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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL

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MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL

BARBARA PAULA DOS SANTOS BATISTA

“AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS REPRODUTIVOS E BIÓPSIAS ENDOMETRIAIS DE ÉGUAS INSEMINADAS COM SÊMEN DE ASININO”

Niterói 2013

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MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL

BARBARA PAULA DOS SANTOS BATISTA

“AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS REPRODUTIVOS E BIÓPSIAS ENDOMETRIAIS DE ÉGUAS INSEMINADAS COM SÊMEN DE ASININO”

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica Reprodução Animal.

ORIENTADORA: PROFA. DRA. ANA MARIA REIS FERREIRA CO-ORIENTADOR: PROF. DR. FELIPE ZANDONADI BRANDÃO

Niterói 2013

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“AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS REPRODUTIVOS E BIÓPSIAS ENDOMETRIAIS DE ÉGUAS INSEMINADAS COM SÊMEN DE ASININO”

Dissertação apresentada Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal.

Aprovada em 27 de fevereiro de 2013.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________ Profª. Drª. Ana Maria Reis Ferreira - Orientadora

Universidade Federal Fluminense

______________________________________________ Profª. Drª. Juliana da Silva Leite

Universidade Federal Fluminense

______________________________________________ Profª. Drª. Lio Moreira

Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro

Niterói 2013

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Agradecimento a todos que estiveram ao meu lado durante todo trajeto do mestrado. À minha família, aos meus amigos e colegas de mestrado, aos Médicos Veterinários que trabalham comigo e que sempre me apoiaram. Ao Médico Veterinário Renato Brito, que me ajudou a formatar a dissertação em tempo recorde. A amiga Thais Torres, pelas revisões ortográficas.

A toda equipe da Fazenda Vital Brazil, sem eles não teria conseguido. Obrigada pela atenção e o respeito. Ao Médico Veterinário Leonardo G. R. Meirelles e o Sr. Luís Eduardo R. Cunha, pela oportunidade de desenvolver o projeto.

A Profª. Drª. Ana Maria Reis Ferreira, pela orientação e a calma nos momentos de nervosismo.

Ao Prof. Dr. Felipe Zandonadi Brandão, pela orientação e ajuda em todo projeto.

A Profª. Drª Ana Beatriz Fonseca, pela execução da análise estatística.

A Profª. Drª Juliana Leite, pela ajuda na avaliação das amostras histopatológicas.

À Fabiane, técnica do Laboratório de Anatomia Patológica que escutou todas as minhas agonias e sempre teve uma palavra amiga.

À Profª. Drª Eunice Oba, pela orientação na avaliação das amostras para dosagem hormonal.

A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a concretização deste trabalho.

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LISTA DE QUADROS E TABELAS ... 06

LISTA DE FIGURAS ... 08

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ... 11

RESUMO ... 12

ABSTRACT ... 14

1. INTRODUÇÃO ... 16

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 18

2.1. CICLO ESTRAL DA ÉGUA ... 18

2.2. MORFOLOGIA UTERINA DA ÉGUA ... 20

2.3. MECANISMOS DE DEFESA UTERINA ... 21

2.4. ENDOMETRITE ... 23

2.5. AVALIAÇÃO GINECOLÓGICA ... 25

2.5.1. Enfermidades encontradas no exame histológico ... 26

2.6. FATORES QUE INFLUENCIAM A FERTILIDADE DAS ÉGUAS INSEMINADAS DURANTE A ESTAÇÃO DE MONTA ... 28

3. OBJETIVO GERAL ... 32

3.1. OBJETIVO ESPECÍFICO ... 32

4. METODOLOGIA ... 33

4.1. LOCALIZAÇÃO, CONDIÇÕES CLIMÁTICAS E PERÍODO EXPERIMENTAL ... 33 4.2. ANIMAIS EXPERIMENTAIS ... 34 4.2.1. Éguas ... 34 4.2.2. Reprodutor ... 35 4.3. DELINEAMENTO DO EXPERIMENTO ... 36 4.3.1. Controle reprodutivo ... 36 4.3.1.1. Fêmeas ... 36

4.3.2. Colheita, avaliação espermática e diluição do ejaculado ... 38

4.3.2.1. Colheita do sêmen ... 38

4.3.2.2. Avaliação espermática ... 39

4.3.2.3. Diluição do ejaculado ... 39

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4.4.2. Dosagem de progesterona ... 42 4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 42 5. RESULTADOS ... 45 5.1. DADOS REPRODUTIVOS ... 45 5.2. AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA ... 48 5.2.1. Animais jovens ... 49 5.2.2. Animais senis ... 51 5.3. DOSAGEM DE PROGESTERONA ...... 61 6. DISCUSSÃO ... 60 7. CONCLUSÕES ... 66 8. ANEXOS ... 67

8.1. DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM USO DE ANIMAIS DA UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE ... 67

8.2. FICHA DE ACOMPANHAMENTO INDIVIDUAL (Éguas) ... 68

8.3. FICHA DE AVALIAÇÃO DE SÊMEN ... 69

8.4. FICHA DOS RESULTADOS DA HISTOPATOLOGIA DE ÉGUAS INSEMINADAS COM SÊMEN DE ASININO FRESCO E DILUÍDO ... 70

8.5.1. Ficha de avaliação histopatológica de seções endometriais ... 71

8.5.2. Ficha de avaliação histopatológica de seções endometriais ... 72

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Tabela 1: Dados climatológicos obtidos durante o período experimental (média± desvio padrão). (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012) ... 34

Tabela 2. Distribuição dos grupos de acordo com a faixa etária e os ciclos estrais utilizados. (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012) ... 35

Tabela 3: Classificação do grau de endometrite segundo Kenney e Doig (1986), modificado por Schoon et al., (1992) ... 41

Tabela 4. Número de ciclos e da taxa de concepção relacionados à faixa etária de éguas inseminadas com sêmen fresco e diluído de asinino. (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012) ... 46

Tabela 5. Número de ciclos e da taxa de concepção relacionados ao intervalo da última inseminação e a ocorrência da ovulação, das éguas inseminadas com sêmen fresco e diluído de asinino. (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012) ... 47

Tabela 6. Número de ciclos e da taxa de concepção relacionado ao bimestre da ovulação, das éguas inseminadas com sêmen fresco e diluído de asinino. (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012) ... 47

Tabela 7. Número de ciclos e da taxa de concepção relacionados ao número de inseminações, com sêmen fresco e diluído de asinino, em éguas. (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012) ... 48

Tabela 8. Classificação endometrial, de acordo com a faixa etária e fase do ciclo estral, de éguas inseminadas com sêmen fresco e diluído de asinino. (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012) ... 49

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sêmen de asinino (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012) ... 51

Tabela 10. Alterações inflamatórias agudas avaliadas de biópsias endometriais que foram coletas de éguas jovens e senis, em dois momentos do ciclo estral e inseminadas com sêmen de asinino (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012) ... 52

Tabela 11. a. Alterações inflamatórias degenerativas avaliadas de biópsias endometriais que foram coletas de éguas jovens e senis, em dois momentos do ciclo estral e inseminadas com sêmen de asinino (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012) ... 52

Tabela 11. b. Alterações inflamatórias degenerativas avaliadas de biópsias endometriais que foram coletas de éguas jovens e senis, em dois momentos do ciclo estral e inseminadas com sêmen de asinino (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012) ... 53

Tabela 12 – classificação das éguas jovens nos intervalos de 48/72 horas (ultima inseminação e detecção da ovulação) ... 73

Tabela 13 – classificação das éguas senis nos intervalos de 48/72 horas (ultima inseminação e detecção da ovulação) ... 74

Tabela 14 - Dosagem hormonal (progesterona), e éstro e no diestro de éguas inseminadas com sêmen de asinino fresco ... 75

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Figura 1 – Organograma do Controle reprodutivo (modelo modificado segundo Palhares, 1989) ... 37

