Seleção e caracterização de biomarcador aplicável em plataformas nanotecnologicas para o monitoramento do tratamento da tuberculose

Texto

(1)U N I V E R S I D AD E F E D E R A L D E U B E R L Â N D I A F AC U L D A D E D E M E D I C I N A P R O G R AM A D E P Ó S - G R AD U A Ç Ã O E M C I Ê N C I AS D A S A Ú D E. S E B AS T I Ã O M AR C O S T AF U R I. S E L E Ç Ã O E C AR A C T E R I Z AÇ Ã O D E B I O M A R C A D O R AP L I C Á V E L E M P L AT A F O R M A S N AN O T E C N O L O G I C AS P AR A O M O N I T O R AM E N T O D O T R AT AM E N T O D A T U B E R C U L O S E. UBERLÂNDIA 2013.

(2) S E B AS T I Ã O M AR C O S T AF U R I. S E L E Ç Ã O E C AR A C T E R I Z AÇ Ã O D E B I O M A R C A D O R AP L I C Á V E L E M P L AT A F O R M A S N AN O T E C N O L O G I C AS P AR A O M O N I T O R AM E N T O D O T R AT AM E N T O D A T U B E R C U L O S E. Dissertação apresent ada ao programa de Pós Graduação em Ci ênci as da Saúde, Uni versidade Federal de Uberlândia, como requisito parcial para obtenção do título de mestre em Ciências da Saúde. Área de concentração: Ciências da Saúde Orientador: Prof. Dr. Carlos Ueira Vieira Coorientadora:Dra.Fabiana de Araujo Santos. UBERLÂNDIA 2013.

(3) S E B AS T I Ã O M AR C O S T AF U R I. S E L E Ç Ã O E C AR A C T E R I Z AÇ Ã O D E B I O M A R C A D O R AP L I C Á V E L E M P L AT A F O R M A S N AN O T E C N O L O G I C AS P AR A O M O N I T O R AM E N T O D O T R AT AM E N T O D A T U B E R C U L O S E. Dissertação apresentada ao programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal de Uberlândia, como requisito parcial para obtenção do título de mestre em Ciências da Saúde.. Área de concentração: Ciências da Saúde. Uberlândia, 26 de março de 2013. Banca Examinadora. Prof. Dr. Guilherme Lino - UFG. Profa. Dra. Janaina Lobato - UFU. Prof. Dr. Carlos Ueira Vieira – Orientador – UFU.

(4) D E D I C AT Ó R I A Aos meus pais, P edro Tafuri Neto e Balbina Amaral Tafuri pelo incentivo, o exemplo de honestidade e fé, para a realização deste estudo. À minha querida esposa, Moema Barbosa Loureiro Tafuri que s em pre est eve ao m eu lado c om o um a gr ande guer reira durant e todo este caminhar. À toda minha família, por confiarem na minha dedicação. Aos meus companheiros (as) do Laboratório de Nanobiotec nologia da Univers idade Federal de Uberlândia, por terem me recebido com muito respeito e carinho, proporcionando um crescimento profissional e pessoal. A todos os professores e técnicos administrativos da Escola Técnica de Saúde (ESTES) da Universidade Federal de Uberlândia, pelo incentivo e apoio incondicional para desenvolver este estudo. Aos meus queridos amigos (in memorian), Nilda Marques, Marlos Urqui za, Lui z Roberto Inoc ente, que foram grandes incentivadores no convívio profissional..

(5) AG R AD E C I M E N T O S. À Deus e a Nossa Senhora Desatadora dos Nós pela luz que depositaram na realização deste estudo. Ao meu orientador Prof. Dr.Carlos Uiera Vieira, pela grande oportunidade de realizarmos este estudo. Ao Prof.Dr.Luiz Ricardo Goulart pelo grande incentivo, principalmente nos momentos mais delicados. Aos professores do curso Técnico em Análises Clínicas da Escola Técnica de Saúde por terem permitido minha liberação total. À Dra. Fabiana de Araujo Santos pela principalmente por sua dedicação e experiência.. coorientação. e. À doutoranda Mayara Ingrid de Souza pela experiência, paciência e alegria em todos os dias que trabalhamos juntos na execução do Biopanning. À doutoranda Patrícia Tieme, generosa, paciente, experiente, exigente, que em todo mom ento tinha uma palavra otim ista, meu eterno agradecimento. Aos amigos (as) do Laboratório de Nanobiotecnologia, aprendizado e pela excelente convivência.. pelo. À prof essora Dra.Yara Cristina P. Maia, pelo incentivo. Ao enfermeiro André Luís de Moraes pela execução e avaliação da Prova Tuberculínica dos indivíduos participantes do estudo. A o técnico administrativo Mauro Alexandre de Castro do Programa Nacional de Controle da Tuberculose em Uberlândia, pelas análises do SINAN. A Profa. Rosária Maria Paixão coordenadora do Programa Nacional de Controle da Tuberculose em Uberlândia, pelo acesso aos dados do programa. Aos Enfermeiros, Médicos e Residentes do Moléstias I nf ecciosas do Hos pital de Clínicas.. Departamento. A todos os colaboradores do Laboratório CREDESH.. de.

(6) À Profa. Dra. Júlia Cruz do departamento de Imunologia pela gentileza no empréstimo de um reagente para realização de experimentos. A os profess ores Dra. Cynthia Barbos a Firmino e Dr. Mário Paulo Penatti, Dr. Reginaldo dos Santos Pedroso do Curso Técnico em Análises Clínicas que sempre estimularam para cursar esta pósgraduação. A o Curso Técnico em Análises Clínicas da Escola Técnica de Saúde pela gentileza no empréstimo de reagentes para realização de experimentos. Ao técnico Adriano Gonçalves Martins do Curso Técnico em Análises Clínicas pela colaboração fundamental na formatação deste estudo. Aos meus filhos Pedro Henrique B. Tafuri e João Vitor B. Tafuri pela compreensão e auxilio na informática. Aos pacientes e indivíduos saudáveis que aceitaram participarem deste estudo doando suas amostras biológicas. Ao colega Farmacêutico palavras otimistas.. Milton. Pereira. Gomes. Junior. pelas.

(7) “Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus , não sou o que era antes.”. Martin Luther King Jr..

(8) RESUMO. Introdução: A Tuberculose é uma doença inf ectocontagiosa, que acomete mais de 9 milhões de indivíduos a cada ano em todo o mundo. Para o controle da tuberculose o estudo por métodos de diagnósticos mais acurados e o monitoramento ao tratamento, tornam se imprescindíveis. Objetivos: identificar biomarcadores pela técnica de Phage display e avaliar a imunorreatividade dos clones selecionados às IgG’s de soros de pacientes com tuberculose para o monitoramento do tratamento. Métodos: foram coletadas amostras de sangue de 61 indivíduos maiores de 18 anos, ambos os sexos, e realizada a prova tuberculina (PPD) como controle. As amostras foram submetidas ao processo de seleção de clones, o Biopanning, utilizando uma biblioteca de 12 aminoácidos randômicos expressos na região da proteína pIII do bacteriófago. Após a seleção foi realizado o ensaio ELISA para analisar a imunorreatividade dos clones selecionados. Resultados: após as análises in silico, observou-se que a s e q u ê n c i a d o c l o n e F 1 0 ( V Y K T P N S T A N RW ) , p o s s u i s i m i l a r i d a d e com a proteína MPT64 de membrana de baixo peso molecular, 28 a 32 K Da, im unogênica do c om plexo M.t uberculosis. No ens aio ELISA o clone F10 apresentou uma reatividade significante (p<0,05) e no monitoramento dos indivíduos em tratamento (p<0,005). Conclusão: a reatividade do clone F10 demonstrou que pode ser utilizada para o monitoramento do tratamento da tuberculose, contribuindo para seu controle.. Palavras-chave: Biomarcador. ELISA. Phage Display. Tratamento. Tuberculose..

(9) A B S T R AC T. Introduction: Tuberculosis is an infectious disease that affects more than 9 million people each year worldwide. For tuberculosis c ontrol m et hods f or the st udy of m ore accur at e diagnost ic and monitoring treatment, make it essential. Objectives: To identify biomarkers. by. Phage. display. technique. and. evaluate. the. immunoreactivity of the IgG's clones selected sera from patients wit h tuberc ulosis t o m onitor tr eatm ent . M ethods: Blood s am ples were collected f rom 61 individuals over 18 years, both sexes, and performed the tuberculin test (PPD) as a control. The samples were. subjected. to. the. process. of. selection. of. clones,. the. biopanning using a library of random 12 amino acid region of the protein expressed on the phage pIII. After selecting the ELISA assay was performed to analyze the immunoreactivity of selected c lones. Results: after in silico analys is , it was found that the s e q u e n c e o f c l o n e F 1 0 ( V Y K T P N S T A N RW ) h a s s i m i l a r i t y t o t h e membrane protein MPT64 low molecular weight, 28 to 32 kDa, immunogenicity of the M.tuberculosis complex. In ELISA clone F10 showed. reactivity. significant. (p. <0.05). and. monitoring. of. individuals in treatment (p <0.005). Conclusion: the reactivity of clone F10 demonstrated that it can be used for monitoring the treatment of tuberculosis, contributing to its control.. Key. words:. Treatment.. Biomarker.. ELISA.. Phage. Display.. Tuberculosis..

