FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL
CONTRIBUIÇÃO AO MAPEAMENTO DO CROMOSSOMO 9 DO BÚFALO DE RIO (BUBALUS BUBALIS) UTILIZANDO PAINEL DE CÉLULAS SOMÁTICAS
HÍBRIDAS IRRADIADAS
André Marcos Santana
Orientadora: Profa. Dra. Maria Elisabete Jorge Amaral Co-Orientadora: Profa. Dra. Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
Fevereiro de 2008
(Bubalus bubalis) utilizando painel de células somáticas híbridas irradiadas / André Marcos Santana. – – Jaboticabal, 2008
xiii, 37 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2008
Orientador: Maria Elisabete Jorge Amaral
Banca examinadora: Vera Fernanda Martins H. de Lima, Humberto Tonhati, Simone Cristina Méo Niciura
Bibliografia
1.Búfalo de rio. 2. Mapeamento. 3.Cromossomo 9. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 619:575:636:293
André Marcos Santana possui graduação em Medicina Veterinária pela
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal da Universidade
Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (2005). Tem experiência na área de
Medicina Veterinária, com ênfase em Patologia Clínica Veterinária e Genética
Animal, atuando principalmente em temas como proteinograma, bioquímico
sérico e mapeamento genético em búfalos. Durante a graduação foi bolsista de
Iniciação Científica da FAPESP de setembro de 2003 a julho de 2005, tendo
desenvolvido os trabalhos de Iniciação Científica “Hemograma e proteinograma
sérico de búfalas (Bubalus bubalis) sorologicamente reagentes e de não
reagentes à Brucelose” e “Constituintes do soro sanguíneo de
Veados-Catingueiro (Mazama Gouazoubira) criados em cativeiro”. Durante os meses de
Agosto a Novembro de 2005, realizou estágio na empresa Minerembryo (Alfenas
- MG), desenvolvendo o trabalho de graduação intitulado “Influência da sincronia
da receptora e do estágio de desenvolvimento de embriões produzidos in vitro
(PIV) sobre a taxa de prenhez, em fêmeas bovinas” . Iniciou mestrado no
Programa de Medicina Veterinária da UNESP - Jaboticabal, no Departamento de
Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal, com ênfase em genética
Aos meus pais, meus verdadeiros mestres, exemplos de vida pessoal e profissional. Muito obrigado por todo amor e dedicação em todos os momentos da minha vida. Muito obrigado por serem a luz no final do túnel, por estenderem a mão nos momentos mais difíceis, por me guiarem pelos caminhos mais seguros. Muito obrigado por construírem um ambiente de paz e alegria. Descobri em vocês o valor da amizade, da humildade e da honestidade. Espero um dia encher seus corações de orgulho. E se esse dia chegar, digo do fundo do meu coração que estarei em paz com o mundo e que viver valeu a pena...
A Prof. Dra. Maria Elisabete Jorge Amaral, pela orientação e apoio dados na execução deste trabalho, por me dar a oportunidade de crescer profissionalmente e pessoalmente, por me receber e me acolher de braços abertos.
A Prof. Dra. Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima, pela co-orientação e apoio dados na execução deste trabalho e pela ajuda em conseguir contato com São José do Rio Preto.
Ao Prof. Dr. César Roberto Ésper, pelo apoio durante todo o mestrado.
A Prof. Dra. Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima, ao Prof. Dr. Humberto Tonhati e a Dra. Simone Cristina Méo Niciura por participarem como membros da banca de defesa e sugerirem alterações valiosas que contribuíram para a melhor qualidade da dissertação final.
A Prof. Dra. Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima, ao Prof. Dr. César Roberto Ésper e a Prof. Dra. Lúcia Galvão Albuquerque por participarem da banca de qualificação e também sugerirem alterações valiosas que contribuíram para a melhor qualidade da dissertação final.
Ao Prof. Dr. José Jurandir Fagliari, por me abrir as portas e despertar meu interesse pelo mundo da ciência, pelo apoio durante toda minha formação profissional.
Vanderlei, Edson, Patrícia, Larissa e Larissa Fornitano), do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), UNESP, Campus de São José do Rio Preto. Muito obrigado pela paciência e amizade no decorrer da execução desse trabalho. Muito obrigado por me ensinarem tudo que foi possível dentro do laboratório e por me receberem tão bem. Dedico esse trabalho também a vocês, pois ele não é de uma pessoa só, e sim de todo um grupo. Desejo a vocês todos muito sucesso na vida profissional e muita alegria e paz na vida pessoal.
A CAPES, pelo apoio financeiro no decorrer do mestrado.
A todos os funcionários da FCAVJ e do IBILCE que de alguma forma ajudaram na execução desse trabalho e pela convivência.
A todos os docentes da FCAVJ, pela ajuda em nosso conhecimento profissional.
Ao pessoal da VET01. Já fazem dois anos, mais não existe um dia em que não me lembre de nossos momentos juntos.
Aos meus tios Marly e Fernando, pela amizade e carinho que me deram durante toda minha vida. Ao meu primo Fernandinho, grande amigo de infância que vou levar por toda minha vida.
As minhas avós Iracema e Isaura, que sempre me trataram com todo o amor do mundo!!!
A toda minha família em geral.
Zé Pequeno, Tinoco e Paia), onde morei quase toda minha graduação. Quantas festas, quantas brigas, quantos momentos de reflexão e aprendizado.... Considero todos vocês como irmãos e torço por cada um nessa longa jornada da vida...
Ao meu amigo Chacal e a minha amiga Colombina, obrigado pela amizade durante todos esses anos de Jaboticabal...
A República Taverna (Papada, Gracinha, Mocinha, Chinês, Rhola, Xibata, Jane, Urubu, Placebo e Koréia), onde morei pouco tempo, mais fiz grandes amigos. Do que valeria a vida sem um pouco de risada!!!!! Muito obrigado por fazerem parte da minha história, por terem me acolhido como um irmão, por me ajudarem a crescer como ser humano.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS...ix
RESUMO ...xii
SUMMARY ...xiii
I. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA... 1
II. OBJETIVOS ... 10
III. MATERIAL E MÉTODOS... 11
1. Seleção dos marcadores para o mapeamento do cromossomo 9 bubalino... 11
2. Otimização das reações de PCR com DNA bubalino... 12
3. Genotipagem dos marcadores utilizando o painel BBURH5000 ... 13
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 15
1.Seleção dos marcadores para o mapeamento do cromossomo 9 bubalino... 15
2. Otimização das reações de PCR com DNA bubalino... 15
3. Genotipagem dos marcadores utilizando o painel BBURH5000 ... 18
V. CONCLUSÕES ...29
LISTA DE ABREVIATURAS
ABCB Associação Brasileira dos Criadores de Búfalos
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
ACP5 Símbolo do gene responsável por codificar a Fosfatase Ácida do tipo 5
AZU1 Símbolo do gene responsável por codificar a proteína catiônica antimicrobiana 37 (Azouricin 1)
BBU9 Cromossomo 9 do búfalo de rio (Bubalus bubalis)
BBURH5000 Painel contendo 90 linhagens de células somáticas híbridas irradiadas, geradas a partir da fusão entre fibroblasto de búfalo e de hamster.
