I. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
– Chọn lọc giống vi sinh vật là phương pháp phân lập và phát hiện chủng vi sinh vật có đặc tính mong muốn từ các mẫu vi sinh vật hỗn hợp, sau đó cải tạo chủng và nuôi cấy bảo quản chúng trong môi trường thích hợp.
Công việc này bao gồm các bước: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến, phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, bảo quản giống.
– Để phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, có thể dựa vào:
Chất chuyển hoá tạo ra: tạo kháng sinh, tiết sắc tố, …
Enzyme ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường: amylase – tinh bột,
protease – gelatin, …
Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật.
Sự thay đổi hình thái của vi sinh vật.
– Bảo quản giống có nhiều cách: giữ giống trên thạch, giữ giống dưới lớp dầu khoáng, giữ giống trong cát, đông lạnh, đông khô. Việc lựa chọn cách bảo quản đối với mỗi vi sinh vật thường dựa vào kinh nghiệm.
– Trong bài thực hành này, ta tiến hành:
Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết amylase ngoại bào.
Môi trường phân lập: thạch tinh bột. Thuốc thử: Lugol (dung dịch iod).
Vi sinh vật có sinh amylase sẽ tạo vòng sáng quanh chỗ mọc (tinh bột bị phân giải thành glucose, nên không tạo màu với iod thuốc thử).
Phân lập và phát hiện vi sinh vật trong mẫu đất có khả năng tiết protease ngoại bào.
Môi trường phân lập: thạch gelatin Thuốc thử: TCA (acid trichloroacetic).
Vi sinh vật có sinh protease sẽ tạo vòng sáng quanh chỗ mọc (gelatin bị phân giải nên không tạo tủa với TCA).
Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của nó với vi sinh vật khác.
Có 2 phương pháp: vạch thẳng vuông góc và khuếch tán. Chủng thử nghiệm sử dụng: S. aureus, E. coli.
II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1. Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết amylase ngoại bào
Bảng 1. Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết amylase
Đường kính khóm (mm) Đường kính vòng phân giải (mm) Tỷ lệ Chủng 1 Khóm trắng đục, bìa gợn 13 14 1,07 Chủng 2 Khóm trắng, nhỏ, có tâm 8 10 1,25 Nhận xét
Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch tinh bột và ủ ở 37oC trong 24 giờ có khả năng tiết amylase ngoại bào.
2. Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết protease ngoại bào
Bảng 2. Kết quả phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết protease
Đường kính khóm (mm) Đường kính vòng phân giải (mm) Tỷ lệ Chủng 1 Khóm trắng đục, bìa gợn 8 11 1,38 Chủng 2 Khóm trắng, có tâm 6 9 1,5 Nhận xét
Chủng vi sinh vật trong mẫu đất sau khi phân lập trên môi trường thạch gelatin và ủ ở 37oC trong 24 giờ có khả năng tiết protease ngoại bào.
3. Phân lập và phát hiện vi sinh vật chủng có khả năng tiết kháng sinh
a. Phương pháp vạch thẳng vuông góc
Bảng 3. Kết quả của phương pháp vạch thẳng vuông góc
Đĩa Kết quả Khoảng cách từ chủng kiểm tra đến chủng thử nghiệm B3 S. aureus + 11 mm E. coli – B4 S. aureus + 7 mm E. coli – Nhận xét
Chủng cần kiểm tra có khả năng ức chế sự phát triển của S. aureus, không ức chế sự phát triển của E. coli.
b. Phương pháp khuếch tán
Bảng 3. Kết quả của phương pháp khuếch tán
Đĩa B1 B2 B3 B4
S. aureus – – 16 mm –
E. coli – – – –
Nhận xét
Chủng vi khuẩn thử nghiệm ở lỗ B3 có khả năng sinh kháng sinh ức chế sự phát triển của
I. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
– Probiotic là vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể với số lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khoẻ vật chủ.
– Một số tiêu chuẩn lựa chọn vi sinh vật làm probiotic bao gồm:
Tính an toàn: không gây bệnh, gây độc, …
Tính đề kháng kháng sinh: có mang gene đề kháng hay không, nếu có thì có khả
năng lây nhiễm sang vi sinh vật khác không.
Chức năng: có chức năng cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, chống tiêu chảy, …
Các yêu cầu công nghệ: sản xuất qui mô lớn, tính ổn định trong bảo quản, …
Khả năng sống sót khi đến đường tiêu hoá: chịu được dịch vị, muối mật.
