Brazilian Journal of Development

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 2,p.5264-5641 feb. 2020. ISSN 2525-8761

Os polimorfismos RS861539 e RS77381814 do Gene XCCR3 e sua possível

associação aos efeitos adversos em órgãos de risco em pacientes com

câncer de colo uterino submetidas à radioterapia

The RS861539 and RS77381814 polymorphisms of the XCCR3 Gene and

their possible association to the adverse effects on risk organs in patients

with cervical cancer undergoing radiotherapy

DOI:10.34117/bjdv6n2-021

Recebimento dos originais: 30/11/2019 Aceitação para publicação: 04/02/2020

Isabela Silvério Moreira

À época Bolsista de Iniciação Científica PUC-GO. Atualmente, Médica egressa PUC-GO. Instituição: Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Escola de Ciências Médicas,

farmacêuticas e Biomédicas, Curso de Medicina

Endereço: Av, Universitária 1.440, Setor Universitário, Goiânia-GO. CEP: 74605-010. E-mail: isabelamedicinapuc@gmail.com

Yuri De Abreu Mendonça

Doutor em Biologia Funcional e Molecular pela Universidade Estadual de Campinas Instituição: Universidade de Rio Verde

Endereço: Curso de Medicina, Campus Aparecida, Ave das Palmeiras, chácaras 26/27, Jardim dos Buritis, Aparecida de Goiânia-GO. CEP: 74923-590.

E-mail: rbarone009@gmail.com Juliana Castro Dourado Pinezi

Doutora em em Radiologia pela Universidade de São Paulo

Instituição: Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Escola de Ciências Médicas, farmacêuticas e Biomédicas, Curso de Medicina

Endereço: Av, Universitária 1.440, Setor Universitário, Goiânia-GO. CEP: 74605-010. E-mail: dourado.pinezi@uol.com.br

Renata De Bastos Ascenço Soares

Doutora em Patologia Molecular pela Universidade de Brasília

Instituição: Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Escola de Ciências Médicas, farmacêuticas e Biomédicas, Curso de Medicina

Endereço: Av, Universitária 1.440, Setor Universitário, Goiânia-GO. CEP: 74605-010. E-mail: renatasuarezbastos@gmail.com

RESUMO

A radioterapia (RT) é eficaz para tratamento câncer de colo uterino (CaCU), porém está associada a lesão de órgãos adjacentes. Este estudo objetivou avaliar o polimorfismo XRCC3 rs861539 e rs77381814 em portadoras de CaCU e sua relação com reações adversas

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decorrentes da RT. Os dados permitiram concluir que polimorfismo rs861539 esteve relacionado à lesão de alto grau gastrointestinal. Todavia, nossos resultados ainda precisam ser confirmados em estudos de larga escala.

Palavras-chave: Polimorfismo XRCC3, Radiossensibilidade, Câncer de Colo Uterino, rs861539, rs77381814.

ABSTRACT

Radiotherapy (RT) is effective for the treatment of cervical cancer (CaCU), but it is associated with damage to adjacent organs. This study aimed to evaluate the XRCC3 polymorphism rs861539 and rs77381814 in patients with CaCU and their relationship with adverse reactions resulting from RT. The data allowed us to conclude that rs861539 polymorphism was related to a high gastrointestinal lesion. However, our results still need to be confirmed in large-scale studies.

Keywords: XRCC3 polymorphism, radiosensitivity, cervical cancer, rs861539, rs77381814.

1 INTRODUÇÃO

O câncer pode ser definido como um conjunto de diversas doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células anormais que invadem tecidos e órgãos (VALGÔDE, 2012). Trata-se de uma doença genética e, portanto, desenvolve-se por meio do acúmulo de mutações e/ou alterações, em um processo designado por carcinogênese (WEBER, 2002). Ao longo dos anos as condições ambientais, hábitos de vida, e as características genéticas das populações têm sofrido fortes mudanças, contribuindo assim para uma alteração na epidemiologia dessa doença (OLIVEIRA, 2007).

