Estudo da fosfatase alcalina sérica e formas isodinâmicas na esquistossomose mansônica.

Texto

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ESTUDO DA FOSFATASE ALCALINA SÉRICA E FORMAS

ISODINÃMICAS NA ESQUISTOSSOMOSE MANSONICA *

O estudo das form as isodinâm icas da fosfatase alcalina sérica em pacientes esquistossom á-ticos, revelou m odificações de suas propriedades físico -q u ím ica s na fase hépato in te s tin a l e hepatosplê-nica compensada e descompensada, com parando-se com as da fosfatase alcalina sérica de in d ivíd u o s considerados com o norm ais. P or filtra ç ã o m ole cu la r em Sephadex G—2 0 0 fo i possível separarar três (3) form as m oleculares d istin ta s de fosfatase alcalina sérica na esquistossom ose m ansônica hepatosplê-nica compensada e descompensada, duas das quais se apresentaram com o term orresistentes, d ife rin d o das equivalentes form as isodinâm icas de soro n orm al, que são term olábeis. Na fase hépato in te s tin a l da esquistossom ose m ansônica, em pregando a mesma m etodologia, fo i detectada uma única form a da fosfatase alcalina, te rm o lá b il, que parece corresponder à p rim e ira form a isodinâm ica do soro norm al. F o i tam bém realizado um estudo das dife re n te s form as m oleculares de fosfatase alcalina humana de: fíg a d o , in te s tin o delgado, osso e placenta provenientes de tecidos considerados norm ais, bem com o do

e x tra to de S chistosom a m ansoni.

IN T R O D U Ç Ã O

A fosfatase alcalina sérica fo i id e n tific a d a em 1 9 2 6 1 p o r M a rtla n d e R o bison m u ito em bora já se conhecesse n o u tro s te c id o s anim ais e vegetais. A s m aiores c o n trib u iç õ e s c ie n tífic a s o co rre ra m na década de c in q ü e n ta , q u a n d o fo i p u rific a d a e isolada a enzim a de soro h u m a n o 2 - 6 . Poste­ rio rm e n te , fo ra m estudadas as propriedades fís ic o -q u ím ic a s e c o m p o rta m e n to c in é tic o da fosfatase alcalina sérica; c o m o ta m b é m o seu estudo em órgãos a nim ais ta is c o m o : F íg a d o , in te s tin o delgado, osso, pla centa e rim . Os resultados o b tid o s fo ra m com parados co m os estudos da fosfatase a lcalina sérica de diversos anim ais situados na escala zooló g ica e, m a n tiv e ­ ram um padrão de constância 6 _ 2 4 > 2 9, 3 0 , o que im p lic a ser a fostatase a lcalina sérica o rig i­ nária da liberação das fo s fo h id ro la se s integrantes dos re fe rid o s órgãos.

D u ra n te a década de sessenta a m e to d o lo g ia a n a lític a fo i aperfeiçoada p e rm itin d o o em prego da e le tro fo re se em gel de p o lia c rila m id a e filt r a ­ ção m o le c u la r em colu n a de Sephadex para o estudo da enzim a te n d o c o m o re sultado a inden- tific a ç ã o de pequenos co m p o n te n te s da fosfatase alcalina 6 ' 2 5 - 2 8

Moss 25 conseguiu id e n tific a r a fosfatase alca­ lina hepática q u a n d o separada em eletroforese gel de p o lia c rila m id a apresentava três frações que m igravam co m a tra n s fe rrin )3 g lo b u lin a , a j3 lipo- p ro te in a e o í 2 g lo b u lin a em o rd e m decrescente de massa m o le cu la r respectivam ente. Porém a fosfatase alcalina renal e a in te s tin a l apresenta­ vam apenas um a fo rm a e nzim ática.

A n o m e cla tu ra em pregada na denom inação das frações Com a tivid a d e e nzim ática após sepa­ ração em e le tro fo re se em gel de p o lia c rila m id a ou filtra ç ã o m o le c u la r p e lo S ephadex, é m u ito c o n ­ tro v e rtid a . A n o m e n cla tu ra das m ú ltip la s form as

* Resumo da tese que fo i apresentada ao D epartam ento de M edicina T ro p ica l do C entro de Ciências da Saúde

da U niversidade F ederal de Pernam buco para obtenção do grau de M estre.

* * M estre em M edicina T ro p ica l — P ro l? C olaboradora da D iscip lin a de M edicina T ro p ica l da Universidade

F ederal de Pernam buco.

( * ) A tese fo i orientada p e lo P rofessor D r. L u iz Gonzaga de Azevedo A c c io ly , Chefe de L a b o ra tó rio de Enzim

o-logia do D epartam ento de B io q u ím ica do C entro de Ciências B iológicas da UFPe.

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das enzim as fo i d e fin id a em 1 9 7 1 31 pela C o m is­ são de N o m e n cla tu ra de B io q u ím ic a (C B N ) da U nião In te rn a c io n a l de Q u ím ic a Pura e A p lic a d a (IU P A C —IU B ).

Neste tra b a lh o as frações co m d ife re n te s p ro ­ priedades fís ic o -q u ím ic a s encontradas nos soros hum anos estudados serão d e n om inadas de fo rm a s isodinâm icas de fostadase alcalina.

A hiperfosfatasem ia na esquistossom ose man- sônica te m sido relatada na lite ra tu ra desde 1 9 7 5 32, porém a investigação d o c o m p o rta ­ m e n to das fo rm a s isodinâm icas nesta p a to lo g ia ainda não fo i descrita na lite ra tu ra m édica. Justifica-se p o rta n to este estudo pela possível co n trib u iç ã o ao c o n h e cim e n to das m o d ifica çõ e s b io q u ím ica s decorrentes desta doença, fo rn e ­ cendo, deste m o d o m elhores su b síd io s a novas orientações diagnósticos e terapêuticas.

