expression of bax and a reduction of Bcl-2 protein, that can be related
with the enhancement of apoptosis found in the striatum of aged rats. Altogether, our data indicate that, during aging, there are alterations in Ca2+ handling and in bioenergetic functions which may contribute to apoptosis induction.
Lista de Tabelas
Tabela 1. Modificações funcionais no envelhecimento e as patologias correlatas. Tabela 2. Ciclos térmicos da reação de RT-PCR.
Lista de Figuras
Figura 1. Vias neuroquímicas dos gânglios da base. Figura 2. Homeostase do Ca2+ intracelular.
Figura 3. Efeito do glutamato no aumento de Ca+2: fotomicrografias representativas.
Figura 4. Efeito do glutamato no aumento de Ca+2: traçado representativo, traçado médio e
histograma.
Figura 5. Avaliação do aumento de Ca+2 na sinalização glutamatérgica frente ao antagonismo de AP3: traçado representativo, traçado médio e histograma.
Figura 6. Avaliação do aumento de Ca+2 na sinalização glutamatérgica frente ao antagonismo de AP5: traçado representativo, traçado médio e histograma.
Figura 7. Avaliação do aumento de Ca+2 na sinalização glutamatérgica frente ao antagonismo de AP3 e AP5: traçado representativo, traçado médio e histograma.
Figura 8. Efeito da tapsigargina no aumento de Ca+2: traçado representativo, traçado médio e histograma.
Figura 9. Efeito do FCCP no aumento de Ca+2: traçado representativo, traçado médio e
histograma.
Figura 10. Efeito do FCCP no aumento de Ca+2, na presença de CdCl2: traçado representativo,
traçado médio e histograma.
Figura 11. Imunofluorescência para receptores glutamatérgicos: fotomicrografias representativas e histogramas.
Figura 12. Avaliação do ∆Ψm por indicador fluorescente: fotomicrografias representativas e
histograma.
Figura 13. Efeito do glutamato no ∆Ψm : fotomicrografias representativas e traçado.
Figura 14. Medidas da produção de ERO com indicador fluorescente: fotomicrografias representativas e histograma.
Figura 15. Avaliação da inibição do complexo I da CTE por medidas de consumo de O2:
traçado e histogramas.
Figura 16. Avaliação da inibição do complexo II da CTE por medidas de consumo de O2:
traçado e histogramas.
Figura 17. Avaliação da inibição do complexo III da CTE por medidas de consumo de O2:
Figura 18. Microscopia eletrônica de transmissão para mitocôndrias: fotomicrografias representativas.
Figura 19. Marcação de células apoptóticas por TUNEL: fotomicrografias representativas e histograma.
Figura 20. Análise da expressão gênica de bax e bcl-2 por RT-PCR: fotomicrografias
representativas e histogramas.
Figura 21. Análise da expressão de proteínas Bax e Bcl-2 por Western-Blot:fotomicrografias representativas e histogramas.
Lista de Abreviaturas
ψm - Potencial de membrana mitocondrial
3-NP – Ácido 3-nitropropiônico 6-OHDA – 6-hidroxidopamina
aCSF - “Artificial cerebral-spinal fluid” AIF - Fator Indutor de Apoptose
AMPA - α-amino-3-hidróxi-5-metilsoxazol
ATP – Trifosfato de inusitol Bax – “Bcl-2 associated X protein” Bcl-2 – “B cell lymphoma”
Ca2+ - Cálcio cAMP - AMP cíclico
CM-H2DCFDA - 5-clorometil-2’,7’-diclorodihidrofluoresceína diacetato, acetil éster
CTE - Cadeia transportadora de elétrons DCF - 2’,7’-diclorofluoresceína
DL-AP3 - “DL-2-Amino-3-phosphonopropionic acid” DL-AP5 - “DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid” EROs - Espécies reativas do oxigênio
FAD+ - “Flavin adenine dinucleotide”
FCCP - “p-trifluoromethoxy carbonyl cyanide phenyl hydrazone” Fura-2AM – Fura acetoximetiléster
GABA – Ácido gama-aminobutírico GFAP - Proteína ácida fibrilar glial HRP - horsearedish peroxidase IP3 - inositol-1,4,5-trifosfato
mGluR – receptor metabotrópico de glutamato MPTP - 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina mtDNA – DNA mitocondrial
NAD+ - “nicotinamide adenine dinucleotide” NMDA - ácido N-metil-D-aspártico
PBS – tampão fosfato-salina
PMCA - Ca2+-ATPase da membrana plasmática
PNAD - pesquisa Nacional por Amostra de Domicílios PTP – poro de transição de permeabilidade
RE - retículo endoplasmático
Rmax - razão máxima de fluorescência
ROI – região de interesse
RT-PCR - “Reversed Transcription – Polimerase Chain Reaction” SERCA - “sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase”
SNC – sistema nervoso central TBS – tampão Tris-salina
TMRE - tetrametilrodamina etil éster
Sumário
1.0 Introdução... 01
1.1 Aspectos sociais do envelhecimento... 02
1.2 Aspectos gerais e teorias do envelhecimento... 03
1.3 O envelhecimento cerebral... 05
1.4 Farmacologia da via nigro-estriatal e neuroquímica do corpo estriado... 06
1.5. O papel do glutamato na neurotransmissão... 09
1.6 Sinalização de Ca2+ e estoques intracelulares... 11
1.7 Mitocôndria e homeostase de Ca2+... 13
1.8 A apoptose... 15
2.0 Objetivos... 18
3.0 Materiais e Métodos... 20
3.1 Animais experimentais... 21
3.2 Isolamento do cérebro... 21
3.3 Fatiamento da área do estriado... 21
3.4 Medidas do Ca2+ intracelular... 22
3.4.1 Efeito do glutamato... 23
3.4.2 Efeito da tapsigargina... 24
3.4.3 Efeito do FCCP... 24
3.5 Ensaio de imunofluorescência para receptores glutamatérgicos... 25
3.6 Medidas do potencial elétrico mitocondrial (∆Ψm)... 26
3.7 Formação de espécies reativas de oxigênio (ERO)... 27
3.9 Microscopia eletrônica de transmissão... 28
3.10 Marcação de células apoptóticas... 29
3.11 Expressão Gênica... 30
3.12 Western blot... 32
3.13 Análise estatística... 33
3.14 Reagentes e drogas utilizadas... 33
4.0 Resultados... 35
4.1 Efeito do glutamato no aumento de Ca+2:... 36
4.2 Avaliação do aumento de Ca+2 na sinalização glutamatérgica frente ao antagonismo de AP3... 38
4.3 Avaliação do aumento de Ca+2 na sinalização glutamatérgica frente ao antagonismo de AP5... 39
4.4 Avaliação do aumento de Ca+2 na sinalização glutamatérgica frente ao antagonismo de AP3 e AP5... 40
4.5 Efeito da tapsigargina no aumento de Ca+2 ... 41
4.6 Efeito do FCCP no aumento de Ca+2 ... 42
4.7 Imunofluorescência para receptores glutamatérgicos... 44
4.8 Avaliação do ∆Ψm por indicador fluorescente... 46
4.9 Efeito do glutamato no ∆Ψm... 46
4.10 Medidas da produção de ERO com indicador fluorescente... 47
4.11 Avaliação da inibição de complexos da CTE por medidas de consumo de O2... 48
4.12 Microscopia eletrônica de transmissão para mitocôndrias:... 51
4.13 Marcação de células apoptóticas por TUNEL... 52
4.14 Análise da expressão gênica de bax e bcl-2 por RT-PCR: :... 53
5.0 Discussão... 56
5.1 Estudo da via glutamatérgica em corpo estriado de animais senescentes... 57
5.2 Participação e modulação de estoques de Ca2+... 60
5.3 Alterações mitocondriais no envelhecimento... 62
5.4 A apoptose em corpo estriado no envelhecimento... 63
6.0 Conclusão...67
7.0 Referências bibliográficas... 69
1.1 Aspectos sociais do envelhecimento
Por quanto tempo deveríamos viver? A cada vez que referendamos nossos pontos de vista em tal questionamento não conseguimos evitar a petulante idéia da “fonte da juventude”. Nas culturas antigas, a busca do “elixir da vida” pelos alquimistas trouxe à experimentação elementos como mercúrio ou enxofre como promessa de imortalidade. Aos poucos, a idéia “biológica” de vida eterna foi sendo suplantada por convicções religiosas, que sustentam a relevância de se viver com saúde, paz espiritual e coletividade. . Considerada a ontogênese como necessária para a manutenção da comunidade, o envelhecimento, com comprometimento funcional, altera a engrenagem social, tanto em aspectos individuais quanto coletivos, o que pode ser considerado um ônus ao bem comum.