As neoplasias representaram, no início do século XXI, um problema de saúde pública em todo o mundo. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que, em 2018, ocorreram 18,1 milhões de novos casos e aproximadamente 9,6 milhões de óbitos por câncer segundo dados publicados pelo Centro Internacional para Pesquisa do Câncer (IARC), subordinado à Organização Mundial da Saúde (OMS). Sendo a segunda maior causa de mortes da população adulta no mundo (FERLAY et al., 2018). Para o ano de 2030, são esperados cerca de 26 milhões de casos novos e 17 milhões de mortes pela doença (THUN et al., 2009)(BOYLE, 2008).

O câncer de colo uterino ocupa um lugar de destaque nas taxas de morbi-mortalidade entre a população feminina, especialmente nos países em desenvolvimento. Ele representa a quarta neoplasia mais frequente entre as mulheres no Brasil, sendo também a quarta causa de

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morte por câncer nas mesmas. Segundo o INCA em 2018 houveram 16.370 novos casos. Sendo que em 2017 esta neoplasia fez com que 6.385 mulheres viessem a óbito. Entretanto se o diagnóstico for feito precocemente e caso tratadas adequadamente as mulheres, vítimas da neoplasia cervical, têm praticamente 100% de chance de cura (INCA, 2019).

Apesar de diversos fatores ambientais, imunológicos e genéticos do hospedeiro serem referidos como fatores de risco para o desenvolvimento do câncer cervical, o único fator fortemente associado é a infecção pelos papilomavírus humano (HPV) (BOSCH et al., 2002). O pico de incidência do câncer de colo uterino situa-se entre 40 e 60 anos de idade e apenas uma pequena parcela ocorre abaixo dos 30 anos (INCA, 2014). É uma doença de evolução lenta, levando em média 14 anos para sua evolução total (GRUENWALDT, 2010).

O tratamento do câncer do colo uterino pode envolver o uso de três modalidades terapêuticas: a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia. A cirurgia é necessária para a remoção da neoplasia, podendo esta ser classificada como parcial, total ou radical. A quimioterapia corresponde ao uso de droga via sistêmica promotora da parada do crescimento de células tumorais. E a radioterapia utiliza a radiação ionizante para destruir células residuais tumorais locorregionais (GUNDERSON; TEPPER, 2007). O uso da radiação é uma das terapias anticâncer mais eficazes (BARNETT et al., 2009). Em alguma fase evolutiva da doença, quase metade dos pacientes submetidos a qualquer tratamento oncológico fará uso da radioterapia (AYOUB, 2000). Estima-se que mais de um milhão de indivíduos na Europa e América do Norte farão radioterapia por ano como parte de seu tratamento para câncer (KUFE et al., 2003).

Diante de tais dados percebe-se que a radioterapia exerce um papel muito importante no tratamento do câncer desde sua descoberta há mais de cem anos. Esta é uma modalidade de tratamento utilizada para todos os tipos de câncer. A radioterapia é um método capaz de destruir células tumorais empregando feixes de radiações ionizantes, na qual uma dose pré-calculada de radiação é aplicada, em um determinado tempo, a um volume de tecido que engloba o tumor, buscando erradicar todas as células tumorais, com o menor dano possível às células normais circunvizinhas (INCA,1993). Visando destruir o tecido tumoral de modo ainda mais específico, a radioterapia se apresenta em duas diferentes modalidades: a teleterapia, como modalidade que emprega feixes de radiação externamente ao paciente para destruir as células tumorais na superfície da pele ou mais profundamente no corpo e a braquiterapia, caracterizada como tratamento feito com uso de nuclídeos (sondas ou anéis)

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radioativos onde a fonte de radiação fica a uma curta distância, em contato ou até mesmo implantada na região que deve receber a dose (SMELTZER et al., 2011); (SCAFF, 1997).