O presente tra b a lh o se p ro p õ e a estudar as alterações que o c o rre m co m a fosfatase alcalina sérica e fo rm a s isodinâm icas em pacientes com esquistossom ose m ansônica nas fases hépato in te s tin a l e hépato esplênica com pensada em des- com pensada; com parando-se com um g ru p o tes­ te m u n h o considerado n o rm a l.

M A T E R IA L

A fosfatase alcalina sérica fo i dosada em soro hum ano o b tid o d o sangue to ta l após c e n trifu - gação refrigerada d u ra n te dez m in u to s a I.OOOxg. O sangue co le ta d o era de in d iv íd u o s q ue se enquadrava nos grupos d e n tro da p a to lo g ia da esquistossomose m ansônica. Os grupos apresen­ tavam in d iv íd u o s num a fa ix a e tá ria de 2 0 a 5 0 anos. Os pacientes deveriam apresentar o pré- re q u isito de não te r o u tra p a to lo g ia associada à esquistossomose m ansônica.

G R U P O A — In d iv íd u o s sem esquistossom ose m ansônica o u o u tra p a to lo g ia que venha m o d ifi­ car o m e ta b o lism o h e pático.

G R U PO B — In d iv íd u o s p o rta d o re s de esquis­ tossom ose m ansônica h é p a to in te s tin a l, isto é, sem viscerom egalia e sem sintom as c lín ic o s .

G R U P O C — In d iv íd u o s p o rta d o re s de esquis­ tossom ose m ansônica hépato esplênica co m p e n ­ sada podendo ser um p a ciente que se re cuperou de uma descompensação o u então nunca te r des- com pensado.

G R U P O D — In d iv íd u o s p o rta d o re s de esquis­ tossom ose m ansônica h é p a to esplênica descom - pensada p o dendo ser o q u a d ro c lín ic o co m ascite e /o u hem orragia g a strentestinai.

A fosfatase alcalina p ro ve n ie n te d o fíg a d o , in te s tin o delgado, osso, pla centa e

Schistosoma

mansoni

— verm e a d u lto — ta m b é m fo ra m inves­ tigadas e os resultados com p a ra do s co m aqueles o b tid o s da enzim a soro ló g ica dos g ru p o s analisa­ dos. A m o stra s destes órgãos fo ra m p ro ve n ie n te s de c iru rg ia de pacientes não e sq u istossom ático e, o m a te ria l p la c e n tá rio c o lh id o logo após o d e liv ra m e n to , os verm es a d u lto s d o

Schistosoma

mansoni

p ro v ie ra m de um a filtra ç ã o hepática e x tra corpórea.

Os reagentes q u ím ic o s u tiliz a d o s para separar, dosar a a tiv id a d e e n zim á tica da fosfatase alcalina sérica e suas fo rm a s isodinâm icas e, d e te rm in a çã o da massa m o le c u la r fo ra m : Sephadex G —2 0 0 p a rtíc u la 4 0 —12 0 d o P harm acia; A m id o d o Reagen; Á c id o 3 ,5 , d in itro s a lis ílic o d o N u tritio - nal B io ch e m ica ls e os dem ais o b tid o s de E. M e rk D a rm sta d t.

M E T O D O L O G IA

A — Separação de frações isodinâmicas de fos­

fatase alcalina sérica m ediante filtração m olecular

em Sephadex G—200.

Procedeu-se à separação das fo rm a s iso d in â ­ micas da fosfatase alca lin a m e d ia n te filtra ç ã o m o le c u la r em co lu n a de S ephadex G —2 0 0 m e­ d in d o 15 X 7 5 m m de dim ensões: A plica n d o -se 2 ,0 m l d o soro em estudo e em pregando-se água d e stilada co m eluente. Frações de 3 ,5 m l fo ra m coletadas d u ra n te o processo co m o a u x ílio de um c o le to r de frações L K B e preservados em te m p e ra tu ra de 0 —4 ? C.

B — Determ inação da atividade enzimática.

F o i u tiliz a d o o m é to d o de Bessey, L o w ry , B ro c k 33 para d e te rm in a r a a tiv id a d e e n zim á tica da fosfatase alcalina sérica e das frações coletadas d u ra n te a filtra ç ã o m o le c u la r em S ephadex, co m a seguinte m o d ific a ç ã o :

S olução ta m p ã o : g lic in a , NaOH 5 0 m M , pG 10 ,5 c o n te n d o M gC I2 0 ,5 m M .

S olução s u b stra to ta m p ã o : 1 c o m p rim id o d o su b stra to (p a ra n itro fe n ifo s fa to 5 ,5 m M ) d is so lvid o em 10 m l da solução ta m pão. Incuba-se em um a cu b e ta de q u a rtz o (tra je to ó p tic o de 1 cm ) a 3 6 ? C 2 ,0 m l d o su b stra to ta m p ã o e 0 ,5 m l da solução ta m p ã o . E stabele­ c id o o e q u ilíb r io té rm ic o 0,1 m l d o soro o u da fra çã o co letada é a d ic io n a d o ao sistem a e a absorbancia n o c o m p rim e n to de o nda de 4 0 5 nn fo i registrada a a tiv id a d e e n zim á tica co m o a u x í­

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m ente m e d ia n te tra ta m e n to té rm ic o de 100?C p o r 5 m in u to s.

A la b ilid a d e té rm ic a das frações isodinâm icas fo i investigada segundo tra ta m e n to té rm ic o de 56?C d u ra n te 10 m in u to s .