A população idosa está em ascensão no Brasil e no mundo. Em 2003, o IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) apontou que os brasileiros vivem em média 71,3 anos, garantindo ao país a 86ª posição no ranking dos países com maior expectativa de vida. Isso representa um aumento relativo de 5,05% quando comparado aos índices em 1993. Desde 1940, a porcentagem de brasileiros com 60 anos ou mais quase duplicou (4,1% em 1940 para 7,7% em 1999), havendo uma projeção para 2020 de aproximadamente 13% da população brasileira. Em pesquisa recente, a PNAD 2007 (Pesquisa Nacional por Amostra de Domicílios) estimou cerca de 19 milhões de pessoas com 60 anos ou mais de idade, correspondendo a 10,2% do total da população.
Além dos valores absolutos da população, a PNAD também indicou um grande contingente de idosos com problemas de saúde, sendo mais freqüentes: problemas cardíacos, hipertensão, deficiência ósteo-muscular e diabetes. Os mencionados com menor freqüência foram problemas respiratórios, digestivos e neuropsiquiátricos. Os distúrbios neurodegenerativos têm sido uma das grandes preocupações tanto para os pesquisadores quanto para os administradores públicos, dadas as lesões irreversíveis, que representam um grande encargo social. Como exemplo, um relatório publicado em 2007 pela Revista “Alzheimer’s & Dementia” informou que atualmente o custo global com a doença de Alzheimer é de US$ 315 bilhões anuais (WIMO et al., 2007). As doenças neurodegenerativas têm como um forte fator de risco a idade: a prevalência da doença de
Parkinson é de 8,5% em homens e 7,7% em mulheres entre 55 e 85 anos, e após os 85 anos esse índice sobe para 12,1% e 10,2%, respectivamente (VAN DEN EEDEN et al., 2003).
de 30,9% dos idosos (ou seja, 5,9 milhões de pessoas) continuam trabalhando. Ainda assim, considerando aspectos psicossociais, o idoso não é valorizado por ser considerado “aquele que não participa”, devido à perda do status profissional ao qual estava vinculado (dada à visão unilateral que a sociedade impõe a seus membros) e aos preconceitos, que os levam a assumir uma ideologia de condição de invalidez mental e física dos idosos (SIEDLER, 1986).
1.2 Aspectos gerais e teorias do envelhecimento
Uma abordagem de cunho molecular e investigativa dos fenômenos do envelhecimento vem sendo necessária para o entendimento de diversas doenças, em especial as crônico-degenerativas. Apesar das observações universais do aparecimento inexorável de sinais “da idade”, isso não ocorre de maneira uniforme porque há influência do estilo de vida e histórico genético familiar. Alguns determinantes como o tabagismo e o sedentarismo tendem a precipitar o aparecimento desses sinais, ao contrário da prática de atividades físicas e alimentação equilibrada. Além disso, a maior propensão ao aparecimento de déficits funcionais e de doenças está intimamente ligada a fatores de exposição ambiental. Para a consolidação de um conhecimento centrado nos processos do envelhecimento, os eventos relacionados à idade apresentam quatro características: serem deletérios (com redução da capacidade funcional), progressivos (graduais), intrínsecos (sendo influenciados pelo componente ambiental, mas não mantendo relação causal com ele), e universais (ocorrer em todos os membros da espécie).
Tabela 1. Modificações funcionais no envelhecimento e as patologias correlatas.
Adaptado de RESNICK et al., 2004.
É difícil estimar numericamente a quantidade de teorias propostas para analisar e explicar o envelhecimento. Na Inglaterra do fim do século XIX os cidadãos viviam em média 48 anos (SZRETER, 1988) e as teorias mais antigas de que se tem registro surgiram no século XIX. Alguns autores se dedicaram a fazer uma classificação e organização dessas teorias (HART; TURTURRO, 1998; HAYFLICK, 1985; FINCH, 1993; ARKING, 1988), sendo que estas estão baseadas em aspectos celulares, sistêmicos, genômicos e evolutivos. À frente dessas sistematizações deve haver obviamente o preceito da integração dos sistemas, com uma visão ampla dos processos biológicos, não limitados a uma teoria única e absoluta que explique todos os fenômenos do envelhecimento.
Na década de 50, Harman (1956) propôs que as espécies reativas do oxigênio (EROs) eram capazes de causar dano em moléculas e conduzir a alterações observadas no envelhecimento. Essa idéia ficou conhecida como a “teoria dos radicais livres”, que nos dias atuais vem sendo referendada por inúmeros estudos. Como exemplo, Schriner e colaboradores (2005) demonstraram que camundongos transgênicos com superexpressão de catalase mitocondrial, enzima que metaboliza as EROs, apresentaram um aumento da expectativa média de vida da ordem de 18,5%. Toescu (2005) propôs que alterações da homeostase de cálcio (Ca2+) no processo de envelhecimento contribuem para a geração de EROs em nível
imunológica e do metabolismo de drogas, o aumento da susceptibilidade às doenças neurodegenerativas e neoplasias malignas, com a diminuição da capacidade de responder de forma adaptativa ao meio ambiente, podem ser resultados do desbalanço entre a produção e o consumo das EROs. De modo geral, essas moléculas podem oxidar o material genético e causar mutações cumulativas no DNA. Por outro lado, alguns estudos discutem a importância de se aprimorar os modelos experimentais para a confirmação da teoria dos radicais livres, uma vez que a correlação entre níveis de enzimas antioxidantes e dano oxidativos podem apresentar falhas em alguns modelos experimentais (SOHAL et al., 2002).
No âmbito das teorias genéticas, o acúmulo de mutações no DNA resulta em efeitos tóxicos aos sistemas celulares, levando à morte celular (KIRKWOOD, 1989; VIJG et al., 2005). Camundongos com deficiência no gene da telomerase (enzima responsável pela manutenção dos telômeros) tiveram uma redução na expectativa de vida e resposta adaptativa alterada, com certa instabilidade genética (RUDOLPH et al., 1999). Com o aumento da idade, há uma considerável diminuição do potencial reparador das enzimas que agem sobre o DNA (HART et al., 1974), podendo haver acúmulo de mutações. Portanto as células aos poucos passam a apresentar variações na sua composição química e expressão gênica. Se genes decisivos para o ciclo vida/morte celular forem alterados, a morte por apoptose poderá ocorrer com maior freqüência. Esta por sua vez contribuirá para o envelhecimento, sendo em grande parte responsável pela queda na função orgânica (MULLART et al., 1990).