– Ở bài thực hành này, ta khảo sát tỉ lệ sống sót của vi sinh vật probiotic (tế bào sinh dưỡng và bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis PY79) trong dịch vị nhân tạo (ở các pH 1, 3) và dịch mật nhân tạo (ở nồng độ muối mật 0,3%, 0,5%).
II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1. Đánh giá khả năng chịu dịch vị nhân tạo
Tế bào sinh dưỡng Thời gian (phút) pH Đối chứng pH 1 pH 3 0 120.104 60 300.104 0 100.104 90 20.104 0 0
BÀI 3. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI
Bào tử Thời gian (phút) pH Đối chứng pH 1 pH 3 0 100.104 60 99.104 40.104 85.104 90 75.104 20.104 60.104 Nhận xét
– Tại cùng giá trị pH và thời gian, số lượng bào tử sống sót nhiều hơn số lượng tế bào sinh dưỡng tương ứng.
– Thời gian tiếp xúc với dịch vị nhân tạo càng lâu, số lượng tế bào sinh dưỡng và bào tử càng giảm đi.
Trong đó, số lượng tế bào sinh dưỡng giảm rất nhanh, còn bào tử giảm ít hơn. – Tế bào sinh dưỡng không mọc được ở pH 1 và mọc ít ở pH 3.
Bào tử ở pH 1 vẫn mọc được nhưng nhỏ hơn pH 3.
Giải thích
– Bào tử vi khuẩn có cấu trúc vỏ dày, chịu được những điều kiện khắc nghiệt của môi trường. Vì vậy bào tử mọc nhiều hơn, và giảm ít hơn so với tế bào sinh dưỡng.
2. Đánh giá khả năng chịu muối mật
Tế bào sinh dưỡng
Thời gian (giờ)
Nồng độ muối mật (%)
Đối chứng 0,3 0,5
0 124.104
1 60.104 0 0
Bào tử
Thời gian (giờ)
Nồng độ muối mật (%) Đối chứng 0,3 0,5 0 126.104 1 114,5.104 57,5.104 47,5.104 2 95.104 68.104 61,5.104 Nhận xét
– Thời gian tiếp xúc với dịch mật càng lâu, số lượng số bào tử càng tăng, tế bào sinh dưỡng không còn.
– Theo thời gian, số bào tử giảm không đáng kể.
– Số bào tử ở nồng độ muối mật 0,3% mọc nhiều hơn so với nồng độ muối mật 0,5%.
Giải thích
– Bào tử vi khuẩn có thể chịu được dịch mật. Vì vậy bào tử mọc nhiều hơn, giảm không đáng kể khi tăng thời gian tiếp xúc và nồng độ muối mật.
– Tế bào sinh dưỡng không mọc được trong dịch mật, đây có thể là sai sót trong quá trình pha loãng hoặc cấy lên đĩa thạch.
I. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
– Amylase là enzyme thuỷ phân tinh bột, có ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật.
– Amylase được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, công nghiệp, thực phẩm, y dược …
Trong ngành dược, amylase được sử dụng để sản xuất glucose làm dịch tiêm truyền, chuyển hoá tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược của một số thuốc.
– Tinh chế amylase là một khâu quan trọng trong sản xuất. Có nhiều phương pháp tinh chế. Trong bài này, việc tinh chế amylase được thực hiện bằng gel alginate.
– Phương pháp tinh chế này thực chất là phương pháp cố định enzyme, theo cơ chế hấp phụ. Amylase “nhầm tưởng” alginate là cơ chất nên bám lên bề mặt các hạt gel, từ đây có thể lọc lấy amylase dễ dàng.
– Xác định hoạt độ của amylase được thực hiện theo phương pháp Heinkel.
Hoạt độ của amylase được tính bằng lượng tinh bột bị phân giải dựa trên mức giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với thuốc thử Iod.
