UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CARACTERÍSTICAS SEMINAIS E RESFRIAMENTO DE SÊMEN DE TAMANDUÁS-BANDEIRA (Myrmecophaga tridactyla) DE VIDA LIVRE
CAMILA DO NASCIMENTO LUBA
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CARACTERÍSTICAS SEMINAIS E RESFRIAMENTO DE SÊMEN DE TAMANDUÁS-BANDEIRA (Myrmecophaga tridactyla) DE VIDA LIVRE
CAMILA DO NASCIMENTO LUBA
Dissertação apresentada junto ao programa de pós-graduação em Biotecnologia Animal para obtenção do título de mestre.
Orientador: Prof. Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira
Nome do autor: Camila do Nascimento Luba
Título: CARACTERÍSTICAS SEMINAIS E RESFRIAMENTO DE SÊMEN DE TAMANDUÁS-BANDEIRA (Myrmecophaga tridactyla) DE VIDA LIVRE
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Assistente Dr. João Carlos Pinheiro Ferreira Presidente e Orientador
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP, Botucatu-SP
Prof. PhD. Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga Membro
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP, Botucatu-SP
Prof. Dr. Marcelo Alcindo de Barros Vaz Guimarães Membro
Departamento de Reprodução Animal FMVZ – USP, São Paulo-SP
AGRADECIMENTOS
Professor João Carlos Pinheiro Ferreira, obrigada pela oportunidade e por ter me recebido de braços abertos, ainda que com uma idéia ousada e inovadora, pelos ensinamentos, broncas, incentivos e por ter confiado em mim até o final.
Família: Obrigada pelo apoio financeiro, psicológico e emocional, por acreditarem sempre em mim, aceitarem a minha ausência e me incentivarem a correr atrás dos meus sonhos sempre. Vocês são a base de tudo.
CERAN: Obrigada Professor Frederico Ozanan Papa, Gabriel Monteiro, Yamê Fabres, Felipe Hartwig, Camila Dell'Aquae Priscilla Guasti pela forma como me receberam no laboratório, por me passarem o conhecimento de vocês e me ajudarem a planejar o experimento.
Projeto Tamanduá:
Flávia Miranda obrigada por me fornecer toda a estrutura para conseguir trabalhar a campo e por todos os ensinamentos sobre Xenarthras e conservação.
Alexandre Martins obrigada pela disposição, pelos mapas, pela força e incentivo a campo quando o cansaço era grande na procura pelos tamanduás.
Vinícius Gasparotto obrigada pelas corridas ninjas e tiros em movimento com a zarabatana, por ser o melhor ASCP que existe, sempre me socorrer e ouvir minhas lamentações, me colocando para cima com nossos ideais em comum.
Paola Stramandinoli e Carolina Lorieri pela amizade e ajuda a campo.
Mariana Catapani obrigada pela irmandade, doçura, e parceria emocional e profissional.
Além disso, obrigada EQUIPE por dispenderem do tempo de vocês, me ajudarem de coração sem receber nada em troca, largarem os empregos, madrugarem (ou não dormirem), e ainda sempre bem humorados e dispostos. Eu devo muito a vocês e serei grata o resto da vida.
PZMQB: Rodrigo Teixeira sempre disposto a ajudar no que é preciso, Adauto Nunes, Cecília Pessuti, Alícia Hippólito e Henrique Riva obrigada a todos pela confiança, oportunidade de realização dos pilotos, anestesias e necropsias concedidas.
POUSADA AGUAPÉ: Joana, André, Sr. João, Jaira, Fabiano, Rosalino, e todos os funcionários, obrigada por conceder o espaço para a base de campo, auxiliares e pela boa vontade e disposição em ajudar sempre.
Aos amigos: Taina Gonçalves, Daniel Capucho, Andressa Tucholski, Carla Queiróz, Mariane Boaretto, Babi Del Corso obrigada pela amizade, incentivo, por torcerem por mim, aguentarem meus surtos e choros, e me levantarem todas as vezes que pensei em desistir.
Caroline Destro obrigada por me ajudar com as colorações no laboratório de FIV.
Professora Fabiana Ferreira de Souza obrigada pelo incentivo e ajuda em todas as correções.
ProfessorSony e José Dell'Aqua obrigada pela banca de qualificação, vocês foram essenciais para a elaboração desta dissertação.
Professora Fernanda da Cruz Landim obrigada por aceitar meu convite para a banca e pela ajuda com a microscopia eletrônica.
Professor Marcelo Guimarães obrigada por se colocar sempre a disposição em ajudar desde o início do projeto e por aceitar o convite para a banca. Sua sabedoria e experiência não poderiam faltar neste trabalho.
À FAPESP obrigada pelo auxílio financeiro.
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1: Mapa de distribuição da espécie Myrmecophaga tridactyla . ... 7 Figura 2: Foto ilustrativa do pênis de um tamanduá-bandeira, demonstrando o sulco medial ventral e a ausência de testículos externos. ... 10
ARTIGO 1
Figura 1: Animal após receber dardo anestésico, localizado na musculatura do membro torácico esquerdo ... 22 Figura 2: Probe confeccionada para realização de eletroejaculação em tamanduás-bandeira ... 24 Figura 3: Aspecto microscópico dos espermatozoides de tamanduá-bandeira corados pelo método Karras-modificado sob aumento de 1000x ... 31 Figura 4: Aspecto microscópico do sêmen de Myrmecophaga tridactyla em aumento de 200x, contendo grânulos arredondados (setas pretas) e espermatozoides (setas vermelhas) ... 33 Figura 5: Grânulos de lipídio (seta) evidenciados pela coloração oil-red O observados no ejaculado de tamanduás-bandeira em aumento de 6300x ... 34 Figura 6: Aspecto microscópico da célula espermática de tamanduá-bandeira apresentando os seus valores morfométricos médios ± erro padrão ... 35
ARTIGO 2
cabeça espermática – AC: crista apical. (C) A: acrosoma; AC: crista apical; NU: núcleo espermático; IF: fossa de implantação; CAP: capitulum; PC: centríolo proximal; M: mitocôndria; MS: bainha mitocondrial; setas pretas: segmento equatorial; setas vermelhas: pontos difusos elétron-lucentes presentes no núcleo. (D) MP: peça intermediária; PP: peça principal; AN: annulus; MS: bainha mitocondrial. (E) NU: núcleo; OAM: membrana acrossomal externa; IAM: membrana acrossomal interna; PL: plasmalema; AC: crista apical; PA: região pós-acrossomal; setas pretas: segmento equatorial; setas vermelhas: pontos difusos elétron-lucentes presentes no núcleo. (F) corte transversal da cauda – AX: axonema; MS: bainha mitocondrial; ODF: fibra densa externa .... 53
LISTA DE TABELAS
ARTIGO 1
Tabela 1: Valores individuais e médios (± erro padrão) das características seminais de tamanduá-bandeira de vida livre ... 30
Tabela 2: Classes morfológicas encontradas em espermatozoides do tamanduá-bandeira espressas em porcentagem, sob coloração com Karras-modificado e DIC, e média (± erro padrão) das alterações encontradas para cada técnica ... 32
LISTA DE ANEXOS