Figura 2 – Prancha 1: Fotomicrografia de seção endometrial equina, em HE. A - categoria IIA, égua jovem, no estro, intervalo de 48 horas entre inseminação e ovulação. Moderado infiltrado inflamatório misto de neutrófilos e mononucleares (aumento, 400x). B - Categoria I, égua jovem, no diestro, intervalo de 48 horas entre inseminação e ovulação. Acentuado Infiltrado inflamatório polimorfonucleares rico em eosinófilos acentuados (aumento, 400x). C - Categoria III, égua jovem, no estro, intervalo de 72 horas entre inseminação e ovulação. Acentuado infiltrado inflamatório de neutrófilos associado à dilatação glandular acentuada (aumento, 100x). D - Categoria III, égua jovem, no estro, intervalo de 72 horas entre inseminação e ovulação. Dilatação glandular e fibrose periglandular acentuadas, E - Categoria III, égua jovem, no diestro, intervalo de 72 horas entre inseminação e ovulação. Infiltrado Inflamatório neutrofílico acentuado (aumento, 400x). F - Categoria IIB, égua jovem, no estro, intervalo de 72 horas entre inseminação e ovulação. Acentuado infiltrado inflamatório misto (aumento, 400x) ... 54

Figura 3 – Prancha 2: Fotomicrografia de seção endometrial equina, em HE. A/B – Categoria IIB, éguas jovens, no estro, intervalo 72 horas entre inseminação e ovulação. Acentuado infiltrado inflamatório misto e fibrose periglandular moderada (aumento, 400x). C - Categoria IIB, égua jovem, no estro, intervalo 72 horas entre inseminação e ovulação. Hialinização e hipertrofia da parede arterial (aumento, 400x). D – Categoria III, égua jovem, no diestro, Intervalo 72 horas entre inseminação e ovulação. Moderada dilatação glandular e Infiltrado inflamatório neutrofílico acentuado (aumento, 100x). E - Categoria III, égua jovem, no diestro, intervalo 72 horas entre inseminação e ovulação. Moderada dilatação glandular, discretas Lacunas linfáticas e Infiltrado inflamatório neutrofílico acentuado (aumento, 100x). F - Categoria III, égua jovem, no diestro, intervalo 72 horas entre inseminação e ovulação. Discretas lacunas linfáticas e infiltrado inflamatório neutrofílico acentuado (aumento, 100x) ... 55

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Categoria III, égua jovem, no diestro, intervalo 72 horas entre inseminação e ovulação. Acentuado Infiltrado inflamatório neutrofílico (aumento, 100x). B - Categoria IIB, égua jovem, no estro, intervalo 48 horas entre inseminação e ovulação. Diminuição da população glandular (aumento, 100x). C - Categoria IIB, égua jovem, no estro, intervalo 48 horas entre inseminação e ovulação. Acentuadas lacunas linfáticas e ninhos fibróticos periglandulres (aumento, 100x). D - Categoria IIB, égua jovem, no estro, intervalo 48H entre inseminação e ovulação. Acentuados ninhos fibróticos periglandular e diminuição da população glandular (aumento, 100x). E - categoria IIB, égua jovem, no estro, intervalo 48 horas entre inseminação e ovulação. Acentuadas lacunas linfáticas, ninhos fibróticos e diminuição da população glandular (aumento, 100x). F - Categoria IIB, égua jovem, no diestro, intervalo 72H entre inseminação e ovulação. Moderado infiltrado inflamatório neutrofílico (aumento, 400x) ... 56

Figura 5 – Prancha 4: Fotomicrografia de seção endometrial equina, em HE. A - Categoria IIB, égua senil, no estro, intervalo 48 horas entre a inseminação e a ovulação. Moderado infiltrado inflamatório neutrofílico (aumento, 400x). B – Categoria IIB, éguas senis, no estro, intervalo 48 horas entre a inseminação e a ovulação. Moderada fibrose periglandular e Infiltrado inflamatório neutrofílico (aumento, 400x). C/D - Categoria IIB, éguas senis, no diestro, intervalo 48 horas entre a inseminação e a ovulação. Foco infiltrado inflamatório neutrofílico acentuado (aumento, 400x) ... 57

Figura 6 – Prancha 5: Fotomicrografia de seção endometrial equina, em HE. A - categoria IIB, égua senil, no estro, intervalo 72 horas entre a inseminação e a ovulação. Moderados ninhos fibróticos periglandulares e artérias hipertrofiadas com hialinização de parede (aumento, 100x). B - Categoria IIB, égua senil, no estro, intervalo 72 horas entre a inseminação e a ovulação. Moderados ninhos fibróticos periglandulares, dilatação glandular e diminuição da população glandular (aumento, 100x). C - categoria IIB, égua senil, no estro, intervalo 72 horas entre a inseminação e a ovulação. Acentuado infiltrado inflamatório mononuclear e fibrose periglandular moderada (aumento, 400x). D - Categoria IIB, égua senil, no estro, intervalo 72

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(aumento, 400x). E - Categoria II, égua senil, no diestro, intervalo 72 horas entre a inseminação e a ovulação. Infiltrado inflamatório neutrofílico moderado e infiltrado inflamatório mononuclear acentuado. F - Categoria IIB, égua senil, no diestro, intervalo 72 horas entre a inseminação e a ovulação. Dilatação glandular moderada e fibrose periglandular moderada (aumento, 400x) ... 58

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ẋ e σ ... Média e Desvio Padrão % ... Porcentagem

CL ... Corpo Lúteo cm ... Centímetros

EDTA ... Ácido Etilenodiamino Tetra-acético FSH ... Hormônio Folículo Estimulante GL ... Graus Gay-Lussac

GnRH ... Hormônio Liberador de Gonadotrofina H ... Horas

H.E ... Hematoxilina-Eosina I.A ... Inseminação artificial

IFE ... Indicie de Fertilidade Equina LH ... Hormônio Luteinizante mg ... Miligramas

mL ... Mililitros mm ... Milímetros

ng/mL ... Nanogramas por mililitros Nº ... Número

ºC ... Graus Celsius P4 ... Progesterona

PGF 2α ... Prostaglandina 2-alfa PMNs ... Polimorfonuacleares rpm ... Rotação por minuto SP ... São Paulo

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O presente experimento objetivou avaliar os parâmetros reprodutivos e biópsias endometriais de éguas antes e após a inseminação artificial com sêmen de asinino. Foram utilizadas 73 éguas sem raça definida, com idade entre 3 a 16 anos e acompanhados 100 ciclos estrais durante a estação de monta, que ocorreu nos meses de outubro de 2011 a março de 2012. As éguas foram inseminadas com sêmen fresco e diluído, coletado de um único asinino, e eram realizadas às segundas, quartas e sextas-feiras, quando eram detectados, ultrassonograficamente, folículos ovarianos com diâmetros entre 30 a 35 mm. As doses inseminantes eram depositadas no corpo uterino, em intervalos de 48 a 72 horas até a detecção da ovulação e confirmadas por ultrassom. Os ciclos estrais foram agrupados de acordo com: a idade dos animais (éguas jovens e senis); o intervalo entre as inseminações e a ocorrência das ovulações; o número de inseminações por ciclo e o bimestre da estação de monta. Um total de 84 amostras para biopsia endometrial provenientes de 42 éguas foram coletadas em dois momentos do ciclo estral (estro e diestro) e classificadas quanto ao grau de endometrite e alterações regressivas em escores I, IIa, IIb e III, de acordo com Kenney e Doig, (1986). Os resultados das avaliações dos ciclos estrais observados revelaram que não houve influência da idade, do intervalo entre as inseminações, do número de inseminações e do bimestre da estação de monta sobre a taxa de concepção da tropa. A taxa de concepção observada nesta investigação foi de 50,00% entre as éguas jovens e 57,40% entre as senis; 48,10% entre as éguas inseminadas no intervalo de 48 horas e 60,40% no intervalo de 72 horas; 54,20% nas éguas inseminadas uma única vez, 51,70% naquelas inseminadas 2 vezes e 58,80% nas éguas inseminadas 3 ou mais vezes. Em relação ao bimestre da ovulação, a taxa de concepção foi de 59,30% entre outubro e novembro de 2011, 50,00% de dezembro a janeiro de 2012 e de 54,50% de fevereiro a março de 2012. A biópsia endometrial revelou que a classificação IIb foi a mais frequente entre as éguas, sendo 30,68% das amostras coletadas no estro e 36,35% no diestro. Não houve influência da idade e do intervalo entre as inseminações na classificação das biópsias endometriais. Os resultados da presente investigação comprovam que o protocolo de inseminação utilizado neste experimento obteve uma taxa de concepção aceitável para estação de monta, preconizando a sua realização em