Entretanto esta forma de tratamento não atinge apenas o colo do útero, mas também outros órgãos que são afetados pela radiação, sendo que os mais atingidos incluem: o retossigmóide, a bexiga e o intestino delgado. A tolerância de um determinado órgão à irradiação depende não só da dose dada, mas também do volume do órgão irradiado. Pacientes variam consideravelmente a sua resposta à radiação (BARNETT et al., 2009); (TURESSON et al., 1996). Embora a maioria tolere bem o tratamento, cerca de 5-10% sofrem de efeitos colaterais graves no tecido normal. No entanto, é esta super-reação em tecidos mais sensíveis que limita a dose de radiação a ser dada para o paciente oncológico em tratamento (BARNETT et al., 2009). Os mecanismos de hipersensibilidade a radiações ionizantes ainda permanecem obscuros e apenas em parte podem ser explicados por fatores clínicos tais como idade, condição do paciente e dose de radiação e volume do tecido. Até 70% desta variação na sensibilidade de radiação parece ser geneticamente determinada (TURESSON et al., 1996). Os efeitos da radiação podem ser divididos em agudos e tardios e destacam-se: dermatite, diarréia, tenesmo, cólicas abdominais, urgência miccional, disúria, hematúria e dispareunia, causando interrupções no tratamento e aumentando seus custos (COX; STETZ; PAJAK, 1995). Sendo assim, este trabalho tem seu cerne voltado aos efeitos colaterais da radioterapia em órgãos de risco.

2 O GENE XRCC3

O gene XRCC3 (X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 3), localizado no braço longo do cromossomo 14 (14q32.33), mais precisamente do número 103,697,607 pares de base aos 103,715,485 pares de base no cromossomo 14, é um gene codificador de proteína, também conhecido como CMM6, RAD51-like e X-Ray Repair Cross-Complementing Protein 3. Ele é necessário para o reparo eficiente de rupturas de filamentos duplos via reparação recombinacional homóloga (HR), tendo como objetivo a reparação de possíveis translocações, fragmentações cromossômicas e deleções, para a segregação cromossômica correta e para o reparo de ligações cruzadas de DNA. Em células humanas, XRCC3 forma um complexo com RAD51C que é recrutado logo no início ao dano do DNA (VOGEL, 2011). Além disso, desempenha um papel na regulação do número de cópias do DNA mitocondrial sob condições de estresse oxidativo na presença de RAD51 e RAD51C (GENE CARDS, 2014).

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Estruturalmente o XRCC3 tem seu tamanho composto por 17.896 pares de bases; possuindo 9 éxons, sendo que são transcritos 2.504 pares de bases (VOGEL, 2011). Sua transcrição resulta na proteína reparo de DNA XRCC3, que contém 346 aminoácidos, 37850 Da, na qual interage com RAD51C e RAD51 participando de um complexo composto juntamente com RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2. Além disto, forma um complexo com FANCD2, BRCA2 e FANCG fosforilada e interage com SWSAP1 e ZSWIM7. A proteína XRCC3 se localiza no núcleo, no citoplasma, na região perinuclear e na mitocôndria. E acumula-se em discretos focos nucleares antes do dano ao DNA, e estes focos persistem ao longo do curso do tempo de reparação. O gene XRCC3 foi relacionado a doenças como o câncer de mama e o melanoma cutâneo maligno 6 (CMM6). Um polimorfismo de microssatélites raro neste gene está associado ao câncer e a radiossensibilidade variável de diferentes pacientes (GENE CARDS, 2014).

Há mais de um polimorfismo de único nucleotídeo (SNP) encontrado neste gene, porém entre os mais estudados está o XRCC3 T241M variante rs861539, com substituição de Treonina (T) por Metionina (M) na posição 241, o que tem consequência fenotípica na proteína, no qual causa como alteração físico-química a mudança de tamanho médio e polar (T) para o tamanho médio e hidrofóbico (M) (EXPASY, 2014). Portadores do alelo T variante de XRCC3 T241M têm níveis mais elevados de aductos de DNA em comparação com o DNA de linfócitos portadores do alelo C-homozigóticos, o que indica que o polimorfismo está associado com reduzida capacidade de reparação do DNA (GENE CARDS, 2014).

Há poucos estudos internacionais sobre a possível correlação entre este polimorfismo e reações de radiossensibilidade tecidual recente e tardia. Além disso, ainda não existem estudos nacionais envolvendo polimorfismos deste gene. A maioria dos estudos internacionais existentes relaciona este SNP com o câncer de próstata e o câncer de mama. Uma revisão focada no tema correlacionou o SNP rs861539 com sangramento retal tardio em pacientes com câncer de próstata tratados com radioterapia (PARLIAMENT; MURRAY, 2010). Foi descrito também em outro estudo, na Itália, que pacientes portadoras do câncer de mama que carregavam a variante alélica XRCC3-241Met tinham uma chance aumentada de desenvolver radiossensibilidade (MANGONI et al., 2011). Logo, este pequeno número de estudos demonstra a carência e necessidade de maiores estudos sobre este polimorfismo, e especificamente, com a possibilidade de relacioná-lo de maneira praticamente inédita com a radiossensibilidade desenvolvida em casos de tratamento radioterápico no câncer de colo de útero.