(10) L I S T A D E F I G U R A S E T AB E L AS. Pag. Figura 1- Esquema da estratégia utilizada no primeiro ciclo do Biopanning................................................................. 35. Figura 2- Ensaio de Bead-ELISA para verificação da eficiência do acoplamento de IgG’s nas microesferas magnéticas .................................................................... 45. Figura 3- Gel de agarose contendo DNA dos clones selecionados.................................................................. 46. Figura 4- Alinhamento do clone F10 com a proteína MPT64 do M.tuberculosis............................................................ 48. Figura 5- Phage-Elisa com os clones seleciona-dos na prévalidação...................................................................... . Figura 6- Phage-Elisa com os clones mais reativos............. 49 50. Figura 7- A razão do c lone F10 c om fago irrelevante utilizando soros individuais.............................................. 51. Figura 8- A curva ROC demonstrando a sensibilidade e especificidade do clone F10 com indivíduos em tratamento com o PPD-, indivíduos saudáveis ................................... 52. Figura 9- Ensaio ELISA de soros individuais dos grupos (TB+,PPD+,PPD-), com extrato proteico............................ 53. Figura 10- ELISA competitivo do clone F10 com extrato proteico em concentrações diferentes e soro de indivíduos em trat am ento em dias...... ... .... ... ....... ....... ... .... ... .... ......... 54. Tabela 1- Títulos (em pfc: unidades formadoras de colônias) obtidos nos três ciclos de seleção....................... 46. Tabela 2- Sequências válidas dos aminoácidos dos peptídeos sequenciados, frequências absoluta e observada........................................................................... 47.

(11) L I S T A D E AB R E V I AT U R AS E S I G L A S. Aa Abs Ac Ag AM APC BAAR BSA BCG Célula NK CEP CFP CNPq CFP-10 CR CTL Cut-off DC DDT DNA DO DOTs DP E.coli EDTA ELISA ESAT-6 HC HIV HR HRZ IFN-γ IgA IgM. Aminoácidos Absorbância Anticorpo Antígeno Arabinomanana Célula Apresentadora de Antígeno Bacilo Álcool Ácido Resistente Soro albumina bovina Bacilo de Calmette-Guérin Célula Natural Killer Comitê de Ética em Pesquisa Proteína do Filtrado de Cultura Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Culture Filtrate Protein 10-KDa Receptor de Complemento Linfócito T Citotóxico Ponto de corte Célula Dendrítica Dithiothreitol, β-mercaptanoethanol Ácido Desoxiribonucléico Densidade Ótica Estratégia de Tratamento Diretamente Observado Desvio Padrão Escherichia coli Etileno Diamino Tetra Acetato Teste imunoenzimático Early Secreted Antigenic Target 6-KDa Hospital de Clínicas Vírus da Imunodeficiência Humana Isoniazida e Rifampicina Isoniazida, Rifampicina e Pirazinamida Interferon gama Imunoglobulina A Imunoglobulina M.

(12) IgG IgY IL iNOS IPTG Irr kDa LAM LB LM MDR MÊS MIP-1 MHC MPT 64 MS/SVS MTBC NO NMT OMS OPD PAGE PAMPS PBS PBS-T PCR PEG Pfu pH Ph.D-12 pIII pVII pVIII PIMs PMSF PNCT PPD RT-PCR RD-1 Sel. Imunoglobulina G Imunoglobulina Y Interleucina Óxido Nítrico Sintetase induzível Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside Fago irrelevante Quilodalton Lipoarabinom anana Meio de cultura Luria-Bertani Lipomanana Multi droga resistente Ácido 2-morfolinoetanosulfónico monohidratado Proteína 1 Inflamatória de Macrófagos Complexo principal de histocompatibilidade Proteína do M.tuberculosis Ministério da Saúde/Secretaria Vigilância em Saúde Mycobacterium tuberculosis Complexo Óxido Nítrico Não Mycobacterium tuberculosis Organização Mundial da Saúde Orto-fenilenodiamina Eletroforese em gel de poliacrilamida Padrões Moleculares Associados ao Patógeno Tampão fosfato salino Fosf at o de sódio c om t ween 20 Reação em cadeia da polimerase Polietileno glicol Unidades formadoras de colônias Potencial Hidrogênico Biblioteca contendo 12 peptídeos randômicos Proteina III capsídica de bacteriófgagos f ilam ent osos Proteina VII capsídica de bacteriófgagos f ilam ent osos Pr oteina VIII capsí dica de bacterióf gagos f ilam ent osos Manosídeo de Fosfatidilinositol Fluoreto de alfa-fenilmetil sulfonila Programa Nacional de Controle da Tuberculose Derivado de Pr ot eína Purif icada PCR em tempo real Regiões diferenciais Fago selvagem.

(13) SDS SINAN T.A TB TBS TBS-T T CD4+ T CD8+ TCLE TGF Th TLR TBM TNF-α XDR X-Gal °C uG uL G mG L M mM mL N Ng Nm RPM V. Dodecil sulfato de sódio Sistema de Informação de Agravos de Notificação Temperatura ambiente Tuberculose Tampão Tris-salino Tampão Tris-salino com tween 20 Linfócitos T Linfócitos T Termo de consentimento livre e esclarecido Fator de Crescimento Tumoral Linfócito T Auxiliar Receptor do tipo Toll Tetram et ilbenzina Fator de Necrose Tumoral Alfa Extensively drug-resistant 5-Bromo-4-cloro-3indolil-alfa-D-galactosideo Grau Celsius Microgramas Microlitros Grama Miligrama Litro Molar Milimolar Mililitro Normalidade Nanograma Nanometro Rotações por minuto Volts.

(14) L I S T A D E AM I N O Á C I D O S. A. Alanina. Ala. C. Cisteína. Cis. D. Ácido aspártico. Asp. E. Ácido glutâmico. Glu. F. Fenilalanina. Fen. G. Glicina. Gly. H. Histidina. His. I. Isoleucina. Ile. K. Lisina. Lys. L. Leucina. Leu. M. Metionina. Met. N. Asparagina. Asn. P. Prolina. Pro. Q. Glutamina. Gln. R. Arginina. Arg. S. Serina. Ser. T. Treonina. Thr. V. Valina. Val. W. Triptofano. Trp. Y. Tirosina. Tyr.

(15) SUMÁRIO 1 I N T R O D U Ç Ã O ......................................................................................................... 17 1 . 1 A t u b e r c u l o s e .................................................................................................. 17 1 . 2 P a t o g e n i a d a t u b e r c u l o s e ......................................................................... 18 1 . 2 . 1 T r a n s m i s s ã o ............................................................................................. 19 1 . 2 . 2 A s p e c t o s i m u n o l ó g i c o s ....................................................................... 20 1 . 2 . 3 E p i d e m i o l o g i a .......................................................................................... 22 1 . 2 . 4 O a n t í g e n o M P T 6 4 .............................................................................. 23 1 . 3 D i a g n ó s t i c o p a r a t u b e r c u l o s e ................................................................. 24 1 . 3 . 1 A t é c n i c a d e P h a g e d i s p l a y ............................................................. 26 1 . 4 T r a t a m e n t o p a r a t u b e r c u l o s e .................................................................. 27 2 O B J E T I V O S .............................................................................................................. 29 3 M A T E R I A I S E M É T O D O S .................................................................................. 29 3 . 1 T i p o d e e s t u d o ................................................................................................ 29 3 . 2 C a s u í s t i c a ......................................................................................................... 29 3 . 2 . 1 C r i t é r i o s d e i n c l u s ã o ........................................................................... 30 3 . 2 . 2 C r i t é r i o s d e e x c l u s ã o .......................................................................... 30 3 . 3 O b t e n ç ã o d a s a m o s t r a s b i o l ó g i c a s ...................................................... 31 3 . 4 S e l e ç ã o d a s a m o s t r a s b i o l ó g i c a s ......................................................... 32 3.5 Acoplamento e purificação de IgG total em microesferas m a g n é t i c a s d e p r o t e í n a G ................................................................................. 32 3 . 6 S e l e ç ã o d e p e p t í d e o s r e c o m b i n a n t e s ................................................ 33 3 . 6 . 1 B i o p a n n i n g ................................................................................................ 33 3 . 6 . 2 T i t u l a ç ã o .................................................................................................... 36 3 . 6 . 3 A m p l i f i c a ç ã o d o s C l o n e s ................................................................... 36.

