Uma montagem experimental para a medida de fluorescência.

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Desenvolvimento em Ensino de F´ısica

Uma montagem experimental para a medida de fluorescˆencia

(An experimental setup for fluorescence measurement)

J.F. Pavoni

1

, W.F.P. Neves-Junior

2

, M.A. Spiropulos

1

, D.B. de Ara´

ujo

1,3

1

Departamento de F´ısica, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil

2

Departamento de Radioterapia, Hospital S´ırio Libanˆes, S˜ao Paulo, SP, Brasil

3

Instituto do C´erebro, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brasil

Recebido em 14/4/2014; Aceito em 10/6/2014; Publicado em 3/10/2014

Neste trabalho apresentamos um arranjo simples e bastante ilustrativo que utiliza materiais dispon´ıveis em laboratórios de pesquisa e ensino de f´ısica para a medida da fluorescência. O fluor´ımetro proposto é composto basicamente por um sistema de ilumina¸cão duplo de leds, que excitam a amostra e produzem sua emissão. Em seguida, uma lente convergente focaliza a luz emitida na entrada de um monocromador e umchopper é utilizado para modular este sinal com uma frequência conhecida através de um acoplador ótico. Após isso, a luz entra em um monocromador que é responsável pela decomposi¸cão espectral, cujos componentes são detectados com um fotodiodo amplificado. Como a intensidade da luz emitida é muito baixa, utiliza-se um amplificador lock-in para filtrar esse sinal através do sinal de referência fornecido pelo acoplador ótico. Este fluor´ımetro foi testado em uma amostra fluorescente de laranja de acridina e os resultados obtidos foram bastante semelhantes aos resultados esperados por um fluor´ımetro comercial.

Palavras-chave: fluor´ımetro, fluorescência, medida da fluorescência, espectroscopia de fluorescência.

In this work we present a simple and illustrative arrangement using materials available in research and te-aching laboratories to measure fluorescence. The developed fluorimeter is basically composed of a dual LED lighting to excite the samples and produce their emission. Then, a converging lens focuses the emitted light in the entrance of a monochromator and a chopper is used to modulate this signal with a known frequency mea-sured by an optical coupler. After that, the light enters the monochromator that is responsible for its spectral decomposition into components that are finally detected by an amplified photodiode. Since the intensity of the emitted light is very low, a lock-in amplifier is used for filtering this signal by the reference signal provided by the optical coupler. This fluorimeter was tested using an acridine orange fluorescence sample and the results were very similar to those expected by a commercial fluorimeter.

Keywords: fluorimeter, fluorescence, fluorescence measurement, fluorescence spectroscopy.

1. Introdu¸

c˜

ao

A ciência tem desvendado a estrutura da matéria através do uso da radia¸cão eletromagnética em técnicas espectroscópicas [1]. Essas técnicas analisam a radia¸cão que é absorvida, emitida ou espalhada pela amostra de interesse. Os dados espectroscópicos são geralmente representados por um espectro, que é a representa¸cão gráfica da resposta de interesse em fun¸cão do compri-mento de onda e que são fornecidos por aparelhos cha-mados espectrômetros.

Os espectrômetros são amplamente utilizados em pesquisas f´ısicas e diversos equipamentos comerciais estão dispon´ıveis nos laboratórios de pesquisa e ensino. Eles podem apresentar diversos arranjos experimentais, mas em geral possuem três elementos básicos: uma

fonte de radia¸cão, um monocromador e um detector. A maior parte destes equipamentos comerciais são fe-chados e, a partir da coloca¸cão da amostra, fornecem diretamente o espectro desejado.

Neste trabalho propõem-se a constru¸cão de um espectrômetro de fluorescência ou simplesmente um fluor´ımetro [2], utilizando solu¸cões baratas e/ou pre-viamente dispon´ıveis em laboratórios de ensino, para que seja usado em atividades experimentais de f´ısica moderna para ilustra¸cão de todos os passos envolvidos na aquisi¸cão do espectro de fluorescência.