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A principal indagação é a estreita relação do gene XRCC3 com a radiossensibilidade, uma vez que este gene é capaz de se associar a diversas outras proteínas que estão relacionadas a controle do ciclo celular, tais como RAD51, BRCA2, XRCC2. XRCC3 está associado com a reparação celular e esta é determinante no desenvolvimento da radiotoxicidade e radiossensibilidade (HEALTH PROTECTION AGENCY, 2013).

Outro polimorfismo que pode ser encontrado no gene XRCC3 é referente ao R243H rs77381814, pouco estudado se comparado ao proposto anteriormente, este polimorfismo de único nucleotídeo (SNP) possui estudo correlacionando-o com um risco aumentando de câncer de colo uterino (SNPEDIA, 2014); (PÉREZ et al., 2013).

Como já explanado o papiloma vírus humano (HPV) é a principal causa de câncer de colo do útero e suas lesões precursoras. No entanto, a malignização pode ser impulsionada por vários mecanismos, abarcando a ativação de oncogenes e de instabilidade do genoma. As diferenças individuais no reconhecimento de dano e reparo do DNA têm surgido como hipótese para explicar a influência no risco de câncer de colo uterino. Em um estudo caso-controle na Argentina, composto por 322 amostras, foi encontrado maior predomínio do alelo G no gene XRCC3 R243H rs77381814 na população estudada (PÉREZ et al., 2013). No entanto, pela pequena amostra necessita-se de maiores estudos para confirmação desta correlação. Conquanto, não há estudos que correlacionem o polimorfismo XRCC3 R243H rs77381814 aos efeitos adversos em pacientes submetidas a radioterapia corroborando, portanto, a importância deste projeto.

É relevante salientar que não existem muitos trabalhos experimentais sobre o assunto, seja qual for o polimorfismo em questão, de modo que se trata de uma área pouco explorada, embora sua importância seja inquestionável. Este é um estudo pioneiro que visa verificar a relação entre a presença dos polimorfismos do gene XRCC3 T241M e R243H aos efeitos colaterais agudos e/ou tardios em órgãos de risco apresentados pelas pacientes portadoras de câncer de colo uterino submetidas à radioterapia nos últimos 5 anos no Serviço de Radioterapia do Hospital Araújo Jorge, da Associação de Combate ao Câncer em Goiás.

O objetivo principal do estudo foi avaliar o genótipo (polimorfismo XRCC3 T241M variante rs861539 e polimorfismo XRCC3 R243H variante rs77381814) de pacientes portadoras de câncer de colo uterino com as reações adversas agudas, provenientes da exposição a agentes genotóxicos (radiação ionizante).

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• Avaliar os efeitos colaterais dos pacientes tratados segundo critérios do RTOG (Radiation Therapy Oncology Group), e classificá-los como radiossensíveis ou radioresistentes;

• Caracterizar o perfil genético das pacientes quanto ao polimorfismo XRCC3 T241M variante rs861539;

• Caracterizar o perfil genético das pacientes quanto ao polimorfismo XRCC3 R243H variante rs77381814;

• Comparar os resultados encontrados com outros relatos na literatura;

• Atualizar dados bibliográficos que correlacionem polimorfismos XRCC3 T241M variante rs861539 em pacientes com câncer de colo do útero submetidos à radioterapia;

• Atualizar dados bibliográficos que correlacionem polimorfismos XRCC3 R243H variante rs77381814 em pacientes com câncer de colo do útero submetidos à radioterapia;

• Colaborar com os resultados obtidos em vários estudos com o desenvolvimento de métodos preditivos visando determinar o grau de radiossensibilidade da paciente e dos tecidos saudáveis adjacentes.