Đơn vị hoạt độ là lượng enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh bột sau 15 phút ở 30o C
II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1. Xác định hàm lượng protein Công thức tính toán A280 = V x n x OD 280 Trong đó, A280: tổng lượng protein (mg) V: thể tích thu được (ml) n: độ pha loãng (lần)
OD280: mật độ quang của mẫu đo tại bước sóng 280 nm
Bảng 1. Hàm lượng protein
Thể tích thu được Độ pha loãng OD280 A280
Dịch thô 10 20 0,837 167,4
Enzyme sau tinh chế 25 1 0,664 16,6
2. Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính amylase
Công thức tính toán
U/ml là số mg tinh bột do 1 ml amylase phân giải trong 15 phút. Trong bài này, ta sử dụng 0,1 ml amylase, nên:
U/ml = Lượng tinh bột (mg) x 10
Bảng 2. Tương quan giữa lượng tinh bột và giá trị ΔOD560
Ống 0 1 2 3 4 5
Tinh bột (mg) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ΔOD560 0 0,145 0,369 0,549 0,756 0,943
U/ml 0 2 4 6 8 10
Vẽ đường chuẩn
Đường chuẩn xác định hoạt tính amylase
3. Thông số qui trình tinh chế
Công thức tính toán
OD = OD chuẩn – OD thử
Lượng tinh bột (mg) phân giải tính theo đường chuẩn y = 0,9611x – 0,0202
y = 0.9611x - 0.0202 R² = 0.998 0.000 0.150 0.300 0.450 0.600 0.750 0.900 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Lượng tinh bột phân giải (mg) ∆OD 560
Bảng 3. Kết quả đo của enzyme thô và sau tinh chế
Enzyme thô Enzyme sau tinh chế
OD chuẩn 0,973 0,926 OD thử 0,651 0,338 OD 0,322 0,588 Lượng tinh bột phân giải (mg) 0,356 0,633 U/ml 3,561 6,328 Công thức tính toán Tổng hoạt tính = A x V x n
Trong đó, A: hoạt tính enzyme trong 1 ml dung dịch (U/ml) V: thể tích thu được (ml)
n: độ pha loãng (lần)
Hoạt tính chuyên biệt =
Hiệu suất =
Mức tinh chế =
Bảng 4. Các thông số của qui trình tinh chế enzyme
Thông số Dịch thô Enzyme sau tinh chế
Thể tích 10 25
Độ pha loãng 400 20
Tổng protein A280 167,4 16,6
Tổng hoạt tính U 14242 3164
Hoạt tính chuyên biệt 85,08 190,60
Hiệu suất 22,22%
Tổng hoạt tính Tổng protein A280
Tổng hoạt tính U của enzyme thô Tổng hoạt tính U của enzyme sau tinh chế
Hoạt tính chuyên biệt của enzyme thô Hoạt tính chuyên biệt của enzyme sau tinh chế
Nhận xét
– Sau quá trình tinh chế, hoạt tính chuyên biệt của amylase tăng lên.
– Hiệu suất tinh chế còn thấp, lượng amylase bị thất thoát trong quá trình tinh chế.
Có thể là do thao tác chưa chính xác, cẩn thận trong bước thôi enzyme (amylase thôi chưa hết), lọc lấy dịch (amylase còn sót trong tủa gel), … cũng như trong quá trình đo quang. Ngoài ra cần khảo sát thời gian tối ưu của quá trình ủ.
– Để đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế, có thể dựa vào mức tinh chế amylase. Theo lý thuyết, mức tinh chế trên 1 là đạt yêu cầu (tốt nhất là trên 4).
Mức tinh chế trong bài là 2,24 lần, đạt yêu cầu nhưng còn thấp. Có thể là do trong quá trình tinh chế chưa cẩn thận đã làm giảm hoạt tính của amylase.
4. Câu hỏi
Sơ đồ tinh chế amylase bằng alginate:
Nghiền khoai lang với đệm phosphate 1 : 1 10 ml Dịch thô Phức Enzyme–Alginate–Na Lọc Na-alginate 2% (đệm CH3COONa 2M pH 4,8) tỉ lệ 1:3 ủ 1h Tủa Enzyme–Alginate–Ca 20 ml CaCl2 0,7M Tủa Enzyme–Alginate–Ca Glucose 2% để lạnh 12h Lọc lấy dịch
I. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
– Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) là enzyme duy nhất chuyển hoá tinh bột và các chất tương tự thành các cyclodextrin có mức polymer hoá 6, 7 và 8 đơn vị glucose (tương ứng α–CD, β–CD và γ–CD).
– Việc cố định sẽ giúp tái sử dụng CGTase đắt tiền, đồng thời tăng cường tính ổn định và hoạt tính enzyme.
– Dựa vào bản chất liên kết giữa chất mang và enzyme, cố định enzyme bao gồm các phương pháp:
Vật lý: hấp phụ, liên kết ion, tương tác kỵ nước, …
Liên kết cộng hoá trị: dựa vào ái lực giữa enzyme và chất mang để tạo phức hợp
enzyme – chất mang có liên kết cộng hoá trị.
Bắt giữ enzyme trong gel: dựa vào sự hút giữ enzyme vào mạng lưới mà cơ chất
và sản phẩm đi qua được, nhưng không cho enzyme khuếch tán vào môi trường.