BOVMAP Banco de dados com marcadores bovinos do Institut National de Recherche Agronomique
BTA7 Cromossomos 7 de gado bovino (Bos taurus)
CCNH Símbolo do gene responsável por codificar a ciclina H
CD14 Símbolo do gene responsável por codificar duas formas protéicas: a “glycosylphosphatidylinositol-anchored membrane protein (mCD14)” e a “monocyte or liver-derived soluble serum protein (sCD14)”
CD74 Símbolo do gene responsável por codificar molécula do complexo de histocompatibilidade, classe II
COMP Símbolo do gene responsável por codificar a “cartilage oligomeric matrix protein”
CPATU Centro de Pesquisa Agropecuária do Trópico Úmido
CRTL1 Símbolo do gene responsável por codificar a “cartilage linking protein 1”
DCVC S-1,2-diclorovinil-l- cisteína
DNM2 Símbolo do gene responsável por codificar a “dynamin 2”
D7S3 Símbolo de segmento de DNA codificante
EDAS Kodak Electrophoresis Documentation and Analysis System™
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
e-PCR PCR eletrônico
ESTs “Expressed Sequence Tags” = Seqüência Marcada Expressa
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
FAPESP Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
FISH Flourescence In Situ Hybridization = Hibridização In Situ
Fluorescente
FR Freqüência de Retenção
F12 Símbolo do gene responsável por codificar o “coagulation
factor XII”
GABRA1 Símbolo do gene responsável por codificar a “gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, alpha 1”
GNPI Símbolo do gene responsável por codificar a “Glucosamine-6-phosphate deaminase 1”
GUK1 Símbolo do gene responsável por codificar a “guanylate kinase 1”
ICAM3 Símbolo do gene responsável por codificar a “intercellular adhesion molecule 3”
IDF “International Dairy Federation” = Federação Internacional de Laticínios
IEP Intervalo Entre Partos
ILTXRH map Mapa RH 5000rad Terceira Geração de Bovino da University of Illinois at Urbana-Champaign Texas A&M University
IL3 Símbolo do gene responsável por codificar a Interleucina 3
IL4 Símbolo do gene responsável por codificar a Interleucina 4
IL12B Símbolo do gene responsável por codificar a Interleucina 12B
INSL3 Símbolo do gene responsável por codificar a “insulin-like 3 (Leydig cell)”
do interferon 1
ISH “in situ” Hybridization = Hibridização “in situ”
KCl, Cloreto de Potássio
MARC Meat Animal Research Center- USA
MBD3 Símbolo do gene responsável por codificar a “methyl- CpG binding domain protein 3”
Mbp Mega pares de bases
MEF2C Símbolo do gene responsável por codificar a “myocyte enhancer factor 2C”
MgCl2 Cloreto de Magnésio
NCBI National Center For Biotechnology Information
NIH- USA National Institute of Health– Estados Unidos da América
NSF Fundação Americana “National Science Foundation”
PCR Polymerase chain reaction = Reação em cadeia de polimerase
QTL Quantitative Traci “Loci” = “locus” de características
quantitativas
RASA1 Símbolo do gene responsável por codificar a proteína ativadora de GTPase
RH Radiation hybrid = híbridas irradiadas
SCH Somatic Cell Hybrid = Células Somáticas Híbridas
SENAI-RS/UNET Serviço Nacional de Aprendizagem Industrial – Departamento Regional do Rio Grande do Sul - Unidade de Negócios em Serviços Tecnológicos
STS Sequence Tagged Sites = Sítios de Seqüência Marcada
TA Temperatura de Anelamento
Taq Polimerase Thermus Aquaticus Polimerase
USDA United States Department of Agriculture
CONTRIBUIÇÃO AO MAPEAMENTO DO CROMOSSOMO 9 DO BÚFALO DE RIO (BUBALUS BUBALIS) UTILIZANDO PAINEL DE CÉLULAS SOMÁTICAS
HÍBRIDAS IRRADIADAS
RESUMO - O búfalo de rio (Bubalus bubalis) é uma espécie de interesse
econômico pertencente à família Bovidae, utilizado para a produção de carne e leite, além de força de trabalho no campo, constituindo-se em um animal de tripla aptidão. Recentemente, a construção de um painel de células somáticas híbridas irradiadas (linhagens celulares) contendo fragmentos do genoma do búfalo de rio, incorporado ao genoma de hamster (BBURH5000), está permitindo, pela primeira
vez, o mapeamento de todos os cromossomos bubalinos. A utilização desse painel de células associado a análises estatísticas, está gerando mapas genômicos de alta resolução contendo diferentes tipos de marcadores moleculares. O presente trabalho teve por objetivo utilizar este painel de células para gerar grupos de ligação com os marcadores mapeados no cromossomo 9 bubalino e assim comparar a organização dos grupos de ligação obtidos com aqueles já descritos para o cromossomo 7 bovino. Para tal, foram testados com DNA bubalino, seqüências de “primers” para PCR de 26 marcadores moleculares previamente mapeados no cromossomo 7 bovino, o qual foi descrito na literatura como o homólogo ao cromossomo 9 de búfalo. Do total de marcadores testados, 18 geraram produtos de PCR adequados ao mapeamento utilizando o painel BBURH5000, sendo que destes 18, foi possível a genotipagem final de 10
marcadores. A partir das análises de ligação com os 10 marcadores genotipados, foi possível distribuir os mesmos em três grupos de ligação no BBU9. A análise comparativa entre os grupos de ligação do BBU9 e do BTA7 revelou a presença dos mesmos grupos de ligação nos cromossomos de ambas espécies, evidenciando conservação de sintenia.
Palavras-Chave: Bubalus bubalis, búfalo de rio, cromossomo 9, genoma,
CONTRIBUTION FOR THE MAPPING OF CHROMOSOME 9 OF THE RIVER BUFFALO (BUBALUS BUBALIS) USING RADIATION HYBRID SOMATIC CELL
PANEL
SUMMARY - The river buffalo (Bubalus bubalis), a member of the Bovidae
family, is an economically important livestock specie useful to produce milk and meat, as well as source of labor, comprising an animal of triple aptness. The recent construction of a whole-genome 5000-rad radiation hybrid somatic cell panel for the river buffalo genome (BBURH5000), is allowing for the first time the mapping of
all chromosomes from the specie. The use of BBURH5000 panel associated with
statistical analyses is generating high-resolution RH maps integrating different types of molecular markers. The goal of this study was to genarate linkage groups with the markers mapped on the river buffalo chromosome 9 (BBU9), using the BBURH5000 panel, and then compare these groups with those already described in
BTA7. Previous studies have identified bovine chromosome 7 as homologous to BBU9. Cattle derived PCR primers from 26 markers, previously mapped in cattle, were tested with buffalo DNA. A total of 18 of the 26 markers amplified PCR products suitable for RH mapping. From these 18 markers, it was possible the genotyping of 10. The analyses of linkage with the 10 markers genotyped turned possible to distribute them in three linkage groups on the BBU9. The comparative analyses between the linkage groups of BBU9 and BTA7 revealed the presence of the same linkage groups on the chromosome of both species, revealing conservation of synteny between them.