A fluorescência é um fenômeno muito estudado, pois diversos processos e sistemas de interesse biológico en-volvem moléculas que absorvem e emitem radia¸cão na faixa do ultravioleta e vis´ıvel do espectro. As

medi-1_{E-mail: jfpavoni@ffclrp.usp.br.}

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das de fluorescência de macromoléculas fornecem forma¸cões sobre: conforma¸cão, s´ıtios de liga¸cão, in-tera¸cões com solventes, grau de flexibilidade, distâncias intermoleculares e coeficiente de difusão rotacional de macromoléculas.

Como o tempo caracter´ıstico envolvido no processo de fluorescência (da ordem de 10−9 _{s) é comparável}

com eventos relacionados à intera¸cão com o meio cir-cundante, esta técnica é particularmente atraente para o estudo de diversos fenômenos relacionados às propri-edades biof´ısicas de moléculas biológicas. Além disso, por ser um método extremamente sens´ıvel, mesmo bai-xas concentra¸cões de amostra podem ser estudadas, o que a torna uma técnica de grande interesse para estu-dos qu´ımicos e farmacêuticos.

2. Base te´

orica

Em temperatura ambiente, a maioria das moléculas está em seu n´ıvel vibracional e rotacional fundamen-tal. Quando estas moléculas são irradiadas com fótons de frequências apropriadas, podem absorver energia e passar do estado fundamental para vários estados vi-bracionais do estado eletrônico excitado. Colisões com outras moléculas fazem com que a molécula excitada perca energia vibracional até alcan¸car o estado vibra-cional de menor energia dentro do estado excitado. Como esse estado é instável, as moléculas voltam ime-diatamente para qualquer n´ıvel vibracional do estado eletrônico fundamental emitindo um fóton neste pro-cesso, que carrega a energia fluorescente. Por existi-rem diversos n´ıveis vibracionais no estado fundamental, os fótons emitidos possuem diferentes energias e conse-quentemente diferentes frequências. Analisando as in-tensidades emitidas nas diferentes frequências é poss´ıvel se obter o espectro de emissão de fluorescência na es-pectroscopia de fluorescência [3,4].

Em geral, o fóton de emissão fluorescente carrega menos energia que o fóton de excita¸cão, devido às poss´ıveis perdas de energia nas transi¸cões dos estados vibracionais do estado eletrônico excitado, o que per-mite que os espectros de absor¸cão e emissão sejam dis-tinguidos. Cada molécula fluorescente possui um com-primento de onda de excita¸cão e um comcom-primento de onda de emissão caracter´ıstico, sendo a distância en-tre eles chamada de deslocamento de Stokes (Fig. 1). O deslocamento de Stokes é fundamental para a de-teçcão da fluorescência, especialmente em aplica¸cões biológicas, uma vez que moléculas com grandes des-locamentos de Stokes tem fluorescência facilmente de-tectável, enquanto que a fluorescência de moléculas com pequenos deslocamentos de Stokes é de dif´ıcil deteçcão.

3. Montagem experimental

O esquema experimental idealizado para o fluor´ımetro a ser constru´ıdo est´a ilustrado na Fig. 2. Toda a

mon-tagem é realizada sobre um trilho para alinhamento dos equipamentos. O fluor´ımetro é composto basicamente por um sistema de ilumina¸cão duplo de leds, que exci-tam a amostra e produzem sua emissão. Em seguida, uma lente convergente focaliza a luz emitida na entrada do monocromador e um chopper é utilizado para mo-dular este sinal com uma frequência conhecida através de um acoplador ótico. Após isso, a luz entra em um monocromador, responsável pela decomposi¸cão espec-tral, cujos componentes são detectados com um fotodi-odo amplificado. Como a intensidade da luz emitida é muito baixa, o sinal detectado ao final do experimento é ruidoso. Assim, para melhoria dos resultados obtidos com a obten¸cão apenas da componente de luz emitida pela amostra, utilizamos um amplificador lock-in para filtrar esse sinal através do sinal de referência fornecido pelo acoplador ótico.

Figura 1 - O deslocamento de Stokes do espectro de excita¸cão e emissão em amostras fluorescentes. Na esquerda, uma molécula com um grande deslocamento de Stokes e na direita um pequeno deslocamento.

3.1. Fonte de excita¸c˜ao da amostra e o sistema de ilumina¸c˜ao

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Figura 2 - Esquema experimental idealizado.

Figura 3 - Espectro de emiss˜ao dos dois Leds azuis utilizados no experimento.