(16) 3 . 6 . 4 E x t r a ç ã o d e D N A d o s C l o n e s .......................................................... 37 3 . 6 . 5 S e q u e n c i a m e n t o .................................................................................... 38 3 . 7 A n á l i s e s i n s i l i c o ........................................................................................... 39 3 . 8 S c r e e n i n g d o s c l o n e s c o m p o o l d e s o r o s ........................................ 39 3 . 9 E L I S A d o s c l o n e s D 8 , F 1 0 , G 1 2 c o m p o o l d e s o r o s .................. 40 3.10 ELISA do clone F10 com soros individuais: TB ativa (TB+), P P D p o s i t i v o ( P P D + ) , P P D n e g a t i v o ( P P D - ) ........................................... 41 3.11 ELISA do clone F10 com soros de indivíduos em tratamento ........................................................................................................................................ 41 3 . 1 2 E x t r a ç ã o d a p r o t e í n a d o M . t u b e r c u l o s i s ..................................... 42 3.13 ELISA com extrato proteico do M.tuberculosis, soros i n d i v i d u a i s T B + , P P D + , P P D - , e i n d i v í d u o s e m t r a t a m e n t o ............... 42 3.14 ELISA competitivo do clone F10 com soros de indivíduos e m t r a t a m e n t o e e x t r a t o p r o t e i c o d o M . t u b e r c u l o s i s .......................... 43 3 . 1 5 A n á l i s e s e s t a t í s t i c a s ................................................................................. 44 4 R E S U L T A D O S ......................................................................................................... 44 4 . 1 A c o p l a m e n t o d a s I g G ’ s n a s m i c r o e s f e r a s d e p r o t e í n a G ........ 44 4 . 2 S e l e ç ã o d e p e p t í d e o s m i m é t i c o s .......................................................... 45 4 . 2 . 1 B i o p a n n i n g - S e l e ç ã o d e p e p t í d e o s ............................................ 45 4 . 2 . 2 E x t r a ç ã o d o D N A d o s c l o n e s s e l e c i o n a d o s ............................. 46 4 . 2 . 3 . S e q u e n c i a m e n t o d o D N A e a n á l i s e i n s i l i c o ......................... 47 4.3 Validação por Phage-ELISA dos mimetopos selecionados no B i o p a n n i n g . ............................................................................................................... 49 5 . D I S C U S S Ã O ............................................................................................................ 55 6 . C O N C L U S Õ E S ....................................................................................................... 59.

(17) 7 . R E F E R Ê N C I A S ...................................................................................................... 60 APÊNDICE- FICHA DE AVALIAÇÃO CLÍNICA ............................................................. 66 ANEXO 1- TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ...................... 67 ANEXO 2 - ANÁLISE FINAL N°. 660/11 DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA PARA O ADENDO AO PROTOCOLO REGRISTRO CEP/UFU 123/10. .................... 68 ANEXO 3 - SISTEMA DE INFORMAÇÃO DE AGRAVOS DE NOTIFICAÇÃO (SINAN) .............................................................................................................................. 69.

(18) 17. 1 INTRODUÇÃO 1.1 A tuberculose A tuberculose (TB) é uma doença infecto contagiosa, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, que pertence ao M. tuberculosis complexo (MTBC), ao qual incluem mais seis outras espécies: M.bovis, M.africanum, M.microti, M.pnnipedii, M.caprae, M.caneti, que acomete indivíduos em todos os continentes do mundo, principalmente aqueles menos desenvolvidos (MOUTINHO, 2011). Os casos novos no mundo correspondem a 8,7 milhões (W HO, 2012). Destes, 13% são coinfectados com HIV e 1,4 milhão de indivíduos morreram. Dos quais 1,0 milhão, são HIV negativo e 430 m il de HIV positiv o. As m ulheres cor respondem a 300 m il mortes entre o HIV negativo e 200 mil com HIV positivo. As crianças menores de 15 anos correspondem a 500 mil casos, s endo que 64 m il m orreram (W HO, 2012). A t uberculose acom et e mais homens, principalmente aqueles com idade economicamente at iva (W HO, 2012). Geograf icam ente a Á sia com 60% e Áf r ica com 2 4 % a p r e s e n t a m a m a i o r c a r g a d a d o e n ç a n o m u n d o (W H O , 2 0 1 2 ) . Apesar do aum ent o no núm ero de cas os novos, a taxa de incidência global vem diminuindo lentamente (menos de 1% ao ano), sendo estimada uma taxa de 139 casos por 100.000 hab. No m undo dos 3, 7% dos cas os novos, estim a-s e que 20% apresent am resistência aos medicamentos que tratam a tuberculose (TB-MDR) e 9% dos casos são indivíduos infectados com bacilos resistentes à maioria dos quimioterápicos antituberculose (TB-XDR). Com a estratégia. do. Tratamento. Diretamente. Observado. (DOTs). o. sucesso no tratamento tem mantido elevado, em torno de 85% a 87%, principalmente nos indivíduos com baciloscopia positiva para t uberculose pulmonar que represent a a m aior c aus a (W HO, 2012)..

(19) 18. Os tratamentos de indivíduos que apresentam resistência a um ou m ais f ármacos antituberculose são mais de seis meses, c o m e f e i t o s c o l a t e r a i s s e v e r o s e d e c u s t o s e l e v a d o s (W H O , 2 0 1 2 ) . Os investimentos para o controle da Tuberculose no mundo ainda são insuficientes, principalmente para o diagnóstico e t r a t a m e n t o d o s c a s o s M D R - T B (W H O , 2 0 1 2 ) . Em. 2011,. o. Brasil. notificou. 69.245. casos. novos,. correspondendo a um coeficiente de incidência de 36/100.000 habitantes.. Destes,. 41.117. casos. novos. foram. bacilíferos. no. escarro. Estes indicadores colocam o Brasil na 19ª posição em relação ao número de casos e na 104º posição em relação ao coeficiente de incidência (MS/SVS, 2011). Entretanto. há. uma. variação. da. incidência. entre. os. estados, por exemplo, o Amazonas com 62,6/100mil habitantes e Distrito Federal com 11,1/100mil habitantes (MS/SVS, 2011). É importante destacar que anualmente ainda morrem 4.500. pessoas. por. tuberculose. no. Brasil,. mesmo. sendo. uma. doença curável e evitável. Em sua maioria, os óbitos ocorrem nas regiões metropolitanas e em unidades hospitalares. A tuberculose é. a. terceira. maior. responsável. pelos. óbitos. por. doenças. infecciosas e a primeira entre indivíduos com AIDS no Brasil (MS/SVS, 2011). A proposta da Organização Mundial de Saúde (OMS) através do Plano Global para Combate à Tuberculose (2011 a 2015) tem por objetivo é diminuir a carga da doença até 2015 e uma das metas principais é reduzir pela metade, a incidência e a mortalidade por tuberculose, para que em 2050 a tuberculose seja eliminada como problema de saúde pública (MS/SVS, 2011).. 1.2 Patogenia da tuberculose O indivíduo pode ser infectado pelo M.tuberculosis e seu sistema imunológico manter seu organismo sem desenvolver a.

(20) 19. doença,. c ar acter izando. a. tuberculose. infecção,. podendo. permanecer assim por muito tempo. Se o patógeno multiplicar-se o bastante para romper a barreira imunológica alcançando um ou m ais órgãos caract eriza- se a tuberculose doença (W HO, 2010). A sobrevivência. deste. patógeno. no. pulm ão. infectado. e. o. seu. desenvolvimento, dependerá de sua virulência e da habilidade das células de defesa do hospedeiro (MELO et al., 2005). A Organização Mundial de Saúde (W HO, 2010) estim a que um terço da população mundial esteja infectada pelo bacilo. A pandem ia do HIV e o contraste ent re o aum ento da m iséria das populações menos favorecidas e o aumento da sobrevida nas mais desenvolvidas favoreceram o aumento da tuberculose no mundo (MELO et al., 2005). O indivíduo infectado pelo M.tuberculosis provavelmente ficará infectado por toda sua vida, porém apenas 10% destes indivíduos. desenvolverão. tuberculose. (W H O ,. 2010).. Aqueles. portadores do HIV o risco para desenvolverem a doença sobe para 50% (MELO et al., 2005). O bacilo do M.tuberculosis também pode permanecer em uma fase latente (ULRICHS; KAUFMANN, 2006). Podendo resistir a um ambiente com baixa taxa de oxigênio (AKHTER et al., 2007).. 1.2.1 Transmissão A f orm a m ais com um de transmissão do M.tuberculosis se dá por via aerógena, pela inalação de gotículas contendo bacilos quando o doente com tuberculose pulmonar espirra ou tosse, fazendo. desta,. uma. via. de. transmissão,. pela. facilidade. de. propagação. O contágio depende das condições de aeração do ambiente,. da. proximidade. indivíduo está sujeito.. e. do tempo. de. exposição. que. um.

(21) 20. O ap arelho re spirat ório ret ém m uitos bacilos na port a de entrada. através. da. depuração. mucociliar,. alguns. bacilos. que. escapam desta barreira física, são fagocitados pelos macrófagos alv eolares. Ao escapar dos m ec anism os de def esa, os bac ilos se multiplicam, constituindo o complexo de Gohn, pelo qual ocorre a disseminação linfática e a inflamação dos gânglios regionais, constituindo o complexo primário. A partir da via hematogênica, bacilos se instalam em outros órgãos, promovendo em algumas semanas. a. resposta. especificamente. dirigida. imune contra. adquirida agentes. ou. adaptativa. agressores. do. bacilo. (LAPA e SILVA, 2012).. 1 . 2 . 2 As p e c t o s i m u n o l ó g i c o s O mecanismo de defesa contra o M.tuberculosis é a interação entre os macróf agos e os linf ócitos T (FLYNN, 2001). As células dendríticas e macrófagos fagocitam o bacilo, destroem e processam os seus antígenos, que serão apresentados aos linfócitos através das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade antigênica,. estas. (MHC células. I. e. MHC. utilizam. II).. Para. moléculas. apresentação de. superfície,. denominadas de coestimuladoras, como CD80 e CD86 (FLORESBATISTA et al., 2007). Esta apresentação antigênica desencadeia outros eventos biológicos nos linfócitos como ativação, expansão c l o n a l e s e c r e ç ã o d e c i t o c i n a s , p r i n c i p a l m e n t e o I F N - γ, q u e i r á ativar. outros. macrófagos. para. serem. mais. eficazes. contra. o. patógeno, eliminando-o (LAPA e SILVA, 2012). Através de um mecanism o de escape, o M.tuberculosis consegue multiplicar-se e ficar protegido dentro do macrófago, evitando. ação. de. mecanismos. externos. para. sua. eliminação,. fazendo com que o indivíduo apresente o estado de tuberculose latente.. Há. vários. mecanismos. que. são. utilizados. pelos.