Figura 1: Morfologia espermática sob coloração com Karras-modificado. a) célula espermática normal; b) cabeça piriforme e cauda abaxial; c) cabeça com contorno anormal; d) cabeça subdesenvolvida; e) Acrossomo lesado e gota citoplasmática proximal; f) defeito em peça intermediária; g) gota citoplasmática distal; h) cauda abaxial; i) cauda fortemente dobrada; j) cauda dobrada com gota citoplasmática.. ... 77
Figura 2: Morfolgia espermática em microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC). a, b, c) células espermáticas normais; d) defeito de acrossomo e cauda dobrada; e) cauda dobrada com gota citoplasmática; f) gota citoplasmática proximal; g) gota citoplasmática distal; h) cauda abaxial; i) cauda enrolada. ... 78
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS ANOVA CEMPAS CITES DIC EP I.M.P. IUCN MA1 MA2 MA3 MA4 MA5 MA6 MA7
Análise de variância
Centro de Medicina e Pesquisa em Animais Selvagens
Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora
Microscopia de contraste de interferência diferencial Erro Padrão
Índice de integridade da membrana plasmática International Union for Conservation of Nature
Primeiro animal da espécie Myrmecophaga tridactyla encontrado em Aquidauana
Segundo animal da espécie Myrmecophaga tridactyla encontrado em Aquidauana
Terceiro animal da espécie Myrmecophaga tridactyla encontrado em Aquidauana
Quarto animal da espécie Myrmecophaga tridactyla encontrado em Aquidauana
Quinto animal da espécie Myrmecophaga tridactyla encontrado em Aquidauana
Sexto animal da espécie Myrmecophaga tridactyla encontrado em Aquidauana
MB1
M6
M12
M18
M24
Primeiro animal da espécie Myrmecophaga tridactyla apreendido em Botucatu
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ... vi
LISTA DE TABELAS ... viii
LISTA DE ANEXOS ... ix
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS ... x
RESUMO ... xiii
ABSTRACT ... xv
INTRODUÇÃO ... 2
OBJETIVOS ... 5
REVISÃO DE LITERATURA ... 6
1. Taxonomia e características da espécie ... 6
2. Habitat e distribuição geográfica ... 7
3. Situação atual da espécie ... 7
4. Características Reprodutivas do tamanduá-bandeira ... 8
5. Características seminais da espécie ... 10
6. Colheita de sêmen ... 11
7. Análise subjetiva convencional da motilidade e vigor espermáticos ... 12
8. Avaliação da integridade de membrana plasmática e morfologia espermática . 13 9. Microscopia eletrônica de transmissão ... 15
10. Refrigeração de sêmen ... 15
TRABALHOS CIENTÍFICOS ... 17
DETERMINAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS SEMINAIS E REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN DE TAMANDUÁS-BANDEIRA (Myrmecophaga tridactyla) DE VIDA LIVRE ... 17
AVALIAÇÃO POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO DOS ESPERMATOZOIDES DE TAMANDUÁS-BANDEIRA (Myrmecophaga tridactyla) DE VIDA LIVRE ... 45
DISCUSSÃO GERAL ... 60
CONCLUSÕES GERAIS ... 64
REFERÊNCIAS ... 65
ANEXOS ... 77
APÊNDICE ... 80
RESUMO
LUBA, C. N. Características seminais e resfriamento de sêmen de tamanduás-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) de vida livre. Botucatu, 2014. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
motilidade e vigor até no máximo 24 horas, com valores decrescentes em ambos os parâmetros com o decorrer do tempo.
ABSTRACT
LUBA, C. N. Seminal characteristics and cooling semen of in situ anteaters (Myrmecophaga tridactyla). Botucatu, 2014. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
INTRODUÇÃO
O Brasil representa uma importante reserva de biodiversidade de flora e fauna mundial, o que oferece muitas possibilidades de estudo e avanços científicos para o país, principalmente em relação a conservação de espécies. Dentre essas possibilidades, uma das áreas mais importantes é a reprodução de animais silvestres. Porém, para que se possa contribuir e utilizar biotecnologias da reprodução é necessário desenvolver pesquisas básicas sobre os mecanismos e estruturas envolvidos no processo reprodutivo de cada espécie (GUIMARÃES, 2008).
O tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) é o maior representante da família Myrmecophagidae, pertencente a ordem Pilosa e Superordem Xenarthra. A espécie é restrita às Américas Central e do Sul, sendo encontrado em todo o território brasileiro (MEDRI & MIRANDA, 2010) e considerada extinta no Uruguai (FALLABRINO & CASTIÑEIRA, 2006), Belize, Guatemala e Costa Rica. Considerando-se que as populações da espécie diminuíram cerca de 30% nos últimos 10 anos, a União Internacional de Conservação da Natureza (IUCN) inclui esta espécie na categoria Vulnerável, ou seja, enfrenta um grande risco de extinção em médio prazo. Ainda assim, pouco se sabe sobre aspectos reprodutivos do tamanduá-bandeira, o que torna ainda mais difícil a utilização de algumas técnicas de reprodução assistida para auxiliar a conservação da espécie.
da biodiversidade. As perdas de grandes áreas naturais e a fragmentação de matas geram pequenas populações isoladas, o que pode acarretar em superlotação, aumento da endogamia, e aumento da susceptibilidade à doenças (LASLEY et al., 1994). Desta forma, a reprodução é fundamental para a conservação de espécies, populações e indiretamente à vitalidade de todos os ecossistemas (WILDT et al, 2003).
A fertilidade em animais do sexo masculino é o resultado de uma série de fatores que envolvem a capacidade do macho de produzir e ejacular gametas saudáveis (potentia generandi) e de realizar adequadamente a cópula (potentia coeundi). O recurso biotecnológico mais adequado para se inferir a potentia generandi é o exame andrológico. As etapas fundamentais deste exame são o exame físico geral do animal, associado a um exame rigoroso dos órgãos do sistema reprodutor masculino, seguido da colheita e avaliação seminal (CBRA, 1998).
Mendonça (2010) avaliou o sêmen de tamanduás-bandeira de cativeiro em zoológicos do estado de São Paulo e encontrou grande proporção de indivíduos com alterações seminais graves. Ao final do estudo o autor ressaltou a necessidade de serem estudadas características seminais de animais de vida livre, pois posto que, a qualidade espermática é resultado de fatores envolvendo a sanidade genética e a qualidade dos manejos ambiental, sanitário e nutricional, entre outros, só assim torna-se possível uma compreensão real das características espermáticas da espécie.
OBJETIVOS
Caracterizar o aspecto macroscópico como volume, cor, odor, aspecto e pH do sêmen de tamanduás-bandeira de vida livre.
Determinar os parâmetros motilidade, vigor, concentração e integridade de membrana plasmática de amostras seminais da espécie.
Estabelecer a morfologia espermática por meio de microscopia de luz e microscopia com contraste de fase de interferência diferencial (DIC). Analisar ultraestruturalmente as células espermáticas por meio de
microscopia eletrônica de transmissão.