1.3 O envelhecimento cerebral
No decorrer da evolução dos organismos superiores, o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC) tem um papel de destaque, dada sua complexidade. No entanto, este sistema apresenta mecanismos limitados de proteção neuronal frente a injúrias celulares severas, que podem levar à morte celular. Danos isquêmicos são por vezes irreversíveis, culminando em calcificação da região atingida com a formação de cicatriz composta maciçamente por células da glia (TRENDELENBURG; DIRNAGL, 2005). Danos dessa natureza ocorrem com maior freqüência em idosos (THORVALDSEN et al., 1999). Funcionalmente, isso pode levar a alterações do status cognitivo ou motor do indivíduo, deixando seqüelas ou muitas vezes levando este à morte.
modificações na estrutura cerebral que, dependendo do grau e velocidade, podem desencadear uma patologia. Anatomicamente foram constadas as seguintes alterações no cérebro humano: hipotrofia acentuada nos lobos frontal e temporal; alargamento e aprofundamento dos sulcos, cisternas basais e fissuras; aumento do volume ventricular e de liquor; redução do volume do córtex para-hipocampal (de 10%), núcleo lentiforme (de 21,4 a 36,8%), núcleo caudado (de 24,6%), entre outros; redução do número de neurônios do corpo estriado e espessamento meníngeo (CANÇADO; HORTA, 2002).
Emaranhados neurofibrilares e placas neuríticas têm acúmulo acentuado principalmente nos lobos temporais de indivíduos com doença de Alzheimer, mas já foram descritos casos de idosos sem alterações cognitivas com esses componentes, revelando que os depósitos desses subprodutos da degradação do citoesqueleto celular ocorrem durante o envelhecimento normal (KATZMAN et al., 1988). Hoje se compreende a ocorrência de retração neuronal e dos espaços interneuronais, com a de presença de vacúolos autofágicos e produtos de oxidação lipídica (a lipofuscina), ao contrário da perda celular maciça primariamente proposta (FINCH, 1993). Quanto às células da glia, foi observado um quadro de hipertrofia e hiperplasia astrocitária, em associação ao aumento de expressão da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (FINCH, 2003). Porém, as complicações de ordem funcional são as mais prejudiciais à neurotransmissão, pela limitação da capacidade regenerativa dos vasos cerebrais e redução da plasticidade neuronal, observada pela alteração dos padrões eletrofisiológicos (BARNES, 1994) e espalhamento dendrítica após lesão (COTMAN; ANDERSON, 1988; RAMIREZ, 2001).
1.4 Farmacologia da via nigro-estriatal e neuroquímica do corpo
estriado
compostos pelo corpo estriado (caudado/putâmen), núcleos subtalâmicos, globo pálido (interno e externo) e substância negra (pars reticulata/pars compacta).
A via nigro-estriatal tem, em linhas gerais, duas formas de enviar sinais ao córtex e modular as informações motoras. Uma consiste na desinibição das sinapses glutamatérgicas de origem talâmica para o córtex somatosensorial, motor e áreas de associação (via direta). A outra, consiste na inibição dessa desinibição do tálamo (via indireta). A Figura 1 foi apresentada para auxiliar na compreensão.
Figura 1. Vias neuroquímicas dos gânglios da base. Adaptado e traduzido de SIAN et al.
1999.
Neurônios glutamatérgicos (em preto) se projetam do córtex motor ao corpo estriado. Na via direta, os neurônios A e A’ partem do corpo estriado para o globo pálido interno e substância negra pars reticulata, respectivamente. Neste caso, essas duas estruturas agem
intermediando a comunicação com o tálamo através do envio de fibras (B e B’) que, se ativadas, bloqueiam a resposta talâmica para o córtex. Assim, a ativação de A (e A’) sobre B (e B’) resulta em desinibição do tálamo (via direta). Por outro lado, a ativação de a inibe b, desinibindo o núcleo subtalâmico que envia fibras glutamatérgicas para o globo pálido, dessa forma ativando c, que inibe o tálamo (via indireta).
interneurônios, são responsáveis pela comunicação intra-estriatal (IZZO; BOLAM, 1988). As projeções de transmissão GABAérgica que partem do corpo estriado para o globo pálido e substância negra pars reticulata antagonizam o efeito excitatório de três neurotransmissores:
glutamato, dopamina e acetilcolina.
O núcleo caudado e o putâmen compartilham propriedades citoarquitetônicas e fisiológicas, de tal forma que, em roedores, eles não possuem limites definidos, sendo denominados de corpo estriado. Esse nome advém de seu aspecto macroscópico, pelo cruzamento de feixes de fibras mielinizadas da cápsula interna pouco desenvolvida por essa estrutura (corpo estriado). Em seres humanos, essas fibras formam um feixe único que separa o núcleo caudado do putâmen. Existem duas grandes subdivisões na aparente massa homogênea estriatal: a porção dorsal e a ventral. Estas apresentam conectividade e características neuroquímicas semelhantes, mas diferem no conteúdo das informações processadas (HEIMER et al., 1982). É importante notar que a porção do córtex sensório-motor com neurotransmissão glutamatérgica atinge o quadrante dorso-lateral do estriado (KELLEY et al., 1982), que é uma estrutura homóloga ao putâmen nos primatas, sendo inervada também por neurônios dopaminérgicos da substância negra pars compacta
(BECKSTEAD, 1979; KELLEY et al., 1982).
Neurônios com prolongamentos médios (“medium spiny neurons”) constituem 90-95% da população neuronal do corpo estriado. Com árvore dendrítica de 200-500 µm, estes
são neurônios GABAérgicos que se projetam ao globo pálido e substância negra, mas que também podem inibir as células vizinhas (WILSON; GROVES, 1980). Os interneurônios colinérgicos (“large aspiny neurons”) compõem 1-2%, e são comparativamente maiores que os primeiros, com pouca arborização dendrítica, porém com longos axônios (PHELPS et al., 1985). Por fim, o terceiro tipo faz o uso de somatostatina para a comunicação neuronal e são chamados de “medium aspiny neurons”.
Existem várias doenças que acometem os gânglios da base, tendo caráter hipocinésico ou hipercinésico, que de qualquer forma comprometem a motricidade voluntária. Em ambos os casos ocorrem perdas celulares de alguma estrutura que compõe a via direta ou indireta, lembrando que sua modulação restringe certas ações e dá dimensionamento a elas. Assim, podem ocorrer movimentos estereotipados patognomônicos, involuntários e que incapacitam o indivíduo, como o tremor em repouso (movimento de "rolar pílulas") na doença de Parkinson ou a coréia na doença de Huntington (REDBURN; DAHL, 1998).
centra-se em fatores ambientais e genéticos (FOLTYNIE et al., 2002), estando associada ao envelhecimento. Entretanto, existem muitos casos de aparecimento precoce dessa doença (GERSHANIK, 2003). Assim, decorridos quase 200 anos de sua descrição pelo médico James Parkinson, a causa da doença ainda permanece em discussão. O fenômeno correlacionado a esta sintomatologia consiste na morte de neurônios dopaminérgicos da sustância negra, provocando um déficit desse neurotransmissor no corpo estriado (EHRINGER; HORNYKIEWICZ, 1960). Os modelos experimentais farmacológicos disponíveis usam compostos que agem primordialmente inibindo o complexo I da cadeia transportadora de elétrons (CTE), a exemplo do MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) e da rotenona (LANGSTON; BALLARD, 1983; GERLACH et al., 1991), ou que agem aumentando a dopamina nos terminais axonais da substância negra, que acaba por ser oxidada e promove a toxicidade, tal como ocorre com a 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Além disso, em modelo experimental da doença de Parkinson, provocado pela denervação da via nigro-estriatal, há hiperatividade das sinapses glutamatérgicas no estriado, revelando uma modulação da liberação de glutamato pela dopamina (LINDEFORS; UNGERSTEDT, 1990).