(22) 21. macrófagos para destruir o patógeno de seu interior dentre eles a apoptose (TEIXEIRA et al., 2007). A. apoptose. tem. sido. descrita. como. um. importante. mecanismo da resposta imune do hospedeiro contra o patógeno. As células mortas liberam vesículas apoptóticas para o meio extracelular. que. são. fagocitadas. por. outras. células. apresentadoras de antígenos, que participam ativando linfócitos T CD8+. por. meio. de. um. processo. denominado”. apresentação. c r u z a d a ” d e s t r u i n d o o b a c i l o (W I N A U e t a l . , 2 0 0 6 ) . Outro mecanismo é a ação de macrófagos mais ativados. Neste. processo. principalmente. ocorre. a. síntese. a de. expressão óxido. de. várias. nítrico. enzimas,. sintetase. (iNOS). secretora de radical livre óxido nítrico, que são altamente tóxicos para o M.tuberculosis (NICHOLSON et al.,1996). Para. uma. resposta. protetora,. os. linfócitos. T. CD4+. expressam um grande número de citocinas fundamentais para eliminação do patógeno enquanto os linfócitos T CD8+ pela ação citotóxica tem efeito diretamente contra o bacilo, e através de seus. grânulos. cit otóxic os. contendo. perforina. e. granzima. que. produzem poros na membrana celular, além produzirem citocinas (LAPA e SILVA, 2012). De acordo com perfil das células T CD4+, a s c é l u l a s T h 1 s e c r e t a m I F N - γ, I L - 2 , I L - 1 2 , I L - 1 8 , T N F - α , T N F - β . As células Th2 que secretam IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, tem. uma. função. de. induzir. a. diferenciação. de. células. B,. promovendo uma regulação negativa do perfil Th1. As células que produzem IL-17 e IL-23 teriam uma ação reguladora da resposta imune na tuberculose. A presença da IL-10 no sitio da infecção parece facilitar a ativação da tuberculose, por diminuir a ação bactericida. dos. macrófagos,. desativando. os. mecanismos. de. proteção (LAPA e SILVA et al., 2009). A citoc ina TNF-α secr etada por m acróf agos at ivados e por outras células, apresenta uma função protetora e participa da patogenicidade da tuberculose, principalmente na formação do.

(23) 22. granuloma onde ocorrem as ações biológicas da tuberculose. Sem a. formação. do. granuloma. os. bacilos. ficam. dispersos. numa. nec rose cas eos a f acilit ando sua diss em inaç ão, o que ocorre em indivíduos. infectados. pelo. HIV.. O. granuloma. é. a. estrutura. histopatológica característica da infecção do M. tuberculosis. Esta estrutura. pode. variar. em. composição. celular,. tamanho. e. distribuição, apresentando variações entre indivíduos diferentes e até. mesmo. no. próprio. indivíduo. (KUNNATH-VELAYUDHAN,. GENNARO, 2011). Os. antagonistas. do. TNF-α. facilitam. a. reativação. de. tuberculose latente e a frequência aumentada de células T CD4+ secretoras. de. TNF-α. é. um. preditor. do. desenvolvimento. da. tuberculose ativa (LAPA e SILVA, 2012). Durante a fase ativa da tuberculose ocorre o aumento de mediadores intracelulares, como suppressor of cytokine signaling (SOCS 1), interleukin-1 receptor-associated kinase M (IRAK-M) e extracelulares. (IL-10,. TGF-β. RII,. IL-1RN. e. indoleamine. 2,3-. dioxygenase) que podem resultar na menor atividade m icrobicida dos macrófagos que expressam a iNOS (HO et al., 2010).. 1.2.3 Epidemiologia Entre os fatores de risco para o desenvolvimento da tuberculose,. estão. os. contatos. intradomiciliares. com. casos. bacilíferos recém diagnosticados, crianças menores de 5 anos, infecção por HIV e desnutrição grave (SANT’ANNA;HIJJAR, 2007). Segundo MELO e colaboradores, 2005, a infecção e doença são mais frequentes entre os contatos de baixa idade, os idosos, os portadores. de. doenças. em. condições. imunossupressoras,. diabéticos e os de prova tuberculínica (PP D) não reativos. A. tuberculose. é. um. problema. social. relacionado. às. condições econômicas, sendo que nos países desenvolvidos é mais comum em idosos, quando há a queda da imunidade, própria.

(24) 23. da senescência, enquanto que em países em desenvolvimento é mais freqüente no grupo etário economicamente produtivo, entre os 15 e 44 anos (W HO, 2010). Os indiví duos m oradores de rua, privados. de. liberdade. e. indígenas. são. mais. suscetíveis. à. tuberculose (MS/SVS, 2011). A tuberculose é uma doença milenar que acomete a humanidade, e o seu controle ainda representa um desafio para os governos, autoridades da saúde e comunidade que busquem novas formas de diagnóstico mais acurado e em tempo hábil, de maneira que torne mais abrangente e facilitada a busca de infectados e doent es, assim com o do m onit oram ento do t rat am ento, de novos fármacos e vacinas mais preventivas que Bacilo de CalmetteG uérin (BCG ) (W HO, 2011). A Organização Mundial de Saúde (W HO, 2011) destaca a necessidade de mais estudos sobre a patogenia da tuberculose para permitir avanços no controle da doença, que permanece como uma doença negligenciada.. 1.2.4 O antígeno MPT 64 O secretado. antígeno pela. MPT. 64. membrana. apresenta. plasmática. de. das. 24. a. 38-KDa,. micobactérias.. é Na. tuberculose extra pulmonar esta presente a de 24-KDa e na tuberculose pulmonar ativa é a de 38-KDa (Rv 0934),também conhecida com o antígeno 5. Tem sido utilizada em diagnóstico para diferenciar em culturas positivas de escarro o complexo Mycobacterium. tuberculosis. (MTC). das. não. micobactérias. tuberculosis (NTB) que correspondem a 3% das culturas positivas ( H A S E G AW A e t a l . 2 0 0 2 ) . V á r i o s c a s o s d e M T B c o m r e s u l t a d o s negat ivos t em sido reportados. HIRANO e colaboradores, 2004, acreditam na possibilidade de uma mutação dentro do gene mpt64 que poss a produzir um a pr ot eína inc om pleta que apresent aria resultados falsos negativos. Neste caso, técnicas convencionais.

(25) 24. para. o. diagnóstico. sintomatologia. for. devem. ser. sugestiva. de. recomendadas. tuberculose.. quando. Devido. as. a. suas. características imunodominantes, estudos recentes revelam que a MPT 64 é considerada candidata a subunidade de vacina contra a tuberculose (SALI et al., 2010).. 1.3 Diagnóstico para tuberculose Desde o isolamento do bacilo por Robert Koch em 1882, muitas técnicas vem sendo desenvolvidas para o diagnóstico da tuberculose.. O. radiológicos, bacteriológicos. diagnóstico. tomografia e. cultura. baseia-se. nos. computadorizada do. escarro.. achados de. clínicos,. tórax,. Atualmente. exames. os. testes. sorológicos, principalmente o ELISA e técnicas biomoleculares como a reação em cadeia de polimerase (PCR) e a PCR em tempo real (RT-PCR) estão sendo aplicadas (KUNNATH-VELAYUDHAN et al., 2010). A baciloscopia é o método prioritário de diagnóstico e controle do tratamento da tuberculose (TEIXEIRA et.al., 2007). Apesar de sua facilidade de execução e baixo custo, tem como pr inc ipal des vantagem o f at o de s er negativ a em 30 a 50% dos casos. de. indivíduos. infectados. com. M.tuberculosis,. em. parte. devido presença de no mínimo de 5000 bacilos/mL de escarro (TEIXEIRA et al., 2007). A cultura microbiológica do escarro é empregada com a vantagem de permitir a detecção e o isolamento do bacilo, bem como sua identificação. Além da determinação da sensibilidade do bacilo aos quimioterápicos (TEIXEIRA et al., 2007). Apesar de sua importância, a cultura do M.tuberculosis é um método demorado, pois o bacilo apresenta um crescimento lento em torno (15-20 h), e o teste nem sempre apresenta 100% de positividade (TEIXEIRA et al., 2007)..