REVISÃO DE LITERATURA
1. Taxonomia e características da espécie
A superordem Xenarthra é dividida em duas ordens: Cingulata (Tatus) e Pilosa (Tamanduás e Preguiças). São mamíferos com características únicas como: articulações secundárias denominadas “xenarthrales” localizadas entre as vértebras lombares, ossos pélvicos fusionados, taxa metabólica baixa e temperatura corporal variável sendo em média de 33°C (VALDES e SOTO, 2011). A ordem Pilosa engloba a Subordem Vermilingua, e esta por sua vez a família Myrmecophagidae, formada por tamanduás (MACKENNAL & BELL, 1997).
Myrmecophaga tridactyla é o maior membro da família, pode medir até 2,1 m de comprimento e pesar até 45 kg (MEDRI et al., 2006). Muitas características anatômicas dos tamanduás refletem sua extrema especialização em uma dieta mirmecófaga, ou seja, baseada em formigas e cupins. Seus fortes membros anteriores são providos de grandes garras, que lhes permitem não só despedaçar formigueiros e cupinzeiros, como também se defender de predadores (SUPERINA, 2012).
2. Habitat e distribuição geográfica
O tamanduá-bandeira habita florestas tropicais úmidas, florestas secas, savanas e pradarias (MERITT, 2008). É encontrado na Colômbia, Equador, Venezuela, do Sul das Guianas até o Peru, Brasil, Bolívia e do Paraguai ao Norte da Argentina (GARDNER, 2007) (Figura 1).
Figura 1: Mapa de distribuição da espécie Myrmecophaga tridactyla (IUCN, 2012).
3. Situação atual da espécie
Guatemala, Costa Rica (MEDRI & MIRANDA, 2010) e Uruguai (FALLABRINO & CASTIÑEIRA, 2006). No Brasil já desapareceu no estado de Santa Catarina (CHEREM et al., 2004) e ainda é considerado criticamente em perigo de extinção no Rio Grande do Sul (FONTANA et al., 2003).
Devido à situação crítica, esta espécie é avaliada como “Vulnerável” pela IUCN (International Union for Conservation of Nature) (MEDRI e MIRANDA, 2010) e listada no Apêndice II do CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) como uma espécie de alta probabilidade de extinção, a menos que suas ameaças sejam rigorosamente controladas (CITES, 2014).
Quando considerados os últimos 10 anos, nota-se que mais de 30% das populações de natureza diminuíram, devido a perdas de habitats e mortes causadas por incêndios e atropelamentos. Outros fatores importantes para o declínio destas populações in-situ são: dieta altamente específica, baixas taxas reprodutivas, e tamanho corporal avantajado (MEDRI & MIRANDA, 2010).
4. Características Reprodutivas do tamanduá-bandeira
um ciclo estral com duração média de 51 dias, com fase folicular e luteal com cerca de 2 semanas cada uma, e um período médio de anestro de 3 semanas.
Segundo Bartmann (1983) a cópula ocorre por 3 dias consecutivos, com a fêmea em decúbito lateral e o macho sobre ela em decúbito esternal, pressionando-a contra o solo. A gestação dura cerca de 180 dias e geralmente nasce apenas um filhote (PATZL et al., 1998; SCHAUERTE, 2005). Em natureza os tamanduás vivem solitários, com exceção de pares em período de acasalamento e de mães que permanecem com os filhotes por aproximadamente seis meses (SHAW et al. 1987).
Os machos da espécie possuem um sulco grande e nítido no pênis na zona mediana ventral que termina em uma abertura prepucial de aproximadamente um centímetro de longitude (Figura 2). A constituição interna e externa do pênis permite apenas ereções brandas, sem introdução profunda no canal vaginal (BARTMANN, 1991).
Figura 2: Foto ilustrativa do pênis de um tamanduá-bandeira, demonstrando o sulco medial ventral e a ausência de testículos externos.
Não existem dados sobre longevidade, taxas de sobrevivência ou de reprodução de tamanduás selvagens, uma vez que não é possível determinar a idade de um indivíduo ao atingir o tamanho adulto (MEDRI & MIRANDA, 2010).
5. Características seminais da espécie
espermáticas. Observou-se ainda a presença de grânulos com aspecto circular em ambas as frações do ejaculado.
As características médias do ejaculado foram: volume de 1,3 ± 0,86 ml, pH de 7,44 ± 0,6, vigor espermático de 2,27 ± 0,35 e motilidade espermática de 33,18 ± 20,14%, com grande dispersão entre os resultados de motilidade. A avaliação morfológica evidenciou maior incidência de defeitos maiores (cauda fortemente dobrada, defeito na peça intermediária e cauda dobrada com gota) do que de menores (cauda dobrada, cabeça isolada normal e abaxial). Por fim, os testes funcionais, as análises de integridade do acrossoma e de membrana plasmática apresentaram prevalência de acrossomas e membranas intactos, e bom potencial de mitocôndria para a maioria dos animais (MENDONÇA, 2010).
6. Colheita de sêmen
O volume e a composição do sêmen variam entre as espécies, sendo influenciados pelas características anatomofisiológicas do aparelho reprodutor masculino e feminino. Durante a evolução, fatores como volume, concentração e presença de gel, foram determinados mediante anatomia do útero, do pênis e do local onde o sêmen é depositado (MANN & LUTWAK-MANN, 1981).
elevada sensibilidade desses animais à manipulação e para evitar o estresse e garantir a segurança dos animais e da equipe envolvida, o método é praticado sob contenção química (MORATO & BARNABE, 1998).
A anestesia representa o principal fator de risco no procedimento, tanto para a vida do animal mediante alterações nos parâmetros fisiológicos, como para o ejaculado (DURRANT, 1990), pois pode contaminar a amostra com urina, diminuir o volume seminal, ocasionar uma ejaculação retrógrada para a bexiga, além de planos anestésicos inadequados e ineficácia de algumas colheitas (QUEIROZ, 2003; TEBET, 2004). Entretanto, a eletroejaculação transretal tem sido utilizada com sucesso na obtenção de sêmen de diversos animais selvagens, como felinos, cervos, primatas não humanos e catetos (KAHWAGE, 2010; MORATTO et al, 1998; SILVA et al., 2004; TEBET, 2004) e é considerada o recurso mais seguro e apropriado para colher sêmen desses animais, devendo-se, contudo, estabelecer um protocolo para cada espécie e de acordo com a resposta de cada indivíduo (DURRANT, 1990).
7. Análise subjetiva convencional da motilidade e vigor espermáticos
Os parâmetros motilidade e vigor espermáticos são os mais empregados para determinar o estado fisiológico da célula e devem ser mensurados simultaneamente (SEAGER & FLETCHER, 1972). Usualmente a motilidade espermática é estimada de forma subjetiva através da avaliação visual das células sob microscopia de luz (CRESPILHO et al., 2006) determinando a percentagem de espermatozoides com movimentos progressivos na amostra (CBRA, 1998). Já o vigor espermático classifica de 0 a 5 a qualidade da motilidade observada nas células espermáticas (SILVA et al., 2003).
8. Avaliação da integridade de membrana plasmática e morfologia
espermática
As avaliações da morfologia espermática e/ou da integridade acrossomal podem ser realizadas através de sondas fluorescentes (KALLAJOKI et al., 1986; MORTIMER et al., 1987), esfregaços corados (DIDION et al., 1989; TALBOT & CHACON, 1981; PAPA et al., 1988) ou preparações úmidas (SAACKE & MARSHALL, 1968; PURSEL et al., 1972).