3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 SELEÇÃO DE PACIENTES

As informações clínicas dos pacientes foram previamente coletadas a partir da revisão de prontuários e fichas de radioterapia por teleterapia do Serviço de Arquivo Médico do Hospital Araújo Jorge (HAJ) da Associação de Combate ao Câncer em Goiás (ACCG) em estudo anterior. Foram selecionadas 50 pacientes com o diagnóstico de câncer de colo do útero não-metastático que receberam radioterapia há 5 anos. A amostra de sangue periférico foi obtida após cada paciente ter concordado em participar do estudo e assinado o termo de consentimento livre e esclarecido. As pacientes incluídas neste estudo fizeram parte de um projeto desenvolvido anteriormente e já aprovado em Comitê de Ética em Pesquisa local. Uma nova análise ética foi solicitada ao CEP da PUC Goiás, e o parecer favorável foi emitido em dezembro de 2014, sob o n. 911.143 em 09/12/2014.

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 2,p.5264-5641 feb. 2020. ISSN 2525-8761 3.2 CLASSIFICAÇÃO DA TOXICIDADE

As reações adversas à radioterapia foram classificadas segundo critérios de escore de morbidade aguda e crônica do RTOG e LENT-SOMA para efeitos do trato genitourinário (SMALL et al., 2011).

Critérios de Inclusão

• Pacientes com diagnóstico histológico de câncer de colo uterino.

• Pacientes submetidos à radioterapia no Hospital Araújo Jorge, ACCG.

• Assinatura do TCLE (Res. 196/96, CNS). Critérios de Exclusão

• Pacientes com diagnóstico de carcinoma metastático.

• Pacientes encaminhadas para radioterapia de serviços externos ao Hospital Araújo Jorge.

• Pacientes com perda de seguimento deste hospital.

• Pacientes que não concordarem em assinar o TCLE. Obtenção das Amostras

Foram coletadas 50 amostras de 15 mL de sangue periférico heparinizado. Após a coleta, o material foi submetido à extração de DNA e armazenado em microtubos à -20ºC. Quantificação e Análise de Integridade do DNA Genômico

Após a extração, o DNA genômico foi quantificado utilizando o bioanalisador de DNA Nanodrop (ThermoScientific, USA). Este DNA dos pacientes incluídos no estudo anterior está mantido no Laboratório de Microbiologia, sala 06, sob a responsabilidade do pesquisador principal do estudo. A integridade do DNA foi analisada em gel de agarose 0,8% e fotodocumentado pelo Molecular Imager Gel Doc XR System (Bio-Rad Laboratories INC Latin America).

3.3 VARREDURA EM LARGA ESCALA UTILIZANDO MICROARRANJOS

Para a realização do ensaio genético em larga escala, as 50 amostras foram primeiramente quantificadas, utilizando o espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific), e tiveram suas concentrações ajustadas para 12 ± 4 ng/μl. Em seguida foi realizada uma amplificação das amostras utilizando a enzima Axiom 2.0 Amp® (Affymetrix), adicionada ao Amplification Master Mix. Uma vez montada a reação, as placas foram incubadas no GeneChip® Hybridization Oven a 37º C durante 23 ± 1 h. Para a interrupção da reação de amplificação, as placas foram incubadas a 65º C por 20 min. Como etapa

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fundamental para o bom funcionamento do ensaio, foi realizada na sequência a fragmentação parcial do DNA das amostras. Para a fragmentação foi utilizada a enzima Axiom Frag, adicionada ao Axiom Fragmentation Master Mix, e as placas então incubadas a 37º C por exatamente 30 min. A reação de fragmentação foi finalizada com a adição de 19 μl da Stop Solution. Após a fragmentação, o DNA é precipitado com a adição do Precipitation Master Mix. Uma vez precipitado o DNA, as amostras foram secas e ressuspendidas em 35 μl do Axiom Resusp Buffer. Neste ponto foram feitos, para verificação e controle de qualidade da fragmentação, um gel de agarose 0,5%, e uma nova quantificação. A maior concentração da DNA fragmentado na reação deve se encontrar entre 125 e 25 pares de bases no gel de agarose, (banda inferior do marcador referente a um fragmente de 100 pares de bases). Para a quantificação, a média da concentração de DNA após a fragmentação deve ser em média 1000 μg. Foi feita uma diluição 1/1000 para possibilitar a leitura no espectrofotômetro NanoDrop®, como recomenda o fabricante. A partir do resultado deste controle de qualidade, seguiu-se para a etapa de hibridização das amostras nas placas fornecidas pelo kit Axiom Exome 319®. As etapas finais de hibridização, ligação, marcação e escaneamento são realizadas no GeneTitan®. O equipamento é então preparado para receber as placas do ensaio Axiom Exome 319® (Hybridization Tray, Ligation Tray, Stain Tray e GeneTitan Scan Tray) e a placa contendo as amostras. Estas foram cadastradas no equipamento por um código de barras individual para o início do procedimento. A ligação e marcação das sondas foi realizada com a adição da Axiom Ligate Enzyme e do Axiom Probe Mix 1, devidamente adicionadas às soluções Stain 1 Master Mix, Stain 2 Master Mix, Stabilization Master Mix, Ligation Master Mix e Axiom Hold Buffer, de acordo com as recomendações do fabricante. No final da etapa de hibridização, ligação e marcação, a placa de escaneamento contendo o ensaio, foi então transferida para o scanner do GeneTitan para a etapa final. Todo o processo teve duração aproximada de 25 horas.O procedimento completo foi feito em 5 dias por placa.