Keywords: Bubalus bubalis, river buffalo, chromosome 9, genome, mapping,
I. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
O búfalo doméstico (Bubalus bubalis) é originário da Índia e chegou ao Brasil
entre 1890 e 1895, na Ilha de Marajó, Estado do Pará (FONSECA, 1986; MIRANDA, 1986; TONHATI et al., 1999), vindo em pequenos lotes da Ásia, Europa (Itália) e Caribe. Sua grande adaptabilidade aos mais variados ambientes, assim como sua elevada fertilidade e longevidade produtiva (OLIVEIRA, 2005), despertaram o interesse dos produtores como alternativa para a produção de carne e derivados do leite, permitindo que o rebanho bubalino brasileiro experimentasse uma evolução significativa.
Segundo estimativas da “Food and Agriculture Organization of the United Nations” (FAO, 2007), houve aumento do número de bubalinos no mundo de aproximadamente 98%, passando de 88 milhões em 1961, para 174 milhões de cabeças em 2005, sendo que 90% do total da população encontra-se na Ásia, continente predominantemente agrário onde os búfalos, além da produção de leite e carne, também são muito utilizados como animais de tração, sendo por isso considerados animais de tripla aptidão.
No Brasil, o crescimento da população bubalina entre 1961 e 2002 foi de, aproximadamente, 18 vezes o percentual mundial no mesmo período, passando de 63 mil para 1,2 milhão de cabeças (IBGE, 2007), englobando as raças Jafarabadi, Mediterrâneo e Murrah, sendo que o Estado do Pará possui o maior rebanho brasileiro. Segundo OLIVEIRA et al. (2005) a população bubalina brasileira está distribuída cerca de 50% na região Norte, 15% na região Sudeste, 14% no Nordeste, 12% no Centro Oeste e 9% na região Sul, destacando-se que na região Sudeste a população bubalina vem aumentando de maneira considerável, com ênfase para a produção leiteira.
período de 1992 a 2002, bem superior ao aumento verificado na produção de leite de vaca, de 8,83%, para o mesmo período.
No Brasil, a produção de leite de búfalas é uma atividade que tem crescido nos últimos anos, particularmente nos estados da região Sudeste, onde já existem vários laticínios, sendo o leite destinado, quase que na sua totalidade, para a produção de queijo tipo “muzzarella” (MADELLA-OLIVEIRA et al., 2005). O elevado teor de sólidos totais, incluindo gordura e proteína (caseína), torna o leite mais calórico e valioso para a produção de produtos lácteos, tais como queijos, leites fermentados e iogurtes, entre outros, favorecendo decisivamente o aumento do rendimento na fabricação desses derivados quando comparado ao rendimento do leite de vaca (NASCIMENTO & CARVALHO, 1993). Segundo NADER FILHO et al. (1984) e VALE (1999), o rendimento industrial do leite de búfalas pode chegar, comparativamente, a suplantar o rendimento do leite bovino em mais de 40%, sendo que produtos como a “muzzarella” podem atingir no mercado até quatro vezes o valor do similar em bovinos (DAMÉ, 2007).
Pesquisas realizadas demonstraram que os bubalinos apresentam grande produtividade e capacidade de adaptação às condições brasileiras (JORGE et al., 1997) e segundo PEREIRA & TAVARES (2007), o ganho de peso de búfalos sob as mesmas condições de manejo e alimentação, tem revelado superioridade quando comparados a bovinos, mesmo de raças especializadas. Desta forma, a bubalinocultura passa a ser uma atividade atraente para produção de carne, tanto em pastagens (MACEDO et al., 2001), quanto em confinamento (JORGE & FONTES, 2001).
O mapeamento genômico em animais e plantas, por meio dos cruzamentos selecionados por marcadores e da manipulação do genoma, representa o primeiro passo necessário para fazer uso prático das tecnologias baseadas em DNA. Assim, torna-se aparente que o sucesso do uso de técnicas moleculares visando manipulação de genes economicamente importantes reside na obtenção de mapas físicos e genéticos saturados, com uma resolução cada vez mais apurada, descrevendo de maneira ordenada a constituição genética de espécies animais e vegetais (LEDUR & SCHMIT, 2000).
Neste contexto, o uso de genes e microssatélites como marcadores moleculares assume fundamental importância na construção de mapas saturados e conseqüente estudo de polimorfismos em populações. Os genes, altamente conservados, podem auxiliar no entendimento da evolução das espécies através de estudos comparativos de genomas. Já os microssatélites, seqüências de repetição em tandem de dois a cinco nucleotídeos comuns em genomas de eucariotos, vem sendo muito utilizados para construção de mapas genômicos devido ao alto grau de polimorfismo e características de co-dominância na natureza (KAPPES et al, 1997).
Os mapas estruturais do genoma estão divididos em três categorias: o mapa genético, os mapas físicos (mapa citogenético, mapa de sintenia e mapa RH) e, mais recentemente, os mapas moleculares. O mapa genético é de grande utilidade, pois deduz a ordem de marcadores em um mesmo cromossomo e a distância entre eles, utilizando como critério a freqüência de recombinação meiótica. Estes marcadores, no entanto, não podem ser designados a cromossomos específicos ou a regiões específicas em um cromossomo (CHOWDHARY & RAUDSEPP, 2005). Desta forma, torna-se de fundamental importância o mapeamento físico, onde, utilizando técnicas envolvendo células somáticas híbridas (SCH) (mapa de sintenia), células somáticas híbridas irradiadas (mapas RH), hibridização “in situ” (ISH) e hibridização “in situ” fluorescente (FISH) (mapa citogenético), os marcadores são capazes de mostrar regiões específicas de cromossomos já conhecidos.
chegando a ter até dez vezes maior resolução que os mapas genéticos e maior resolução que os demais mapas criados. A grande vantagem da construção de mapas RH está na possibilidade de ordenar fisicamente todos os tipos de marcadores, polimórficos e não polimórficos (genes codificantes), possibilitando o mapeamento de genes, os quais geralmente se apresentam extremamente conservados durante o processo evolutivo. Este tipo de mapeamento leva certa vantagem em relação aos mapas de sintenia (células somáticas híbridas), onde marcadores podem ser indicados a um determinado cromossomo, porém não ordenados. Leva certa vantagem também em relação aos mapas genéticos, onde apenas utilizam-se marcadores de DNA que apresentam polimorfismo, já que a técnica baseia-se na análise de recombinação meiótica entre marcadores ao longo do cromossomo, dependendo de diferenças alélicas dentro da população estudada para serem mapeados (CHOWDHARY e RAUDSEPP, 2005).