Em pacientes com a doença de Huntington a hipercinesia é mais acentuada, com movimentos involuntários bruscos em todo o corpo (THOMPSON et al., 1988). A perda gradual de neurônios estriatais (e posteriormente corticais, com afecção cognitiva) ocorre por volta da quarta ou quinta década de vida, comprometendo a alça indireta da via nigro-estriatal (liberando a estimulação excitatória talâmica). Esta é uma doença hereditária autossômica dominante, genotipicamente determinada pela expansão do códon CAG no braço curto do cromossomo 4, no gene da huntintina (GUSELLA et al., 1983). Quanto maior é o número de repetições da glutamina na molécula, mais precoce e severo é o aparecimento da doença. Para o estudo da doença de Huntington existem camundongos transgênicos que possuem a huntintina mutada (TELES et al., 2008), além do tratamento com o ácido 3-nitropropiônico (3-NP), um inibidor irreversível do complexo II mitocondrial (BEAL et al., 1993; BROUILLET et al., 1995, ROSENSTOCK et al., 2004).
1.5 O papel do glutamato na neurotransmissão
em longo prazo (LTP) como da depressão em longo prazo (LTD) (BENNET et al., 2000). A consolidação da memória e aumento de prolongamentos e conexões dos neurônios é resultado de um sincronismo entre as células adjacentes ao neurônio alvo, de fato promovendo uma despolarização pós-sináptica sustentada, finalizada com uma cascata molecular de produção de proteínas e neuritogênese (BLISS; COLLINGRIDGE, 1993; BENNET, 2000).
O aminoácido e neurotransmissor glutamato tem sua ação em receptores ionotrópicos de membrana, canais que, uma vez ativados, alteram sua estrutura terciária permitindo o influxo iônico, os quais recebem o nome de seus principais agonistas. O glutamato também ativa receptores metabotrópicos ligados à proteína G, podendo ser excitatórios ou inibitórios. Em 1989 foi feita a primeira clonagem de um receptor glutamatérgico, que posteriormente levou ao conhecimento de mais de 16 genes que codificam as proteínas destes receptores (HOLLMANN et al., 1989). A ampla gama de genes mostrou que esta é uma família de receptores que apresenta diversos tipos e subtipos. O excesso de glutamato extracelular, após liberação na neurotransmissão, é recaptado por um sistema sódio-dependente presente principalmente em astrócitos, mas também em neurônios (LEHRE; DANBOLT, 1998; GEGELASHVILI; SCHOUSBOE, 1998). Algumas pesquisas indicam diferenças ontogênicas nesse sistema de recaptação (THOMAZI et al., 2004).
Os receptores de NMDA (ácido N-metil-D-aspártico; NMDAR), AMPA (α
-amino-3-hidroxi-5-metilsoxazol) e cainato compõem o grupo dos ionotrópicos (ROC – “receptor operated channel”) . Como já introduzido, eles possuem várias subunidades: NMDAR (NR1, NR2A-D), AMPA (GluR1-4), cainato (GluR5-7, KA1-2). A expressão de NR1 no cérebro é abrangente, mas o NR2 apresenta maior densidade em algumas estruturas cerebrais (NAKANISHI, 1992). Com a geração do potencial de ação, há uma rápida despolarização resultando em um pico elevado e transiente de Ca2+, tendo os receptores AMPA e cainato como constituintes de destaque nessa atuação por possuírem cinética rápida e dessensibilização em intervalos de milisegundos (DINGLEDINE; MCBAIN, 1999). O NMDAR é estimulado pelo glutamato juntamente com o co-agonista glicina (KLECKNER; DINGLEDINE, 1988) e encontra-se estacionariamente bloqueado pelo íon magnésio (Mg2+) à -70 mV (NOWAK et al., 1984). Porém, à medida que o potencial de membrana se eleva, há uma diminuição da afinidade desse íon e a inibição é diminuída.
O aumento de Ca2+ intracelular proporcionado pela ativação dos receptores metabotrópicos (mGluR1 e mGluR5, do grupo I) se deve à estimulação da proteína Gq,
formação de IP3 (inositol-1,4,5-trifosfato) que libera Ca2+ do retículo endoplasmático (RE). Já
ciclase diminuindo a formação de AMP cíclico (cAMP), função desempenhada pelos receptores do grupo II (mGluR2 e mGluR3) e III (mGluR4, mGluR6-8) (CONN; PIN, 1997). Todos os três grupos estão presentes no estriado, e os mais abundantes são o mGluR3 e o mGluR5 (TESTA et al., 1994; PARENT; HAZRATI, 1995). Um dado interessante a respeito dessa classe de receptor é que ele modula a ativação de outros canais iônicos, mais especificamente inibindo os canais de Ca2+ voltagem-dependentes (VOCC - “voltage operated calcium channels”) (LOVINGER; MCCOOL, 1995).
A exposição das células neurais a altas concentrações de glutamato ou outros aminoácidos excitatórios, pode produzir injúria celular e danos irreversíveis, culminando em morte celular (FOGAL et al., 2005). O influxo via NMDAR pode aumentar as concentrações de Ca2+ citosólicos em níveis tóxicos (RAJDEV; REYNOLDS, 1994), porém existem hipóteses de que outras vias estejam envolvidas nessa toxicidade (LEE et al., 1999). Em muitas doenças neurodegenerativas, como a doença de Huntington e de Parkinson, a morte celular por excitotoxicidade está presente (COYLE; PUTTFARCKER, 1993; DIFIGLIA, 1990; BEAL, 1998). Um exemplo experimental foi o aumento da atividade glutamatérgica córtico-estriatal observado em modelo de denervação dopaminérgica, simulando a doença de Parkinson (CALABRESI et al., 1993). Em modelos de lesão dopaminérgica por 6-OHDA, foi observada uma redução de sítios de ligação de NMDA e AMPA (TARAZI et al., 1998), mostrando um possível mecanismo compensatório.
1.6 Sinalização de Ca
2+e estoques intracelulares
É indiscutível o papel do Ca2+ na mediação da transmissão neural em todo o organismo. Para a manutenção do potencial de repouso (-80 mV em neurônios), o Ca2+ estabelece um equilíbrio eletrofisiológico junto ao K+ e ao Na+. O Ca2+ mantém-se em um
por sua distribuição particular na membrana plasmática e em tipos celulares. A entrada de Ca2+ em células do SNC se dá por canais de baixo limiar de ativação do tipo N e P que são
necessários para a liberação de neurotransmissores, enquanto que o tipo T (de cinética rápida) está envolvido na geração do potencial de ação (RANG et al., 2003).
A ativação de receptores metabotrópicos (como os mGluR do grupo I) controla o influxo de Ca2+ pela estimulação da proteína Gq; que ativa a fosfolipase C que por sua vez
cliva o PIP2 (fosfatidilinusitol-4,5-difosfato) formando o IP3 e a proteína de membrana DAG
(diacilglicerol). O IP3 ativa canais de IP3R (receptor de inositol-1,4,5-trifosfato) localizados
especialmente no RE, promovendo a liberação de Ca2+ estocado neste compartimento (BERRIDGE et al., 1993). Por sua vez, a estimulação dos receptores glutamatérgicos ionotrópicos promove uma mudança conformacional no domínio transmembranar no interior do poro, liberando-o para o influxo de Ca2+, devido ao gradiente iônico.
Os aumentos de Ca2+ citosólicos são tamponados por diversos mecanismos, tal como o
tamponamento feito pelo RE, que conta com a ação de uma Ca2+-ATPase (SERCA - “sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase”) que ao se ligar a duas moléculas de Ca2+ em seu domínio citoplasmático, promove a hidrólise do ATP, causando mudança conformacional da enzima, e permitindo o fluxo de Ca2+ para o interior do RE. A tapsigargina é um inibidor seletivo e irreversível da SERCA, que resulta na extrusão e esgotamento de Ca2+ do RE, consolidando-se como uma poderosa ferramenta para o estudo desses estoques sensíveis à essa droga.