Tạo vi nang: enzyme được giữ trong bao vi thể có màng bán thấm dày 200 o
A (như cellulose, polysaccharid).
– Trong bài thực hành này, enzyme được cố định bằng phương pháp hấp phụ và bắt giữ. Nguyên tắc là cho enzyme lẫn vào mạng lưới gel Ca–alginate, enzyme có thể bám trên bề mặt (hấp phụ) hoặc nằm trong (bắt giữ) hạt gel.
Đệm Tris–HCl pH = 8 để tạo môi trường ổn định cho enzyme hoạt động tối ưu. Tránh dùng đệm phosphate vì gel alginate không bền.
Bảng 1. Các điểm khác biệt giữa phương pháp hấp phụ và bắt giữ enzyme
Hấp phụ Bắt giữ
Tạo gel Ca–alginate trước, sau đó mới cho enzyme vào hấp phụ
Gel Ca–alginate được tạo cùng lúc bắt giữ enzyme
Thời gian ủ lâu (45 phút) Thời gian ủ nhanh (10 phút) BÀI 5. CỐ ĐỊNH CGTase LÊN ALGINATE
C n 2 II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase và protein cố định
a. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein
Bảng 2. Tương quan giữa nồng độ BSA và ΔOD595
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nồng độ BSA (μg/ml) 0 10 20 30 40 50 ΔOD595 0 0,190 0,312 0,455 0,568 0,681 Vẽ đường chuẩn Đường chuẩn xác định nồng độ protein b. Tính hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase
Công thức tính toán
Nồng độ protein mẫu đo tính theo đường chuẩn y = 0,0134x – 0,0332
Hàm lượng protein trong 2 ml chế phẩm CGTase tính theo công thức:
y = 0.0134x + 0.0332 R² = 0.9917 0.000 0.150 0.300 0.450 0.600 0.750 0 10 20 30 40 50 60 ∆OD 595 Nồng độ BSA (μg/ml)
C x V
1000
mcố định mban đầu
Trong đó, mban đầu: hàm lượng protein trong 2 ml chế phẩm CGTase (mg) C: nồng độ protein mẫu đo (μg/ml)
n: độ pha loãng (lần)
Bảng 3. Kết quả đo protein trong chế phẩm CGTase
Phương pháp Hấp phụ Bắt giữ
ΔOD595 nm 0,405 0,220
Nồng độ protein mẫu đo (μg/ml) 27,746 13,940
Độ pha loãng (lần) 20 20 Hàm lượng protein (mg) 1,110 0,558 c. Tính hàm lượng protein cố định Công thức tính toán Hàm lượng protein không cố định được tính theo công thức: mkhông cố định = Trong đó, mcố định: hàm lượng protein cố định (mg) C: nồng độ protein mẫu đo (μg/ml) V: thể tích dịch gộp (ml) Hàm lượng protein không cố định được tính theo công thức: mcố định = mban đầu – mkhông cố định Hiệu suất cố định (%) = x 100 Bảng 4. Kết quả hàm lượng protein cố định Phương pháp Hấp phụ Bắt giữ ΔOD595 0,165 0,080
Nồng độ protein mẫu đo (μg/ml) 9,836 3,493 Thể tích dịch gộp (dịch lọc + dịch rửa) (ml) 40 45 Hàm lượng protein không cố định (mg) 0,393 0,157
Nhận xét
Hiệu suất cố định bằng phương pháp bắt giữ cao hơn so với phương pháp hấp phụ.
Có thể giải thích rằng, phương pháp bắt giữ là phương pháp cố định không thuận nghịch, CGTase bị nhốt trong hạt gel không thoát ra được.
Còn phương pháp hấp phụ là phương pháp cố định thuận nghịch, CGTase chỉ bám lên bề mặt hạt gel.