A estratégia de mapeamento utilizando painéis de células somáticas híbridas irradiadas (mapeamanto RH) foi primeiramente descrita por GOSS & HARRIS (1975) e redescoberta por COX et al. (1990). Atualmente, a cobertura genômica completa foi alcançada em humanos e a técnica vem sendo estendida ao mapeamento de outras espécies como camundongo (MCCARTHY et al., 1997), suínos (HAWKEN et al., 1999), eqüinos (KIGUWA et al., 2000), caninos (PRIAT et al., 1998), felinos (MURPHY et al., 1999) e bovinos (WOMACK et al., 1997). A partir do projeto de pesquisa iniciado em 2004 no Laboratório de Genômica Comparativa – IBILCE/UNESP, com financiamento conjunto da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP – Processo 02/10150-5) e da Fundação Americana “National Science Foundation” (Processo OISE-0405-743), foi construído, a partir do genoma total do búfalo de rio, um painel de células somáticas hibridas irradiadas para o mapeamento do genoma bubalino (AMARAL et al., 2007).
de roedor, através de um processo de fusão celular. Cada clone RH gerado a partir desta fusão contém uma combinação diferente de fragmentos cromossômicos da célula doadora incorporado ao genoma da célula receptora, que atinge a estabilidade após sucessivos processos de divisão celular. Posteriormente, os clones híbridos são testados quanto à presença ou à ausência de marcadores de DNA do genoma de interesse. Utilizando métodos estatísticos para a ordenação linear, a distância relativa entre os diferentes marcadores pode ser determinada.
Apesar de uma população relativamente grande e em crescimento, e levando-se em consideração que a espécie bubalina já possui importância econômica em muitos países, o mapeamento do genoma bubalino encontra-se atrasado quando comparado aos genomas de outras espécies de interesse econômico, possuindo somente 302 marcadores moleculares mapeados (IANUZZI et al., 2003; DI MEO et al., 2006) sendo que a espécie bovina já possui 17.254 marcadores moleculares mapeados (SNELLING et al., 2007). Desta maneira, o conhecimento de seu genoma torna-se de fundamental importância para identificação e manipulação de genes responsáveis por características de interesse econômico como resistência a parasitos, ganho de peso, produção de leite, fertilidade, intervalo entre partos (IEP), entre outros, que permitirão o melhoramento genético desses animais e maior retorno econômico para o setor.
Mundialmente, os búfalos são divididos em duas espécies: o búfalo asiático
(Bubalus bubalis) e o búfalo africano (Syncerus caffer). O búfalo asiático é dividido em
duas subespécies: o búfalo de rio (2n = 50), representada pelas raças Murrah, Mediterrâneo e Jafarabadi, e o búfalo de pântano (2n = 48), representada pela raça Carabao ou Rosilho, sendo que os búfalos de rio, são os mais numerosos (IANNUZZI, 1994).
A espécie bubalina, assim como a bovina, pertence a família Bovidae, que é a mais diversa das nove famílias de Artiodactyla, com 45 gêneros e 124 espécies
braços cromossômicos é um indicativo de que a evolução cromossômica da família Bovidae procede de um cariótipo primitivo de 58 cromossomos autossomos acrocêntricos e um par de cromossomos sexuais (2n = 60). Desta forma, propuseram que a variabilidade do número diplóide de cromossomos dentro da família Bovidae foi primeiramente resultado de translocação e posterior fusão cêntrica envolvendo este cariótipo primitivo inicial, o que indica que dentro dessa família existe uma grande conservação de material genético.
O cariótipo do búfalo de rio (Bubalus bubalis) (2n = 50) consiste em 5 pares de
cromossomos autossomos submetacêntricos e 19 pares de cromossomos autossomos acrocêntricos, além de um par de cromossomos sexuais X e Y, enquanto que o bovino doméstico (Bos taurus) (2n = 60) possui 29 pares de cromossomos autossomos
acrocêntricos e um par de cromossomos sexuais (IANUZZI et al, 2003). Estudos de citogenética envolvendo cromossomos do búfalo de rio e bovino revelaram um alto grau de homologia entre bandas, tendo confirmado a hipótese de que os cinco pares de cromossomos submetacêntricos do búfalo de rio são resultantes de translocações e posterior fusões cêntricas entre dez pares de cromossomos acrocêntricos do genoma bovídeo ancestral (EL NAHAS et al., 1997; EL NAHAS et al., 1999; OTHMAN & EL NAHAS, 1999; DE HONDT et al., 2000).
Assim, considerando o alto grau de homologia de bandas entre os cromossomos de bovinos e búfalos e levando-se em consideração vários estudos que demonstraram, através da conservação de genes de um mesmo grupo sintênico, uma extensa conservação cromossômica entre as duas espécies (IANNUZZI et al., 1990, 1998, 1999, 2001a, 2001b; EL NAHAS et al., 1996; DI MEO et al., 2000; EL NAHAS et al., 2001; NAVANI et al., 2002), o uso dos mapas físicos e genéticos bovino pode ser extremamente útil na construção de um mapa genômico comparativo do búfalo de rio, principalmente levando-se em consideração que o genoma bovino é o mais estudado entre as espécies de interesse econômico.
genômicos conservados entre as espécies. A base do mapeamento comparativo fundamenta-se no conceito de que os genes ligados em uma espécie mantêm-se ligados na outra espécie, sendo que a probabilidade da ordem de ligação estar conservada ou interrompida depende dos rearranjos que ocorreram desde a divergência evolutiva das espécies que estão sendo estudadas (NADEAU & SANKOFF, 1998). Entre os mamíferos, espera-se que a genômica comparativa auxilie numa maior compreensão da diversidade fisiológica, fenotípica e metabólica, tanto em níveis moleculares quanto sistêmicos (LARKIN et al., 2003). Dessa forma, genomas seqüenciados de mamíferos representam padrões de referência que permitirão o uso da genômica comparativa como ferramenta para compreender as bases moleculares da diversidade fenotípica dentro desta classe de vertebrados (O’BRIEN et al., 2001).
O cromossomo 9 do búfalo de rio (BBU9) é acrocêntrico e possui apenas cinco genes (IL3, EEF2, RASA1, CAST e LDLR) e dois marcadores do tipo microssatélite (D7S3 e RM006) mapeados por meio da técnica de hibridização “in situ” fluorescente (FISH) (IANNUZZI et al., 2003). Estes mesmos marcadores já foram mapeados no cromossomo 7 bovino (BTA7) (BOVMAP, 2007), evidenciando conservação cromossômica entre as duas espécies (EL NAHAS et al., 2001).