3.4 BIOINFORMÁTICA

Após a geração dos dados genéticos pelo GeneTitan®, estes foram então tratados com o auxílio do Genotyping Console Software version 4.2.0.26 (Affymetrix). Primeiramente os dados são submetidos a um controle de qualidade (Dish QC). Nesta etapa, o ponto de corte do dish QC é de 0,820. Das 50 amostras, apenas 1 não atingiu a meta e foi eliminada das análises subsequentes. Em seguida é feita a análise dos genótipos pelo programa, passo no qual também é atribuída uma métrica para cada amostra (Call Rate), com ponto de corte de 97,0.

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Braz. J. of Develop.,Curitiba, v. 6, n. 2,p.5264-5641 feb. 2020. ISSN 2525-8761 4 RESULTADOS DE CONTROLE DE QUALIDADE

Nestas etapas de controle de qualidade, 01 amostra não atingiu o ponto de corte do dish QC. O total final de amostras foi de 49, além das 08 que foram controles internos.

Uma vez genotipadas as amostras, foi utilizado o pacote SNPolisher 1.5.1 (Affymetrics) para filtrar os polimorfismos e classificá-los de acordo com o padrão de agrupamento (Cluster Plot) destes genótipos nesta população. O SNPolisher é um pacote que utiliza as linguagens de programação R e perl (versão 5.18.1 de 64 bits), funcionando por linha de comando. Foi utilizado o console RStudio 3.1.3 para Windows.

Foram então feitas as etapas de análise utilizando as funções PS_Metrics, PS_Classification e PS_Visualization. O PS_Metrics gera uma métrica de controle de qualidade por polimorfismo (SNP call rate) auxilia na identificação de polimorfismos problemáticos para as análises posteriores. O PS_Classification classifica os mais de 350.000 polimorfismos em populações menores, de acordo com o cluster plot. Neste ponto, os polimorfismos são separados em 7 grupos: PolyHighResolution, que contém polimorfismos com boa resolução e pelo menos dois agrupamentos de genótipos minor; MonoHighResolution, contendo polimorfismos com identificação de apenas um genótipo; No Minor Hom, contendo dois agrupamentos e ausência de um genótipo minor; Off-Target Variant, contendo polimorfismos que apresentaram agrupamento anômalo; CallRate Below Threshold, contendo os polimorfismos cujo SNP call rate ficou abaixo do ponto de corte, mas outras características dos agrupamentos ficaram acima do limite pré estabelecido; Other, contendo polimorfismos de baixa qualidade; e Hemizygous, contendo polimorfismos oriundos de hemizigose. O PS_Visualization gera gráficos das intensidades de leitura e das genotipagens para cada um dos polimorfismos.

Para as primeiras análises, foram selecionados os polimorfismos presentes nos grupos PolyHighResolution, No Minor Hom, e Hemizygous.