É interessante notar que, quando as concentrações de Ca2+ no citoplasma são elevadas à 250 nM e 300 nM, ocorre sensibilização não só dos receptores de IP3 como também de
rianodina, aumentando a liberação de Ca2+ do RE (POZZAN et al., 1994; HOROWITZ et al., 1996). Quando o RE é esvaziado, há a ativação de outro canal presente na membrana plasmática, o SOC (“store-operated channel”), que promove o influxo de Ca2+ para o repreenchimento dessa organela (PUTNEY, 1986; PAREKH; PUTNEY, 2005).
envelhecimento e também em doenças neurodegenerativas (CHOI, 1985; ARUNDINE; TYMIANSKI, 2004). A alteração no sistema de tamponamento rápido de Ca2+ com o
envelhecimento aumentaria a vulnerabilidade dos neurônios a estímulos citotóxicos, podendo levar à morte celular (VERKHRATSKY; TOESCU, 1998).
1.7 Mitocôndria e homeostase de Ca
2+No decorrer da evolução, a relação simbiótica entre bactérias e células eucarióticas trouxe não só benefícios de sustentabilidade, como também de proteção. A importância da mitocôndria transcende a sua função bioenergética, pois ela compartimentaliza fatores desencadeantes do processo de apoptose e regula a sua liberação. A atividade bioenergética pode ser modulada pelo Ca2+ e, juntos, estes regulam a formação de ATP e das moléculas provenientes do estresse oxidativo. Portanto, devido à sua relevância nos processos fisiológicos e patológicos, a mitocôndria tem sido relacionada diretamente ao processo do envelhecimento e apoptose (TOESCU, 2005; LOPES et al., 2004).
No que diz respeito especificamente ao seu papel na homeostase de Ca2+, a mitocôndria tem sido vista como um notável estoque intracelular do íon (DUCHEN, 1999), e a dinâmica do transporte e manutenção deste no interior da organela depende da fosforilação oxidativa. O piruvato e os ácidos graxos, participantes do metabolismo de triglicérides, são transportados pela membrana mitocondrial e convertidos a acetil CoA em sua matriz. A acetil CoA entra no ciclo do ácido cítrico, resultando em redução de NAD+ e FAD a NADH + H+ e FADH2, que são carreadores de elétrons. Estas moléculas são oxidadas nos complexos I e III
da cadeia transportadora de elétrons (CTE), respectivamente. Os elétrons são transportados ao longo da CTE até o complexo citocromo c oxidase, onde a molécula de oxigênio é reduzida e se liga aos prótons livres na matriz mitocondrial, dando origem a moléculas de H2O. A
energia fornecida à cadeia é utilizada para bombear prótons (H+) para o espaço intermembranar, o que ocorre com a participação dos complexos I, III e IV (MITCHELL, 1961; SCHULTZ; CHAN, 2001), gerando um gradiente eletroquímico e um potencial de membrana mitocondrial ( ψm) negativo (no interior da matiz). Esse pH e gradiente de
energia necessária para impulsionar a fosforilação oxidativa e converter ADP + Pi em ATP. O
aumento da captação e da quantidade de Ca2+ na matriz mitocondrial pode significar ativação
da cadeia respiratória através da modulação direta de desidrogenases dependentes de Ca2+
ligadas ao ciclo do ácido cítrico (GUNTER et al., 2000), além de ativar diretamente o complexo ATP-sintase (TERRITO et al., 2000).
A captação de Ca2+ pela mitocôndria é feita principalmente por meio de um uniporter (proteína carreadora que transporta solutos de um lado para outro da membrana) (GUNTER; PFEIFFER, 1990 GUNTER et al., 2000), e esse movimento iônico é influenciado pelo próprio Ca2+, pH, temperatura e gradiente eletroquímico (NICHOLLS; AKERMAN, 1982, NICHOLLS; BUDD, 2000). Apesar da relativa baixa afinidade do sistema de captação mitocondrial (RIZZUTO; POZZAM, 2006), a proximidade com o RE cria os chamados “microdomínios” de Ca2+, que aumentam a captação deste pela mitocôndria. Além deste, outros mecanismos foram propostos para explicar a captação do íon pela mitocôndria, dentre os quais o sistema de transporte de “modo rápido” (RaM, GUNTER, 1998) e os canais sensíveis a rianodina (BEUTNER et al., 2005) .Os mecanismos de extrusão se dão pelo trocador Na+/Ca2+ ou Ca2+/H+, ou ainda pelo uniporter operando em modo reverso, e também pelo poro de transição de permeabilidade (PTP) (LEHNINGER et al., 1978, NICHOLLS, 2004). A estrutura do PTP permanece em discussão, sendo que atualmente dois modelos são considerados: a) um constituído por duas subunidades principais que realizam a comunicação da matriz mitocondrial com o citosol, o canal aniônico voltagem-dependente (VDAC) (SZABO; ZORATTI, 1993), o transportador do nucleotídeo adenina (ANT) (BUSTOVETSKY; KLINGENBERG, 1996) e a ciclofilina D (CONNERN; HALESTRAP, 1994; CROMPTON, 1999); b) e outro por um aglomerado de proteínas não específicas da membrana mitocondrial interna (KIM et al., 2003). A abertura do PTP pode se dar em condições de elevado acúmulo de Ca2+, mudança de pH, redução do ψm e aumento da
produção de EROs (VERCESI et al., 1997; KOWALTOWSKI et al., 2001). Essa abertura pode levar ao colapso no gradiente de prótons com conseqüente redução da atividade da ATP–sintase, alterando morfológica e funcionalmente a mitocôndria (ZORATTI; SZABÒ, 1995), promovendo a liberação de pequenos solutos (tais como Ca2+ e glutationa) e levando ao inchamento mitocondrial (BERNARDI et al.; 1999).
Figura 2. Homeostase do Ca2+ intracelular onde são observados os principais mecanismos de liberação, estoque, influxo e efluxo do íon. Adaptado de ORRENIUS et al., 2003.
1.8 A apoptose
Na presença de injúrias severas, os sistemas celulares podem se recompor por meio de mecanismos de reparação (genômicos e autofágicos) ou morrer. Quando o dano é agudo e intenso, como o causado por lesões do tipo isquêmica, ocorre um tipo não controlado de morte celular, a necrose, com sua característica resposta inflamatória. Porém, em determinadas circunstâncias, como a injúria genotóxica, a privação de fatores tróficos (como hormônios e citocinas) e a resposta imune celular entre outros, o fenômeno da morte celular programada está certamente presente. Dentre os tipos de morte celular programada foram descritas a autofagia e a apoptose (do grego apo "parte" e ptosis "queda").
(NEMES et al., 1996); a exposição do aminofosfolipídio fosfatidilserina na membrana plasmática como um sinalizador para o reconhecimento do sistema fagocítico mononuclear (SAVILL, 1997). Associada geralmente a estímulos patológicos, a necrose se diferencia da apoptose em muitos aspectos, principalmente pela geração de um processo inflamatório conseqüente da liberação do conteúdo enzimático lisossomal e pela degradação celular (LOCKSHIN; ZAKERI, 2004).
Dependendo da origem do estímulo, muitas cascatas bioquímicas podem ativar as proteases que agem de maneira efetora no processo apoptótico, e a comunicação entre elas pode complicar o estudo deste fenômeno. Os estímulos podem ser gerados por ativação de receptores de morte celular localizados na membrana plasmática de várias células (BOLDIN et al., 1996; MUZIO et al., 1996) (via extrínseca) ou por fatores intracitoplasmáticos (ORRENIUS et al., 2003) (via intrínseca). A mitocôndria tem uma importante participação na apoptose, em especial na via intrínseca, pois é fonte de proteínas pró-apoptóticas tais como citocromo c, SmacDiablo e Fator Indutor de Apoptose (AIF) (SMAILI et al., 2003; ORRENIUS et al., 2003). O processo de liberação destas proteínas é um assunto em amplo debate na literatura no momento, sendo que vários mecanismos foram propostos, dentre eles a abertura do PTP (HALESTRAP et al., 1998; CROMPTON et al., 1999).