O cromossomo 7 bovino, por sua vez, apresenta 67 genes e 14 marcadores do tipo microssatélite mapeados pela técnica de células somáticas híbridas irradiadas (mapa RH) (EVERTS-VAN DER WIND et al., 2004). Neste cromossomo, equivalente ao cromossomo 9 bubalino (BBU9), são encontrados diversos genes relacionados com o funcionamento do sistema imune que ainda não foram mapeados em búfalo como o IL4, IL12B, CD14, CD74, IRF1 e AZU1 (BOVMAP, 2007). Além disso, também já foram identificados no BTA7, alguns “loci” de características quantitativas (QTL) relacionados com taxa de ovulação (KIRKPATRICK et al., 2000), taxa de nascimento de gêmeos (LIEN et al., 2000), contagem de células somáticas e incidência de distocias (KUHN et al., 2003).
outros leucócitos, tendo inúmeras funções dentro do sistema imune (ABBAS & LICHTMAN, 2005). O gene IL3, indicado por FISH na região 9q15 do cromossomo 9 bubalino (IANNUZZI et al., 2003), codifica a proteína interleucina 3, responsável por atividades como o estimulo do crescimento e maturação de eosinófilos, neutrófilos e monócitos, a diferenciação e a ativação mastocítica e basofílica e a ativação de eosinófilos (TIZARD, 1998). Em suínos, ANDREW e colaboradores (2006) descobriram que a interleucina 3 pode ser utilizada de maneira eficiente como adjuvante em vacinas contra a Peste Suína Clássica. Já o gene IL4, que codifica a proteína interleucina 4, é responsável por estimular a produção de anticorpos IgE (reações alérgicas) e participar do desenvolvimento de células TH2 a partir de células T auxiliares CD4+ naive. O gene IL12B, também localizado no cromossomo 7 bovino, codifica a interleucina 12B. Esse gene encontra-se ativo, principalmente, em macrófagos e células dendríticas, que produzem e liberam essas proteínas, responsáveis indiretamente pelo combate a microorganismos intracelulares (ABBAS & LICHTMAN, 2005).
O gene IRFl também tem importante função no sistema imune e codifica o fator regulatório de interferon, responsável pela ativação do interferon tipo I e outros interferons produzidos (FUJITA et al., 1989), além de possuir atividades antioncogênicas (HARADA et al., 1993). Em humanos, este gene está localizado na região 5q3 1.1, sendo que, recentemente, foi provado que a sua deleção, devido a anomalias envolvendo a deleção do braço longo do cromossomo 5 humano, pode ser um dos principais fatores responsáveis pelo desenvolvimento dos quadros de leucemia mielóide aguda (AML) e das síndromes mielodisplásicas (MDS) (WILLMAN, 1993).
II. OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivos:
1. Avaliar o aproveitamento de pares de “primers” para PCR de marcadores já mapeados no BTA7 para o mapeamento do BBU9;
2. Gerar grupos de ligação com os marcadores mapeados no cromossomo 9 bubalino;
III. MATERIAL E MÉTODOS
1. Seleção dos marcadores para o mapeamento do cromossomo 9 bubalino
Para mapeamento de genes codificantes e microssatélites no cromossomo 9 do búfalo de rio foram utilizados “primers” para PCR descritos na literatura e previamente utilizados no mapeamento do cromossomo 7 bovino (BTA7). Dentre os genes selecionados, dois (IL3 e RASA1) foram previamente indicados como pertencentes ao cromossomo 9 bubalino por meio da técnica de hibridização “in situ” fluorescente (FISH) (IANNUZZI et al., 2003).
Para a seleção dos marcadores foram utilizadas informações de mapas do cromossomo 7 bovino, disponíveis nos bancos de dados públicos NCBI e BOVMAP (NCBI, 2007). Dentre os mapas consultados no banco de dados americano NCBI – “Map Viewer” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/), constam o mapa de ligação gerado pelo “United States Department of Agriculture” (USDA) – “Meat Animal Research
Center” - USA (MARC) (USDA – ARS, 2007)
2. Otimização das reações de PCR com DNA bubalino
Com a intenção de selecionar os marcadores adequados para genotipagem com as linhagens do painel BBURH5000, foram realizadas reações de PCR com gradiente de
temperatura de anelamento visando à obtenção de um produto de PCR único com DNA bubalino, podendo este ser búfalo específico ou diferenciado do produto de PCR com DNA de hamster. Para realização desses experimentos, utilizou-se um termociclador do tipo gradiente PTC-200™ (M.J.Research), com bloco para 96 amostras distribuídas em
12 colunas e 8 linhas. Em cada coluna, o termociclador programa uma temperatura de anelamento pré-determinada. As temperaturas utilizadas nas 12 colunas foram, respectivamente: 50ºC; 50,4ºC; 51,2ºC; 52,5ºC; 54,2ºC; 56,4ºC; 58,9ºC; 61ºC; 62,7ºC; 63,9ºC; 64,7ºC e 65 ºC.
Nos experimentos com gradiente de temperatura de anelamento, cada marcador foi testado com:
- DNA bovino, em temperaturas variando de 50ºC a 65ºC, para verificar a qualidade do “primer” a ser utilizado uma vez que estes foram inicialmente desenhados para o mapeamento do genoma bovino (controle positivo).
- DNA de hamster, provenientes dos fibroblastos utilizados na formação do painel BBURH5000, em temperaturas variando de 50ºC a 65ºC, para verificar se as
amplificações geradas poderiam interferir nas amplificações geradas pelo DNA bubalino.
- DNA bubalino, provenientes dos fibroblastos utilizados na formação do painel BBURH5000, em temperaturas variando de 50ºC a 65ºC, para verificar a presença de
amplificação e assim escolher a temperatura ideal de anelamento, levando em conta as amplificações geradas em hamster.
As reações de PCR foram feitas em um volume total de 10μl, utilizando 2μl de DNA (25 ng/μl), 0,2 mM de “primer” sense, 0,2 mM de “primer” antisense, 100 mM de dNTP, 10mM Tris pH 9, 50 mM KCl, 1,5 mM de MgCl2 e 0,5 unidade de Taq DNA
polimerase (AmpliTaq Gold™, Promega e Easy). Os ciclos para a amplificação da reação de PCR foram os seguintes: desnaturação inicial de 2 minutos a 94ºC, seguida de 35 ciclos com desnaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento variando de 50-65ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 30 segundos. A extensão final foi de 72ºC por seis minutos.
Os produtos de PCR (bovino, hamster e bubalino) foram submetidos a corrida em gel de agarose a 2% (100 mL de tampão TBE 1X – formado por tris, ácido bórico e EDTA - para 2 gramas de agarose comum), corado com brometo de etídeo (2μl em cada 100 mL de gel). A corrida foi realizada em cuba média, durante 30 minutos, utilizando voltagem de 250 V e amperagem de 100 A. Os géis foram visualizados em transiluminador e posteriormente fotodocumentados com câmera digital DC290 KODAK™ e analisados com o programa EDAS (próprio da câmera digital DC290 KODAK™).
3. Genotipagem dos marcadores utilizando o painel BBURH5000
O painel utilizado na genotipagem dos marcadores, denominado BBURH5000,
contém 90 linhagens de células somáticas híbridas irradiadas, geradas a partir da fusão entre fibroblasto de búfalo e de hamster. A fragmentação dos cromossomos do genoma bubalino foi obtida submetendo-se as células a um total de 5000 “rads” de irradiação X (AMARAL et al., 2007).