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As análises serão realizadas com o pacote de software estatístico Epi Info versão 7.1.4.0. Após coleta de dados em formulário será realizada a caracterização da amostra por meio de cálculos de medida de dispersão e tendência central. As variáveis serão testadas para verificação de possíveis associações por meio dos testes t de student para variáveis contínuas paramétricas ou Mann Whitney quando estas não tiverem distribuição normal. Para variáveis categóricas serão utilizados teste do chi-quadrado (X2) e análise do risco relativo para visando

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estimar possíveis associações. Quando necessário utilizou-se do teste chi-quadrado (X2) com correção de Yates ou exato de Fisher. A associação entre os polimorfismos do gene XRCC3 T241M variante rs861539 e o polimorfismo XRCC3 R243H variante rs77381814 com as reações adversas à radioterapia serão estimadas pelo teste de chi-quadrado (X2) ou teste exato de Fisher e análise do risco relativo para estimar as possíveis associações com os efeitos adversos à radioterapia. Todas as análises serão realizadas com o α de 5% e intervalo de confiança de 95%.

6 RESULTADOS

Das 50 pacientes selecionadas inicialmente para o estudo houve a exclusão de uma devido à amostra de sangue periférico que não atendeu aos critérios no controle de qualidade. Portanto, foram mantidas 49 pacientes selecionadas e recrutadas para o estudo, sendo estas submetidas à radioterapia para tratamento de câncer de colo uterino e apresentaram uma média de idade de 59,71 anos ± 10,65. A idade das pacientes variou entre 36 a 78 anos.

A maioria das pacientes, 32 (65,3%), completaram o tratamento sem apresentar nenhuma reação adversa, ou com reações leves – classificados como efeitos colaterais de baixo grau, enquanto 17 pacientes (34,7%) apresentaram efeitos colaterais de alto grau, sendo que destas, 3 (17,6%) os efeitos gastrointestinais(GI) quanto geniturinários(GU), 12 (70,6%) somente do trato geniturinário e em 2 (11,8%) apenas do trato gastrointestinal (Gráfico 1).

Gráfico 1 – Número de Pacientes com Efeitos Adversos de Alto Grau

17,6%

70,6% 11,8%

Número de Pacientes com Efeitos

Adversos de Alto Grau

Geniturinário e Gastrointestinal Geniturinário Gastrointestinal

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A média de idade das pacientes com RTOG GI sem lesão ou com lesão de baixo grau foi de 59,95 ±11,05 e as de alto grau 57,6 ±6,58 (p=0,54). A associação entre as características clínicas das pacientes com o RTOG TGI estão sumarizadas na Tabela 2.

Tabela 2 – Associação entre as características clínicas e intercorrências no tratamento com o RTOG gastrointestinal. Variável RR IC – 95% P Tabagismo (sim/não) 1,06 0,501 – 2,244 0,11 HAS (sim/não) 0,59 0,35 – 1,02 0,80 QT concomitante (sim/não) 1,14 0,73 – 1,78 0,0003** DM (sim/não) 0,84 0,74 – 0,96 0,44 Álcool (sim/não) 0,97 0,93 – 1,02 0,89

Com relação ao RTOG GU das pacientes em lesão ou com lesão de baixo grau apresentavam uma média de idade de 59,5 ±11,5 anos e as de alto grau 60,2 ±8,5 anos (p=0,89). A associação entre as características clínicas das pacientes com o RTOG GU estão sumarizadas na Tabela 3.

Tabela 3 – Associação entre as características clínicas e intercorrências no tratamento com o RTOG geniturinário. Variável RR IC – 95% P Tabagismo (sim/não) 1,51 0,84 – 2,71 1,63 HAS (sim/não) 1,76 0,80 – 3,80 1,78 QT concomitante (sim/não) 0,94 0,78 – 1,13 0,001** DM (sim/não) 1,10 0,83 – 1,46 0,10 Álcool (sim/não) 0,97 0,91 – 1,03 0,69

Quando avaliamos o polimorfismo do gene XRCC33 T241M variante rs861539 observamos que 33 (67,35%) das pacientes apresentavam mutação nesse gene. Em relação ao RTOG GI observamos que 4 das 33 (12,12%) pacientes apresentaram lesão de alto grau comparado com 1 paciente dentre 16 (6,25%) sem a mutação (p=0,018; RR=1,07; IC 95% 0,9 – 1,3), havendo, portanto, correlação estatística significativa.

No entanto, não houve correlação estatística significativa entre lesão de alto grau RTOG GU, presente em 11 de 33 (33,3%) pacientes com mutação comparado com 4 das 16 (25,0%) pacientes sem mutação (p=0,07; RR=1,12; IC 95% 0,78 – 1,63).