Esfregaços corados com eosina têm sido utilizados com eficácia para avaliar a integridade de membrana das células espermáticas. A eosina é um corante supra vital que penetra somente em células com a membrana plasmática lesada, ligando-se aos ácidos nucléicos e conferindo uma coloração rosa ao espermatozoide (BRITO et al., 2003). A coloração pelo método Karras-modificado sugerido por PAPA et al. (1988), consiste na utilização de três corantes: Rosa Bengala, Tanino e Azul Vitória e tem sido muito utilizado com sucesso no que diz respeito à coloração da célula espermática, inclusive acrossomo.
9. Microscopia eletrônica de transmissão
A microscopia eletrônica de transmissão tem sido muito utilizada para avaliação ultraestrutural dos espermatozoides de diversas espécies animais. Baseada na interação de elétrons incidentes sobre a matéria a técnica determina o tamanho e a forma de estruturas inorgânicas e biológicas (SILVA et al., 2009). Quando se pretende avaliar a morfologia e defeitos de células espermáticas em escala nanométrica (nm) há a necessidade do uso da microscopia eletrônica, pois ocorrem falhas nos métodos tradicionais de avaliação (JOSHI et al., 2001).
10. Refrigeração de sêmen
Para uma refrigeração adequada do sêmen é necessário o uso de diluidores que garantam a sobrevivência dos espermatozoides em baixas temperaturas. Assim, após diluição, a queda da temperatura deve ser gradativa até manter-se a solução seminal entre 4 e 6°C (HAFEZ & HAFEZ, 2003). FELDMAN & NELSON (1996) afirmam que o sêmen de espécies domésticas quando adequadamente diluído e refrigerado, podem manter-se viáveis por até cinco dias.
O sistema de refrigeração de sêmen passivo tem sido o mais utilizado em animais domésticos devido ao menor preço e maior facilidade prática a campo (VALLE et al., 1999). Este método é desenvolvido em contêineres que garantem taxas lentas de refrigeração em torno de 0,05°C/min (BRINSKO et al., 2000) e mantêm a temperatura em média de 5°C (VARNER et al., 1998). O Equitainer foi o primeiro contêiner fabricado para resfrigerar sêmen equino e garante que tais taxas de refrigeração e temperatura final sejam adequadas (DOUGLAS-HAMILTON et al., 1984). AVANZI et al. (2006) compararam outros sistemas passivos com o Equitainer, como Botutainer e Botubox, e afirmam não existir diferenças entre os contêineres quando mantidos a temperatura ambiente de cerca de 24°C.
DETERMINAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS SEMINAIS E REFRIGERAÇÃO 1
DE SÊMEN DE TAMANDUÁS-BANDEIRA (Myrmecophaga tridactyla) DE 2
VIDA LIVRE 3
4
Camila do Nascimento Lubaa,b - camilaluba@gmail.com 5
Flávia Regina Mirandab - flavia@tamandua.org 6
Alexandre Martins Costa Lopesb - alemclzoo@hotmail.com 7
Marcelo da Silva Gomesb - zoosbc.marcelo@gmail.com 8
Frederico Ozanan Papaa- papa@fmvz.unesp.br 9
João Carlos Pinheiro Ferreiraa - jcferreira@fmvz.unesp.br 10
11
a Departamento de Radiologia Veterinária e Reprodução animal, Faculdade de 12
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Julio de 13
Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, São Paulo, Brasil. Endereço: Rubião 14
Junior, s/n CEP: 18.618-000. 15
16
b Instituto de Pesquisa e Conservação de Tamanduás no Brasil – Projeto 17
Tamanduá. Endereço: Rua Pastor Carlos Frank, 458. Boqueirão, Curitiba, 18
Paraná, Brasil. Cep: 81.730-340. 19
20 21
Autor correspondente: 22
João Carlos Pinheiro Ferreira - Departamento de Reprodução Animal e 23
Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP. Distrito de Rubião Junior, s/n Botucatu-24
RESUMO 26
27
O tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) é considerado 28
vulnerável à extinção e dados científicos em relação aos parâmetros 29
reprodutivos da espécie são escassos. Colheu-se sêmen de oito tamanduás-30
bandeira de vida livre com o intuito de estabelecer parâmetros de amostras 31
seminais relacionados ao volume, odor, coloração, motilidade, vigor, 32
concentração e morfologia espermática, e investigar o tempo em que o sêmen 33
mantém-se com motilidade e vigor quando submetido à refrigeração à 5ºC. A 34
motilidade e vigor espermáticos foram avaliados de forma subjetiva, e a 35
avaliação de morfologia espermática foi realizada por microscopia óptica 36
convencional e microscopia de contraste e interferência diferencial. O ejaculado 37
apresentou duas frações distintas sequenciais: fração esbranquiçada - leitosa e 38
rica em células espermáticas, e fração gel - incolor, viscosa e azoospérmica). 39
Os valores médios (± erro padrão) das características seminais foram: volume 40
da primeira fração 0,75 (±0,1) mL, motilidade 75 (±2,9) %, vigor 3,2 (±0,3), 41
concentração 108,5 x106/ml (±13,4), índice de integridade de membrana 42
plasmática de 71% (±4,0), alterações espermáticas em coloração karras-43
modificado 35,5% (±3,3) e 48,3% (±6,8) em microscopia de contraste de 44
interferência diferencial. Quando diluído em Botucrio® e refrigerado, o sêmen 45
apresentou motilidade e vigor por no máximo 24 horas, com valores 46
decrescentes em ambos os parâmetros no decorrer do tempo. 47
48
Palavras-chave: in-situ, eletroejaculação, reprodução, Xenarthra, Pilosa, 49
ABSTRACT 51
The giant anteater (Myrmecophaga tridactyla) is considered vulnerable to 52
extinction. Scientific data in relation to species reproductive parameters are 53
scarce. Semen from eight free-living giant anteaters was collected to establish 54
parameters from seminal samples related to volume, odor, color, motility, vigor, 55
concentration and spermatic morphology. Also, the period that the semen 56
maintains motility and vigor when submitted to 5ºC refrigeration was 57
investigated. Motility and spermatic vigor were evaluated subjectively. 58
Evaluation of spermatic morphology was performed with conventional optical 59
microscopy, contrast microscopy and differential interference contrast 60
microscopy. The ejaculate presented two distinct sequential fractions: a whitish 61
fraction-milky and rich in sperm cells, and a gel fraction-colorless, viscous and 62
azospermic. Mean values (± SEM) of seminal characteristics were: volume of 63
first fraction 0.75 (±0.1) mL, motility 75 (±2.9) %, vigor 3.2 (±0.3), concentration 64
108.5 x106/mL (±13.4), plasma membrane integrity index of 71% (±4.0), 65
spermatic alterations with the modified Karras staining 35.5% (±3.3) and 48.3% 66
(±6.8) in differential interference contrast microscopy. When diluted in Botucrio® 67