O sistema de ilumina¸cão foi constru´ıdo sobre uma base de acr´ılico em um suporte para posicionamento sobre o trilho ótico (Fig. 4). No centro desta base foi frezado um local para o encaixe de uma cubeta. Em distâncias iguais e em ambos os lados da cubeta, foram feitos dois suportes em nylon para a fixa¸cão dos leds azuis, estes suportes possuem altura regulável através de parafusos laterais na base de acr´ılico.

Os leds, já ligados aos fios para sua conexão com a fonte, foram colocados dentro de tubos pintados de preto, para condu¸cão da luz até a amostra, evitando que ela sa´ısse lateralmente pelo tubo e atrapalhasse a deteçcão da fluorescência. A distância entre os leds e a cubeta também era ajustável por parafusos, que po-dem ser visualizados na Fig. 4, na parte superior dos suportes de nylon.

Figura 4 - Sistema de ilumina¸c˜ao.

Esta geometria para ilumina¸cão da amostra foi ide-alizada, de maneira a maximizar e homogeneizar a ex-cita¸cão da amostra. Além disso, o arranjo perpendicu-lar de excita¸cão em rela¸cão à deteçcão da fluorescência deveria evitar a deteçcão direta de luz proveniente dos leds.

3.2. Convergˆencia do feixe de emiss˜ao da amos-tra

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uma lente convergente com uma distância focal pequena (5 cm), de modo a diminuir distância necessária entre o ponto de emissão da amostra e a entrada do monocro-mador, minimizando a perda de luz no caminho ótico.

Figura 5 - Lente convergente utilizada, fixa em um suporte.

3.3. Modula¸cão do sinal para deteçcão

Um importante artif´ıcio usado neste experimento, foi a modula¸cão do feixe de luz emitida pela amostra com uma frequência conhecida. O sinal modulado foi am-plificado e filtrado por um lock-in (Stanford Research Systems modelo SR530) com base no sinal de referência fornecido pelo acoplador ótico, o que permitiu a dimi-nui¸cão da interferência de fontes de luz externas no sinal captado pelo detector.

Para a modula¸c˜ao foi constru´ıdo umchopper, com-posto por um disco de alum´ınio fixo em um motor que produziria a sua rota¸c˜ao (Fig. 6a). Na parte inferior do

chopper, através de uma haste, foi fixado um acoplador ótico. O esquema desse sinal pode ser visualizado na Fig. 6b. Para ochopper foi feita a conexão do motor com a fonte geradora e para o acoplador ótico, além da conexão com a fonte, foi feita uma sa´ıda direta com cabo coaxial para olock-in.

A frequência utilizada no chopper foi regulada em 30Hz por limita¸cões mecânicas do motor utilizado, esta foi a maior freqüência que era poss´ıvel ser mantida estável por um bom intervalo de tempo, sem risco de da-nificar o motor. No entanto, idealmente, quanto maior a freqüência, menor a influência do ru´ıdo rosa (ou de 1/f), e uma freqüência da ordem de 1 kHz seria sufi-ciente para minimizar tal influência, desde que o am-plificadorlock-in utilizado consiga operar faixa. É im-portante também ressaltar que a freqüência de 60 Hz (e seus harmônicos, e.g.: 120 Hz) de oscila¸cão da rede elétrica AC deve ser evitada para livrar o sinal de fontes de luz ambiente indesejadas.

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3.4. Monocromador e a sele¸cão dos compri-mentos de onda de deteçcão

Na montagem experimental foi utilizado um monocro-mador comercial (Oriel, modelo 7240) para coletar a luz emitida pela amostra e fornecer como sa´ıda uma única linha espectral para constru¸cão do espectro de emissão da amostra (Fig. 7). As fendas utilizadas no monocro-mador foram constru´ıdas utilizando lâminas de barbear contrapostas, com uma abertura de aproximadamente 1 mm.

Figura 7 - Monocromador utilizado.