(26) 25. A prov a de t uber culina, t am bém conhecida com o PPD, realizada a partir da aplicação intradérmica da proteína purificada derivada. RT23,. é. útil. para. provar. a. infecção,. mas. não. necessariamente a doença. A prova positiva para tuberculose sugere somente a exposição prévia ao antígeno, não infecção ativa,. e,. ainda,. se. o. paciente. estiver. em. estado. de. imunossupressão não podemos descartar a possibilidade de o pac ient e estar infect ado c om t uberculose (HORNUM et al., 2007) . Na identificação de novos antígenos que substituam o PPD, várias regiões do genoma do M.tuberculosis foram definidas como sendo expressas apenas em suas cepas, tornando se como potenciais para o diagnóstico. São conhecidas como regiões de diferença (RDs), tendo sido caracterizadas 16 RDs. Na RD1 (do inglês, region of difference 1), do Mycobacterium tuberculosis, ausente no M.bovis BCG, M.avium, e na maioria das micobactérias ambientais (ANDERSEN et al., 2000). São codificados pelo menos dois. antígenos. promissores. para. detecção. da. tuberculose,. denominados do inglês como Early Secreted Antigenic Target 6KDa (ESAT-6) e Culture Filtrate Protein 10-KDa (CFP-10),que são fortemente imunodominantes, assim sendo consideradas ideais para. um. método. antígenos. diagnóstico. expressos. no. (TEIXEIRA. filtrado. de. et. cultura. al.,. do. 2007).. Os. Mycobacterium. tuberculosis submetidos à condições de estresse, como antígeno 85 (Ag-85), a malato sintetase (Rv1837c),também conhecida por G L c B o u M T B 8 1 ( S M I T H e t a l . , 2 0 0 3 ) , a M P T 5 1 ( R v 3 8 0 3 c ) (W i l s o n et al.2004), e a Hspx (Proteinas de choque térmico) (Rv2031c) (O’TOOLE et al., 2003),. formam um complexo aplicado em testes. de diagnóstico da tuberculose. O TLR-2 reconhece uma grande variedade de antígenos micobacterianos lipoarabinomanana. como (LAM). as. lipoproteínas. (BRIGHTBILL. et. de. 19-KDa,. al.,. 1999).. a São. responsáveis pela indução da necrose caseosa e parece ter um.

(27) 26. papel. importante. na. virulência. das. diferentes. espécies. de. micobactérias (BRIKEN et al., 2004). Os testes sorológicos com o ELISA tem sido aplicados pela facilidade de execução, baixo custo e rapidez, mas devido apresentar. um. alto. índice. de. reações. cruzadas. não. é. recomendado pelo Organização Mundial de S aúde (W HO, 2012). As técnicas de biologia molecular, como a Reação em cadeia da polimerase (PCR) e suas variações, tem sido aplicadas para o diagnóstico rápido da tuberculose (ASSIS et al., 2007). A técnica de Phage display, permite identificar peptídeos que serão utilizados. como. biomarcadores. desenvolvimento de novas. vacinas. para e novos. o. diagnóstico,. medicamentos. no. estudo de doenças infecciosas (MULLEN, et al., 2006). 1.3.1 A técnica de Phage display. A biomoléculas. metodologia. do. em fagos, foi. Phage. display,. desenvolvida. exposição. por Smith(1985),. de ao. conseguir a expressão da enzima de restrição EcoR1 através da fusão com a proteína três (pIII) do capsídeo do fago. Os bacteriófagos (fagos), são vírus que infectam uma variedade de bactérias Gram negativas usando o pilus sexual como receptor, principalmente a E.coli. Um fago viável expressa aproximadamente. 2.700. cópias. da. proteína. 8. ou. pVIII,. uma. proteína de 50 resíduos de aminoácidos) e de 3 a 5 cópias da proteina 3 ou pIII com 406 aminoácidos. Uma das vantagens do uso do bacteriófago é que fagos filamentosos não geram infecção lítica em E.coli, mas preferencialmente induzem a um estado no qual a bactéria infectada produz e secreta partículas de fago sem sofrer lise (AZZAZY; HIGHSMTH, 2002). A incorporação de proteínas exógenas na superfície dos fagos filamentosos faz-se fusionando às proteínas estruturais das partículas virais. As duas proteínas principais para esse fim são a.

(28) 27. proteína pVIII e a pIII. A proteína 3, a maior das proteínas estruturais, com 42 Kda, também é responsável pela adesão da partícula viral ao pillus sexual (BRÍGIDO; MARANHÃO, 2002). O peptídeo ou proteína expresso na superfície do fago possibilita a sua seleção baseada na afinidade de ligação para uma. molécula. alvo. por. um. processo. de. seleção. in. vitro. denominado Biopannig (PARMELEY; SMITH, 1988). A utilização de amostras de sangue periférico na seleção de. peptídeos,. estratégia. através. que. da. pode. técnica. ser. de. Phage. aplicada. para. display, o. é. uma. diagnóstico,. monitoramento do tratamento ou no desenvolvimento de vacinas c ontra divers as doenças , na tentativa de ident ificar sequênc ias especificas. que. se. ligam. a. anticorpos. presentes. nestas. am ostr as. O Phage display pode perm itir a geraç ão de com post os mais simples e sensíveis, além do entendimento da participação de antígenos conhecidos, ou não, nos mecanismos da resposta imune (MANOUTCHARIAN et al., 1999). A identificação de peptídeos miméticos aos antígenos da tuberculose,. bem. biomarcadores,. como. poderá. sua ser. caracterização potencialmente. como. novos. aplicados. no. desenvolvimento do diagnóstico, monitoramento do tratamento e na produção de novas v ac inas , mais aperf eiçoadas e prot etor as do que a atual. vacina do Bacilo de Calmette-Guérin (BCG).. 1.4 Tratamento para tuberculose A Organização Mundial de Saúde (OMS), considerando a situação. da. tuberculose. um. estado. de. emergência,. criou. es trat égias de c ont role da t uberculose par a reduzir a m ort alidade, m orbidade e t ransm issão da doenç a (W HO, 2010). Principalm ent e a e s t r a t é g i a S T O P T U B E R C U L O S E (W H O , 2 0 1 0 ) . P a r a a l c a n ç a r o s objetivos é preciso assegurar o diagnóstico e garantir tratamento.

(29) 28. e cura para os doentes. No Brasil existe um programa de controle da. doença. o Programa Nacional. de Controle da. Tuberculose. (PNCT) que é um conjunto de ações integradas com participação do. governo. e. comunidade. visando. reduzir. a. morbidade,. a. mortalidade e atenuar o sofrimento humano causado pela doença. A principal aç ão de c ont role c onstit ui-se da procura de casos novos e da quimioterapia efetiva, de modo a reduzir os focos de infecção (MELO et al., 2005). Um grande problema da tuberculose é a duração do tratamento, que por ser prolongado, faz com que muitos pacientes desistam do tratamento logo ao desaparecerem os sintomas, o que leva ao surgimento de tuberculose multi droga resistente (MDR), (W HO, 2010). Entre as estratégias criadas pela OMS, 1993 estão o Tratamento Diretamente Observado (DOT), que consiste na monitoração. pelo. sistema. de. saúde. ao. paciente,. durante. o. tratamento a fim de garantir o uso correto dos medicamentos e n ã o a b a n d o n o d o t r a t a m e n t o (W H O , 2 0 1 0 ) . E s t i m a - s e q u e 5 0 0 . 0 0 0 indivíduos são infectados por bactérias multi droga resistente ( MDR), (W HO, 2011) . A. rifampicina,. antibiótico. utilizado. no. tratamento. da. tuberculose, é a "chave" do esquema terapêutico, sendo que alguns autores chamam a atenção para o fato de que pacientes portadores de cepas de M.tuberculosis resistentes à rifampicina têm. grande. chance. de. serem. resistentes. a. outros. tuberculostáticos (CARVALHO et al., 2007). Nas últimas décadas os principais desafios do controle da tuberculose são a pandemia de HIV/AIDS e a tuberculose multi drogas resistentes (MDR-TB) e a extensively drug-resistant M.tuberculosis (XDR-TB, tuberculose extrarresistente), revelando a necessidade de novos fármacos e novos protocolos de tratamento (MS/SVS, 2010). A casos terapia. Tuberculose é curável em. novos. desde que. medicamentosa. obedecidos e. o. praticamente 100%. os. princípios. acompanhamento. dos. básicos. da. operacional. do.

(30) 29. tratamento na observação da dose adequada, no tempo de uso correto. e. na. associação. dos. fármacos. preconizados. para. o. tratamento (MS/SVS, 2010).. 2 OBJETIVOS - Caracterizar in silico peptídeos miméticos aos antígenos de soros de indivíduos com tuberculose.. -. Aplicar a técnica de Phage display como ferramenta. para. identificar e caracterizar peptídeos miméticos aos antígenos de soros de indivíduos com tuberculose, para serem utilizados no monitoramento do tratamento da tuberculose.. 3 M AT E R I A I S E M É T O D O S. 3.1 Tipo de estudo Estudo analítico observacional do tipo transversal.. 3.2 Casuística Foram. convidados. a. participarem. deste. estudo,. indivíduos com diagnóstico de tuberculose, maiores de 18 anos, com bacteriologia positiva ou não e em tratamento, atendidos no setor. de. Moléstias. Infecciosas. do. Hospital. de. Clínicas. da. Universidade federal de Uberlândia e aqueles acompanhados pelo.