and refrigerated, the semen maintained motility and vigor for a maximum of 24 68
hours, with decreasing values in both parameters over time. 69
70
1. INTRODUÇÃO 76
77
O tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) é o maior 78
representante da família Myrmecophagidae, pertencente a ordem Pilosa e 79
Superordem Xenarthra. A espécie é restrita às Américas Central e do Sul, 80
sendo encontrado em todo o território brasileiro [1] e considerada extinta no 81
Uruguai [2], Belize, Guatemala e Costa Rica. Considerando-se que as 82
populações da espécie diminuíram cerca de 30% nos últimos 10 anos, a União 83
Internacional de Conservação da Natureza (IUCN) inclui esta espécie na 84
categoria Vulnerável, ou seja, enfrenta um grande risco de extinção em médio 85
prazo [1]. Sabe-se que a espécie não possui sazonalidade, tem hábito solitário, 86
gestação de 180 dias e que origina somente um filhote, o qual permanece com 87
a mãe por cerca de seis meses. Porém, pouco se conhece sobre mais 88
aspectos reprodutivos do tamanduá-bandeira, o que torna difícil a utilização de 89
técnicas de reprodução assistida para auxiliar na conservação da espécie. 90
As principais ameaças ao tamanduá-bandeira são atropelamentos, 91
incêndios e desmatamentos [1]. As perdas de grandes áreas naturais e a 92
fragmentação de matas representa um dos principais fatores para a diminuição 93
da biodiversidade, pois geram pequenas populações isoladas, o que pode 94
acarretar em superlotação, aumento da endogamia, e aumento da 95
susceptibilidade à doenças [3]. Desta forma, a reprodução é fundamental para 96
a conservação de espécies, populações e indiretamente à vitalidade de todos 97
os ecossistemas [4]. 98
Mendonça [5] avaliou o sêmen de tamanduás-bandeira de cativeiro e 99
final do estudo o autor ressalta a necessidade de se estudar características 101
seminais de animais de vida livre, pois uma vez que a qualidade espermática é 102
resultado de fatores que envolvem manejos ambiental, sanitário e nutricional 103
adequados, entre outros, somente assim torna-se possível compreender as 104
reais características espermáticas de uma espécie. 105
O objetivo do presente estudo foi estabelecer características do sêmen 106
fresco de tamanduás-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) de vida livre como 107
volume, odor, coloração, motilidade, vigor, concentração e morfologia 108
espermática, assim como avaliar motilidade e vigor do sêmen após refrigeração 109
a 5° C durante 24 horas. 110
111
2. MATERIAL E MÉTODOS 112
113
2.1. Animais e Local de Captura 114
115
Foi colhido sêmen por eletroejaculação de oito tamanduás-bandeira 116
adultos de vida livre. Destes, um animal foi apreendido em área urbana da 117
cidade de Botucatu (22º53'09"/48º26'42"), passou por triagem no CEMPAS 118
(Centro de Medicina e Pesquisa de Animais Selvagens – Universidade 119
Estadual de São Paulo) e após colheita de sêmen foi liberado em natureza. Os 120
outros sete tamanduás foram capturados na fazenda São José, região de 121
Aquidauana, no estado brasileiro de Mato Grosso do Sul 122
(20°05’43.46’’S/55°57’53.25’’) em quatro expedições de sete dias cada, nos 123
meses de outubro de 2012, abril, julho e novembro de 2013, considerando-se 124
As capturas foram realizadas por busca ativa, com procura e 126
avistamento do animal, sem uso de armadilhas. O local selecionado 127
apresentava vegetação característica de cerrado, que atua como facilitador em 128
capturas de animais desta espécie por propiciar melhor visualização dos 129
espécimes e poucas áreas de fuga. A procura dos animais foi realizada ao 130
amanhecer e ao anoitecer, devido ao hábito vespertino/noturno da espécie. 131
Uma vez encontrado, estimou-se visualmente o peso do animal e este foi 132
cercado e contido quimicamente com dardo anestésico e zarabatana (Figura 133
1). 134 135
136
Figura 1: Animal após receber dardo anestésico, localizado na musculatura do 137
membro torácico esquerdo. 138
O protocolo utilizado para anestesiar os animais foi a associação de 8,0 140
mg/kg de cloridrato de cetamina 10% (Cetamina, Syntec®, Cotia, estado de São 141
Paulo, Brasil), 0,5 mg/kg de midazolam (Dormire®, Cristália Produtos Químicos 142
Farmacêuticos LTDA., São Paulo, Brasil) e 0,5 mg/kg de cloridrato de xilazina 143
2% (Xilazin, Syntec®, Cotia, estado de São Paulo, Brasil). 144
Todos os animais capturados foram marcados individualmente com 145
implantação de microchip subcutâneo em região dorsal. Os indivíduos 146
utilizados no experimento foram identificados com a primeira letra do gênero 147
Myrmecophaga seguida da letra inicial da cidade onde foram encontrados, 148
utilizando-se MB1 (tamanduá encontrado em Botucatu, estado de São Paulo, 149
Brasil), MA1, MA2, MA3, MA4, MA5, MA6 e MA7 (animais capturados em 150
Aquidauana, estado de Mato Grosso do Sul, Brasil). 151
152
2.2. Colheita de sêmen 153
154
Após contenção química foi realizada tricotomia e lavagem com solução 155
de 0,9% de NaCl da área genital. Utilizou-se um aparelho de eletroestimulação 156
(Eletrojet Premium, Eletrovet®, Eletrovet LTDA, Valinhos, estado de São Paulo, 157
Brasil) e uma probe com 1,3 cm de diâmetro, 17 cm de comprimento e dois 158
eletrodos com 7 cm de extensão (Figura 2). A probe foi lubrificada com 159
carboximetil celulose, cerca de 16 cm da sua extensão total foi introduzida no 160
162
Figura 2: Probe confeccionada para realização de eletroejaculação em tamanduás-163
bandeira. 164
165
O protocolo de eletroejaculação foi baseado nos estudos de PLATZ e 166
SEAGER em felinos [7], no qual são descritos 80 estímulos, divididos em três 167
séries. A primeira série composta de 10 estímulos elétricos de 2 V, 10 de 3 V e 168
10 de 4 V, seguidos por um período de descanso de dois minutos. A segunda 169
série consiste de 10 estímulos de 3 V, 10 de 4 V e 10 de 5 V, seguidos 170
novamente de um período de descanso de dois minutos. Por fim, a última série 171
com 10 estímulos elétricos de 5 V e 10 de 6 V. O procedimento de 172
eletroestimulação foi interrompido assim que se obteve a fração rica em células 173
espermáticas do ejaculado, exceto em 3 procedimentos nos quais os estímulos 174
As amostras seminas foram acondicionadas em tubos plásticos de 2,0 176
mL e transportadas ao laboratório em cerca de 10 a 15 minutos. 177
178
2.3. Avaliação do sêmen 179
180
O volume do ejaculado foi mensurado com micropipeta variável de 100 a 181
1.000 µL. O aspecto foi determinado visualmente e classificado como viscoso, 182