Outro mecanismo importante na liberação desses fatores pró-apoptóticos envolve as proteínas da família da Bcl-2 (“B-cell lymphoma 2”). Essa família compreende proteínas com atividade anti-apoptótica (com a Bcl-2 e a Bcl-xL) ou pró-apoptótica (como a Bax, Bak e Bid),
concomitante de AIF e endonuclease G (EndoG), que também participam da fragmentação do DNA (SUSIN et al., 1999; LI et al., 2001).
O Ca2+ pode estar associado a algumas das vias da apoptose (SMAILI et al., 2003) e,
apesar de permanecer no foco de muitas pesquisas como um elemento importante na morte celular, não se sabe ainda qual o papel exato que desempenha. No entanto, sabe-se que esse íon participa ativamente na morte celular após um estímulo excitotóxico. Neste, o aumento do influxo de Ca2+, principalmente via NMDAR, leva a um acúmulo de Ca2+ nas mitocôndrias (NICHOLLS; BUDD, 2000), fato que acelera a fosforilação oxidativa (GUNTER et al., 2000) e altera a bioenergética mitocondrial, contribuindo para um aumento na produção de EROs (HANSSON et al., 2008). Esse evento pode contribuir para que ocorra a abertura do PTP (KOWALTOWSKI et al., 2001) e para que haja liberação de fatores pró-apoptóticos (SMAILI et al., 2003). Por outro lado, certas concentrações de Ca2+ podem também ativar calpaínas (proteases dependentes de Ca2+), levando à clivagem da pró-caspase-12 (YUAN et
Vários autores mostram que a homeostase de Ca2+ tem um papel importante nos diversos processos de indução e amplificação da morte celular em doenças neurodegenerativas e crônicas, sendo que o conhecimento desses mecanismos é fundamental para o entendimento das doenças relacionadas ao envelhecimento. Assim, buscamos abordar fenômenos envolvidos na homeostase de Ca2+ e na morte celular, em corpo estriado de cérebros provenientes de animais jovens e senescentes. Para isso, estudamos:
1) o envolvimento dos receptores glutamatérgicos e as alterações das vias intracelulares de tamponamento e armazenamento de Ca2+;
2) a mitocôndria, sua estrutura e seu potencial de membrana frente a aumento de Ca2+ intracelular;
3) a atividade dos complexos da cadeia transportadora de elétrons, acompanhada da produção de EROs;
3.1 Animais experimentais
Em nossos estudos utilizamos ratos Wistar 2BAW fêmeas com 5-6 meses (adulto jovem) e com 24-25 meses (senescentes), mantidos sob condições adequadas no Biotério do Instituto Nacional de Farmacologia (INFAR), da Universidade Federal de São Paulo. A temperatura foi mantida em torno de 25 ºC e a ração servida ad libitum. O presente trabalho
teve aprovação prévia do comitê de ética em pesquisa da UNIFESP (CEP: 1891/07)
3.2 Isolamento do cérebro
Os animais foram inicialmente decapitados com o auxílio de uma guilhotina. Foram feitas secções sagitais na calota craniana e os cérebros foram retirados cuidadosamente (~2 min) e imersos em solução aCSF (“artificial cerebral-spinal fluid”) (KCl 4,7 mM, CaCl2 2,5
mM, NaHCO3 25 mM, KH2PO4 1,2 mM, MgSO4 1,2 mM, glicose 11 mM) suplementada com
225 mM de sacarose, para diminuir danos neuronais (MOYER; BROWN, 1998). A solução aCSF foi previamente oxigenada (100% O2) e o pH mantido em 7,4. Foram descartados o
cerebelo e uma pequena porção do lobo frontal do encéfalo com o auxílio de uma lâmina e, em seguida, o cérebro foi colado com cola plástica (“SuperBonder”) em um bloco de metal ajustado a uma espessa fatia de gel de agarose (5%), que dava suporte horizontal ao cérebro.
3.3 Fatiamento da área do estriado
Após o preparo dos blocos (conforme descrito na seção anterior), esses foram fixados em suporte do vibrátomo (1000 Plus Sectioning System, Campden Instruments, IN, USA), de modo que os cérebros ficavam submersos em solução aCSF constantemente oxigenada (100% O2) e mantida sob refrigeração em gelo. Os cortes foram feitos em sentido coronal com
aproximadamente 200 µm de espessura (“slices”) (ROSENSTOCK et al., 2004). As fatias de um hemisfério foram transferidas para uma cuba com o mesmo líquido, oxigenadas e mantidas a 0 ºC.
3.4 Medidas do Ca
2+intracelular
Para verificar alterações do Ca2+ citosólico foi utilizado um microscópio de
fluorescência invertido (Nikon TE 300, Nikon, Osaka, Japan) contendo uma câmera digital de CCD de alta resolução e resfriamento (Quantix 512 – Roper Sci, Princeton Instruments, USA) acoplada. Para aquisição e análise das imagens foi utilizado o programa Spectralyser (Paul Anderson, NJ, USA), que nos permite delimitar as regiões de interesses (ROI) por uma ferramenta específica para a obtenção dos valores de fluorescência em unidades arbitrárias.
O corpo estriado (porção dorso-lateral) foi a região do SNC escolhida neste estudo, tomando como ROI um campo de aproximadamente 26000 pixels no centro da estrutura, com objetiva de 10X. Antes da análise em microscópio, as fatias foram incubadas com o fluoróforo fura-2AM (10 µM), por 30 minutos, juntamente com ácido plurônico F-127 0,01%,
para facilitar a entrada do fura-2 na célula. O fura-2AM, uma vez dentro da célula, sofre ação de esterases, que catalisam a liberação dos grupos carboxílicos. Isso permite que fura-2 esteja na sua forma ionizada e possa interagir com o Ca2+. O complexo fura-2-Ca2+ é excitado em comprimento de onda de 340 nm e sua emissão ocorre em 505 nm. Por sua vez, o fura-2 livre (não ligado ao Ca2+) é excitado em 380 nm e sua emissão ocorre também em 505 nm. Para estas medidas são necessários filtros de excitação que se alternam em 340 e 380 nm por intermédio de um carrossel controlado manualmente ou por computador, e um filtro de emissão de 505 nm localizado em cuba no microscópio invertido de fluorescência. Por permitir estas medidas em 340 e 380 nm, o fura-2 é um indicador raciométrico, (GRYNKIEWICS et al., 1985). O método raciométrico consiste em utilizar a razão entre os comprimentos de onda 340 e 380 nm (340/380) que são uma expressão da variação das concentrações intracelulares do Ca2+. Ao final de cada experimento, foi feita uma calibração do sinal de fluorescência utilizando a digitonina (1 mM), composto que se liga ao colesterol da membrana plasmática tornado-a permeável ao Ca2+. A entrada maciça de Ca2+ do meio extracelular após permeabilização, promove uma saturação do fura-2 e a obtenção da razão máxima de fluorescência do sistema (Rmax). Os valores experimentais de fluorescência foram
comparações de porcentagem e a apresentação dos gráficos, foi considerado o Rmáx como
100% e o valor basal como 0%.