A s am ostras dos te cid o s ta is c o m o placenta, fíg a d o , in te s tin o delgado e pe rió ste o hum ano fo ra m hom ogeneizados em solução ta m p ã o e, do sobrenadante fo ra m c o lh id o s 2 ,0 m l aplicados no to p o de um a co lu n a de S ephadex G - 2 0 0 para filtra ç ã o m o le c u la r sem elhante à m e to d o lo g ia empregada para a separação da fosfatase alcalina sérica, já d escrita a n te rio rm e n te . Para o estudo do

Schistosoma mansoni

fo ra m u tiliz a d o s 1 .356 vermes a d u lto s os quais fo ra m hom ogeneizados em solução ta m p ã o e, d o sobrenadante 2 ,0 m l fo ra m aplicados no to p o de um a co lu n a Sepha­ dex G —2 0 0 ; procedendo-se de ora em d ia n te de m o d o sem elhante aos semais te c id o s estudados.

Para d e te rm in a r a massa m o le c u la r das fo rm a s isodinâm icas 1, 2 e 3 da fosfatase a lcalina sérica fo i u tiliz a d o o m é to d o de A n d re w s 3 4 , usando co m o padrões a catalase e a a m ila s e .

A a tiv id a d e catalásica fo i d e te rm in a d a em pre- gando-se o m é to d o m o d ific a d o de A c c io ly e M elo 35 e n q u a n to qu e a (X am ilásica fo i pro ce d i da c o n fo rm e m e to d o lo g ia d e scrita p o r Beni- fe ld 36 .

R E S U L T A D O S

O H istogram a 1 e x e m p lific a um dos resultados o b tid o s co m a filtra ç ã o m o le cu la r em Sephadex G —2 0 0 de fosfatase alcalina de soro n o rm a l, a Tabela resum e os resultados da a tivid a d e da fo s ­ fatase a lcalina to ta l e fo rm a s isodinâm icas estuda­ dos no g ru p o n o rm a l.

A s fo rm a s isodinâm icas qua n d o subm etidas ao tra ta m e n to té rm ic o apresentaram uma redução de 44% para o p rim e iro p ic o e de 100% para o segundo e te rc e iro picos.

N o estudo da a tivid a d e e n zim á tica da fo sfa ­ tase a lcalina e fo rm a s isodinâm icas em soro de pacientes co m esquistossom ose m ansônica na fase hé p a to in te s tin a l, c o m o e xe m p lific a d o no H istogram a 2, fo i d e te cta d o apenas uma fo rm a iso d inâm ica da enzim a, e o corre sp o nd e n te tra ta ­ m e n to té rm ic o re su lto u em um a redução de 56% . Estes resultados estão apresentados na T abela II. E stu d a n d o o soro de paciente com esquistossom ose m ansônica hepatosplênica co m ­ pensada a a tivid a d e da fosfatase alcalina e suas fo rm a s isodinâm icas e o seu respectivo tra ta ­ m e n to té rm ic o , c o m o apresenta o H istogram a 3; observam os o a p a re cim e n to das trê s fo rm a s iso­ d inâm icas da fosfatase alcalina.

A Tabela III resum e os dados d o g ru p o em estudo. O c o m p o rta m e n to té rm ic o destas resul­

Tabela I

E studo da F A S e suas fo rm a s, isodinâm icas em soro no rm a l

1? p ico m ll/m l 2? p ico m U /m l 3 ? p ico m U /m l N W I V I C

E A R% E A R% E A I

1 OPB F 29,25 10,5 6,6 40 6,45 0 100 4,95 0 100

2 LC M 21,0 4,5 1,95 50 2,25 0 100 1,5 0 100

3 L F 39,0 9,0 4,5 50 3,0 0 100 2,7 0 100

4 CB M 43,5 11,25 4,5 60 4,50 0 100 4,5 0 100

5 MLS F 48,0 0 ,0 4,5 30 6,0 0 100 3,0 0 100

6 A M F 48,0 12,0 ü,G 30 4,5 0 100 6 0 100

7 EM O F 25,5 19,5 3,0 80 13,5 0 100 3,0 0 100

8 C M 31,5 25,5 16,5 30 19,5 0 100 19,5 0 100

9 J M 25,5 16,5 10,5 40 22,5 0 100 9,0 0 100

10L F 48,0 6,0 4,5 30 6,0 0 100 3,0 0 100

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to u num a redução de 37 ± % para o p rim e iro pico, o segundo de 2 3 ± % e, o te rc e iro p ico não sofreu redução da a tivid a d e e nzim ática.

0 H istogram a 4 refere-se ao estudo da fo s fa ­ tase alcalina e sjjas fo rm a s isodinâm icas no soro de um paciente com esquistossom ose m ansônica na fase hepatosplênica descom pensada co m o correspondente tra ta m e n to té rm ic o . A Tabela IV reune os dados d o re fe rid o g ru p o . Nesta fase da esquistossomose m ansônica observam -se nova­ m ente as três fo rm a s isodinâm icas de fosfatase alcalina. 0 c o m p o rta m e n to té rm ic o destas fra ­ ções revelou que o p rim e iro p ico so fre u uma

redução de 55 ± %; o segundo e o te rc e iro pico um a redução de 5 ± %.

O H istogram a 5 apresenta o re su lta d o da a tiv i­ dade e n zim á tica da fosfatase alcalina d o verm e a d u lto o q ual apresenta apenas um p ic o , que não sofreu redução de sua a tiv id a d e e n zim á tica , após tra ta m e n to té rm ic o de 5 6 ? C d u ra n te 10 m in u to s .