cremoso ou aquoso. A cor foi classificada como translúcida, opalescente ou 183
esbranquiçada. O pH foi aferido com tiras indicadoras (pH - indicator strips 0-184
14, Universal indicator, Merck®, Merck KGaA, Hessen, Alemanha). 185
Subsequentemente, realizou-se exames subjetivos de motilidade e vigor 186
espermáticos, entre lâmina e lamínula aquecidas a 30°C em placa aquecedora, 187
utilizando-se microscópio de luz (DM500, Leica®, Wetzlar, Alemanha) com 188
câmera digital (ICC50 HD, Leica®, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) 189
acoplada, em aumento de 200x. A temperatura de 30°C foi selecionada a partir 190
dos resultados de estudos preliminares, nos quais obteve-se maior tempo de 191
manutenção da motilidade e vigor espermáticos. Os resultados foram 192
expressos em porcentagem (0 a 100%) para a motilidade e em escore de 0 a 5 193
para vigor. 194
A concentração espermática foi determinada em câmara hematimétrica 195
de Neubauer sob microscopia de luz (aumento de 400x), após diluição de 1:20 196
em água destilada. Os resultados foram apresentados em número de 197
espermatozoides/mL. 198
A integridade de membrana plasmática foi avaliada pela coloração com 199
animal com 10 µL de sêmen fresco e 10 µL da solução de coloração. A leitura 201
das lâminas foi realizada em aumento de 400x, classificando-se as células 202
coradas em vermelho como apresentando membrana lesada e as células sem 203
coloração com a membrana íntegra. O resultado foi expresso em porcentagem 204
(0 a 100%) de células com a membrana íntegra. 205
A morfologia espermática foi avaliada por dois métodos, nos quais foram 206
contadas 200 células. Utilizou-se método Karras-modificado [8], para o qual 207
foram confeccionados três esfregaços com 10 µL de sêmen fresco fixados em 208
metanol. Concomitantemente, uma alíquota de 10 µL de sêmen fresco foi 209
conservada em 500 µL de formol salina para realização do segundo teste em 210
microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC). 211
Para dimensionar a morfometria espermática foi utilizado o software 212
LAS EZ (Leica®, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha). Foram avaliadas 213
trinta células de cada indivíduo em esfregaço corado com Karras-modificado e 214
aumento de 1000x, nas quais aferiu-se a largura da cabeça, comprimento de 215
cabeça e da peça intermediária, comprimento total da cauda e comprimento 216
total do espermatozoide. 217
Para identificação da constituição dos grânulos presentes no ejaculado 218
da espécie, descritos por Mendonça [5] foi utilizada a coloração de 219
diferenciação lipídica com o corante oil-red O (Invitrogen Life Science 220
Technologies, Carlsbad, CA, USA), que faz com que moléculas de lipídio 221
tornem-se avermelhadas. Para isto empregou-se alíquotas de 200 μL de cada 222
fração da amostra seminal (frações rica espermática e gel), que foram 223
depositadas separadamente em placas de petri. Subsequentemente, foi 224
com água destilada, retirando posteriormente o conteúdo líquido em excesso. A 226
solução restante em cada placa de petri foi observada em microscopia de luz 227
sob aumento de 2000 a 6300x. 228
229
2.4. Refrigeração do sêmen 230
231
Após colheita e avaliação do ejaculado, diluiu-se uma parte do sêmen 232
em duas partes do diluente Botucrio® sem crioprotetor (Botupharma Ind. e 233
Com. de Produtos Veterinários Ltda, Botucatu, São Paulo, Brasil), em 234
recipientes plásticos com capacidade volumétrica de 2 mL. O sêmen diluído foi 235
armazenado em sistema Botuflex® (Botupharma®, Botupharma Ind. e Com. de 236
Produtos Veterinários Ltda, Botucatu, São Paulo, Brasil), adequando-se o 237
volume necessário para uma taxa eficiente de refrigeração (-0,05°C/min até 238
5°C) com dois frascos contendo 90 mL de água, de acordo com a metodologia 239
descrita por Papa et al [9] . A motilidade e vigor espermáticos foram avaliados a 240
cada seis horas, utilizando-se os mesmos procedimentos descritos 241
anteriormente, até que não fossem observados espermatozoides móveis na 242
amostra. 243
244
2.5. Análise estatística dos dados 245
246
Para os parâmetros seminais foi utilizado a média e erro padrão dos 247
valores encontrados para os oito animais. Já para refrigeração de sêmen foi 248
utilizada análise de variância (ANOVA) para medidas repetidas, seguida pelo 249
avaliação estatística dos dados, considerou-se M0 para o sêmen fresco, M6, 251
M12, M18 e M24, para 6, 12, 18 e 24 horas após o início do resfriamento, 252
respectivamente. 253
254
3. RESULTADOS 255
256
Durante o período experimental foram capturados um macho no mês de 257
abril, um no mês de julho e cinco machos no mês de novembro de 2013. 258
Nenhum indivíduo foi recapturado e todos foram considerados saudáveis e 259
mantiveram-se estáveis durante todo o procedimento de colheita do sêmen, 260
com bom retorno anestésico. 261
As amostras seminais apresentaram duas frações distintas: a primeira 262
de coloração esbranquiçada, aspecto leitoso e rica em células espermáticas, e 263
a segunda incolor, de aspecto viscoso e ausência de espermatozoides. A 264
segunda fração, denominada gel espermático, foi de difícil dissolução, não 265
podendo ser liquefeita em até 6 horas de aquecimento em banho-maria a 37°C. 266
A primeira fração do ejaculado, em todos os animais, foi obtida com o 267
emprego apenas da primeira série de estímulos elétricos, não sendo 268
necessária a execução completa do protocolo de eletroestimulação. O término 269
da primeira fração foi caracterizado pelo inicio da expulsão da segunda fração 270
de aspecto gel. 271
O volume da fração gel variou entre os indivíduos, de forma que o 272
animal MB1 ejaculou 1,2 mL, o MA1 0,3 mL e o MA2 0,4 mL. Observou-se 273
maior quantidade de gel conforme o aumento do número e intensidade dos 274
O odor foi caracterizado como suis-generis e o pH de todos os 276
ejaculados foi 10, conferindo caráter básico ao sêmen. 277
Os valores individuais e médios (± erro padrão) encontrados para 278
volume, motilidade, vigor e concentração espermáticos, e integridade de 279
Tabela 1: Valores individuais e médios (± erro padrão) das características seminais de tamanduá-bandeira de vida livre. 281
Volume (ml)
Animais Fração rica Gel Motilidade (%) Vigor (0-5) Concentração (x106/ml) I.M.P(%)*
MB1 0,7 1,2 70 2 52 68
MA1 1,5 0,4 75 3 102 77
MA2 1 0,3 60 3 60 58
MA3 0,2 0 70 2 99 53
MA4 0,6 0 80 3 157 74
MA5 0,9 0 85 4 131 70
MA6 0,6 0 85 4 147 87
MA7 0,5 0 75 4 120 81