(31) 30. Programa Nacional de Controle da Tuberculose na cidade de Uberlândia – MG, no período de maio de 2010 a fevereiro de 2012.. 3.2.1 Critérios de inclusão Pacientes com tuberculose confirmada segundo um dos critérios da W HO, 2010: . Confirmado. bacteriologicamente. (casos. definidos. de. tuberculose) indivíduos com duas amostras: positivas para bacilo álcool-ácido resistente (BAAR) em exame direto ou cultura positiva para M.tuberculosis ou uma amostra positiva para BAAR e presença de alteração radiológica. . Casos bacteriologicamente negativos - indivíduos com exame direto e cultura negativa, mas que apresentem à radiografia de tórax infiltrado em lobo superior com ou sem cavitação.. . Indivíduos. com. tuberculose. que. história. de. tratamento. apresentarem. anterior. alterações. para. radiológicas. quando comparadas com radiografias anteriores. . Para o grupo de indivíduos saudáveis como aqueles contatos intradomiciliares e profissionais de saúde que apresentaram a Prova de Tuberculínica (PPD), negativa.. 3.2.2 Critérios de exclusão Foram adotados como critérios de exclusão indivíduos em tratamento. com. corticosteróides,. drogas. diabetes,. gestantes e HIV/AIDS.. imunodepressoras,. neoplasias,. menores. uso de. 18. de anos,.

(32) 31. 3.3 Obtenção das amostras biológicas Durante a consulta regular no ambulatório de Moléstias Infecciosas do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia e acompanhado pelo Programa Nacional de Controle da Tuberculose da Secretaria Municipal de Saúde de Uberlândia (Unidade. Prisional,. UAIs,. UBSs,. Casas. de. acolhimento. e. domicílios), o indivíduo foi convidado a participar do estudo. Aquele. que. encaminhado. concordou para. a. em coleta. participar de. foi. ao. material. mesmo. biológic o:. tempo sangue. periférico. Foram coletados 8,0 ml de sangue periférico em tubos vacutainer TM, sem anticoagulante, para obtenção do soro. O material. colet ado. encaminhado. foi. para. conservado o. no. gelo. Laboratório. de. por. 4. horas. e. Nanobiotecnologia. (INGEB/UFU). A separação da amostra foi realizada em centrifuga refrigerada à 4°C sob 4.500 rpm e armazenado em freezer à 20ºC. O número total de indivíduos foram de 61, maiores de 18 anos,. no. período. de. maio. de. 2010. a. fevereiro. de. 2012,. distribuídos da seguinte f orma: indivíduos com tuberculose ativa com zero a 30 dias de tratamento =10, contatos intradomiciliares, profissionais. de. saúde. (médicos. e. enfermeiros). com. PPD,. negat ivo=18 e PPD, positivo= 15, e indiví duos c om mais de 30 dias de tratamento=28. Este. estudo. foi. aprovado. pelo. comitê. de. Ética. em. Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de Uberlândia, sob o processo de n°123/10. Todas as técnicas de manipulação de amostras biológicas seguiram normas do Código de Ética em Pesquisa com Humanos (Resolução CNS N°196/96) e das normas de biossegurança aplicadas ao laboratório de risco nível 2. Todos os indivíduos participantes após lido o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), o assinaram..

(33) 32. 3.4 Seleção das amostras biológicas Os soros foram descongelados em temperatura ambiente por 15 minutos, identificados e alicotados (300 uL) para formar pools de soros, distribuídos em: Grupo Tuberculose ativa (TB+); Grupo. negativo(PPD-);. amostras,. 28. Grupo. indivíduos. Positivo(PPD+).. permaneciam. em. Do. total. tratamento. das com. quimioterápicos preconizados pelo Ministério da Saúde (MS/SVS, 2011), com mais de 30 dias.. 3 . 5 Ac o p l a m e n t o e p u r i f i c a ç ã o d e I g G t o t a l e m m i c r o e s f e r a s magnéticas de proteína G Microesferas magnéticas ativadas com proteína G foram utilizadas para purificação de IgG’s dos soros dos indivíduos. A. purificação. de. IgG. a. partir. de. pool. de. soros. de. indivíduos com tuberculose ativa(TB+), PPD positivo(PPD+),PPD negativo(PPD-), foi feita por meio de microesferas magnéticas (beads. magnéticos). conjugadas. a. proteína. G. (Dynabeads-. Invitrogen) como plataforma. Para. cada. 2X109. partículas. magnéticas. (100. uL. do. estoque), lavadas anteriormente três vezes com tampão MES(0,1 M pH 5,0) para ativar as microesferas, adicionou-se 100 uL de pool de soro de tuberculose ativa (TB+), PPD+, PPD-, seguida da incubação. por. 1. hora. sob. agitação. a. T.A.. As. microesferas. adsorvidas com anticorpos foram, então, lavadas novamente três vezes com tampão MES (0,1 M pH 5,0) com a finalidade de retirar os anticorpos não ligantes. Para r ealizar a ligação covalent e entre as micr oesf eras e a IgG, o sistema beads foi lavado duas vezes com 1 mL de tampão trietanolamina (0,2 M pH 8,2) e, ressuspendido com 1 mL de tampão de ligação covalente (20 mM de dimetil pimelinidato X 2 HCl em tampão trietanolamina) por 30 minutos sob agitação a T.A..

(34) 33. A neutralização da reação da ligação covalente foi feita pala incubação do sistema beads com 1 mL de tampão Tris(50 mM pH 7, 5) por 15 m inutos a T.A. Em seguida, as m ic roesf er as for am lavadas com TBS-T 0,1% de Tween e bloqueadas por 1 hora à 37°C com solução de bloqueio(5% de BSA em TBS-T 0,05% de Tween) e ressuspendido em 200 uL de TBS. Para. certificar-se. do. acoplamento,. 5. uL. de. beads. c ontendo I gG dos pool de soros, f or am incubadas por 1 hor a a 37°C. com. anti-IgG. (VH+VL. da. Sigma). humana. diluído. na. proporção 1:5000 na solução de bloqueio e com IgY na proporção 1:5000 para controle da reação. Após a incubação, os beads foram lavados três vezes com TBS-Tween 0,1% e revelados com substrato. de tetrametilbenzina. (TBM),. cor. azul.. A. reação foi. interrompida com solução de ácido sulfúrico 2N e efetuada a leitura a 450 nm em leitor de microplacas (Titertek Multiskan Plus, Flow Laboratories, USA.. 3.6 Seleção de peptídeos recombinantes. 3.6.1 Biopanning Para a. seleção de peptídeos miméticos. às proteínas. antigênicas de M.tuberculosis utilizou-se de biblioteca comercial de peptídeos apresentadas em bacteriófagos filamentosos M13: Ph.D.-12 (complexidade: 2,7 x 109 transformantes), com peptídeos fusionados a proteína pIII (5 cópias por partícula de fago) da New England BioLabs, Schwalbach, Alemanha. Para selecionar fagos ligantes às IgGs purificadas do soro de pacientes infectados com. M.tuberculosis, f oi realizado. três ciclos de seleção, sendo que para cada ciclo foi feito uma incubação subtrativa com IgG de indivíduos controles PPD- e PPD+ acopladas no bead proteína G..

(35) 34. Para realizar a metodologia, pipetou-se 20ul de beads acopladas com IgG de indivíduos controles. e incubou com 100μL. da. em. biblioteca. Agitou-se. comercial. por. 30. diluída. m inut os. a. em. 10ul. temperatura. 90μL. de. ambiente. TBS-T. e. os. sobrenadante dos fagos não ligantes foram transferidos para os tubos contendo os 20uL beads acoplados com IgG de pacientes PPD+, os quais foram, também, submetidos a agitação por 30 minutos a temperatura ambiente (Figura 1). Em seguida, o sobrenadante de fagos não ligantes foram transferidos para um novo tubo para serem incubados com 20uL de beads acoplados com IgG de pacientes com tuberculose por 30 minutos sob agitação. O sobrenadante foi removido, e os fagos inespecíf icos foram lavados dez vezes com TBS-T (0,1% Tween20) nos dois primeiros ciclos de seleção e no terceiro ciclo subsequente. com. TBS-T. (0,5%. Tween-20). para. aumentar. a. estringência. Em todos os ciclos foram feitas eluições ácida com 500ul de Glicina 0,05M, pH=2,8 (Figura 1)..

(36) 35. Figura 1.. Estr atégia do pr imeiro ciclo do Biopanning par a seleção de. mimetopos do M.tuberculosis.. Os f agos recuperados f or am am plif icados em Esc her icia coli ER2738. A seleção foi repetida usando sempre o eluato ant erior ao c iclo de seleção em ques tão com o represent ant es da biblioteca comercial de fagos. Após o terceiro ciclo de seleção, os fagos. foram. sequenciado. escolhidos no. aleatoriamente. sequenciador. Dynamics/Amersham).. Mega. e. extraído. BaceTM. 1000. o. DNA. e. (Molecular.