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Palavras-chaves: Inseminação artificial, sêmen de asinino, intervalos entre

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This study aimed to evaluate the reproductive parameters and endometrial biopsies of mares before and after artificial insemination with semen asinine. Seventy-three mares of no specific breed were used between 3 and 16 years of age and accompanied 100 estrous cycles during the breeding season, which took place from October 2011 to march 2012. The mares were inseminated with fresh semen, diluted, collected from one donkey, and on Mondays, Wednesdays and Fridays, when ovarian follicles with diameters of 30-35 mm were detected by ultrasound. The insemination dose was deposited in the uterine body, at intervals of 48 to 72 hours until detection of ovulation, and confirmed by ultrasound. The estrous cycles were grouped according to: the age of the animals (young and old mares); the interval between insemination and the occurrence of ovulation; the number of inseminations per cycle and the bimester of the breeding season. A total of 84 endometrial biopsy samples from 42 mares were collected in two stages of the estrous cycle (estrus and diestrus) and classified according to the degree of endometritis and regressive changes in scores I, IIa, IIb and III, according to Kenney and Doig, (1986). The results the of the estrous cycles observed showed no influence of age of the interval between inseminations, of number of inseminations and of the bimester of the breeding season conception rate of the herd. The conception rate observed in this study was 50.00% among young mares and 57.40% among old; 48.10% among mares inseminated within 48 hours and 60.40% within 72 hours; 54.20% in mares inseminated once, 51.70% in those inseminated twice and 58.80% inseminated 3 or more times, with regard to the period the conception rates was 59.30% from October to November 2011, 50.00% from December to January 2012 and 54.50% from February to March 2012. Endometrial biopsy revealed that the classification IIb was most frequent among the mares 30.68% of the samples collected during the estrus and during 36.35% diestrus. There was no influence of age and interval between inseminations in the classification of endometrial biopsies. The results of this study prove that the insemination protocol used in this experiment achieved an acceptable conception rate of the mating season and recommends its implementation in commercial stud farms during the breeding season, without impairment of conception rate.

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1. INTRODUÇÃO

No Brasil estima-se que a população de equídeos tenha 7.986.023 cabeças, sendo 5,5 milhões equinos, sendo 974,5 mil asininos e 1,3 milhões de muares (IBGE, 2011).

Apesar das substanciais reduções nos efetivos dos equídeos, motivadas pela mecanização dos transportes, a produção de muares, ainda constitui uma importante atividade econômica no Brasil.

Os muares são animais híbridos, oriundos do cruzamento de jumentos (Equus

asinus) com fêmeas da espécie equina (Equus caballus). No país, destaca- se a

criação de jumentos da raça Pêga e seus híbridos (mulas e burros). Os investimentos na genética têm sido responsáveis por uma grande valorização da raça Pêga, mas ainda falta conhecer muitos aspectos sobre fisiologia reprodutiva desta espécie. Os asininos são considerados mais resistentes em comparação aos cavalos e menos exigentes quanto ao manejo, além de ter em maior vida útil em comparação com os equinos (DÍAZ, et al., 2009). Investimentos em genética têm sido responsáveis por uma grande valorização da espécie E. asinus. O mercado dos muares, por sua vez, abrange vários setores, salientando-se o seu uso como animais de tração, bem como os envolvidos no manejo de rebanhos de corte. Destaca-se ainda a sua utilização em concursos de marcha e na realização de cavalgadas. No topo da pirâmide encontra-se um mercado mais restrito, mas de substancial valor agregado, o da seleção genética.

Um dos pontos centrais para a eficiência do programa reprodutivo é utilização de sêmen de boa qualidade e a instituição de um protocolo de inseminações, que tenha como objetivo realizar o mínimo de procedimentos possíveis, com intervalos

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adequados, não conferindo agressão endometrial e tendo por fim a confirmação da gestação.

A instauração de um programa inseminações artificiais fixadas nas segundas, quartas e sextas-feiras tem sido relatado pelos autores Palhares (1997); Silva Filho

et al., (1998) e Saturnino et al., (2002), e tem o objetivo de reduzir o trabalho nos

finais de semana, facilitar a programação do técnico no haras e melhorar o controle dos dias da inseminação. O intervalo proposto por estes autores, não apresentou alteração na taxa de concepção. Mas pouco se tem investigado com relação à resposta endometrial e a viabilidade deste mesmo protocolo para obtenção de muares para o plantel brasileiro.

Os processos inflamatórios e degenerativos que acometem o endométrio são considerados como uma das principais causas de infertilidade em éguas (Concha-Bermejillo e Kennedy,1982); Hoffman et al., (2009); Snider et al., (2011); Lehmann et

al., (2011) e tem como principal enfermidade envolvida a endometrite, que apresenta

diversas etiologias e diferentes manifestações clínicas.

Diante do exposto é imprescindível uma investigação mais detalhada sobre a influência da inseminação artificial utilizando sêmen de asinino em éguas sobre a taxa de concepção e resposta endometrial.

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2.1. CICLO ESTRAL DA ÉGUA

No equino, o ritmo circadiano da reprodução é primariamente regulado pelas mudanças no fotoperíodo ao longo do ano. Este sinal ambiental é traduzido para um sinal endócrino na glândula pineal que está localizada no centro do cérebro. Essa glândula secreta melatonina durante a fase de menor luminosidade, sendo que esse hormônio possui atividade inibidora de gonadotrofinas. Na égua, dias curtos são associados à queda na secreção de gonadotrofinas e consequente diminuição na atividade ovariana. A duração do anestro varia entre éguas e também na mesma égua entre os anos (DAELS, 2006).

O ciclo estral das éguas se inicia com aumento da estimulação luminosa. A luz incide pela retina ocular, ativando os receptores de rodopsina, que ao se conectarem com a glândula pineal, aumentam a secreção do hormônio melatonina. A melatonina é responsável por aumentar a frequência de liberação de GnRH (Hormônio liberador de gonadotrofina) pelo hipotálamo (HAFEZ et al., 2004).

O hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) é o que induz a hipófise anterior a liberar o hormônio folículo estimulante (FSH), que nas gônadas femininas estimula as células da granulosa a produzirem estrógeno, que estimula o aumento de células da granulosa e também o número de receptores de gonadotrofinas. A produção do hormônio folículo estimulante (FSH) através da frequência do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) é inibida pelo aumento no nível de estrógeno (E2), produzido pelos folículos em desenvolvimento, o estrógeno diminui a frequência de liberação do GnRH, assim, essa nova frequência do GnRH estimula a

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produção e liberação de LH (hormônio luteinizante) que age no final da maturação folicular e é o responsável por estimular a indução da ovulação (GINTHER, 1992).

O ciclo estral da égua tem duração média de 21 dias, consistindo de 14 dias de diestro (fase luteínica) e 7 dias de estro (fase estrogênica), período em que ela está sexualmente receptiva (HAFEZ;HAFEZ, 2004).

A presença do garanhão é o melhor meio para detectar o cio. Além disso, a maioria das éguas permanecem voluntariamente junto do garanhão (LEBLANC et

al., 2003), o que permite a aproximação e cobertura (SAMPER, 2008). Nesta fase,

os comportamentos da égua perante o garanhão incluem a elevação da cauda e a permanência da posição de urinar e sem evidência de esforço, movimentos repetidos de eversão dos lábios vulvares com eversão do clitóris, agachamento e frequente eliminação de urina, normalmente com um odor característico e aparência amarela opaca (LEBLANC et al., 2003). Anatomicamente, na fase de estro, a égua apresenta relaxamento do útero e cérvix, presença de um folículo de grande dimensão (dominante) e edema endometrial (SAMPER, 2008).