Os pares de “primers” selecionados a partir dos experimentos de PCR com gradiente de temperatura de anelamento, foram utilizados na genotipagem dos respectivos marcadores nas 90 linhagens híbridas búfalo/hamster do painel BBURH5000.
de resultados falso positivos ou falso negativos. Nos casos em que as linhagens apresentaram produtos de PCR duvidosos, estas foram testadas uma terceira vez.
O padrão de presença e ausência dos produtos de PCR de cada marcador nas linhagens híbridas foi registrado em uma tabela do tipo “Excel”, a qual foi analisada estatisticamente pelo pacote estatístico rh_tsp_map (AGARWALA et al. 2000) (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/agarwala/rhmapping/rh_tsp_map.tar) e CONCORDE (APPLEGATE et al. 1998) (http://www.isye.gatech.edu/~wcook/rh/) ligado a Qsopt (website http:// www.isye.gatech.edu/~wcook/qsopt), seguindo procedimentos já utilizados na construção dos mapas de outros cromossomos da espécie bubalina, como demonstrado nos trabalhos de AMARAL et al. (2007), MIZIARA et al. (2007) e STAFUZZA et al. (2007). O software “rh_tsp_map” e “CONCORDE” foram originalmente desenvolvidos para a construção de mapas RH do genoma humano, sendo atualmente também aplicados na construção de mapas dos genomas de equinos, ovinos, felinos, caninos, etc., além do genoma bubalino ( SCHAFFER et al., 2007).
A análise estatística foi realizada pelos pesquisadores Doutor Alejandro Schaffer e Doutora Richa Agarwala, do “National Institutes of Health” (NIH) dos Estados Unidos, os quais são colaboradores do Programa Internacional do Mapeamento do Genoma Bubalino.
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO
1.Seleção dos marcadores para o mapeamento do cromossomo 9 bubalino
Foram selecionados do banco de dados NCBI (mapas do genoma bovino MARC e ILTX) e do banco de dados BOVMAP, pares de “primers” para PCR de 26 marcadores derivados do BTA7. Destes, 22 (ACP5, AZU1, CACH1, CCNH, CD14, COMP, CRTL1, DNM2, F12, GABRA1, GNPI, GUK1, ICAM3, IL3, IL4, IL12B, INSL3, IRF1, MBD3, MEF2C, RASA1, VDAC1) são genes e 04 (BM1557, BMS1331, BMS2258, RM006) são microssatélites. Dentre os marcadores selecionados, 02 genes (IL3 e RASA1) e 01 microssatélites (RM006) haviam sido previamente indicados ao BBU9 por meio da técnica de FISH (IANNUZZI et al., 2003).
2. Otimização das reações de PCR com DNA bubalino
Dos 26 pares de “primers” para PCR testados nos experimentos com gradiente de temperatura de anelamento, 18 apresentaram produtos de PCR búfalo-específico, mostrando-se adequados para serem genotipados com o DNA das linhagens híbridas do painel BBURH5000, sendo 16 genes: ACP5, CCNH, COMP, CRTL1, GNPI, GUK1,
ICAM3, IL3, IL4, IL12B, INSL3, IRF1, MBD3, MEF2C, RASA1, VDAC1 e 02 microssatélites: BM1557 e BMS2258.
para PCR que apresentaram produtos únicos de PCR búfalo-específico foram selecionados para posterior genotipagem do marcador com as linhagens do painel BBURH5000.
Figura 1. Gel de agarose a 2% corado com brometo de etídeo, mostrando uma reação de PCR com gradiente de temperatura de anelamento com o marcador CRTL1. Parte A: DNA bovino utilizado como controle positivo. Parte B: DNA de hamster. Parte C: DNA bubalino. 1: marcador de peso molecular 100 bp.
A.2-A.7 e B.2-B.7: diferentes temperaturas de anelamento utilizadas: 50,4ºC; 52,5ºC; 56,4ºC; 61ºC; 63,9ºC e 65ºC, respectivamente. C.2-C.11: diferentes temperaturas de anelamento utilizadas: 50,4ºC; 51,2ºC, 52,5º C; 54,2ºC; 56,4ºC; 58,9ºC; 61ºC; 62,7ºC, 63,9ºC e 64,7ºC, respectivamente. b: controle negativo da reação de PCR. Nota-se que o primer gera produto de PCR com DNA bubalino entre as temperaturas de 50,4ºC a 64,7ºC. Selecionou-se a temperatura de 64ºC (interior do quadrado), como a temperatura ideal para os experimentos de PCR com este marcador.
A temperatura de anelamento elevada aumenta a especificidade dos primers, exigindo um alto grau de homologia com o DNA de interesse (AUDY et al., 1996). Desta forma, ressalta-se a importância da realização das reações de PCR com gradiente de
C
b 1 2 3 4 5 6 7 2 3 4 5 6 7
A B
temperatura de anelamento, uma vez que os “primers” utilizados em búfalo foram desenhados a partir de sequências do genoma bovino.
A partir dos experimentos de PCR com gradiente de temperatura foram excluídos oito marcadores do conjunto, sendo seis genes (AZU1, CACH1, CD14, DNM2, F12 e GABRA1) e dois microssatélites (BMS1331 e RM006). Destes, três não geraram produto de amplificação com o DNA bubalino e bovino (AZU1, CACH1 e CD14), um apresentou amplificação fraca do DNA bubalino e bovino (BMS1331) e quatro apresentaram amplificações inespecíficas com o DNA bubalino e bovino (DNM2, F12, GABRA1 e RM006). Desta forma, embora tenham sido excluídos estes oito marcadores, não pode ser descartada a possibilidade da presença da seqüência homóloga em búfalo, uma vez que os “primers” utilizados, específicos para a espécie bovina, não amplificaram produtos de PCR ou amplificaram produtos de PCR inespecíficos para a própria espécie bovina.
Figura 2. Gel de agarose a 2% corado com brometo de etídeo, mostrando a reação de PCR com gradiente de temperatura de anelamento com o marcador RM006. Parte A: DNA bovino utilizado como controle positivo. Parte B: DNA de hamster. Parte C: DNA bubalino. 1: marcador de peso molecular 100 bp. A.2-A.7 e B.2-B.7: diferentes temperaturas de anelamento utilizadas: 50,4ºC; 52,5ºC; 56,4ºC; 61ºC; 63,9ºC e 65ºC, respectivamente.
C.2-C.11: diferentes temperaturas de anelamento utilizadas: 50,4ºC; 51,2ºC, 52,5º C; 54,2ºC; 56,4ºC; 58,9ºC; 61ºC; 62,7ºC, 63,9ºC e 64,7ºC, respectivamente. b: controle negativo da reação de PCR.
3. Genotipagem dos marcadores utilizando o painel BBURH5000
Depois de verificado o padrão de amplificação dos 18 pares de “primers” para PCR que geraram produtos adequados ao mapeamento RH, estes foram submetidos aos experimentos de PCR com o DNA das linhagens do painel BBURH5000, para
determinar o padrão de presença ou ausência dos produtos de PCR nas diferentes linhagens.