(37) 36. 3.6.2 Titulação Para realizar a titulação, em cada ciclo de seleção a solução de fagos foi submetida a diluições seriadas crescentes exponenciais sob log10 em meio LB. Para os eluatos de fago de cada ciclo foram utilizadas diluições de 10-1 até 10-4. Para os eluatos amplificados a faixa de diluição utilizada variou entre 10-8 a 10-11. Em cada diluição acrescentou-se 200 uL da cultura de ER2738 na fase mid-log (densidade. óptica. 600. nm~0,5). e. a. solução. foi. agitada. rapidamente e incubada por 5 minutos a temperatura ambiente. As células bacterianas, agora infectadas, foram transferidas para tubos de cultura contendo 3 mL de Ágar-Top a 45°C e espalhadas sobre uma placa de Petri contendo meio LB sólido, com IPTG/Xgal e tetraciclina. As placas foram incubadas a 37°C, durante 16 horas e após est e perí odo, f oi f eita a cont agem das colônias azuis para obter o título dos fagos.. 3 . 6 . 3 Am p l i f i c a ç ã o d o s C l o n e s Após a seleção, a amplificação dos fagos foi realizada pela inoculação de um meio Luria-Bertani (LB-Triptona 10g/L, extrato de levedura 5g/L, NaCl 10g/L), contendo tetraciclina, com uma colônia isolada de Eschericia coli da linhagem ER2738. O meio foi inoculado sob agitação a 37°C até a fase early-log (OD 600~ 0,3). Ao atingir esta fase, a cultura bacteriana foi inoculada com 500 uL dos eluatos dos fagos e incubados a 37°C por 4-5 horas sob forte agitação. Em seguida, a cultura foi centrifugada a 4°C a 10.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante foi transferido para um tubo estéril. contendo. Polietilenoglicol. uma 8000. solução e. 2,5. M. de NaCl-. PEG/NaCl. (20%. de. solução. estéril). na.

(38) 37. quantidade. 1/6. do. volume. do. sobrenadante.. A. solução. foi. incubada por 12 a 16 hs a 4°C para precipitação do fago e posteriormente, centrifugada a 10.000 rpm por 15 minutos 4°C para. descartar. o. sobrenadante.. O. precipitado. foi,. então,. s uspendido em 1 m L de TBS e precipit ado c om 1/6 do volum e de PEG/NaCl, por 1 hora no gelo. Centrifugou-se a 14.000 rpm por 10 minutos a 4°C o sobrenadante foi descartado. O precipitado foi ressuspendido em 200 uL de TBS a 0,02% , obtendo-se então o eluato amplificado.. 3.6.4 Extração de DNA dos Clones As. colônias. oriundas. das. placas. do. 3°. ciclo. do. biopanning, foram isoladas e transferidas para poços de placas de cultura (tipo deepwell), contendo 1,2 ml de cultura de ER2738 em fase early- log (OD~0,3) para a extração do DNA dos fagos. Aos poços da placa foram adicionas as 96 colônias dos fagos das 100 contadas na diluição de 10-2. A placa foi então vedada com um adesivo e perfurado, incubada a 37°C, por 24 horas, sob vigorosa agitação. 250. placasforam. rpm.. Para. isolar. centrifugadas. a. os. 3700. fagos rpm,. a. das. bactérias,. 20°C,. durante. as 40. minutos. 800 uL do sobrenadante foram transferidos para outra placa e incubados, por 10 minutos, com 350 uL de PEG/NaCl. Após o período de incubação, a placa foi centrifugada a 3700 rpm, a 20°C, durante 40 minutos para precipitação dos fagos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e 100 uL de tampão iodeto(10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1 mM de EDTA e 4 M de NaCl) foram. adicionados. aos. fagos. precipitados.. As. placas. foram. agitadas vigorosamente por 40 segundos e 250 uL de etanol absoluto foi acrescentado. Após uma incubação de 10 minutos, à temperatura ambiente, as placas foram centrifugadas (3700 rpm, 20°C, por 10 minutos) e o sobrenadante descartado. O DNA dos fagos foi lavado com 500 uL de etanol a 70% e centrifugado nas.

(39) 38. mesmas condições. Finalmente, o DNA precipitado remanescente foi diluído em 20 uL de água Milli-Q. A quantidade do DNA de fita simples foi verificada pela resolução eletroforética em gel de agarose 0,8% e corado com solução de brometo de etídeo.. 3.6.5 Sequenciamento Na reação de sequenciamento, foram utilizados 500ng de DNA molde, 5 pmol do primer-96gIII(5’-OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’-Biolab) e Premix(DYEnamic ET Dye Terminator Cy cle Kit. – Amershan Biosc iences). A reação de 35 ciclos f oi realizada. em. um. Termociclador. de. Placas. (MasterCycler-. Eppendorf) nas seguintes condições:Desnaturação (a 95°C por 20 segundos); o anelamento do primer ( a 50°C por 15 segundos) e extensão. (a. 60°C. por. um. minuto).. A. precipitação. do. DNA. sequenciado foi feito com 1 uL de Acetato de Amônio e 27,5 uL de Etanol. Posteriormente, a placa foi centrifugada por 45 minutos, a 3700 rpm e o sobrenadante descartado. Adicionou-se 150 uL de Etanol 70% ao DNA precipitado e centrifugou-se por 15 minutos, a 3700. rpm.. A. solução. de. Etanol. foi. descartada,. a. placa. permaneceu invertida sobre um papel toalha e nesta posição foi pulsada a 800 rpm, durante um segundo. A placa foi coberta por papel alumínio e permaneceu em repouso durante 15 minutos para evaporar. o. etanol. rem anescent e.. Os. precipitados. resultantes. foram ressuspendidos em 10 uL do tampão de diluição (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit – Amersham Biosciences). A leitura do. sequenciamento. MegaBase. 1000. foi. realizada. (Amershan. no. sequenciador. Biosciences). Nanobiotecnologia (INGEB/UFU).. no. automático. Laboratório. de.

(40) 39. 3 . 7 An á l i s e s i n s i l i c o. As sequências de DNA obtidas após o sequenciamento foram. submetidas. à. análise. in. silico. disponíveis. on-line.. As. sequências dos peptídeos foram traduzidas utilizando o programa ExPAsy. (http://web.expasy.org/translate).. O. alinhamento. dos. peptídeos selecionados foi gerado utilizando o programa CLUSTAL W2. (http://www.ebi.ac.uK/Tools/clustalw2/index.html/).. caracterização. dos. peptídeos. mais. reativos. no. Para. ELISA,. suas. sequências foram comparadas a sequências conhecidas do banco de. dados. SwissProt. alinhamento. BLAST. utilizando (Basic. a. Local. ferramenta Alignment. on-line Search. de Tool). (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), com o algoritmo blastp, limitando a procura a sequências do complexo M.tuberculosis. Para análises de similaridade e alinhamento tridimensional com proteínas do M.tuberculosis. foi. aplicado. o. programa. Pepitope. Server. (http://pepitope.tau.ac.il/) (MAYROSE et al., 2007) 3.8 Screening dos clones com pool de soros. Para analisar a reatividade dos indivíduos com TB+(ativa), PPD+, PPD-,. clones às. IgGs. dos. foi realizado o ensaio. ELISA em microplaca (NUNC MAXISORP) carregada, sensibilizada com 40 ug/poço de anticorpo monoclonal anti-M13(GE Healthcare) sem marcação, diluído em tampão carbonato 50 mM pH 9,6 por 16 horas a 4°C, bloqueada com tampão (PBS 1X + 5% de BSA) por 1 hora a 37°C. A placa foi lavada três vezes com PBS-T a 0,05% e incubada com 100 uL/poço de cultura dos fagos selecionados e mais uma cultura de fago selvagem como controle, por 1 hora a 37°C. A placa foi lavada com PBS-T 0,05% por cinco vezes e os clones miméticos as proteínas do M.tuberculosis, foi incubada por 1 hora a 37°C com o respectivo pool de soro na concentração de 1:500, diluídos em tampão de bloqueio. Lavada seis vezes e.

(41) 40. incubada com anti-IgG humana conjugada com Peroxidase (Sigma) diluído 1:5000 em PBS-T 0,05% + 5% de BSA durante 1 hora a 37°C.. Lavada. seis. vezes. com. PBS-T. 0,05%.. A. ligação. antígeno/anticorpo foi detectada pela adição de tampão ortofenilenodiamina oxigenada. sulfúrico. A. 2N.. (Titertek. (OPD) reação. A. a foi. 1mg/mL. interrompida. reatividade. Multiskan. acrescida. Plus,. foi. obtida. Flow. com em. de. 3%. de. água. solução. de. ácido. leitora. Laboratories,. de. placas. USA). com. absorbância de 492 nm. Todas as amostras foram testadas em duplicata.. 3.9 ELISA dos clones D8, F10, G12 com pool de soros Com os clones D8, F10, G12 e um clone irrelevante de c â n c e r d e p r ó s t a t a c o m o c o n t r o l e ( S P L F PW L ) , f o i r e a l i z a d o u m ELISA com 100 uL de pool de soros de indivíduos com tuberculose (TB+), indivíduos com prova tuberculínica positiva (PPD+) e prova tuberculínica negativa (PPD-). Sensibilizou-se. uma. placa. de. microtitulação. (NUNC. MAXISORP) com 10¹°(Pfu) dos clones por poço. A sensibilização se deu com 50 uL de. tampão carbonato 50 mM pH=9,6, por 16. horas a 4°C. No dia seguinte a placa foi bloqueada com 300 uL de tampão (PBS 1X + 5% de BSA) por 1 hora a 37°C. Em seguida, lav ou- se três v ezes a placa com PBS-T a 0, 05% e incubada c om 100 uL pool de soros por 1 hora a 37°C. A placa foi lavada com PBS-T 0, 05% por cinco vezes e a placa f oi inc ubada por 1 hora a 37°C com anti-IgG humana conjugada com Peroxidase (Sigma) diluído 1:5000 em PBS-T 0,05% + 5% de BSA durante 1 hora a 37°C. Lavada a placa seis vezes com PBS-T 0,05%, a ligação antígeno/anticorpo foi detectada pela adição de tampão ortofenilenodiamina oxigenada.. A. (OPD) reação. a foi. 1mg/mL. acrescida. interrompida. pela. de. 3%. de. água. solução. de. ácido. sulfúrico 2N. A reatividade foi obtida em leitora de placas com.