Os folículos contidos nos ovários amadurecem, desenvolvem e produzem estradiol, o hormônio da receptividade sexual e os óvulos. Um óvulo é liberado (ovulado) aproximadamente 24 - 48 horas antes do final do estro. Após a ovulação, forma-se um corpo lúteo (CL) que produz a progesterona que leva a égua a rejeitar os avanços sexuais do garanhão. Enquanto a progesterona está sendo produzida, a égua encontra-se em diestro ou fase luteal do ciclo estral (NEELY; LIU; HILLMAN, 1983). Os hormônios esteroides sexuais regulam o crescimento e a diferenciação endometrial (AUPPERLE et al., 2000). A progesterona é um hormônio esteroidal secretado pelo corpo lúteo, placenta e glândula adrenal. Sua função é preparar o endométrio para implantação do embrião e manutenção da gestação pelo aumento da atividade secretora das glândulas endometriais e inibindo a motilidade do endométrio e o estro. (HAFEZ et al., 2004). A concentração de progesterona varia durante o início da gestação e entre as éguas. Valores acima de 2,0 ng/mL têm sido sugeridos como suficientes para a manutenção da gestação. Nas éguas que apresentaram valores abaixo de 1,0 ng/mL apresentaram morte embrionária (BALL e DAELS, 1997).

A prostaglandina (PGF 2α), hormônio secretado pelo útero é responsável por promover a luteólise do corpo lúteo e consequentemente ocorre a diminuição da

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concentração sérica de PGF2a permitindo assim o crescimento de uma nova onda folicular (GINTHER et al., 1992).

O estrogênio tem importante ação na limpeza física do útero e promove a abertura da cérvix, eliminando os excessos de fluidos uterinos, favorecendo a contratilidade miometrial, (TROEDSSON et al., 1993c).

2.2. MORFOLOGIA UTERINA DA ÉGUA

O útero é composto de por três camadas: endométrio, miométrio e perimétrio. O endométrio consiste em duas camadas: epitélio luminal e lâmina própria. O epitélio luminal apresenta células cuboidais a colunares altas que residem em uma membrana basal e varia de altura de acordo com o ciclo estral (KENNEY, 1978).

A lâmina própria é composta de duas camadas, estrato compacto e estrato esponjoso. O estrato compacto é caracterizado por ter uma densidade alta de células do estroma com números capilares sob a membrana basal. O estrato esponjoso possui baixa densidade de células e com muitas fibras do tecido conjuntivo, criando um aspecto esponjoso. Os vasos sanguíneos no estrato esponjoso são capilares, arteríolas, vênulas e ocasionalmente pequenas artérias musculares. Ocorre também a existência de numerosos vasos linfáticos (KENNEY, 1978).

Durante o ciclo estral ocorrem modificações morfológicas no endométrio. No estro, as células do epitélio luminal apresentam vacúolos citoplasmáticos e também é comum o acúmulo ou marginalização de neutrófilos (polimorfonucleares) ao redor de vênulas ou capilares. Por causa do edema endometrial, a densidade das glândulas por unidade de área é menor durante o estro do que em outras faces do ciclo estral (KENNEY, 1978). No diestro a densidade glandular aumenta normalmente, pois o edema do estroma esta diminuído e a tortuosidade das glândulas aumentam (KENNEY, 1978).

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2.3. MECANISMOS DE DEFESA UTERINA

O lúmen uterino de uma égua fértil normal é bacteriologicamente estéril e tem a capacidade de recuperar-se da contaminação natural ocorrida após o acasalamento ou procedimentos veterinários. A resposta natural do útero às bactérias induzidas nesse período deve-se a liberação de neutrófilos pela circulação sanguínea que irriga o endometrio, resultando em uma reposta inflamatória que combate geralmente dentro de 24 horas (PYCOCK; ALLEN, 1999).

Éguas com seus mecanismos de defesa local prejudicados desenvolvem endometrites persistentes, as quais podem resultar em falha na concepção ou morte embrionária precoce. Os mecanismos de defesa às infecções podem ser divididos em físicos (abertura e integridade da cérvix, capacidade de contração do miométrio e drenagem linfática endometrial), celulares (fagocitose, quimiotaxia) e humorais (anticorpos IgG e IgA, principalmente) (RIET-CORREA, 2007).

As barreiras físicas que impedem o acesso dos microrganismos ao útero são: a vulva (CASLIK, 1937; PASCOE, 1979) e a prega vestíbulo-vaginal (HINRICHS et

al.,1988).

Nos equinos o sêmen é depositado no lúmen uterino independente do método de cobertura. Neste momento, no entanto, as barreiras físicas são ultrapassadas, sendo os espermatozoides, proteínas do plasma seminal e bactérias do sêmen e do pênis do garanhão, responsáveis pela indução de uma resposta inflamatória aguda (TROEDSSON, 1997 apud MALCHITZKY et al., 2007).

Um importante mecanismo para eliminação rápida do agente agressor e dos componentes e subprodutos inflamatórios é a contratilidade miometrial, que é imprescindível para a limpeza física da luz uterina (EVANS et al., 1987, TROEDSSON et al., 1993, LEBLANC, 1994).

Durante o estro, ocorrem períodos de atividade contrátil de aproximadamente cinco minutos, alternados com períodos equivalentes de repouso (JONES et al., 1991). A eficiência é tal, que estudos utilizando cintilografia mostram que, em éguas sadias, metade de um radiocolóide infundido no útero, em conjunto com colônias de

Streptococcus zooepidemicus, é eliminado nos primeiros 60 minutos após a

inoculação (LEBLANC et al., 1994). A limpeza física do útero tem um papel central na patogenia da endometrite persistente pós-cobertura (TROEDSSON, 1997).

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Nikolakopoulos e Watson (2000) induziram deficiência de contratilidade miometrial em éguas sadias, através da administração de clenbuterol. Eles observaram que apesar do acúmulo de fluido uterino e da presença marcada de neutrófilos, no exame citológico, 60% das éguas não apresentaram crescimento bacteriano 48 horas após a cobertura. Os autores concluíram que mesmo quando a contratilidade está prejudicada, os demais mecanismos de defesa da égua são capazes de eliminar a infecção bacteriana.

Além das contrações miometriais, a drenagem linfática é importante no processo de “clearance” uterino. Após a ovulação e o fechamento da cérvice o sistema linfático torna-se responsável pela drenagem de subprodutos do processo inflamatório. Entretanto, para que a drenagem linfática exerça sua função é fundamental uma boa contratilidade miometrial (LEBLANC et al., 1995).

Uma vez iniciado o processo inflamatório, uma série de mediadores pró-inflamatórios é liberada pelos neutrófilos realizando fagocitose, pelas células do endotélio vascular, por células endometriais lesadas e pelos macrófagos ativados pela inflamação. As principais funções desses mediadores são atrair mais células de defesa para o local da inflamação, facilitar o acesso dessas células e melhorar a eficiência da eliminação do agente agressor. As prostaglandinas atuam induzindo alterações na permeabilidade vascular, as citocinas mantendo a inflamação ativa e as colagenases, elastases e gelatinases favorecendo o aporte de células e iniciando imediatamente o processo de reparação. E o óxido nítrico (ON) é responsável pela lise de bactérias no interior do neutrófilo (MACKAY, 2000).

O neutrófilo, a mais importante célula de defesa do útero, já está presente na luz uterina 30 minutos após a cobertura atingindo o pico inflamatório em 12 horas (KATILA, 1995, TROEDSSON, 1997 apud MALASCHITZKY et al., 2007).

Cheung et al., (1985) sugerem que exista um possível efeito inibidor do fluido uterino sobre a função neutrofílica, uma vez que os neutrófilos do útero de éguas susceptíveis à endometrite apresentem menor capacidade bactericida do que os de éguas resistentes. Foi testada a capacidade de migração e movimentação dos neutrófilos polimorfonucleares, provenientes da circulação sanguínea uterina, tanto das éguas resistentes quanto das susceptíveis, durante o diestro. Esses autores concluíram que os neutrófilos provenientes do útero de animais susceptíveis respondem em menor intensidade aos fatores quimiotáticos quando comparados aos provenientes de animais resistentes. Esta fagocitose deficiente seria resultado da

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influência negativa das secreções uterinas de éguas susceptíveis, que seriam mais pobres em opsoninas do que as secreções uterinas das éguas resistentes (THOEDSSON et al., 1993).