O H istogram a 6 é o re su lta d o d o e studo em e x tra to de fíg a d o h u m a n o o n d e as três fo rm a s isodinâm icas fo ra m isoladas, sendo a redução da a tiv id a d e e n zim á tica em to rn o de 7 0 ± % para o p rim e iro p ic o , e n q u a n to o segundo e o te rc e iro

H istog ra m a 1

E stu d o da a tiv id a d e da F A e suas fo rm a s isodinâm icas em so ro n o rm a l

m U /m l

100

90

80

70

60

5 0

4 0

3 0

-20

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

E stu d o da a tiv id a d e e n zim á tica após tra ta m e n to té rm ic o 5 6 ° C / 10 m in u to s

(Frações 3,5 m l)

picos sofreram redução de 100% em suas a ti­ vidades.

O H istogram a 7, re fe re n te a fosfatase alcalina e form as isodinâm icas do in te s tin o delgado hum ano, apresenta as três fo rm a s isodinâm icas e que, sum etidas a

tratam ento

té rm ic o , apresenta­ ram uma redução de 3 0 ± % pará o p rim e iro pico e de 100 ± % para o segundo e te rc e iro picos.

Os resultados d o estudo da fosfatase a lcalina e form as isodinâm icas em osso hum a n o estão no H istogram a 8, reveland apenas um a

form a

isodi- nâmica com um c o m p o rta m e n to té rm ic o cuja

redução da a tivid a d e e n zim á tica fo i de 8 5 ± % . O H istogram a 9, alusivo aos estudos da fosfatase alcalina e fo rm a s isodinâm icas em placenta hum ana, revela apenas um a fo rm a isod in â m ica da fosfatase alcalina e que q u a n d o su b m e tid a a tra ­ ta m e n to té rm ic o sofreu redução de a tiv id a d e em to rn o de 2 0 ± %.

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Tabela II

E studo da F A S e suas fo rm a s isodinâm icas na E M H I

NOM E S E X O

1? p ico m U /m l 2? pico m U /m l 3? pico m U /m l

E A . R% E A R% E A R%

1 NB F 3 1 ,5 1 0,5 0 100 — — — — — —

2 JO M 3 1 ,5 6 ,3 1,5 80 - - -

-3 VS F 3 1 ,5 7,5 3 ,7 5 50 - - -

-4 JL F 141,0 4 7 ,0 6,0 90 - - -

-5 MJS F 141 ,0 4 8 ,0 6 ,0 90 _ - -

-6 E F 27,0 7,5 6,0 20 - - -

-7 JG M 3 1 ,5 8 ,2 5 4 ,5 50 - - -

-8 ES F 27,0 7,5 6 ,0 20 _ - -

-9 M L F 6 9 ,0 3 4 6 22,5 10 - - -

-10 A R M 3 1 ,5 8 ,2 5 4 ,5 50 - - - - -

-FA S — Fosfatase A lc a lin a Sérica F A — Fosfatase A lc a lin a E — Fração e n co ntra d a no soro A — Fração aquecida a 5 6 °C — lo m in . R% — Redução s o frid a após o aq u ecim e n to

H istog ra m a 2

E stu d o da a tiv id a d e da F A e suas fo rm a s isodinâm icas em so ro de p acie nte c o m E M H I

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Vol. XV - NPs 1 - 14

H istog ra m a 3

E stu d o da a tiv id a d e da F A e suas fo rm a s is odinâm icas e m so ro de p acie nte c o m E M H E com pensada

E stu d o da a tiv id a d e e n z im á tic a após tra ta m e n to té rm ic o 5 6 ° C / 10 m in u to s