3.5. Sistema de detec¸c˜ao

O detector utilizado nesta montagem foi o OPT301 [5], um circuito integrado opto-eletrˆonico contendo um fo-todiodo e um amplificador de transimpedˆancia em um ´

unico chip isolado dieletricamente (Fig. 8a). Ele inclui um conversor corrente-tensão que proporciona na sa´ıda uma tensão proporcional à luz recebida. Além disso, o conversor é implementado com um amplificador opera-cional e, portanto, também amplifica o sinal, de modo a conseguir boa sensibilidade. Sendo assim, basta ali-mentar o dispositivo com duas tensões de polaridades oposta referentes à massa, para ter um completo sensor analógico de luminosidade (Fig. 8b). A combina¸cão in-tegrada de fotodiodo e amplificador de transimpedância em um único chip elimina os problemas frequentemente encontrados em circuitos discretos, tal como erros por corrente de fuga, ru´ıdo e picos de ganho devido à perda de capacitância.

Figura 8 - a. O detector OPT301. b. circuito do detector. c. resposta em fun¸c˜ao do comprimento de onda.

A corrente do fotodiodo é proporcional à potência radiante ou fluxo (em watts) incidindo no fotodiodo. Para um comprimento de onda de 650 nm (luz verme-lha) a capacidade de resposta do fotodiodo é aproxi-madamente 0,47 A/W. A capacidade de resposta para outros comprimentos de onda é mostrada em uma curva de performance t´ıpica (Fig. 8c).

O sistema de deteçcão utilizado no experimento foi montado colocando o detector OPT301 em uma caixa (Fig. 9). Sua alimenta¸cão foi feita com duas baterias de 9 V. Com isso foram evitadas flutua¸cões da rede elétrica e consequentemente algum dano no detector. Também foi feita a liga¸cão direta do detector com olock-in uti-lizando novamente um cabo coaxial.

3.6. Filtragem e amplifica¸c˜ao do sinal detec-tado

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Figura 9 - Sistema de deteçcão usando o detector OPT301. a. visão frontal. b. visão lateral.

3.7. Montagem do fluor´ımetro

A montagem total do experimento foi feita sobre uma bancada e em um laboratório que pudesse ser mantido escuro durante toda a realiza¸cão da medida. Esta etapa inclui o alinhamento do sistema ótico e para isso alguns procedimentos foram realizados:

1◦_{) Posicionamento dos componentes do sistema na}

mesma altura e em linha reta:

Para alinhar a posi¸cão vertical e lateral de cada uma das pe¸cas do sistema óptico foi ligado um laser e di-recionamos seu feixe paralelamente ao eixo óptico do sistema, passando pela altura da excita¸cão da amos-tra pelos leds. Feito isso, foram posicionados cada um dos componentes de maneira que o feixe de laser pas-sasse por todos eles sem sofrer desvios. Ou seja, foram alinhados o chopper de maneira que o laser passasse exatamente pelo meio de uma das aberturas, a lente de maneira que o laser passasse pelo seu centro e o mono-cromador de maneira que o laser incidisse no meio da fenda de entrada.

2◦_{) Focaliza¸c˜ao com a lente:}

A lente foi posicionada de maneira que ficasse com seu foco na fenda de entrada do monocromador. Para isso, o laser foi desligado, o sistema de excita¸c˜ao da amostra foi ligado e, com o olho na fenda de sa´ıda do monocromador foi visualizada em que posi¸c˜ao da lente podia-se enxergar uma maior intensidade de sinal. Note

que para isso o monocromador dever estar regulado no comprimento de onda de mais alta intensidade de fluo-rescência da amostra. E também é necessário muito cui-dado para não desalinhar a altura da lente, bem como sua posi¸cão lateral, ou seja, deve-se movê-la lentamente apenas no sentido longitudinal do sistema, até encon-trar a posi¸cão ideal.

3◦_{) Posicionamento do detector:}

O posicionamento do detector é feito ao final do pro-cesso, para isso é ligado novamente o laser e o detector é posicionado encostado na fenda de sa´ıda do monocro-mador. Para encontrar a posi¸cão correta do detector, seu posicionamento é feito com ele ligado e conectado a um osciloscópio, até que encontre-se a indica¸cão do sinal devido à intensidade do laser. Em seguida, o de-tector é conectado aolock-in.

Na Fig. 10 temos uma vis˜ao geral de todo o experi-mento e a Fig. 11 apresenta em detalhes o sistema de ilumina¸c˜ao, a lente, ochopper e a entrada do monocro-mador.