Alghamdi et al., (2004) utilizando éguas com útero apresentando reação inflamatória, realizaram duas inseminações com intervalo de 24 horas, a primeira com espermatozoides mortos e a segunda com sêmen fresco (contendo espermatozoides vivos) com ou sem plasma seminal. Os autores observaram menor taxa de prenhez quando o plasma seminal foi removido (5%), em comparação à taxa obtida das inseminações sem a remoção do plasma seminal (77%).

O resultado encontrado pelos autores anteriores é explicado pelas proteínas presentes no plasma seminal, que foram sugeridas como responsáveis por uma supressão da fagocitose de espermatozoides vivos pelos neutrófilos, em comparação ao que ocorre com as células mortas e apoptóticas (TROEDSSON et

al., 2006).

No trato genital feminino, proteínas aderidas à membrana espermática seriam responsáveis pela opsonização seletiva e pelo reconhecimento de diferentes populações de espermatozoides (TROEDSSON et al., 2006).

Apesar do foco de grande parte dos estudos sobre a patogenia da endometrite terem sido as bactérias, atualmente, o espermatozoide é considerado o principal causador da inflamação que ocorre sempre após a cobertura (KOTILAINEN

et al., 1994).

2.4. ENDOMETRITE

Das afecções que acometem o sistema reprodutivo dos equinos, a endometrite é considerada como uma das principais causas de subfertilidade e infertilidade, podendo apresentar-se de forma clínica ou subclínica (THOMASSIAN, 2005).

A endometrite caracteriza-se pela presença do infiltrado inflamatório no endométrio, com maior gravidade em comparação com que ocorre na limpeza fisiológica do útero durante o ciclo estral, e é independente da sua etiologia (infecciosa, não infecciosa) (KENNEY, 1992; SCHOON et al., 1992).

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A endometrite pós-coital acontece nas éguas e é caracterizado por um processo inflamatório transitório e fisiológico após cobertura, e este processo tem como objetivo remover o excesso de espermatozoides, plasma seminal e contaminantes no útero. Possibilitando assim o recebimento do embrião no quinto ou sexto dia após a fecundação em um meio adequado (LEBLANC et al., 1998).

Em casos de endometrites agudas, ocorre a dominância de neutrófilos e eosinófilos no estrato compacto e entre as células do epitélio luminal. Em casos mais severos, neutrófilos são encontrados em camadas mais profundas da lâmina própria. As glândulas endometriais vão apresentar dilatações e conteúdo neutrófilos degenerados (DOIG e WAELCHLI, 1992).

No caso das éguas susceptíveis, pode-se dizer que existe incapacidade dos mecanismos de defesa uterina e desta forma não resolvem o processo inflamatório pós-coital naturalmente (BRITO & BARTH, 2003).

Segundo Troedsson et al., (2001), a endometrite persistente pós-coital pode ser uma das mais importantes causas da infertilidade em éguas susceptíveis.

Segundo Brito & Barth (2003), a endometrite crônica degenerativa (endometrose) pode ser caracterizada por alterações no endométrio como fibrose periglandular, estase linfática e dilatação glandular que pode ser o resultado de inflamações uterinas repetidas, porém essa enfermidade vem sendo observada em éguas velhas que não apresentam histórico de endometrites.

A fase inicial da endometrose é determinada por feixes periglandulares de colágenos e camadas concêntricas de fibroblastos e fibrócitos e o seu estágio mais precoce não pode ser reconhecido com microscopia óptica (RAILA et al., 1997)

Hoffman et al., (2009) descreveram as características histomorfológicas e imunohistoquímicas das variações fenotícas da endometrose assim como os fatores etiológicos potenciais que influenciam a progressão da enfermidade. Os autores puderam observar uma incidência alta de ninhos glandulares fibrosados nas endometroses graves e também constataram uma associação estatística significativa, entre a endometrose inativa e a dilatação cística das glândulas afetadas.

De acordo com RAILA (2000), conforme a fibrose endometrial vai evoluindo, as células estromais ativas ou inativas, apresentam uma quantidade de miofibroblastos muito maior. Quando estes contraem podem conduzir uma

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constrição das glândulas uterinas, tendo por resultado a dilatação glandular e aumento no índice de perdas embrionárias.

2.5. AVALIAÇÃO GINECOLÓGICA

Antes do exame do trato reprodutivo, a condição física geral da égua deve ser avaliada, qualquer problema sistêmico que possa mexer na fertilidade deve ser observado. A condição corporal da égua influencia diretamente na sua taxa de fertilidade. Além de uma avaliação geral, o períneo e conformação pélvica têm de ser examinado completamente (LEBLANC, 2006).

Os exames ginecológicos realizados são: a ultrassonografia uterina que avalia o escore de edema uterino; a palpação retal que avalia o tônus uterino (flácido no estro, devido ao edema alto do endométrio), consistência folicular, abertura e fechamento da cérvix; O exame vaginal que avalia edema de vulva característico no estro e a conformação vulvar (MOREL, 2003).

Avaliação do estado de saúde uterina das éguas através da biópsia endometrial e histopatologia tem sido um procedimento padrão na reprodução equina nos últimos 35 anos. A biópsia fornece informações valiosas com relação ao tratamento da inflamação, e se a égua é portadora de degeneração, que afeta a limpeza uterina e o fluxo sanguíneo e se terapia adicional é necessária. Éguas com edema endometrial excessivo podem possuir incompetência cervical, defeitos na drenagem uterina ou inflamação crônica. Angiose ocorre em conjunto com lacunas linfáticas e indica que o fluxo sanguíneo no endométrio está anormal e a drenagem pode estar prejudicada. Degeneração glandular cística ou figuras mitóticas no epitélio glandular podem estar associadas à inflamação crônica ou irritação endometrial (LEBLANC, 2008).

Estudos mais recentes, comparando a biópsia endometrial a outras técnicas diagnósticas, concluem que a biópsia endometrial ainda é o método mais sensível e específico para o diagnóstico de endometrite na égua (LIU et al., 2008). Portanto, a biópsia endometrial é o método definitivo para o diagnóstico da endometrite crônica e o prognóstico da fertilidade (MEDICE et al., 1991).

Para obtenção da amostra, a égua deve ser preparada conforme descrito para os exames de cultura e citologia. Usando técnica asséptica similar, o clínico

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veterinário introduz a mão com luva estéril, carregando uma pinça estéril para biópsia protegida na palma, através da vulva e vagina, dentro e através da cérvix. O mordente e o trinco do fórceps são mantidos fechados durante a introdução. Dentro do corpo uterino, são direcionados a um lado ou outro para obter amostra do corno uterino direito ou esquerdo. Uma vez posicionado, o clínico remove a mão enluvada da vulva e a coloca no reto. A palpação da extremidade da pinça de biópsia é prontamente feita, pelo reto, seguindo o cabo até o fim. O trinco da pinça é rotacionado em um ângulo de 90 graus horizontais. À medida que o mordente se abre, a mão que está palpando introduz um dedo nas laterais do mordente e empurra o tecido endometrial para dentro dele. O mordente é lentamente fechado, conforme a pressão digital vai diminuindo. A pinça, então, é removida do trato reprodutivo e o tecido nele contido é liberado, com uma agulha numa solução de formalina a 10% ou fixador de Bouin (LEY, 2006).

A amostra de biópsia é processada de forma rotineira e corada com hematoxilina e eosina (LEY, 2006).

O sistema mais comum de classificação da histopatologia endometrial é de Kenney e Doig (1986). Esse sistema considera a inflamação e a fibrose do endométrio e, então, fornece uma estimativa da capacidade da égua em conceber e manter a gestação a termo.

No estudo realizado por Moreira et al., (2007) a alteração mais frequente foi o infiltrado inflamatório predominantemente de mononuclear e endometrite. De todas essas amostras analisadas, 64% tiveram endometrite crônica, 27% endometrite aguda e 9% endometrite com resposta crônica com uma reação aguda se sobrepondo.