Tabela Ml

E studo da F A S e suas fo rm a s isodinâm icas na E M H E com pensada

Paciente Sexo F A to ta l m U /m l

1o p ico m U /m l 2 o pico m U /m l 3 o pico m U /m l

E A R% E A R% E A R%

1 SA M 3 1 ,5 7,5 4 ,5 30 2,1 1,5 20 3,2 0

2 M M P M 2 9 2 ,5 4 2 ,0 2 2 ,5 50 6 ,5 4 ,2 30 2,1 2,1 0

3 G CA M 75,0 19,5 15,0 30 6 ,0 4 ,0 30 2,1 2,1 0

4E S S M 3 6 ,0 7,5 6,0 10 2,4 1,8 3 0 2,4 2,4 0

5 JRS M 9 7 ,5 18,0 13,5 30 3,9 3,0 20 1,8 1,8 0

6 JLS M 159 ,0 25,5 15,0 40 3,9 3,9 0 1,5 1,5 0

7 JR M 1 4 2 ,5 2 8 ,5 15,0 5 0 . 18,0 6 ,0 70 7,2 7,2 0

8 A F G M 6 7 ,5 12,0 7,5 40 2,7 2,7 0 3,3 3 ,3 0

9 FJS M 2 9 0 ,0 4 1 ,0 4 0 ,0 50 6 ,0 4,0 30 2,1 2,1 0

10 RS M 1 50,0. 25,0 14,5 40 4 ,0 4,0 0 1,5 1,5 0

F A S — Fosfatase A lc a lin a Sérica F A — Fosfatas A lc a lin a

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Tabela IV

E studo da F A S e suas fo rm a s isodinâm icas na E M H E descompensada

Paciente Sexo F A to ta l m U /m l

1o p ico m l> /m l 2? p ico m U /m l 3? pico m U /m l

E A R% E A R% E A R%

1 JJB M 1 4 8 ,5 3 9 ,7 5 19 ,85 50 4 9 ,5 2 4 ,8 50 4 9 ,5 4 9 ,5 0

2 L 3 M 8 2 ,5 24 ,7 5 12,75 50 9,3 3,57 60 3,6 3,6 0

3 JB M 52,5 27,0 14,5 50 1,8 1,05 50 2,4 1,65 30

4 A T F 3 7 ,5 4 ,5 3,0 30 3,0 2,25 20 3 ,0 3,0 0

5 JA F 42 ,0 7,5 3 ,7 5 50 3,0 3,0 0 3 2,2 5 20

6 R PA M 168,0 73,5 15,0 80 6 3 ,0 6 3 ,0 0 12,0 12,0 0

7 G F N M 147,0 4 6 ,5 7,5 80 4 8 ,0 13,5 70 55,5 55,5 0

8 DSV M 199 ,5 6 3 ,0 4 8 ,0 20 3 4 ,5 16,5 50 27,0 24,0 10

9 MJP M 175 ,5 4 8 ,0 6 ,0 80 10,5 6 ,0 40 52,5 52,5 0

1 0 A A S M 8 5 ,5 16,5 6 ,0 6 0 4 ,5 4 ,5 0 6 ,0 6 ,0 0

FA S — Fosfatase A lc a lin a Sérica F A — Fosfatase A lc a lin a E — Fração e n contrada no soro A — Fração aquecida a 5 6 °C — lo m in .

R% — Redução so frid a após o aq u ecim e n to

H istog ra m a 4

E stu d o da a tiv id a d e da F A e suas fo rm a s isodinâm icas em so ro de p acie nte c o m E M H E descom pesada

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Vol. XV - NPs 1 - 14

H istog ra m a 5

E stu d o da a tiv id a d e da F A e suas fo rm a s isodinâm icas em e x tr a to Schistosoma m osoni

E stu d o da a tiv id a d e e n z im á tic a após tra ta m e n to té r m ic o 5 6 ° C / 1 0 m in u to s

H istog ra m a 6

E stu d o da a tiv id a d e da F A e suas fo rm a s isodinâm icas em e x tr a to de fíg a d o h um an o

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H istog ra m a 7

E stu d o da a tiv id a d e da F A e suas fo rm a s is odinâm icas em e x tr a to de in te s tin o delg ad o h u m an o

E stu d o da a tiv id a d e e n z im á tic a após tra ta m e n to té rm ic o 5 6 ° C / 10 m in u to s

H istog ra m a 8

E stu d o da a tiv id a d e da, F A e suas fo rm a s isodinâm icas em e x tra to ósseo h u m a n o

1 0 0•

90

8 0 -

7 0 -

60 .

5 0 -

4 0 •

3 0 -

2 0-

1 0

-0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 3 .1 4 15 16 17 (Frações 3,5 m l)

(10)

UO

G

m

m

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Vol. XV - NPs 1 - 14

Histograma 9

Estudo da atividade da FA e suas formas isodinâmicas em extrato de placenta humana

E stu d o da a tiv id a d e e n z im á tic a após tra ta m e n to té r m ic o 5 6 ° C / 10 m in u to s

Figura 1

D e te rm in a çã o da massa m o le c u la r das fo rm a s isodinâm icas da FA S de pacientes na fase E M H E descom pensada

L E G E N D A

C A T — Catalase

F A j — Fosfatase A lc a lin e 1? fo rm a isodinâm ica

a A M — O! A m iase

F A2 — Fosfatase A lc a lin e 2? fo rm a isodinâm ica F A3 — Fosfatase A lc a lin e 3 ? fo rm a isodinâm ica

2 ,4 X 1 0 3 F A ,

V O L . D E E L U IÇ Â O (m l)

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D IS C U S S Ã O

0 e stu d o da fosfatase alcalina sérica e suas fo rm a s isodinâm icas no g ru p o c o n tro le , dem o n s­ tro u a existê n cia de três fo rm a s isodinâm icas. A a tivid a d e e n zim á tica d o p rim e iro p ic o s u b m e tid o a tra ta m e n to té rm ic o sofre redução de 43,5% , assemelhando-se ao c o m p o rta m e n to da fo rm a isodinçam ica de m a io r a tiv id a d e d escrita na lite ­ ra tu ra 3 7 , e n q u a n to q ue o segundo e o te rc e iro picos so fre ra m redução de 100 ± %.

Nos pacientes co m esquistossom ose mansô- nica hépato in te s tin a l, a fosfatase a lcalina sérica, q u a n d o filtra d a em S ephadex, revelou apenas um p ico co m a tivid a d e e n zim á tica , co rre sp o nd e tn e ao p rim e iro p ic o e n c o n tra d o no g ru p o c o n tro le , um a vez qu e a sua e luição e c o m p o rta m e n to té r­ m ico são a p ro x im a d a m e n te correspondentes.

Os resultados o b tid o s co m o g ru p o de in d iv í­ duos com esquistossom ose m ansônica hepatos- plênica com pesada apresentaram três picos com a tivid a d e e n zim á tica s bastate elevadas, o qu e é c o m p a tív e l co m a elevação da a tiv id a d e en zim á ­ tic a to ta l d o s n ív e is séricos já d e s c rito na lite ­ ra tu ra 3 2 . A s reduções das ativid a d e s enzim áticas dos d ife re n te s picos, q u a n d o s u b m e tid o s a tra ta ­ m e n to té rm ic o , d e m o n stra ra m sensíveis m o d ifi­ cações em relação ao g ru p o c o n tro le , desde que o p rim e iro p ic o sofreu redução de 37 ± % d e s u a a tivid a d e , o segundo p ico reduziu-se em apenas 2 3 ± %, e n q u a n to qu e o te rc e iro p ico p ra tic a ­ m ente não so fre u redução de ativid a d e .