O fura-2 (forma desesterificada) encontra dificuldades de sair da célula, pois apresenta cargas elétricas negativas, sendo que a única via de extrusão são os trocadores aniônicos da membrana plasmática, representando uma liberação pouco significativa do indicador. Em compensação, é inevitável que ocorra uma certa compartimentalização do fluoróforo em organelas, visto que estas podem seqüestrar de forma ativa alguns indicadores na forma polianiônica (DI VIRGILIO et al., 1990). Porém, esse fenômeno é reduzido quando se incuba o indicador em temperaturas mais baixas (20-25 ºC), como feito nos experimentos realizados neste trabalho (ROE et al., 1990). Os experimentos foram realizados com diversos agentes mobilizadores de Ca2+ extra ou intracelular (conforme mostrado a seguir), sendo que em todos os protocolos foram feitas aquisições basais durante 2,5 minutos antes da adição das drogas.
Após a obtenção das fluorescências e normalização dos valores obtidos, estes foram locados em gráficos e a análise dos resultados feita por meio de duas abordagens diferentes: a) avaliação do efeito máximo da razão de fluorescência no intervalo de tempo considerado; b) gráfico de dispersão, com análise por regressão linear (para experimentos com glutamato) e não linear, por análise de associação exponencial (para experimentos com tapsigargina e FCCP), do aumento de Ca2+ em função do tempo. Para tanto, avaliamos três componentes do aumento de Ca2+ quando este foi observado: um fásico, a partir do rápido aumento da razão de
fluorescência e grande inclinação da reta de regressão; um sustentado, a partir da razão de fluorescência tendendo à formação de um platô; e um de decaimento, a partir do decréscimo da razão de fluorescência. Foram apresentados os valores máximos, a constante observada (K) para a análise não linear e o coeficiente α (razão da variação de Ca2+ sobre o tempo) para a
análise linear.
3.4.1 Efeito do glutamato
As fatias foram estimuladas com glutamato (1 mM), que promove ativação de receptores ionotrópicos e/ou receptores metabotrópicos, que por vias diferentes induz ao aumento do Ca2+ citosólico. Em cada experimento foram feitas em média 135 imagens, com
intervalo de 10 s entre elas, sendo que o glutamato foi cuidadosamente adicionado na imagem 15 e seu efeito foi registrado durante 10 minutos, seguido da adição da digitonina (mais 10 minutos).
o AP3 (“DL-2-Amino-3-phosphonopropionic acid”) (antagonista parcial de mGluR do grupo I, que compreendem mGluR1 e mGluR5) a uma concentração de 100 µM e o AP5 (“DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid”) (antagonista parcial de NMDAR), a uma concentração de 100 µM. Estes inibidores foram incubados por 10-15 minutos a 37 ºC na câmara de Leiden (cada um deles) seguido da adição de glutamato.
3.4.2 Efeito da tapsigargina
O Ca2+ liberado pela tapsigargina, um inibidor específico e irreversível da SERCA (TAKEMURA et al., 1989), nos permite avaliar a quantidade do íon estocado no RE, pois, na presença dessa droga, ocorre liberação do Ca2+ compartimentalizado nessa organela. Para avaliar o Ca2+estocado nos compartimentos, foi adicionada a tapsigargina (2 µM) nas fatias cerebrais e seu efeito registrado por 10 minutos.
3.4.3 Efeito do FCCP
O FCCP (“p-trifluoromethoxy carbonyl cyanide phenyl hydrazone”) (2,5 µM), um protonóforo que dissipa o gradiente de potencial elétrico da mitocôndria, promove liberação de Ca2+ mitocondrial (descritos na seção 1.7). Para avaliar a capacidade mitocondrial de
tamponamento do Ca2+ o FCCP foi utilizado. Esse protonóforo dissipa o ∆Ψm, podendo
causar reversão da F0 F1 ATP-sintase e levar ao consumo severo e rápido de ATP. Para que as
células fiquem protegidas por um tempo maior, estes experimentos foram feitos na presença de oligomicina (100 µg/ml), um inibidor da F0 F1-ATPase, o que protege a célula de
consumos rápidos de ATP (NICHOLLS; BRAND, 1980; BUDD; NICHOLLS, 1996; SMAILI et al., 2000).
Como é possível que o FCCP conduza a uma despolarização nas membranas celulares, o que pode promover influxo de Ca2+ (MURCHISON; GRIFFITH, 1999) por canais de membrana, o CdCl2 (1 mM) foi posteriormente adotado como um bloqueador inespecífico
destes canais de Ca2+ (COLWELL; LEVINE, 1999). Os registros na presença de CdCl2 foram
3.5 Ensaio de imunofluorecência para receptores glutamatérgicos
Neste experimento, os cérebros foram imersos rapidamente em isopentano em contato com gelo seco, a uma temperatura de aproximadamente -30 ºC. O armazenamento desse material se deu a -70 ºC em freezer. No dia do experimento, foram feitos cortes coronais na região do estriado (10 µm) em criostato (a -20 ºC), sendo que estes permaneceram aderidos
em lâminas próprias para corte congelado (“superfrost”).
Após a secção dos tecidos, estes permaneceram uma hora para a secagem e para melhor aderência nas lâminas. Em seguida foi feita a fixação em solução paraformaldeído 2% (em PB 0,1 M) por 30 minutos. Após a lavagem (5X, 3 minutos cada) foi feito o bloqueio com H2O2 0,1% por 10 minutos, seguido novamente de lavagem. O bloqueio de proteínas
inespecíficas foi realizado com leite desnatado a 5%, por 12 horas, à temperatura ambiente. Após este procedimento, prosseguiu-se com a incubação com anticorpo primário anti-NMDAR subunidade 1 (Zymed/Invitrogen Co., CA, USA) ou anti-mGluR1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA) em BSA 1%, na diluição de 1:500. O tecido foi submetido a vários tempos de incubação, sendo estabelecido o período de 48 horas a 4 ºC como a melhor condição para uma boa marcação. Em seguida, incubamos o anticorpo secundário fluorescente TRITC (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA; Excitado em 520nm e com emissão em 580nm) por 3 horas à temperatura ambiente na diluição de 1:500 em BSA 1%. Concomitante à marcação dos receptores, foram feitas duplas-marcações, para células da glia com anti-GFAP (Molecular Probes, Eugene, OR, USA; conjugado com fluorocromo AlexaFluor® 488, excitado em 488 nm e com emissão em 520 nm), na diluição de 1:500. Os núcleos foram corados com 1 µg/ml de Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA;
excitado em 350 nm e com emissão em 450 nm). Por fim, os tecidos foram tratados com cloreto de CuCl2 (10 mM, em tampão acetato de sódio 5 mM), para reduzir a
autofluorescência devido à presença de lipofuscina, principalmente nos animais senescentes (SCHNELL et al., 1999). Foram feitos controles negativos em todos os experimentos, em que os tecidos foram incubados com BSA 1% na ausência do anticorpo primário.
escaneamento e fatiamento óptico no eixo “z” com fatias de 1 µm e assim foi obtida uma série
de imagens que foram convertidas em projeção com intensidade média, obtendo uma única imagem. A análise de fluorescência foi feita com o programa Spectralyser. Os experimentos foram feitos utilizando os mesmos parâmetros de ganho e pinhole do confocal. A sobreposição das marcações foi feita em programa Photoshop (versão 7.0., Adobe, CA, USA).
3.6 Medidas do potencial elétrico mitocondrial (
∆Ψ
∆Ψ
∆Ψ
∆Ψ
m)
Para realizar as medidas de ∆Ψm nas fatias de cérebro foi utilizada a microscopia
confocal, que permite a eliminação dos planos não focais e melhor visualização dos planos em foco. Com isto há maior nitidez nas observações dos detalhes, tais como as mitocôndrias, especialmente em tecidos de maior espessura. O equipamento (Zeiss LSM-510 META, Carl Zeiss, NY, USA) é dotado de um sistema de laser de varredura que excita o fluoróforo da amostra fazendo com que este emita uma luz que é projetada para um orifício (pinhole), cuja função é de bloquear os feixes vindos dos planos não-focais e permitir a passagem da luz refletida dos planos em foco.