2.5.1. Enfermidades encontradas no exame histológico

A inflamação pode ser classificada em aguda ou crônica, ou ocasionalmente consistir numa resposta crônica com reação aguda se sobrepondo. Na reação aguda, predomina os leucócitos polimorfonucleares (PMNs), geralmente no estrato compacto ou no epitélio luminal assim como nos capilares e vênulas do estrato compacto. Nas inflamações crônicas são caracterizadas pela infiltração de linfócitos e menos comumente por plasmócitos, siderófagos, eosinófilos e mastócitos. Em

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reação crônica geralmente envolve o estrato compacto, mas pode envolver o estrato esponjoso mais profundamente, normalmente envolve forma de focos discretos que possuem distribuição difusa ou dispersa (KENNEY e DOIG, 1986).

Na reação inflamatória endometrial crônica moderada à grave ocorre presença de plasmócitos, sendo uma indicativa de estimulação antigênica contínua. siderófagos são macrófagos que fagocitaram sangue e convertem em hemossiderina (KENNEY e DOIG, 1986).

A fibrose ocorre geralmente ao redor de glândulas ou em associação com membrana basal do epitélio luminal. Encontrada frequentemente quando há presença de células inflamatórias. A extensão e a severidade da fibrose estão diretamente ligadas à habilidade do útero em manter uma gestação. É típica para éguas com fibrose difusa a detecção da prenhez, mas com perda fetal antes dos 90 dias de gestação (KENNEY e DOIG, 1986). A hipertrofia glandular é a primeira resposta à fibrose periglandular (KENNEY e DOIG, 1986).

A distensão cística das glândulas uterinas e de seus ductos é comum na égua. Um dos mecanismos que causam essa distensão é o efeito de estrangulamento produzido pela fibrose periglandular. Há um acúmulo de secreção no interior da glândula (KENNEY, 1978; TROEDSSON, 1997b).

A hiperplasia glandular é o aumento no número de células glandulares, normalmente ocorre em éguas cíclicas e gestantes (KENNEY, 1978).

As lacunas linfáticas podem ocorrer no endométrio ou no miométrio. Os linfócitos são o tipo celular predominante nas amostras, e nas éguas que apresentam lacunas linfáticas esparsas podem não apresentar alterações de fertilidade, enquanto aquelas que apresentam lacunas linfáticas disseminadas ou com grandes cistos poderão ficar inférteis ou sofrer perda embrionária prematura (YOUNGQUIST, 1994).

E nos vasos sanguíneos, a alteração mais relatada é a ocupação linfocítica de arteríolas e vênulas (KENNEY, 1978).

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2.6. FATORES QUE INFLUENCIAM A FERTILIDADE DAS ÉGUAS INSEMINADAS DURANTE A ESTAÇÃO DE MONTA

Na espécie equina, a inseminação artificial (IA) vem sendo empregada com sucesso devido a sua facilidade de implantação no plantel, proporcionando bons índices de fertilidades, menor desgaste do garanhão e melhora do progresso genético (WEISS et al., 2003).

A inseminação artificial (IA) trata-se de uma técnica utilizada para obter produtos de pais com alta qualidade genética, com vantagem de não necessitar a presença do garanhão selecionado, reduzindo traumas decorrentes do transporte dos animais ou até mesmo resultantes da monta natural. Além disso, com esta biotecnologia, há redução de transmissão de doenças venéreas e infecciosas como endometrite, decorrentes do contato direto entre égua e garanhão aumentando o número de éguas inseminadas por ejaculado, e taxa de prenhez proporcionando melhora na viabilidade econômica (BLANCHARD et al., 2003).

Após a inseminação, os espermatozoides são transportados rapidamente para o oviduto, através de contrações uterinas, que auxiliam a limpeza uterina. Devido à reação inflamatória aos espermatozoides, o transporte de ser o mais rápido possível (TROEDSSON, et al., 1998). Oito minutos após a inseminação Katilla et al., 2000, identificou espermatozoides marcados com radioatividade no corno uterino. Os espermatozoides podem sobreviver vários dias até a ovulação (GINTHER, 1992). Woods et al., 1990, relatou que fertilizações ocorreram com inseminações feitas 6 dias antes das ovulações. A junção útero-tubária funciona como reservatório de espermatozoides (THOMAS et al., 1994; SCOTT et al., 2000), onde ocorre uma adesão com a superfície da porção inicial da tuba uterina, mediado por proteínas espermáticas que se ligam as glicoproteínas do oviduto (BALL et al., 2003).

Clément et al., 2000, demonstrou que após realização de duas ou três inseminações em um mesmo ciclo, a inseminação realizada 2 a 4 dias antes da ovulação resultou em um número maior de fertilizações (70%) do que aquelas realizadas 0-2 dias antes da ovulação.

Palhares (1989), referindo-se a um trabalho realizado por Nishikawa (1959), relatou que as éguas estão sujeitas a efeitos ambientais que determinam a estacionalidade dos ciclos reprodutivos. Há três fatores básicos que explicam esse

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caráter estacional dos ciclos estrais na maioria das éguas: fotoperíodo, nutrição e temperatura. Entretanto, o fator primário no controle da atividade ovariana sazonal é o número de horas luz/dia.

Durante a estação de monta há variações quanto à atividade reprodutiva dos animais, capazes de provocar mudanças na eficiência reprodutiva. (VALLE et al., 2000). Neste trabalho também verificou o efeito do bimestre dentro da estação de monta. Os bimestres foram agrupados da seguinte forma: outubro/novembro, dezembro/janeiro e fevereiro/março. Após a observação, constatou-se que a melhor taxa de concepção por ciclo e melhor eficiência da prenhêz ocorreu nos meses de dezembro/janeiro. Diante destes resultados, esses autores propuseram a eliminação dos meses extremos da estação de monta sem prejuízo da eficiência reprodutiva do rebanho.

Voss et al., (1982), realizou um grande número de observações (257 éguas no primeiro e 64 no segundo experimento) obteve-se efeito positivo do maior número de inseminações sobre a fertilidade. No primeiro experimento, os autores não controlavam as doses inseminantes, e no segundo, foi utilizado sêmen fresco com doses inseminantes de 100 milhões de espermatozoides, com motilidade progressiva, e inseminações a cada 48 horas.

Pickett et al., (1987) também obtiveram melhora da fertilidade com o aumento do número de Inseminações por ciclo, utilizando dados coletados durante seis anos, sem que, no entanto, tivesse controle da concentração espermática utilizada nas inseminações com sêmen a fresco.

Ferreira (1993) observou também melhora da fertilidade com maior número de inseminações por ciclo de éguas, usando sêmen resfriado de jumento, nas doses de 250 milhões de espermatozoides móveis.

Xavier (2006), também utilizando sêmen fresco e diluído nas inseminações, observou que o número de inseminações/ciclo gestante (2,63), não diferiu do número de inseminações/ciclo não gestante (2,13), independentemente do local de deposição do sêmen, no corpo ou no ápice do corno uterino.

O sêmen fresco pode ser utilizado na forma in natura ou diluído. As doses utilizadas para inseminação artificial em éguas é de 250 a 500 x 106 espermatozoides, visando alcançar índices satisfatórios de prenhez, e a dose de 500 x 106 é a mais recomendada (BRINSKO, 2006).

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Vilarim et al., (1993), utilizando sêmen de jumento para inseminar éguas, obtiveram fertilidade ao primeiro ciclo de apenas 20%, na presença de dose inseminante de 100x106 espermatozoides, em relação à de 51,6%, ao utilizarem número de espermatozoides viáveis de 200 x 106.

Leite (1994), trabalhando com sêmen fresco e diluído de jumentos, avaliou o efeito de diferentes concentrações espermáticas sobre a fertilidade nas éguas. Foram utilizados 154 ciclos estrais distribuídos em cinco tratamentos. Os tratamentos eram com relação à dose inseminante, e continha valores de 50, 100, 200, 400 e 600 x 106 de espermatozoides viáveis. As taxas de prenhez proporcionadas pelas inseminações com 50 e 100 x 106 de espermatozoides foram de 3,44% (1/29) e 20,68% (6/29), respectivamente, e com as concentrações de 200, 400, 600 x 106 de espermatozoides viáveis, foram obtidas as taxas de prenhez de 53,12% (17/32), 70,0% (21/30) e 67,64% (23/34) respectivamente. O autor indicou com estes resultados que o número necessário de espermatozoides por dose inseminante seria de 200 x 106.