Investigando-se os pacientes co m esquistosso­ mose m ansônica hé p a to in te s tin a l e obedecendo ao rig o r c lín ic o la b o ra to ria l de seleção e m p re ­ gado na o b te n ç ã o d o m a te ria l , um paciente apresentou trê s fo rm a s isodinâm icas da posfatase alcalina sérica co m te rm o la b ilid a d e sem elhante às encontradas na esquistossom ose m ansônica hepa- to sp lê n ica com pensada, ver H isto g ra m a 10. Estes dados sugerem que em b o ra esse p a ciente esteja d e n tro d o g ru p o co m esquistossom ose m ansônica hepato in te s tin a l, de a co rd o co m os c rité rio s estabelecidos neste tra b a lh o , o estudo de sua fo s ­ fatase a lcalina sérica e fo rm a s isodinâm icas (em pregando a presente m e to d o lo g ia ) sugere já e x is tire m alterações c o m p a tív e is co m a esquistos­ somose m ansônica h e patosplênica com pensada. N o g ru p o de pacientes co m esquistossom ose m ansônica h e patosplênica descom pensada, as trê s fo rm a s isodinâm icas da fostatase alca lin a sérica co m p o rta ra m -se de m o d o sem elhante ao obser­ vado para o g ru p o co m esquistossom ose m ansô­ nica com pensada.

C onsid e ra n d o a h ipótese de qu e os níve is séricos da fosfatase alca lin a dos pacientes com esquistossom ose m ansônica, com pensada o u

descom pensada, pudessem ser in flu e n cia d o s pela p a rticip a çã o de enzim a d o

Schistossoma

manso-n i,

o estudo de a tividadade e n zim á tica da fo s­ fatase alcalina no e tra to de verm e a d u lto , a que se p rocedeu, d e m o n s tro u ser ta l evento a ltam ente im p ro vá ve l, em face d o d ife re n te c o m p o rta m e n to té rm ic o apresentado p o r esta enzim a, c o n fo rm e pode ser observado no H istogram a 5. A lé m do m ais, se o e x te rm ín io dos 1 .3 5 6 verm es o c o r­ ressem sim u lta n e a m e n te d e n tro d o hospedeiro, a a tiv id a d e e n zim á tica elevar-se-ia de apenas 0,1 m U /m l de sangue.

O e stu d o realizado nos diversos e x tra to s de órgãos tin h a c o m o o b je tiv o esclarecer a c o n tri­ b u içã o destas fosfatases alcalinas nos níveis sé­ ricos, co rre la c io n a n d o o c o m p o rta m e n to da fosfatase alcalina dos diversos órgãos co m a fosfatase a lcalina d o soro de in d iv íd u o s consi­ derados norm ais.

Os resultados o b tid o s co m o e x tra to de fíg a d o h u m a n o apresentam a fosfatase a lc a i;na hepática co m um c o m p o rta m e n to sem elhante à fosfatase alcalina sérica. O estudo co m o in te s tin o delgado h u m a n o apresenta resultados sem elhantes à fosfatase a lcalina hepática, no e n ta n to , a a tivi- vidade e n zim á tica é bem m e n o r na fosfatase a lcalina in te s tin a l com parando-se co m a atividade da fosfatase alcaina hepática. Os resultados da fosfatase a lcalina óssea d e m o n stra ra m apenas um a fo rm a isodinâm ica co rre sp o nd e n te à p rim e i­ ra fo rm a iso dinâm ica d o soro e, com uma a tiv id a d e e n zim á tica e resistência té rm ic a m u ito baixas, c o n fo rm e já re latado na lite ra tu ra p o r Posen

e t a lli

3 8 .

C om a fosfatase a lcalina placentária tam bém só fo i id e n tific a d a um a fo rm a isodinâm ica. P orém , com um a a tivid a d e e n zim á tica m u ito elevada e co m m a io r resistência ao tra ta m e n to té rm ic o com parando-se co m o p rim e iro p ico da fosfatase a lcalina sérica de in d iv íd u o s norm ais; R esultados .sem elhantes fo ra m d e scritos p o r Posen

e t a lli

3 8 .

F in a lm e n te vale ressaltar a pequena massa m o le cu la r das duas fo rm a s isodinâm icas, F j , e F 3, descritas neste tra b a lh o , que, em bora v e rifi­ cadas em pacientes co m esquistossom ose m ansô­ nica hepatosplênica descom pensada, eram c o in ­ cidentes com as fo rm a s F 2 e F 3 , verificadas com o g ru p o c o n tro le , c o m o po d e m ser depreendidos dos resultados o b tid o s d u ra n te o estudo da fosfatase alcalina sérica em Sephadex.

C O N C LU S Õ E S

(12)

Histograma 10

Estudo da atividade da F A e suas formas isodinâmicas em soro de paciente com EMHI

m U /m l

1 0 0 •

90

80 •

7 0 -

60 -

50

40

3 0 -

2 0-

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 ~ l V

Estudo da atividade enzimática após tratamento térm ico 5 6 ° C / 10 m inutos

(Frações 3,5 ml)

R

ev

.

S

o

c.

B

ra

s.

M

ed

.

T

ro

p

.

Vo

l.

XV

-

N

Ps

1

1

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13

hum ano, que fo ra m denom inadas F O R M A S IS O D IN Â M IC A S da fosfatase alcalina.