Média ± EP 0,75 (± 0,1) 0,6 (± 0,1) 75 (± 2,9) 3,1 (± 0,3) 108,5 (± 13,4) 71 (± 4,0) * I.M.P: Índice de integridade da membrana plasmática
Os espermatozoides apresentaram cabeça de formato oval, com 283
acrossomo ocupando cerca de metade da sua área (Figura 3). A morfologia 284
espermática mediante Karras-modificado e DIC estão exibidas na tabela 2. 285
286
287
Figura 3: Aspecto microscópico dos espermatozoides de tamanduá-bandeira corados 288
pelo método Karras-modificado sob aumento de 1000x. 289
Tabela 2: Classes morfológicas encontradas em espermatozoides do tamanduá-297
bandeira espressas em porcentagem, sob coloração com Karras-modificado e DIC, e 298
média (± erro padrão) das alterações encontradas para cada técnica. 299
Morfologia espermática KARRAS - modificado DIC
Acrossoma lesado 4,37 ± 1,01 8,25 ± 1,80
Knobedd 0 2,50 ± 0,56
Cabeça
Piriforme 2,00 ± 0,56 2,50 ± 0,56
Subdesenvolvida 1,62 ± 0,46 2,12 ± 0,69
Estreita na base 0 0,12 ± 0,12
Pequena anormal 0,50 ± 0,37 0,37 ± 0,26 Contorno anormal 0,50 ± 0,26 0,62 ± 0,41 Isolada patológica 0,50 ± 0,50 0,25 ± 0,16
Vacúolos nucleares 0 3,25 ± 0,95
Defeito de peça intermediária 0,87 ± 0,35 1,50 ± 0,37 Cauda
Gota citoplasmática proximal 5,25 ± 1,42 6,00 ± 1,34 Gota citoplasmática distal 6,00 ± 1,40 13,5 ± 4,53 Fortemente dobrada 2,62 ± 1,08 1,75 ± 1,84 Dobrada com gota 4,37 ± 1,03 7,00 ± 0,64 Enrolada/dobrada 6,62 ± 2,40 6,25 ± 4,46
Abaxial 4,37 ±1,55 6,75 ± 1,97
Média ± EP 35,5% (±3,3) 48,3% (±6,8)
300
A presença de grânulos arredondados simétricos, com borda regular, de 301
diversos tamanhos e de difícil dissolução foi identificada em ambas as frações 302
espermáticas, porém em maior quantidade na primeira (Figura 4). Sob a 303
coloração por oil-red O, os grânulos tornaram-se avermelhados, o que 304
caracteriza sua constituição lipídica (figura 5). 305
307
Figura 4: Aspecto microscópico do sêmen de Myrmecophaga tridactyla em aumento
308
de 200x, contendo grânulos arredondados (setas pretas) e espermatozoides (setas 309
vermelhas). 310
312
Figura 5: Grânulos de lipídio (seta) evidenciados pela coloração oil-red O observados
313
no ejaculado de tamanduás-bandeira em aumento de 6300x. 314
315
Os valores morfométricos médios ± erro padrão dos espermatozoides 316
foram: largura de cabeça de 5,1 ± 0,09 µm, comprimento de cabeça 9,2 ± 0,1 317
µm, comprimento de peça intermediária 14,2 ± 0,1 µm, comprimento de cauda 318
55,1 ± 0,7 µm, comprimento total da célula espermática 64,4 ± 0,8 µm (figura 319
322
Figura 6: Aspecto microscópico da célula espermática de tamanduá-bandeira 323
apresentando os seus valores morfométricos médios ± erro padrão. 324
325
3.1. Refrigeração do sêmen 326
327
Os ejaculados obtidos dos animais MB1 e MA3 não foram refrigerados, 328
pois não apresentaram volume suficiente. 329
A motilidade espermática diminuiu de acordo com o tempo de 330
refrigeração (p<0,05), com exceção dos momentos M18 e M24, que não 331
apresentaram diferenças (p>0,05). Já vigor manteve-se constante até M6 332
(p>0,05), quando teve uma diminuição significativa de M6 para M18 (p<0,05) e 333
manteve-se novamente constante de M18 a M24 (p>0,05). Os valores para 334
cada animal pós-refrigeração do sêmen estão expressos na tabela 3. 335
Tabela 3: Valores representativos de motilidade e vigor após até 24 horas da solução espermática de cada animal após refrigeração à 5°C em 338
Botuflex®.
339
Sêmen fresco 6 horas 12 horas 18 horas 24 horas
Animais Motilidade (%) Vigor (0-5) Motilidade (%) Vigor (0-5) Motilidade (%) Vigor (0-5) Motilidade (%) Vigor (0-5) Motilidade (%) Vigor (0-5)
MA1 75 3 60 3 40 2 10 1 0 0
MA2 60 3 30 2 10 1 0 0 0 0
MA4 80 3 65 3 50 3 30 2 10 2
MA5 85 4 75 3 50 2 10 1 0 0
MA6 85 4 55 3 20 2 10 1 0 0
4. DISCUSSÃO 340
341
Este é o primeiro estudo a respeito das características seminais de 342
tamanduás-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) realizado in situ, o que 343
representa um importante avanço científico e início de um banco de dados para 344
a superordem Xenarthra. 345
Foi possível demonstrar que a eletroejaculação é um método efetivo 346
para colheita de sêmen de tamanduás-bandeira de vida livre, assim como 347
descrito por Mendonça [5] em espécimes de cativeiro, e para tatus [10, 11] e 348
preguiças [12]. 349
O ejaculado formado por duas frações distintas também pode ser 350
observado em outros animais como cavalos [13], cachaços [14], javalis [15] e 351
catetos [16], porém a função fisiológica deste gel ainda é desconhecida e pode 352
variar conforme a espécie. 353
O gel encontrado em amostras seminais de tamanduás-bandeira de vida 354
livre também foi descrito no ejaculado de outros membros da superordem 355
Xenarthra como preguiças do gênero Bradypus [12] e tatus da espécie 356
Euphractus sexcinctus [10, 11]. Santos et al. [17], relata ainda a ausência de 357
motilidade progressiva em tatus devido a alta viscosidade do gel e a dificuldade 358
de liquefação deste conteúdo. Contudo, verificou-se durante o procedimento de 359
eletroejaculação dos tamanduás in-situ a ejeção inicial da fração rica em 360
espermatozoides, ao contrário daquilo referido para tamanduás cativos, os 361
quais expulsam primeiramente a fração gel [5]. 362
Conforme descrito por Mendonça e observado em etapas preliminares 363
apresentam diferenças marcantes em relação aos espécimes de vida livre. Os 365
animais in-situ apresentaram valores superiores de motilidade e vigor 366
espermáticos, assim como valores inferiores de alterações nos 367
espermatozoides, quando comparados com tamanduás de cativeiro [5]. Além 368
disso, evidencia-se o pH alcalino encontrado em ejaculados de animais livres, 369
condizente com o sêmen de tatus ex situ [10], porém diferente do observado 370
em Myrmecophaga tridactyla de cativeiro, relatado em torno de 7 [5]. Segundo 371
Setchell et al. [18] a eletroejaculação pode elevar o pH do sêmen devido a uma 372
superestimulação de glândulas acessórias e consequentemente maior 373
quantidade de plasma seminal. No entanto, o volume adquirido em animais ex 374
situ foi maior [5] do que o encontrado em animais de vida livre, o que torna 375
plausível uma alteração seminal devido as modificações nutricionais e no bem-376
estar destes animais quando submetidos ao cativeiro. 377
Outro aspecto de relevância no sêmen de tamanduás livres e cativos [5] 378
é a presença de grânulos de lipídio no ejaculado, o que não foi descrito para 379
outros xenarthros. A função deste componente no plasma seminal não foi 380