Em relação ao polimorfismo do gene XRCC3 R243H variante rs 77381814 observamos a mutação em 2 das 49 pacientes (4,08%). Nenhuma dessas pacientes mutadas

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apresentaram lesão de alto grau no RTOG GI, comparado com 5 pacientes que apresentaram lesão dentre as 47 (10,64%) sem mutação (p=0,49; RR=0,95; IC 95% 0,89 – 1,01). Já em relação ao RTOG GU observamos que 1 dentre as 2 pacientes mutadas (50,0%) e 14 das 47 sem mutação (29,8%) apresentaram lesão de alto grau (p=0,031; RR 1,4; IC 95% 0,35 – 5,68). Sendo assim, o polimorfismo rs 77381814 devido ao pequeno número de pacientes não permitiu uma análise confiável dos dados.

7 DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

No presente estudo todas as pacientes foram tratadas com a radioterapia 2D (convencional). Um dos princípios fundamentais dessa modalidade terapêutica é a entrega da dose total fracionada, sem interrupções. Embora, saibamos que a melhor estratégia ainda é o esforço para manter o esquema de fracionamento planejado mantendo a qualidade do tratamento (BESE; HENDRY; JEREMIC, 2007). Entretanto, na clínica diária, pausas no tratamento podem ser inevitáveis devido a muitas razões, entre elas a toxicidade aguda da radiação, portanto, estratégias destinadas a reduzir a toxicidade são muito importantes.

Cada vez mais evidências demonstram que possa haver um componente genético na variabilidade ao tratamento por radioterapia. A ocorrência de correlações significativas entre polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em genes relacionados com a resposta biológica à lesão causada por radiação tem sido bem estabelecida, como em genes envolvidos no reparo do DNA ou na sinalização de danos no DNA e o risco de reações colaterais de tecido normal induzidas por radiação (PALMER et al., 2014).

Em uma recente metanálise publicada Song et. al. avaliaram dezessete estudos envolvendo 656 casos e 2193 controles concluíram que o polimorfismo XRCC3 p.Thr241Met está significativamente associado a um maior risco de efeitos adversos precoces induzidos pela radiação, tais como toxicidade aguda cutânea e mucosa. Embora a associação entre rs861539 e efeitos adversos tardios não tenha sido significativa, esse polimorfismo foi significativamente correlacionado com um maior risco de fibrose. Nos pacientes que receberam irradiação na cabeça e pescoço e mama o polimorfismo correlacionou-se maior risco de efeitos adversos. Ao passo que a correlação não foi significativa em termos de irradiação pulmonar ou irradiação pélvica. Contudo, os autores ressaltam que os resultados precisam ser confirmados em estudos clínicos de larga escala bem desenhados que avaliam o valor de polimorfismos XRCC3 na identificação de pacientes com maior risco de efeito adverso induzido por radiação (SONG et al., 2015).

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No presente estudo, observamos uma correlação entre a mutação para o polimorfismo rs 861539 e lesão de alto grau no trato gastrointestinal, presente em 4 das 33 (12,12%) pacientes que apresentaram mutação para o polimorfismo comparado com 1 paciente dentre 16 (6,25%) sem a mutação (p=0,018), mas não observamos relação entre lesão de alto grau RTOG GU, presente em 11 de 33 (33,3%) pacientes com mutação comparado com 4 das 16 (25,0%) pacientes sem mutação (p=0,07).

Em relação ao polimorfismo R243H variante rs 77381814 o pequeno número de pacientes não permitiu uma análise confiável dos dados.

Na prática clínica, encontrarmos distintas respostas das pacientes com câncer do colo do útero submetido ao mesmo tratamento, reforçando a importância da relação com o perfil genético. A avaliação desse perfil quanto aos polimorfismos de base única do gene XRCC3 variante rs861539 e variante rs 77381814 está em progresso, bem como a correlação genótipo-fenótipo com os efeitos colaterais apresentados por elas a fim de classificá-las de acordo com a sua radiossensibilidade. Essas pacientes podem se beneficiar da análise do perfil genético antes do início da radioterapia, o que possibilitaria uma individualização do tratamento, permitindo uma melhor proposta terapêutica e consequentemente um melhor prognóstico e resposta ao tratamento e caso necessário intervenção precoce aos efeitos adversos em conformidade.

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