2. O n ú m e ro de pro p rie d a d e s fís ic o -q u ím ic a s das fo rm a s isodinâm icas apresentaram d is tri­ buição d is tin ta e ca ra cte rística s p ró p ria s nos sistemas estudados:

A — in d iv íd u o s norm ais S oro hum a n o

duas fo rm a s te rm o lá b e is E x tra to de fíg a d o idem

E x tra to de in te s tin o delgado idem

E x tra to de osso um a fo rm a te rm o lá b il E x tra to de placenta nenhum a fo rm a

B — In d iv íd u o s co m esquistossom ose m ansô­ nica

S oro de esq u isto sso m ó tico na fase hepato in te s tin a l

nenhum a fo rm a

S oro de e sq u isto sso m ó tico na fase h e patosplênica com pensada

dus fo rm a s te rm o rre siste n te s

S oro de esq u isto sso m ó tico na fase hepatosplênica descom pensada idem

3. O a u m e n to da fosfatase a lcalina sérica não é d e vid o à liberação da fosfatase alcalina d o p ró p rio verm e.

4. 0 n ú m e ro e a p ro p rie d a d e das fo rm a s iso­ dinâm icas independem da a tivid a d e da fosfatase alcalina sérica.

5. A massa m o le cu la r das fo rm a s isodinâm icas fo i estim ada em : F 2 13 X 1 0 3 d a lto n s e F 3 2 ,4 X 10 3 d a lto n s.

S U M M A R Y

T he s tu d y o f th e m u ltip ls fo rm a s o f serum a lk a lin e phosphatase in p a tie n ts w ith schisto- somiasis (he p a to in te s tin a l com pensated and decom pesated hepato sp le n ic) revealed m o d ific a - tio n s in th e ir p h ysico -ch e m ica l p ro p e rtie s. M o le ­ cu la r filt r a t io n w ith a S ephadex G —2 0 0 c o lu n separated th re e d is trin c t m o le c u la r fo rm s o f serum a lk a lin e phosphatase in p a tie n ts w ith h e p a to sp le n ic schistosom iasis m ansoni. T w o o f these fo rm s presented as th e rm o re s is ta n t, con- tra s tin g w ith th e e q u iva le n te m u ltp ls fo rm s in n o rm a l serum w h ic h are te rm o la b ile , In th e h e p a to in te s tin a l phase o f schistosom iasis m anso­ ni o n ly one th e rm o la b ile fo rm o f a lk a lin e phosphatase was isolated w h ic h co rra p a rd e d to tw e p rim a ry iso d y n a m ic fo rm in n o rm a l serum .

S tudies w ere also d one o n th e d iffe re n t m o le ­ c u la r fo rm s o f h u m a n a lka lin e phosphatase. F ro m live, sm all in te stin e , bone and placenta, o rig in a tin g fro m tissues considered as norm al, and fro m

Schistosoma mansoni

itself.

R E F E R Ê N C IA B IB L IO G R Á F IC A

1. M A R T L A N D , M. and R O B IS O N , R. Posible sig n ifia n ce o f hexosep h o sp h o ric esters in o s s ific a tio n V I P ho sp h o ric esters in b lo o d plasm a. B io ch e m . J. 2 0 , 8 4 7 , 1926. 2. M A L A M Y , M. H. and H O R E C K E R , B .L .

P u rific a tio n and c ry s ta liz a tio n o f the a lk a lin e phosphatase o f E. co li. Bioche- m is try 8, 1 898, 1954.

3. G H O S H , N .K . and F IS K M A N , W. H. Charac-te riz a tio n o f hum an placental alkaline phosphatase isoenzym es. Fed. Proc. 26, 5 5 8 , 1967.

4. G H O S H , N .K . and F IS K M A N , W .H . P u rific a ­ tio n and p ro p e rtie s o f m o le cu la r-w e ig h t variantes o f hu m a n placental a lkaline phosphatase. B io ch e m . J. 1 0 8 ,7 7 9 ,1 9 6 8 . 5. G H O S H , N .K . P u rific a tio n and m olecular p ro p e rtie s o f p lacental and inte stin a l a lk a lin e phosphatases. A n n . N .Y . Acad. Sei. 166, 60 4 , 1969.

6. A N ID O , G ., M C B E T H , C .H ., R O M E R O , P. Isoenzym es o f a lk a lin e Phoaphatase. Q U A D . Sclavo D iagn. 8, n? 1. 5 4 1 —553, 1972.

7. G H O S H , N .K ., G O L D M A N , S. S. and F IS K M A N , W .H . H u m a n p lacental a lka­ lin e phosphatase: A sia lo -p ro te in . Enzy- m o lo g ia 3 3 ,1 1 3 , 1967.

8. A H E M E D , Z . and K in g , E.J. P u rific a tio n o f p lacental a lk a lin e phosphatase. Biochem . B io p h ys. A c ta . 4 0 ,3 2 0 ,1 9 6 0 .

9. E A T O N , R .H . and Moss, D.W . Partial p u r ifi­ ca tio n and some p ro p e rtie s o f hum an bone a lk a lin e phosphatase. E nzym o lo g ia . 3 5 ,8 1 ,1 9 6 8 a .

10. S M IT H , J .K ., E A T O N , R .H ., W IT B Y , L.G . and MOSS, D .W . Large scale-gel filt r a ­ tio n in th e p u rific a tio n o f hum an liver and sm all in te stin e a lk a lin e phosphatase. A n a ly t. B io ch e m . 2 3 , 8 4 , 1968.

11. PO S EN , S., N E A L E , F.C. and C L U B B , J.S. H eat in a c tiv a tio n in th e s tu d y o f hum an a lk a lin e phosphatases. A n n . In te rn . Med. 62, 1234, 1965.

12. B A L E S T R IE R I, C., C O L O N N A , G.,

(14)

14

Rev. Soc. Bras. Med. Trop.

V ol.X V -N Ps 1 - 14

phosphatase fro m beef b ra in . C om para- tiv e B iochem . Physiol. vo l. 50 b , 2 0 3 , 20 7 , 1975.