As Figuras 3, 4, 5 e 6 ilustram géis de agarose de reações de PCR com o par de “primers” do gene COMP com todas as linhagens do painel BBURH5000. A partir dos
1 2 3 4 5 6 7 2 3 4 5 6 7
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
A B
C
resultados obtidos, podemos observar a presença de produto de PCR em 29 das 90 linhagens (8, 22, 33, 44, 47, 62, 66, 76, 80, 82, 87, 90, 92, 95, 97, 110, 112, 114, 117, 122, 126, 131, 132, 137, 141, 150, 151,162 e 163), sendo a linhagem 38 considerada como duvidosa.
Figura 3. Gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo mostrando o padrão de amplificação do marcador COMP em parte das linhagens híbridas do painel BBURH5000. M: marcador de peso molecular 100 bp. B: DNA bubalino. R:
DNA de hamster. 02 a 51: DNA das linhagens híbridas búfalo/hamster do painel BBURH5000. b: controle negativo da reação de PCR. Observa-se a presença de produtos de PCR nas linhagens 8, 22, 33, 44 e 47, bem como no DNA bubalino parental.
M B R 2 5 8 9 15 17 21 22 23 24 25 26 27
Figuras 4. Gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo mostrando duas repetições do padrão de amplificação do marcador COMP em parte das linhagens híbridas do painel BBURH5000. M: marcador de peso molecular
100 bp. B: DNA bubalino. R: DNA de roedor. 53 a 93: DNA das linhagens híbridas búfalo/roedor do painel BBURH5000. b: controle negativo da reação de PCR. Observa-se que houve produtos de amplificação nas linhagens 62, 66, 76, 80, 82, 87, 90 e 92, bem como no DNA bubalino parental.
M 53 55 62 63 66 67 70 71 72 75 76 78 79 80 81 82
Figuras 5. Gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo mostrando duas repetições do padrão de amplificação do marcador COMP em parte das linhagens híbridas do painel BBURH5000. M: marcador de peso molecular
100 bp. B: DNA bubalino. R: DNA de roedor. 94 a 131: DNA das linhagens híbridas búfalo/roedor do painel BBURH5000. b: controle negativo da reação de PCR. Observa-se que houve produtos de amplificação nas linhagens 95, 97, 110, 112, 114, 117, 122, 126, 131, bem como no DNA bubalino parental. OBS: As linhagens 127 e 131, que estão em negrito no segundo gel, fazem parte da primeira genotipagem
M 94 95 97 98 100 102 103 104 105 106 110 111 112 113 114 116
Figuras 6. Gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo mostrando duas repetições do padrão de amplificação do marcador COMP em parte das linhagens híbridas do painel BBURH5000. M: marcador de peso molecular 100 bp. B: DNA bubalino. R: DNA
de roedor. 02 a 51: DNA das linhagens híbridas búfalo/roedor do painel BBURH5000. b: controle negativo da reação de PCR. Observa-se que houve produtos de amplificação nas linhagens 132, 137, 141, 150, 151,162 e 163 bem como no DNA bubalino parental.
Dos 18 pares de “primers” submetidos aos experimentos de PCR com as linhagens do painel BBURH5000, oito deles (ACP5, BM1557, BMS2258, GNPI, IL3,
INSL3, MBD3, VDAC1), embora tenham apresentado amplificações diferenciadas entre búfalo e hamster durante os experimentos de gradiente de temperatura de anelamento, não amplificaram ou tiveram amplificações inespecíficas no painel RH. Por esse motivo, após várias tentativas, foram também excluídos, restando dez marcadores com resultados adequados.
M 132 133 134 137 138 139 141 143 144 145 146 147 148 150 151 153
A Tabela 1 apresenta informações dos dez marcadores genotipados no painel RH, incluindo a seqüência dos “primers” utilizados, temperatura de anelamento e a freqüência de retenção dos marcadores nas diferentes linhagens do painel.
O valor da freqüência de retenção foi obtido a partir do cálculo da porcentagem de linhagens do painel classificadas como positivas para o respectivo marcador em relação ao número total de linhagens, o qual apresentou uma variação de 10%, para o gene CRTL1, a 32% para o gene COMP.
O padrão de presença e ausência dos produtos de PCR nas linhagens híbridas dos dez genes selecionados foram registrados em tabela do tipo “Excel”, como
exemplificado na Tabela 2, e foram analisados pelos colaboradores do NIH-USA, como descrito nos trabalhos de AMARAL et al. (2007), MIZIARA et al. (2007) e STAFUZZA et al. (2007).
As análises estatísticas distribuíram os dez marcadores em três grupos de ligação utilizando LOD score 7. Seis marcadores foram agrupados em dois grupos de ligação contendo 3 marcadores (CCNH/MEF2C/RASA1 e ICAM3/IRF1/IL4). O marcador COMP mostrou-se ligado com o gene RFXANK, formando um grupo de ligação com dois marcadores. O gene RFXANK não foi analisado neste trabalho, mas consta do banco de dados de marcadores mapeados do genoma bubalino.
Três marcadores (CRTL1, GUK1 e IL12B), não apresentaram ligação com os outros marcadores analisado. Este fato, associado à distribuição dos demais 7 marcadores em grupos de ligação pequenos, indicam que a genotipagem de um maior número de marcadores será necessária para determinar corretamente a ordem e a distância dos marcadores dos respectivos grupos de ligação.
No entanto, a partir dos grupos de ligação gerados para o cromossomo 9 bubalino, foi possível realizar comparações importantes com o cromossomo 7 bovino. Para comparação, foi utilizado o mapa de seqüência do BTA7 (NCBI – Bos taurus Build
DER WIND et al., 2004), com o intuito de analisar a quais grupos de ligação cada gene estudado pertence no BTA7.
Os genes RASA1, CCNH e MEF2C, determinados neste trabalho como pertencentes ao mesmo grupo de ligação em bubalinos, estão também ligados no BTA7 (grupo de ligação 3) (EVERTS-VAN DER WIND et al., 2004), encontrando-se nas seguintes posições: RASA1 (78,791 Mb), CCNH (78,794 Mb) e MEF2C (80,03 Mb). Além disso, o gene CRTL1, que no BBU9 não foi ligado a nenhum outro dos genes analisados, pertence também ao mesmo grupo de ligação que os genes RASA1, CCNH e MEF2C no BTA7, e está localizado logo acima do gene RASA1 (78,791 Mb), na posição 78,21 Mb, sendo que juntos, ocupam um espaço de 1,82 Mb (menos que 2% da região total do cromossomo) (Figura 4). Segundo NADEAU & SANKOFF (1998), genes presentes em segmentos genômicos conservados apresentam uma tendência a se manterem ligados no genoma de espécies relacionadas, porém a ordem desses genes no segmento podem se apresentar alterada. Desta maneira, é necessário a genotipagem de um maior número de genes nesta região para indicar a posição deste gene no BBU9.