Figura 10 - Vis˜ao geral do experimento.

Figura 11 - Detalhes do sistema de ilumina¸c˜ao, da lente, do chop-per e do monocromador.

4. Sele¸

c˜

ao da amostra fluorescente

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de absor¸cão em uma região próxima a ao espectro de emissão dos leds.

A substância escolhida foi a laranja de acridina,cuja fórmula estrutural está indicada na Fig. 12. A presen¸ca de anéis benzênicos na sua estrutura comprova que a substância é fluorescente. O espectro de absor¸cão e de fluorescência desta amostra foram medidos em um espectrômetro de fluorescência comercial (Hitachi, mo-delo F-7000) e os resultados obtidos estão indicados na Fig. 13, esta curva de fluorescência será utilizada como referência para a avalia¸cão dos resultados obtidos com o fluor´ımetro montado.

Figura 12 - F´ormula estrutural da laranja de acridina.

Figura 13 - Espectros de absor¸c˜ao e de fluorescˆencia da laranja de acridina.

Comparando os espectros de absor¸cão da amos-tra e de emissão dos leds (Fig. 14) foi comprovado que essa substância pode ser utilizada para medida no fluor´ımetro proposto.

A prepara¸cão da solu¸cão de laranja de acridina é feita apenas pela sua dilui¸cão em água, a quantidade necessária da substância é muito pequena, basta encos-tar o bico de um pasteur no pó e depois colocá-lo na cubeta com água. A solu¸cão resultante fica pratica-mente incolor. É necessária aten¸cão para não deixar a solu¸cão muito concentrada, pois isso causaria um efeito de filtro interno e toda luz fluorescente seria reabsor-vida pela própria solu¸cão, deixando que a intensidade de fluorescência medida neste caso seja muito baixa.

Figura 14 - Espectros de absor¸cão e de fluorescência da laranja de acridina, juntamente com os espectros de emissão dos leds.

5. Aquisi¸

c˜

ao do espectro de

fluores-cˆ

encia

Com o fluor´ımetro montado e alinhado, liga-se todos os componentes: leds,chopper, detector elock-ine inicia-se o processo de medida que consiste em variar o com-primento de onda de sa´ıda no monocromador e medir a intensidade de voltagem indicada pelo lock-in, com seu respectivo erro, que corresponde à oscila¸cão no va-lor indicado. A curva de fluorescência da amostra foi levantada duas vezes para comprimentos de onda vari-ando de 350 a 700 nm.

6. Resultados e discuss˜

ao dos dados

A Fig. 15 apresenta as duas curvas de fluorescˆencia le-vantadas utilizando o sistema desenvolvido e tamb´em a curva esperada obtida com o fluor´ımetro comercial. Em detalhe, visualiza-se uma foto da amostra sendo excitada com a luz azul e fluorescendo com a luz verde.

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Pode-se notar pela Fig. 15 que os resultados obti-dos concordam bastante com o resultado esperado. No entanto, comparando as curvas obtidas com a curva es-perada notamos a presen¸ca de dois picos extras, um em torno de 450 nm e outro a 600 nm, que n˜ao fazem parte do espectro esperado da amostra.

O primeiro pico pode ser facilmente justificado, pois ocorre aproximadamente no pico da emissão dos leds utilizados para excita¸cão e, sendo assim, corresponde à deteçcão de luz espalhada proveniente dos leds de ex-cita¸cão. Já o segundo pico, na faixa de 600 nm, pode ser explicado pelo fato do detector OPT301 ter uma sensi-bilidade variável com o comprimento de onda (ver Fig. 8c). Em virtude disso, pode-se aperfei¸coar a análise dos

resultados aplicando uma corre¸c˜ao de forma a eliminar a contribui¸c˜ao intr´ınseca da diferen¸ca de sensibilidade do detector para os diferentes comprimentos de onda do espectro.

Para fazer esta corre¸cão, foi extra´ıda parte da curva de sensibilidade do detector (Fig. 8c) correspondente à faixa de comprimentos de onda de interesse. A curva obtida foi normalizada pelo seu valor máximo e inver-tida para a cria¸cão da curva de corre¸cão a ser aplicada aos resultados (Fig. 16). Com isso, multiplicando-se a curva de corre¸cão ponto a ponto à curva experimen-tal obtida com nosso sistema, anula-se a influência da varia¸cão da sensibilidade do detector para os diferentes comprimentos de onda estudados. _⌋

Figura 16 - Esquema de constru¸c˜ao da curva de corre¸c˜ao aplicada aos resultados.