Para realização destes experimentos, as fatias foram carregadas por 30 minutos à temperatura ambiente com 250 nM de TMRE (“tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate”). Esse é um indicador lipofílico e catiônico, excitado com laser Hélio/Neônio a um comprimento de 540 nm e que emite a fluorescência em 580 nm, coletada a partir sistema de espelhos e tubo fotomultiplicador. No processo de respiração mitocondrial, ocorre o bombeamento de prótons a partir dos complexos I, III e IV da CTE, que gera um gradiente eletroquímico. Este gradiente favorece a entrada e acúmulo do fluoróforo TMRE. Em baixas concentrações, o TMRE apresenta pouca toxicidade e praticamente não se liga a proteínas da matriz (SCADUTO; GROTYOHANN, 1999), o que o torna um excelente indicador para medidas dinâmicas do ∆Ψm.
Os experimentos foram iniciados com a aquisição da fluorescência basal seguida da adição de glutamato (1 mM), cujo efeito foi observado por 20 minutos, a 37 ºC. Desta forma, foi possível avaliar a saída do indicador da mitocôndria para o citoplasma, o que nos dá uma estimativa da perda do ∆Ψm (LOEW, 1993). No intervalo de tempo considerado, o glutamato
queda de fluorescência analisada em 50 mitocôndrias randomicamente selecionadas de acordo com a sua visibilidade e isolamento. Os dados foram normalizados levando em consideração a fluorescência inicial e final do sistema. Todos os experimentos foram feitos utilizando os mesmos parâmetros de ganho e pinhole do confocal.
3.7 Medidas da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs)
Neste caso, as fatias foram carregadas com 5 µM de CM-H2DCFDA
(“5-(and-6)-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester”) em banho a 37 ºC por 45 minutos, juntamente com o TMRE por 30 minutos adicionais, à temperatura ambiente. O CM-H2DCFDA é uma molécula lipofílica e, uma vez dentro das células, sofre ação das
esterases. É oxidada a 2’,7’-diclorofluoresceína (DCF) na presença de espécies reativas, especialmente as EROs (VOWELS et al., 1995), sendo que o produto é altamente fluorescente. De cada experimento foi extraída a fluorescência basal. As imagens foram coletadas a cada 2,5 minutos, à 37 ºC. Foram adicionados 1 mM de glutamato que, por elevar a concentração de Ca2+, estimula a captação de Ca2+ pela mitocôndria e aumenta a produção de EROs (CASTILHO et al., 1999; GUNTER et al., 2000). Para aquisição das imagens, foi utilizada microscopia confocal com sistema META (laser de Argônio/Criptônio) sendo o fluoróforo excitado em 488 nm e emitindo em 505 nm. Os parâmetros gerais de ganho e pinhole foram semelhantes aos utilizados com o TMRE.
3.8 Avaliação do estado funcional dos complexos da CTE
As medidas de consumo de O2 foram realizadas em oxígrafo (OXYG2, Hansatech
Instruments, Norfolk, England), que possui um eletrodo tipo Clark acoplado a um sistema analógico e a um computador para registro. Com a aplicação de uma pequena voltagem, o O2
se difunde e é reduzido a H2O no eletrodo de platina. O circuito se completa quando ocorre a
redução da prata pela ação do K+, liberando um elétron, que é medido. A corrente gerada é proporcional à quantidade de O2 do meio.
Para realização do experimento, fatias (400 µm) de cérebro foram feitas em vibrátomo,
macerado foi então adicionado em uma cubeta aquecida (37 ºC), em contato com os eletrodos. Um intervalo de 10-15 minutos foi necessário para estabelecer um equilíbrio do tecido em seu novo ambiente, dado que o aparelho é muito sensível. Após o início dos registros, foi adquirida uma linha de base por 5 minutos (com queda constante do sinal) seguido da adição do agente inibidor da CTE a ser testado. Foram utilizados os agentes inibidores dos complexos I (rotenona), II (3-NP – ácido 3-nitropropiônico) e III (antimicina A) da CTE e as medidas realizadas por cerca de 10 minutos. Foram testadas diferentes concentrações dos inibidores nos experimentos com animais jovens, sendo encolhidas aquelas que promoveram uma inibição parcial no consumo de O2, para que pudessem ser comparadas aos senescentes.
A aquisição e a análise da taxa de consumo de O2 foram obtidas com recursos do
programa Oxygraph Plus (Hansatech Instruments, Norfolk, England), que é baseada na razão da variação da quantidade de O2versus o tempo. A partir destes valores, é possível fazer uma
porcentagem do consumo de O2 em relação aos valores basais e comparação das percentagens
de inibição induzidas por cada agente utilizado.
3.9 Microscopia eletrônica de transmissão
Os animais jovens e senescentes foram submetidos a procedimento de perfusão para se obter uma melhor fixação do material. Os animais foram anestesiados com halotano 4%, entubados, conectados a um respirador mecânico e tiveram a caixa torácica aberta. Uma agulha ligada a uma bomba de perfusão (Easy – load model 7518-60, Masterflex pump controller , Cole Parmer, IL, USA) foi introduzida no ventrículo esquerdo e para a perfusão de 100ml de fixador (2,5% glutaraldeído Merck, 2% formaldeído) a um fluxo contínuo de 15 ml/min. Os animais foram decapitados e as cabeças permaneceram por 24 horas em fixador até serem submetidas ao procedimento de retirada do cérebro.
inclusão (1:1), em constante agitação por 1 hora. Cortes finíssimos (0,5 µm) em
ultramicrótomo Sorvall (modelo Porter-Blum MT-1) foram selecionados por meio de observação em microscópio de luz e submetidos a cortes ultrafinos (60 nm), coletados em malha de cobre e contrastados com acetato de uranila (a 2%, por 5 minutos), lavados em água destilada e tratados com citrato de chumbo (5 minutos). As eletromicrografias deste material foram feitas em microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM-900, 80kV (Carl Zeiss, NY, USA).
3.10 Marcação de células apoptóticas
Foram feitas fatias espessas de aproximadamente 2 mm em vibrátomo, lembrando que o líquido nutritivo é suplementado com altas concentrações de sacarose para prevenir danos neuronais. Os tecidos foram fixados em paraformaldeído 4% (por 24 horas) e incluídos em parafina. Cortes foram feitos em micrótomo (5 µm), aderidos em lâminas previamente
silanizadas e submetidos ao método do TUNEL (“terminal dUTP nick end labeling”), baseado na ligação do nucleotídeo ao terminal 3’-OH do DNA fragmentado (kit Apop Tag Plus, Chemicon, CA, USA).
Inicialmente, os cortes foram desparafinizados em xilol seguidos de passagens graduais de etanol absoluto (100% - 100% - 95% - 70%) e lavagem em água deionizada. As lâminas foram incubadas com enzima proteinase K (por 15 minutos) para permeabilizar a membrana nuclear. Após uma lavagem em água, foram incubadas em peróxido de hidrogênio 1% (durante 20 minutos), para esgotar a peroxidase endógena. Foram então lavadas em tampão PBS e colocadas em solução “tampão de equilíbrio” (fornecido pelo kit) por 10 minutos. A seguir, as lâminas foram incubadas com enzima TdT (“terminal deoxinucleotidyl transferase”) em “tampão de reação” (fornecido pelo kit) à 37 ºC por 1 hora. O “stop buffer” (fornecido pelo kit), um inibidor da TdT, foi adicionado por 15 minutos antes da aplicação do anticorpo anti-digoxigenina-peroxidase. O substrato 3.3’-diaminobenzidina (DAB 0,5%) foi adicionado à preparação, reagindo com a peroxidase conjugada ao anticorpo. Depois de lavados, os cortes foram contracorados com hematoxilina de Carazzi rapidamente. Após a desidratação e diafanização, as lâminas foram montadas com Entelan.