Os genes ICAM3, IL4 e IRF1, também determinados neste trabalho como pertencentes ao mesmo grupo de ligação em bubalinos, estão também ligados no BTA7 (grupo de ligação 1) (EVERTS-VAN DER WIND et al., 2004), nas seguintes posições: ICAM3 (10,76 Mb), IL4 (19,62 Mb) e IRF1 (19,76 Mb); Assim, estão numa região de 9 Mb (Figira 4). É interessante observar que, no BTA7, esses genes ICAM3, IL4 e IRF1 estão distantes 58,45 Mb dos genes RASA1, CCNH e MEF2C e desta maneira, assim como em bubalinos , estão em grupos de ligação diferentes no BTA7 (NCBI – Bos
taurus Build 3.1; EVERTS-VAN DER WIND et al., 2004).
ligado com o gene RFXANK, enquanto o gene GUK1 não apresentou-se ligado a nenhum outro marcador do conjunto.
Além dos genes CRTL1 e GUK1, o gene IL12B também não apresentou ligação com nenhum outro marcador analisado neste trabalho. No BTA7, este gene encontra-se na posição 65,1 Mb, distante 13,11 Mb do gene CRTL1 e 45,34 Mb do gene IRF1 (Figura 4), fazendo parte do grupo de ligação 2 (EVERTS-VAN DER WIND et al., 2004). Assim, a posição deste gene no cromossomo bovino em relação a posição dos outros genes analisados, pode explicar, em bubalinos, porque este gene não foi ligado a nenhum outro gene, sendo necessário a inclusão de um número maior de marcadores nesta região cromossômica para que se possa definir a sua verdadeira posição.
A partir dos resultados obtidos e da comparação dos grupos de ligação encontrados no BBU9 com o BTA7, podemos observar que, além dos 7 marcadores já mapeados por FISH no BBU9 (IL3, EEF2, RASA1, CAST, LDLR, D7S3 e RM006) (IANNUZZI et al., 2003), pela primeira vez obteve-se produto de PCR com DNA bubalino para outros 9 genes (CCNH, COMP, CRTL1, GUK1, ICAM3, IL4, IL12B, IRF1 e MEF2C), totalizando 16 genes que podem ser comparados entre o BBU9 e o BTA7.
Esses dados reforçam a teoria já demonstrada por vários autores (IANNUZZI et al., 1990; EL NAHAS et al., 1996; IANNUZZI, 1998; IANNUZZI et al., 1999; DI MEO et al., 2000; EL NAHAS et al., 2001; IANNUZZI et al., 2001 a; IANNUZZI el al., 2001 b; NAVANI et al., 2002) de que, dentro da Família Bovidae, ocorre uma conservação de braços cromossômicos, onde o número diplóide de cromossomos variam, porém grupos de genes apresentam-se conservados dentro dos braços cromossômicos (conservação de sintenia).
26 dos primers, temperatura de anelamento (TA) selecionada e freqüência de retenção (FR).
Símbolo do
Marcador Tipo
FR
(%) Forward primer (5’-3’) Reverse primer (5’-3’)
TA
(ºC) Referência
CCNH Gene 24 AAGCTTTCCAGTACCTCTCTC CAGGCTTTGGTCTTCAGTAA 60 Everts van-der Wind et al.
(2004)
COMP Gene 32 AGAACATCATCTGGGCCAACCT CCGCCACACAGACACACTTTAT 64 Everts van-der Wind et al.
(2004)
CRTL1 Gene 10 GGCTACATCATCCCAGTGAAGT CAACCTCTCAGAGCCTCAGTTT 64 Everts van-der Wind et al.
(2004)
GUK1 Gene 17 ATAAAGAAGGCCCAAGGCACTG AAGAGACAAGGTCCTCCAAGCA 60 Everts van-der Wind et al.
(2004)
ICAM3 Gene 22 CATGACATTTACCACCTGACG TTGAAGATAGGTACAGCCAAGC 50 Everts van-der Wind et al.
(2004)
IL4 Gene 17 GTGCTGGACATCTGCAAGTG ACATTCAGGTCTGTGATCCATG 57 Kappes et al. (1997)
IL12B Gene 14,44 CCAAATGCCAGGACCTCACAGT GGCTGCCACTCTTTCCTCTGTCT 64 NCBI-ePCR
IRF1 Gene 20 GGGTCACACAGGTAGTCATCAT ATGTGCTAGGACCCATACAGAG 65 Everts van-der Wind et al.
(2004)
MEF2C Gene 21 AGAGCTGGACACAGTTTGACCT CCTGCTAGAGCAAAGACTCAGA 65 Everts van-der Wind et al.
(2004)
RASA1 Gene 16 CAGTGTTCTGCATGGATTCAGC GAGCAGTTCCCAGCAGAATCTT 65 Everts van-der Wind et al.
BBURH5000 .
0: Ausência do produto de PCR na linhagem do painel BBURH5000
1: Presença do produto de PCR na linhagem do painel BBURH5000
2: Não definido (dúvida)
2 5 8 9 15 17 21 22 23 24 25 26 27 30 31 33 38
CCNH 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1
COMP 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0
CRTL1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
GUK1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
ICAM3 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
IL12B 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
IL4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
IRF1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
MEF2C 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2
Figura 7. Representação esquemática do mapa de seqüência do BTA7 (NCBI –
Bos taurus Build 3.1), com tamanho de 101 Mb, destacando a posição
dos marcadores no BTA7 que foram genotipados no BBU9.
0
0
M
M
b
b
F
F
R
R
X
X
A
A
N
N
K
K
G
G
U
U
K
K
1
1
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C
O
O
M
M
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P
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I
C
C
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M
M
3
3
I
I
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L
4
4
I
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R
F
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1
1
I
I
L
L
1
1
2
2
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B
M
M
E
E
F
F
2
2
C
C
C
C
R
R
T
T
L
L
1
1
R
R
A
A
S
S
A
A
1
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C
C
C
C
N
N
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1
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0
0
1
1
M
M
b
b
1
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0
0
2
2
0
0
3
3
0
0
4
4
0
0
5
5
0
0
6
6
0
0
7
7
0
0
8
8
0
0
9
9
0
0
4
4
,
,
3
3
9
9
M
M
b
b
9
9
,
,
0
0
0
0
M
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1
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,
,
8
8
2
2
M
M
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b
6
6
,
,
3
3
7
7
M
M
b
b
4
4
5
5
,
,
3
3
4
4
M
M
b
b
1
1
3
3
,
,
1
1
1
1
M
M
b
b
5
V. CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que:
1. Marcadores derivados do cromossomo 7 bovino, incluindo genes e microssatelites, podem ser utilizados no mapeamento do cromossomo 9 bubalino, já que pela primeira vez obteve-se produto de PCR com DNA bubalino para os genes: CCNH, COMP, CRTL1, GUK1, ICAM3, IL4, IL12B, IRF1 e MEF2C;
2. As analises de ligação com os 10 marcadores genotipados no painel BBURH5000
distribuiu os mesmos em dois grupos de ligação contendo 3 marcadores (CCNH/MEF2C/RASA1 e ICAM3/IRF1/IL4) e um grupo de ligação com 2 marcadores (RFXANK/COMP);
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