(42) 41. absorbância de 492 nm. Todas as amostras foram testadas em duplicata.. 3.10 ELISA do clone F10 com soros individuais: TB ativa (TB+), PPD positivo (PPD+), PPD negativo (PPD-) Uma placa carregada foi sensibilizada com fagos 10¹° por poço com 50 uL de. tampão carbonato 50 mM pH=9,6, por 16. horas a 4°C. Em seguida a placa foi bloqueada com 300 uL de tampão (PBS 1X + 5% de BSA) por 1 hora a 37°C . Lavou-se três vezes com PBS-T a 0,05% e incubada com 100 uL de soros individuais de TB+, PPD+, PPD- . A placa foi lavada com PBS-T 0,05% por cinco vezes e incubada por 1 hora a 37°C com anti-IgG humana conjugada com Peroxidase (Sigma) diluído 1:5000 em PBS-T 0,05% + 5% de BSA durante 1 hora a 37°C. lavagens. com. PBS-T. 0,05%,. a. ligação. Após as seis. antígeno/anticorpo. foi. detectada pela adição de tampão orto-fenilenodiamina (OPD) a 1mg/mL. acrescida. de. 3%. de. água. oxigenada.. A. reação. foi. interrompida pela solução de ácido sulfúrico 2N. A reatividade foi obtida em leitora de placas com absorbância de 492 nm. Todas as amostras foram testadas em duplicata.. 3.11 ELISA do clone F10 com soros de indivíduos em tratamento Uma placa carregada foi sensibilizada com fagos 10¹° por poço com 50 uL de. tampão carbonato 50 mM pH=9,6, por 16. horas a 4°C. Em seguida a placa foi bloqueada com 300 uL de tampão (PBS 1X + 5% de BSA) por 1 hora a 37°C . Lavou-se três vezes com PBS-T a 0,05% e incubada com 100 uL de soros dos indivíduos em tratamento. A placa foi lavada com PBS-T 0,05% por cinco vezes e incubada por 1 hora a 37°C com anti-IgG humana conjugada com Peroxidase (Sigma) diluído 1:5000 em.

(43) 42. PBS-T 0,05% + 5% de BSA durante 1 hora a 37°C. lavagens. com. PBS-T. 0,05%,. a. ligação. Após as seis. antígeno/anticorpo. foi. detectada pela adição de tampão orto-fenilenodiamina (OPD) a 1mg/mL. acrescida. de. 3%. de. água. oxigenada.. A. reação. foi. interrompida pela solução de ácido sulfúrico 2N. A reatividade foi obtida em leitora de placas com absorbância de 492 nm. Todas as amostras foram testadas em duplicata.. 3.12 Extração da proteína do Mycobacterium tuberculosis O extrato total proteico do patógeno foi obtido de colônia do M. tuberculosis em cultura de meio Löwenstein - Jensen e foram submetidas a uma centrifugação de 8.000 x g por 15 minutos a 4°C, após lavadas por 3 vezes com 1,0 ml de tampão contendo 10 mM Tris (pH 8.8); 3 mM NaCl; 5,0 mM EDTA mais 1 mM de fluoreto de alfa-fenilmetil sulfonila (PMSF) + Isopropanol e centrifugado por 2 min à 3.000 x g. O precipitado formado foi lisado com 200 uL da solução: 10 mM Tris (ph 8.8); 0,5 % p/v dodecil sulfato de sódio (SDS); 5,0 mM etileno diamino tetra acetato (EDTA); 1,0mM PMSF. Ao lisado foi acrescentado 100,0 m M Dithiot hreitol, β-m ercapt anoethanol (DTT). As am ostr as foram fervidas à 100 °C quantificação. das. por 3 minutos e estocadas à – 80°C. A proteínas. foi. realizada. pelo. manual. do. fabricante de BRADFORD. Todo o processo foi realizado seguindo as normas de biossegurança do laboratório de nível 2.. 3.13 ELISA com extrato proteico do M.tuberculosis, soros individuais TB+,PPD+,PPD-, e indivíduos em tratamento. Uma placa carregada foi sensibilizada com 2.6 ug/ml de extrato. proteico. por. do. M.tuberculosis. diluídos. em. tampão. carbonato 50 mM pH=9,6, por 16 horas a 4°C. Em seguida a placa foi bloqueada com 300 uL de tampão (PBS 1X + 5% de BSA) por 1.

(44) 43. hora a 37°C e, posteriormente, lavou-se três vezes com PBS-T a 0,05% e incubou-a com soros dos indivíduos TB+,PPD+,PPD- e em tratamento na proporção de 1:100. A placa foi, novamente, lavada com PBS-T 0,05% por cinco vezes e incubada por 1 hora a 37°C com anti-IgG humana conjugada com Peroxidase (Sigma) diluído 1:5000 em PBS-T 0,05% + 5% de BSA durante 1 hora a 37°C.. Após. as. seis. lavagens. com. PBS-T. 0,05%,. a. ligação. antígeno/anticorpo foi detectada pela adição de tampão ortofenilenodiamina oxigenada.. A. (OPD) reação. a. 1mg/mL. foi. acrescida. interrompida. pela. de. 3%. de. água. solução. de. ácido. sulfúrico 2N. A reatividade foi obtida em leitora de placas com absorbância de 492 nm. Todas as amostras foram testadas em duplicata.. 3.14 ELISA competitivo do clone F10 com soros de indivíduos em tratamento e extrato proteico do M.tuberculosis A placa (NUNC MAXISORP) foi sensibilizada com 50 uL de. fago na diluição 10¹° com tampão carbonato 50 mM pH=9,6,. por 16 horas ove rnight a 4°C. B loqueada com 300 uL de t am pão (PBS 1X + 5% de BSA) por 1 hora a 37°C. Os soros de pacientes em tratamento com quimioterápico (30, 60, 90, 120 e 180 dias) foram diluídos em 1:100 em PBS-T (0,005%) -BSA 5% e préincubados com. 1,0 ug/mL, 7,5 ug/mL, 15,0 ug/mL de extrato. proteico do M.tuberculosis. As placas foram lavadas três vezes com PBS-T a 0,05% e incubada com a solução que continha os soros. individuais. mais. o. extrato. proteico. das. diferentes. concentrações por 1 hora a 37°C nas. A placa foi lavada com PBS-T 0,05% por cinco vezes, e incubadas com anti-IgG humana conjugada. com. peroxidase. (Sigma). diluído. 1:5000. em. PBS-T. 0,05% + 5% de BSA durante 1 hora a 37°C. Lavou-se novamente a placa e a ligação antígeno/anticorpo foi detectada pela adição de tampão orto-fenilenodiamina (OPD) a 1mg/mL acrescida de 3% de.

(45) 44. água oxigenada. A reação foi interrompida pela solução de ácido sulfúrico 2N. A reatividade foi obtida em leitora de placas com absorbância de 492 nm. Todas as amostras foram testadas em duplicatas.. 3 . 1 5 An á l i s e s e s t a t í s t i c a s. Os dados obtidos neste estudo foram analisados pelo aplicativo. GraphPadPrisma. apresentaram análise. de. dispersão variância. versão. Gaussiana. (ANOVA). 5.0. foram. com. Para. os. dados. utilizados. repetição. que. testes. (amostra. e em. duplicatas). Para os índices de significância foi considerado o v alor de p< 0, 05. O test e de Kruskal-W allis f oi ut ilizado par a comparar os diferentes grupos.. 4 R E S U L T AD O S. 4 . 1 Ac o p l a m e n t o d a s I g G ’ s n a s m i c r o e s f e r a s d e p r o t e í n a G A primeira etapa do estudo consistiu no acoplamento das IgG’s por meio de microesferas magnéticas (beads magnéticos) de proteína G para quantificar e verificar a ef iciência do isolamento dos anticorpos de pool de soros dos pacientes com tuberculose ativa (TB+), prova de tuberculínica positiva (PPD+), e negativa (PPD-).. No. ensaio. beads-ELISA. demonstrou. significativo comparado ao controle (Figura 2).. um. acoplamento.