Palhares et al., (1998 a), trabalhando com sêmen diluído, resfriado e transportado utilizaram doses inseminantes de 400 a 800 x 106 de espermatozoides. A taxa de concepção não diferiu entre os grupos, e com este resultado os autores recomendam o uso da concentração de 400 x 106 espermatozoides como dose inseminante.

Nos equinos, diferentemente das demais espécies de animais domésticos de produção, são mantidos por um período de tempo mais prolongado como animal de trabalho, como animal de companhia e ou reprodução (CARNEVALE, 2008).

O envelhecimento faz parte do ciclo biológico de todos os seres vivos e traz consigo uma série de consequências indesejáveis para o organismo animal, tais como a perda de vitalidade e alterações no funcionamento dos sistemas biológicos, afetando direta ou indiretamente a função reprodutiva devido ao mau funcionamento dos demais sistemas (WILSON, 2007).

Éguas com idade avançada e susceptíveis a endometrite demonstraram menor capacidade de limpeza uterina, acumulando fluido uterino após contato com o espermatozoide ou inoculação bacteriana durante o estro, sendo o principal fator relacionado à instalação da inflamação uterina (LEBLANC, 1997).

O fluido pode estar presente devido a menor limpeza uterina seja através do cérvix, ou devido à atividade diminuída dos vasos linfáticos, em função de distúrbio

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no mecanismo de contração uterina (LEBLANC, 1994). A razão da menor limpeza uterina não está bem estabelecida, mas anormalidade miometrial, exaustão do músculo liso uterino, sinais hormonais inapropriados controlando as contrações uterinas e conformação perineal anormal tem sido implicada como fatores etiológicos (VANDERWALL & WOODS, 2003).

Uma união de dados de 192 biópsias uterinas de éguas que apresentavam problemas de fertilidade foi avaliada por Waelchli (1990), e os tratamentos pertinentes realizados. As éguas eram separadas em dois grupos, dividindo as faixas etárias em até 11 anos e acima de 12 anos. Os resultados demonstraram uma taxa de concepção maior para éguas jovens (72%) contra (47%) para éguas senis. O autor concluiu que a fertilidade está ligada a alterações endometriais relacionadas com a idade e essas alterações ainda estão indefinidas.

Palhares et al., (1998), inseminando éguas com intervalos das duas últimas inseminações de 48 e 72 horas, sendo a última realizada pós-ovulação, obtiveram taxas de concepção e eficiência de prenhez de 61,11% e 50,00%; 63,66% e 44,44%; respectivamente, sem que houvesse diferença dos intervalos entre os animais dos tratamentos. Brandão (2001), com o mesmo protocolo de inseminações conseguiu a taxa de concepção/ciclo de 53, 45% (48 horas) e 56,76% (72 horas). Não havendo influência dos intervalos entre a inseminação e a ovulação e a taxa de concepção.

Palhares, (1997), Silva Filho et al., (1998) e Brandão (2001), propuseram uma viabilidade de 60 horas para gametas masculinos no trato reprodutivo da fêmea, considerando-se o intervalo de 72 horas, menos a viabilidade de 12 horas do oócito.

Tradicionalmente, as éguas são cobertas ou inseminadas a partir do terceiro dia do cio, e o procedimento é repetido a cada dois dias até o seu término. No entanto, tal esquema não pode ser adotado em éguas consideradas suscetíveis a infecções uterinas (JACOB et al., 2000).

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Avaliar a influência da inseminação artificial, com sêmen fresco diluído de asinino em éguas, sobre a taxa de concepção de uma estação de monta.

3.1. OBJETIVO ESPECÍFICO

Avaliar os efeitos da idade, do intervalo entre a última inseminação e detecção da ovulação (48/72H), do bimestre da ovulação e do número de inseminações, sobre a taxa de concepção de éguas inseminadas com sêmen fresco e diluído de asinino.

Investigar, por biópsia endometrial coletadas no estro e no diestro, a influência da idade, do intervalo entre as inseminações artificiais e a detecção da ovulação sobre o endométrio de éguas.

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Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Uso de Animais da Universidade Federal Fluminense (CEUA/177) (anexo 8.1.).

4.1. LOCALIZAÇÃO, CONDIÇÕES CLIMÁTICAS E PERÍODO

EXPERIMENTAL:

O experimento foi realizado nas instalações da Fazenda Vital Brazil, localizado no Km 23 da estrada RJ 122, no município de Cachoerias de Macacu, no Estado do Rio de Janeiro. A sede situa-se na latitude 22º 27’45’’sul e longitude 2º 39’11’’ oeste, a uma altitude média de 57m, ao nível do mar. De acordo com a classificação de Köppen, o clima é do tipo tropical Aw, isto é, do tipo quente-úmido variando de 15 a 30 o C, denominado de Tropical/Subtropical Super Úmido. Os valores climatológicos estão descritos posteriormente na tabela 1 a seguir, e foram obtidos diariamente a partir de leitura de termômetros, psicrômetros e pluviômetros localizados na Fazenda Escola da Universidade Federal Fluminense distante à 3 km do local do experimento.

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Tabela 1: Dados climatológicos obtidos na Fazenda Vital Brazil durante o período experimental (média± desvio padrão). (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012). Período (mês/ano) Temperatura média (ºC) (média e desvio padrão) Temperatura Mínima (ºC) (média e desvio padrão) Temperatura Máxima (ºC) (média e desvio padrão) Precipitação Pluviométrica (mm/mês) (média e desvio padrão) Umidade Relativa do Ar(%) (média e desvio padrão) Outubro (2011) 24,02 ± 2,97 20,90 ± 2,34 28,60 ± 5,85 82,52 ± 8,69 7,53 ± 14,49 Novembro (2011) 28,58 ± 2,11 21,13 ± 2,90 26,35 ± 4,61 83,07 ± 8,80 9,15 ± 14,69 Dezembro (2011) 25,86 ± 1,45 25,86 ± 1,45 27,53 ± 5,27 85,77 ± 6,91 17,74 ± 23,22 Janeiro (2012) 25,27 ± 2,39 23,56 ± 2,29 29,81 ± 5,64 83,35 ± 8,03 11,05 ± 16,76 Fevereiro (2012) Março 29,90 ± 2,21 23,97 ± 1,91 36,57 ± 2,58 75,97 ± 10,78 5,72 ± 26,01 (2012) 27,02 ± 2,80 25,18 ± 2,73 25,18 ± 2,73 35,42 ± 5,21 9,66 ± 22,44

O período do experimento compreendeu o intervalo dos meses de outubro de 2011 a março de 2012, correspondente à estação de monta 2011/2012.

4.2. ANIMAIS EXPERIMENTAIS

4.2.1. Éguas

Durante o experimento, utilizou-se um total de 73 éguas sem raça definida, com idade média 7 a 13 anos (10,11 ± 3,47) - resultado (Tabela 2). Antes do início da estação reprodutiva, as éguas foram submetidas a exame ginecológico, que compreendeu na avaliação da conformação da genitália externa e interna.

O manejo nutricional utilizado nos animais durante o experimento não foi alterado, mantendo o que era realizado pela própria Fazenda Vital Brazil. A alimentação era feita basicamente por meio do método “espinha de peixe” no qual os equinos ficavam alojados em baias, com alimentação individual. Cada animal

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recebe uma dieta fracionada em duas refeições com os seguintes componentes: quatro quilos de ração comercial peletizada, oito quilos de capim elefante (Pennisetum purpureum) picado, um quilo de farelo de trigo (Triticum vulgare vill) ou malte (Hordeum vulgare) e cinquenta gramas de sal mineral e água ad libitum. Na parte da tarde os animais são soltos em piquetes e somente retornam no outro dia para o manejo, o que permite manter o bem-estar animal.

Tabela 2. Distribuição dos grupos experimentais das éguas conforme a faixa etária e os ciclos estrais apresentados (Fazenda Vital Brazil, Cachoeiras de Macacu – RJ; Outubro 2011/ Março 2012).