⌈

O resultado corrigido para a medida 2, que foi a que apresentou um pico maior próximo ao comprimento de onda de 600 nm, são apresentados na Fig. 17. Pode-se notar, que após a corre¸cão, o resultado Pode-se aproxima ainda mais da curva esperada. No entanto, foi encon-trada uma contribui¸cão ainda maior devido ao pico pro-veniente da luz espalhada dos leds na amostra e cubeta. Essa contribui¸cão poderia ser minimizada por meio de uso de filtros após a lente convergente, mas isso poderia também causar redu¸cão no sinal de fluorescência detec-tado. Outra alternativa seria o uso de um anteparo entre o sistema de ilumina¸cão e os demais componentes do fluor´ımetro, neste anteparo deveria existir uma aber-tura no eixo ótico do sistema para passagem apenas da luz resultante da fluorescência.

O segundo pico, devido à influência do detector na medida, foi corrigido. A curva ficou também mais es-treita, sendo que a região posterior ao pico se aproximou da curva “real”, o que era de se esperar, já que o detec-tor é mais sens´ıvel na faixa do vermelho e infravermelho próximo que na faixa do azul, onde a curva se afastou

da curva real.

Figura 17 - esultado corrigido.

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com dispositivo comercial. Seria poss´ıvel melhorar a resolu¸cão utilizando um monocromador de maior re-solu¸cão e também uma fenda mais estreita, de modo a selecionar melhor o comprimento de onda a ser medido (estreitar a faixa de freqüência de sa´ıda).

Por tudo o que foi apresentado pode-se verificar que a medida da fluorescˆencia da amostra foi feita de forma simples, obtendo resultados semelhantes ao de um fluor´ımetro comercial.

Uma caracter´ıstica importante do arranjo apresen-tado é que ele não se limita aos leds azuis de excita¸cão, nem à laranja de acridina como substância fluorescente, o que amplia sua aplica¸cão prática. Outros comprimen-tos de onda de excita¸cão e outras substâncias também poderiam ser avaliados, como por exemplo, a excita¸cão com leds vermelhos para medida da fluorescência de um extrato alcoólico de folhas verdes que contém clorofila. O fluor´ımetro proposto também não se restringe apenas à medida do espectro de fluorescência, ele pode ser aplicado para estudo de outras caracter´ısticas relaci-onadas ao processo de fluorescência. Dentre elas pode-mos destacar a supressão de fluorescência, bastando-se apenas adicionar compostos supressores da fluo-rescência à solu¸cão estudada que alterem, por exemplo, a sua temperatura ou o seu pH. Além disso, pode-se avaliar também o efeito da concentra¸cão da substância fluorescente na solu¸cão analisada e seu papel de filtro interno da fluorescência.

7. Conclus˜

oes

Foi apresentado um arranjo simples para a medida do espectro de fluorescência de amostras utilizando ma-teriais simples e/ou previamente dispon´ıveis em labo-ratórios de f´ısica. Acredita-se que o entendimento do processo de medida é bem didático e ilustrativo

bene-ficiando alunos de disciplinas experimentais de f´ısica moderna no entendimento do processo de espectrosco-pia.

Acredita-se que, além da visualiza¸cão passo a passo da medida da fluorescência, esta montagem e análise dos dados também proporciona aos alunos experiências importantes como a corre¸cão dos resultados pela sen-sibilidade do detector, um conhecimento que pode ser aplicado em qualquer medida realizada experimental-mente e contribui bastante para a melhoria dos resulta-dos obtiresulta-dos, sendo assim uma vivência importante para os alunos.

Agradecimentos

Aos técnicos Eldereis de Paula, José Luiz Aziani, Nel-son Nascimento Junior, Élcio Aparecido Navas Lou-ren¸co Rocha. Em especial ao professor Iouri Borisse-vitch pelo suporte na escolha das amostras e nas medi-das de referência feitas em equipamentos comerciais.