elucidada e não está disponível em literatura. Sabe-se que lipídio é um dos 381
componentes do plasma seminal e que este fluido tem papel essencial nas 382
funções espermáticas desde a ejaculação até a sobrevivência no trato 383
reprodutivo das fêmeas [19]. Considerando ainda o pênis diminuto e limitada 384
penetração peniana durante a cópula [6], é possível relacionar tais achados 385
com o longo percurso espermático no aparelho reprodutivo das fêmeas da 386
espécie, que possuem grande comprimento de vagina e vestíbulo vaginal, 387
Em geral, a morfologia do espermatozoide de tamanduás-bandeira é 389
semelhante a de outros mamíferos, incluindo os membros da ordem Pilosa 390
Bradypus variegatus [12], porém, difere em formato do espermatozoide de 391
Euphractus sexcinctus, que possui cabeça mais arredondada e achatada 392
[10,11]. As anormalidades mais encontradas em células espermáticas de 393
tamanduás de vida livre, tais como gota citoplasmática distal e cauda dobrada, 394
consideradas por Blom como defeitos menores [21], também foram verificadas 395
em tamanduás-bandeira cativos [5], tatus [11] e preguiças [12]. Essas 396
alterações podem aindaser sugestivas da menor atividade sexual observada 397
em animais com hábitos solitários in situ. 398
A morfometria dos espermatozoides de Myrmecophaga tridactyla (64,4 ± 399
0,8 µm) encontra-se próxima a média de mamíferos placentários que medem 400
69,2 (± 4,1 µm) [22], sendo maior do que de Preguiças de três dedos (Bradypus 401
tridactylus) com comprimento de 33,2 ± 0,7 µm [12], porém semelhante a 402
Tamandua tetradactyla, que mede 67,0 ± 1,6 µm [23]. 403
As células espermáticas de tamanduás-bandeira de vida livre quando 404
submetidas a 5°C permaneceram com motilidade e vigor por no máximo 24 405
horas, o que não corresponde com padrões encontrados para animais 406
domésticos, em que os espermatozoides permanecem com movimento 407
progressivo até 48 horas sob mesmas condições de temperatura e volume [9]. 408
Segundo Darenius [24], para uma boa refrigeração do sêmen a pressão 409
osmótica e o pH do meio diluente devem ser semelhantes aqueles encontrados 410
no ejaculado de garanhões, ou seja 300 a 350 mOsm e 7,0 a 7,2, 411
7 para a espécie equina, sugere-se que o resfriamento foi ineficaz devido as 413
diferenças físico-químicas encontradas no sêmen dos tamanduás. 414
Sabe-se que condições de cativeiro como nutrição, sanidade e ambiente 415
inadequados, juntamente com o estresse podem alterar os parâmetros 416
reprodutivos e limitar o uso de estratégias tradicionais de reprodução de 417
animais ex situ [3, 25]. Assim, o presente estudo proporciona um incentivo para 418
o contínuo estudo com animais da espécie in-situ em relação a criopreservação 419
do sêmen, bancos genéticos e uso de biotecnologias da reprodução, que 420
podem futuramente auxiliar em programas de conservação para os membros 421
da família Myrmecophagidae. 422
423
Agradecimentos 424
Os autores agradecem o auxílio ao processo nº 2012/24538-7, 425
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), e a 426
Pousada Aguapé por todo o apoio pessoal e estrutural a campo. 427 428 429 REFERÊNCIAS 430 431
[1] Medri I, Miranda F. 2010. Myrmecophaga tridactyla. In: IUCN 2012. IUCN 432
Red List of Threatened Species. 2012. www.iucnredlist.org - Accessed on 433
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Cambridge University Press 2003; p.2-20. 443
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Dissertação de Mestrado - Universidade de São Paulo. São Paulo, 2010. 446
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AVALIAÇÃO POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO DOS 1
ESPERMATOZOIDES DE TAMANDUÁS-BANDEIRA (Myrmecophaga
2
tridactyla) DE VIDA LIVRE 3
4
Camila do Nascimento Lubaa,b - camilaluba@gmail.com 5
Flávia Regina Mirandab - flavia@tamandua.org 6
Vinícius Peron de Oliveira Gasparottob- vini_peron@msn.com 7
Fernanda da Cruz Landim e Alvarengaa- fernanda@fmvz.unesp.br 8
Frederico Ozanan Papaa- papa@fmvz.unesp.br 9
João Carlos Pinheiro Ferreiraa - jcferreira@fmvz.unesp.br 10
11
a Departamento de Radiologia Veterinária e Reprodução animal, Faculdade de 12
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Julio de 13
Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, São Paulo, Brasil. Endereço: Rubião 14
Junior, s/n CEP: 18.618-000. 15
16
b Instituto de Pesquisa e Conservação de Tamanduás no Brasil – Projeto 17
Tamanduá. Endereço: Rua Pastor Carlos Frank, 458. Boqueirão, Curitiba, 18
Paraná, Brasil. Cep: 81.730-340. 19
20 21
Autor correspondente: 22
João Carlos Pinheiro Ferreira - Departamento de Reprodução Animal e 23
Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP. Distrito de Rubião Junior, s/n Botucatu-24
São Paulo, Brasil. Cep: 18.618-970. jcferreira@fmvz.unesp.br. 25
RESUMO 27
28
Foram realizadas avaliações ultraestruturais sob microscopia eletrônica 29
de transmissão dos espermatozoides de oito tamanduás-bandeira 30
(Myrmecophaga tridactyla) de vida livre. As amostras seminais foram colhidas 31
por eletroejaculação e armazenadas em glutaraldeído 2,5%. As células 32
espermáticas apresentaram-se com formato cônico, acrossoma ocupando dois 33
terços da cabeça e núcleo espermático denso com pontos elétron-34
lucentes distribuídos por toda a cabeça espermática. Na região do pescoço 35
observou-se a presença do capitulum e centríolo proximal. A estrutura da 36
cauda dos espermatozoides é semelhante a maioria dos mamíferos, com um 37
axonema central e uma bainha mitocondrial helicoidal na peça intermediária. 38
Quanto as anormalidades, observou-se destacamento do acrossoma e dag-39
defect em algumas células. 40
41
ABSTRACT 52
53
Ultrastuctural evaluations were performed under transmission electron 54
microscopy of sperm eight free-living giant anteater (Myrmecophaga tridactyla). 55
The seminal samples were collected by electroejaculation and stored in 56
glutaraldehyde 2.5%. Sperm cells presented with conical shape, acrosome 57
occupying two thirds of the sperm head. Observed electron-dense nucleus with 58
electron-lucentes points distributed throughout the sperm head. In the neck it 59
was observed the presence of the capitulum and proximal centriole. The 60
structure of the tail of the sperm is similar to most mammals, with a central 61
axoneme and mitochondrial sheath helical in midpiece. The abnormalities 62
observed in some cells it was detachment of the acrosome and dag-defect. 63
64
Keywords: Myrmecophagidae, Xenarthra, Semen 65