Grupo éguas jovens Grupo éguas senis

Éguas jovens à adultas (3 a 10 anos)

Éguas adultas à senis (11 a 16 anos) Nº de ciclos estrais utilizados

(46)

Nº de ciclos estrais utilizados (54)

4.2.2. Reprodutor

Em todo projeto foi utilizando um reprodutor asinino, com 17 anos, da raça Pêga como doador de sêmen, O animal passou por uma avaliação andrológica antes do início da estação de monta, através da inspeção e palpação da genitália externa para identificar possíveis alterações ou ferimentos que comprometessem a fertilidade. Foi verificado também o comportamento sexual, representada pela capacidade de reconhecer uma fêmea no cio e se tem intenção de cópula com relação a uma fêmea no cio, e por último a avaliação espermática de acordo com os critérios recomendados pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. Não houve alterações que inviabilizasse a utilização do animal na reprodução.

O manejo nutricional do reprodutor foi o mesmo descrito anteriormente para as fêmeas. Sua baia era de alvenaria com tamanho de 5,0 x 4,0 m2 econtinha em seu interior dois cochos, um destinado para água e outro para alimentação. Logo após a primeira alimentação, o macho permanecia solto em piquete (30 x 40 m2)

(37)

com área sombreada e água à vontade, até o próximo horário do fornecimento da ração, onde se mantinha estabulado até o outro dia.

4.3. DELINEAMENTO DO EXPERIMENTO

Foram utilizadas 73 éguas que apresentaram 100 ciclos estrais. Os ciclos estais foram agrupados de maneira avaliar os seguintes efeitos: 1) Efeito da idade da égua (éguas jovens de 3 a 10 anos) e éguas senis com idade entre 11 a 16 anos; 2) Efeito do intervalo entre as inseminações e a ocorrência das ovulações; 3) Efeito do número de inseminações por ciclo; 4) Efeito do mês da estação de monta; 5) Efeito do intervalo entre as inseminações com sêmen de asinino.

O efeito da idade das éguas e do intervalo entre a última inseminação e a ocorrência da ovulação (48/72H) sobre as características endometriais serão avaliadas por meio do exame histopatológico em dois momentos do ciclo estral (Estro e Diestro).

4.3.1. Controle reprodutivo

4.3.1.1. Fêmeas

Os ciclos estrais foram acompanhados, segundo o modelo modificado por Palhares 1989 (figura 1) e anotados em fichas individuais (anexo-8.3). Palpações transretais e avaliações ultrassonográficas eram realizadas as segundas, quartas e sextas-feiras e quando os parâmetros que caracterivam a fêmea em estro (edema uterino, folículo com 30 a 35 mm e tônus uterino) fossem confirmados, era realizada a primeira biópsia endometrial. Após as realizações das inseminações e confirmação da ovulação que caracterizava o fim do estro e o início do diestro, era efetuada a segunda biópsia endometrial.

Após a confirmação da ovulação, as fêmeas passavam por um novo controle reprodutivo, com o objetivo de diagnosticar a ocorrência da gestação a partir da visualização de vesículas embrionárias, após 15 dias de concepção. Quando o resultado da gestação era positivo, a fêmea era transferida para o grupo denominado de éguas gestantes. Este grupo era acompanhando mensalmente até

(38)

Grupo II Grupo I Acompanhamento do ciclo estral Detecção do cio Edema uterino + Folículo de 30 a 35mm + tônus uterino I.A, 2º, 4º e 6º- feira, até a detecção da ovulação. º Biópsia 1 + 1º Coleta de sangue Ovulação 2º Biópsia + 2º Coleta de sangue Confirmação da prenhez com 15 dias Prenhez negativa Prenhez positiva Confirmação mensal da prenhez Retorno ao controle reprodutivo e inseminações sem biópsia ou coleta de sangue Morte embrionária Prenhez confirmada Divisão dos grupos por idade

a parição. Quando a gestação não era confirmada ou existia a ocorrência de perda embrionária antes dos 90 dias de concepção, o animal recebia 5 mg de Dinoprost trometamina, administrado por via intramuscular (Lutalyse®, laboratório Pfizer, São Paulo, SP, Brasil), permitindo assim que a fêmea retornasse mais rápido ao estro. Após a aplicação da prostaglandina, a égua era redirecionada para o grupo do controle reprodutivo.

Figura 1 – Organograma do Controle reprodutivo (modelo modificado segundo Palhares, 1989).

(39)

4.3.2. Colheita, avaliação espermática e diluição do ejaculado

4.3.2.1. Colheita do sêmen

O manejo reprodutivo ocorria toda segunda, quarta e sexta feira, após a realização da palpação das éguas e assim determinação da quantidade da dose inseminante a ser preparada. O sêmen era coletado, com auxilio de uma vagina artificial, modelo Botucatu (Biotech Botucatu – Botucatu, SP, Brasil), que era preparada com a utilização de uma luva de plástico de palpação transretal, na qual retirava a extremidade distal dos dedos com o objetivo de evitar o contato direto do sêmen com a mucosa de látex da vagina artificial e direcionar o sêmen para um recipiente preso no final da luva de plástico. Este recipiente consistia de uma garrafa térmica com coloração opaca cuja função era armazenar o sêmen e proteger do contato direto com a luz ambiente. Dentro da garrafa térmica continha um coletor de plástico no qual recebia o ejaculado. A vagina era preenchida com água a 50ºC, para equilibrar a temperatura interna com o material da vagina artificial, não causando injúrias ao sêmen (MOREL, 1999; BLANCHARD et al., 2003). A coleta do sêmen ocorria em tronco de contenção, na qual a égua, com sinais de cio (estro) era contida. O macho asinino por meio de um cabresto era direcionado para próximo da fêmea, e apresentava os sinais de reconhecimento de cio (reflexo de Fleming, ereção, e tentativa de monta). Quando o macho apresentava a ereção peniana, o animal efetuava a monta na égua e antes de concluir a intromissão do pênis, realizava-se o desvio lateral do mesmo para a vagina artificial. Após a confirmação do ejaculado, a válvula da vagina artificial era aberta, liberando a água e diminuindo a pressão da mesma, facilitando desta forma a retirada do pênis do garanhão (PAPA et al., 2007).

O ejaculado era encaminhado para o laboratório montado dentro da Fazenda Vital Brazil, onde se realizava os procedimentos de avaliação do sêmen.

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4.3.2.2. Avaliação espermática

Por meio de uma proveta graduada, o volume total do ejaculado era mensurado, antes e após a retirada da fração gelationosa do sêmen por meio de um filtro de nylon.

A análise do sêmen em microscópio óptico, com aumento de 100 a 400 vezes, verificava a motilidade total (%) e vigor (0-5), utilizando uma gota de sêmen fresco entre uma lâmina e uma lamínula previamente aquecida a 37ºC na mesa aquecedora. Para o cálculo da concentração espermática uma gota de sêmen era separada para diluição em formal salina (1:100). O restante do sêmen recebia um diluidor de uso comercial a base de leite, Botusêmen® (Biotech Botucatu - Botucatu, SP, Brasil), em proporção de 1:1, com o objetivo de diminuir a contaminação bacteriana do sêmen, diluir os fatores tóxicos e melhorar a fertilidade (CANISSO apud SQUIRES et al., 1999). O sêmen diluído era mantido em banho-maria a uma temperatura constante de 37ºC, enquanto era realizada a contagem da concentração espermática na câmara de Neubauer e posterior diluição final (PAPA

et al., 2007).

A estimativa da concentração espermática ocorria após o cálculo do valor médio entre as duas observações na câmara de Neubauer. Se ocorresse uma diferença de 10% entre as duas contagens, o procedimento era refeito (Colégio Brasileiro de Reprodução Animal, 1998). O valor médio da contagem nas duas câmaras era multiplicado por 5x10 6 para obter o número de espermatozoides/mL do ejaculado.

4.3.2.3. Diluição do ejaculado

A diluição final do sêmen ocorria de maneira a conferir para cada 20 mL de sêmen fresco e diluído, a concentração espermática de 800 milhões de espermatozoides.

As avaliações seminais do reprodutor eram descritas em fichas diárias (anexo-8.3) onde continha as seguintes informações: data, hora, volume do ejaculado com e sem gel, motilidade total (%), vigor (0-5) e a concentração espermática (milhões de espermatozoides/mL).

Referências

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