13. C A L A M , R. R O G E R ., H E N R Y , R .L ., M U R A N O , G ., G R IG N O L , G., A n a ly tic a l B iochem . 71, 4 2 6 —4 3 5 , 1975.

14. C H A N G , C. H ., A N G E L L IS , D ., F IS K M A N , W. R eaction o f concanavalin a w ith alka- line phosphatase e x tra cte d fro m various hum an tissursources. m o le cu la r and celular B iochem . V . 9, n? 1, 5 5 —5 7 ,1 9 7 5 . 15. H A G E R S T R A N D , I., N O R D IM , J.G ., A c ta Path. M ic ro b io l. Scand. S e ctio n A 8 0 , 5 3 9 - 5 4 7 , 1972.

16. O T A N I, R., H IG A S H IN E , K ., Y A M A -M U R A . C. C h im . A c ta . 60, 1 1 2 -1 1 5 , 1975.

17. P IT A R R A , G .C., C H A R M , S .E ., G R E E N , S. P u rific a tio n o f p lacental a lk a lin e phos­ phatase b y im m u n o a d s o rp tio n , 1975. 18. S A B B IO N I, E., G IR A R D T , F ., M A R A F A N

-T l, E. B iochem . V . 2 2 7 - 2 7 6 , 1976. 19. S A G IU R A , M ., H IR A N O , K ., U N O , S.,

S U Z U K I, H ., O D A , T. P u rific a tio n and p ro p e rtie s o f a lk a lin e phosphatase fro m hum an b ile. C ham . Pharm . B u li. v. 2 3 , n? 9, 2 0 1 9 -2 0 2 4 , 1975.

20. S U G IU R A , H., IS O B E , M „ H IR A N O , K ., U N O , S., S U Z U K I, H ., O D A , T . C om - parison o f p ro p e rtie s o f h u m a n in te s tin a l and p lacental a lk a lin e phospgatase. C hem . Pharm . B u li V . 2 3 , n.° 7, 1 5 4 2 -1 5 4 7 , 1975.

21. E N G S T R O M , L. S tudies o n b o vin e liver a lk a lin e phosphatase, p h osphate incor- p o ra tio n . B iochem . B iò p h ys. A c ta 9 2 , 71, 1964.

22. T R É P A M E R , J.M ., S E A R G E A N T , L. E., S T IN S O N , R. A . B iochem . J o u rn a l 155, 6 5 3 - 6 6 0 , 1976.

23. S U S S M A N , H .H ., A n n .N .Y .A c a d . Sei. 166. 6 8 1 , 1969.

24. O B IN S O N , J.C. and Pierre, J.E ., D iffe -re n tia l a c tio n o f neuram inidase o n hum an serum , a lk a lin e phosphatase. N a tu re (L o n d .) 20 4 . 47 2 , 1964.

25. MOSS, D .W ., P roperties o f a lk a lin e phos­ phatase isoenzym es separated b y

starch-gel ele tro p h o re sis. Proc. Asse. C lin c. B io ch e m . 2 ,5 , 1962a.

26. C H IA N D U S S I, L., G R A E N E , S.F., and S H E R L O C K , S., S erum a lk a lin e phospha­ tase fra c tio n s in h e p a to b ilia ry and bone diseases. C lin . Sei. 22. 2 4 5 , 1962.

27. H O D S O N , A .W ., L A T N E R , A .L . and R A IN E , L ., Isoenzym es o f a lk a lin e phos­ phatase. C lin . C h im . A c ta . 7, 2 5 5 , 1962. 28. C U N N IN G H A M , V .R . and R IM E R , J.G . Isoenzym es o f a lk a lin e phosphatase o f hum an serum . B io ch e m . J. 8 9 . 5 0 ,1 9 6 3 . 30. B O Y E R , S.G . A lk a lin e phosphatase in hum an sera and pla ce n ta l. Science. 134, 1002, 1961.

31. T he n o m e cla tu re o f M u ltip le F o rm s o f E nzy-mes IU P A C . IU B

(

CBN) Eur.

J. B iochem . 24. 1 - 3 , 1971.

32. M A R Q U E S , J.J. e C ol. F osfatasem ia alcalina na Esquistossom ose M ansônica — b o le tim trim e s tra l da C lín ic a de Doenças In fe c tu - osas e Parasitárias, v. III n? 1, 9 —22, 1975.

33. O .A . B E S S E Y , O. H. L O W R Y and M.J. B R O C K J. B io l. C hem . 16 4 , 32 1 , 1946. 3 4 . A N D R E W S , P. E s tim a tio n o f th e m o le cu la r

w eigts o f p ro te in b y sephadex g e l-fitra - tio n . B iochem . J. 9 1 , 2 2 2 , 1964.

3 5 . A C C IO L Y , L .G .A . and M E L O , R. M. D e te r­ m inação c o lo rim é tric a da a tivid a d e cata- lásica m é to d o m o d ific a d o . M em . Inst. B ioc. U n iv. Fed. PE. R e cife 1 ( 1 ) : 5 3 , 56, 1974.

36. B E R N IF E L D , P. In m e th o d s in e n z y m o lo g y (C o llo w ic k , S.P. e K a p la n , N .O . e eds), A ca d e m ic Press, N. Y o rk V . 1, 1 4 9 —150, 1945.

37. F E N N L Y in A N ID O , G ., M E B E T H , G .H ., R O M E R O , P., Isoenzym es o f a lka lin e phosphatase. Q uad. Sclavo D iagn. 8, n? 1, 5 4 1 - 5 5 3 , 1972.

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Referências

temas relacionados : Fosfatase Alcalina