2. Kết quả xác định hoạt tính enzyme trong chế phẩm và hoạt tính enzyme cố định
a. Xây dựng đường chuẩn cyclodextrin
Bảng 5. Tương quan giữa nồng độ cyclodextrin và ΔOD550
Số thứ tự 0 1 2 3 4 5 Nồng độ CD (mg/ml) 0 10 20 30 40 50 OD550 1,940 1,719 1,514 1,338 1,215 1,054 ΔOD550 0 0,221 0,426 0,602 0,725 0,886 Vẽ đường chuẩn
Đường chuẩn xác định hoạt tính CGTase
y = 0.0874x + 0.0397 R² = 0.9901 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 0 2 4 6 8 10 ∆OD550 Nồng độ CD (mg/ml)
CD x 10 x n
M x t
Tổng hoạt tính CGTase ban đầu Hàm lượng protein ban đầu
CD x 10 x n
M x t x m b. Xác định hoạt tính của CGTase
Công thức tính toán
Hoạt tính CGTase trong 1 ml được tính theo công thức: A =
Trong đó, A: hoạt tính CGTase trong 1 ml dung dịch (U/ml)
CD: nồng độ cyclodextrin được tạo ra, tính theo đường chuẩn (μg/ml) n = 40: độ pha loãng (lần)
M = 1135: khối lượng phân tử cyclodextrin t = 15 phút: thời gian phản ứng
10: tỷ lệ enzyme phản ứng (có 0,1 ml enzyme tham gia phản ứng)
Tổng hoạt tính CGTase ban đầu = A x 2
Giá trị 2 là số ml CGTase ban đầu được dùng
Hoạt tính riêng của CGTase ban đầu (U/mg) =
Bảng 6. Kết quả đo hoạt tính enzyme ban đầu
c. Xác định hoạt tính enzyme sau cố định Công thức tính toán
Hoạt tính CGTase sau cố định trong 1 ml được tính theo công thức: A =
Phương pháp cố định Hấp phụ Bắt giữ
ΔOD550 1,073 0,695
Hoạt tính của CGTase
trong 1 ml (U/ml) 277,772 264,237 Tổng hoạt tính (U) 555,544 528,474 Hoạt tính riêng của CGTase
Hoạt tính riêng của CGTase ban đầu Hoạt tính riêng của CGTase sau cố định
Tổng hoạt tính CGTase sau cố định Hàm lượng protein cố định Trong đó, A: hoạt tính CGTase cố định trong 1 ml dung dịch (U/ml)
CD: nồng độ cyclodextrin được tạo ra, tính theo đường chuẩn (μg/ml) n = 1: độ pha loãng (lần)
M = 1135: khối lượng phân tử cyclodextrin t = 15 phút: thời gian phản ứng
m = 0,6 g: khối lượng 20 hạt gel được sử dụng Tổng lượng enzyme cố định trong gel là 10 g
Tổng hoạt tính CGTase sau khi cố định = A x V
Trong đó, A: hoạt tính CGTase trong 1 ml dung dịch (U/ml) V: thể tích dịch gộp (ml)
Hoạt tính riêng của CGTase sau cố định (U/mg) =
Tỉ lệ hoạt tính (%) = x 100
Bảng 7. Kết quả đo hoạt tính enzyme sau cố định
Hấp phụ Bắt giữ
ΔOD550 0,566 0,593
Tổng hoạt tính (U) 141,480 223,107 Hoạt tính riêng (U/mg) 197,322 556,377 Tỉ lệ hoạt tính (%) 39,43% 58,75%
Nhận xét
Hoạt tính của enzyme cố định giảm nhiều so với enzyme tự do ban đầu.
Vì cố định enzyme ít nhiều làm ảnh hưởng đến cấu trúc của enzyme cũng như cản trở không gian tiếp xúc giữa cơ chất – enzyme, dẫn đến hoạt tính enzyme sau cố định thường giảm đi.
3. Câu hỏi
Sơ đồ cố định CGTase bằng phương pháp hấp phụ
Rửa 2 lần với đệm Tris–HCl
Nhỏ từ từ 15 ml alginate 2% vào 30 ml CaCl2
Hạt gel Ca–Alginate 20 ml đệm Tris–HCl pH8 + Hạt gel Enzym cố đinh 1. Thêm 2 ml CGTase 2. Cố định 45 phút 3. Lọc Dịch lọc Gộp dịch Xác định hàm lượng enzyme không cố định
Sơ đồ cố định CGTase bằng phương pháp bắt giữ
Rửa 2 lần với đệm Tris–HCl
2 ml enzyme + 15 ml dung dịch alginate 2% Phức hợp Enzyme–Alginate Phức hợp Enzyme–Alginate–Ca Nhỏ giọt từ từ 30ml CaCl2 0,2M Hạt gel Dịch lọc Dịch rửa Gộp dịch Xác định hàm lượng enzyme không cố định
I. TÓM TẮT LÝ THUYẾT
– Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp được sử dụng phổ biến để tinh chế protein. Đây là phương pháp tách các chất tan dựa vào lực hút tĩnh điện trái dấu giữa các phân tử chất tan với các nhóm mang điện tích trên nhựa trao đổi ion.
– Nhựa trao đổi ion được chia làm 2 loại: nhựa cationit và nhựa anionit.
Nhóm mang điện tích trên nhựa mạnh hay yếu tuỳ thuộc vào mức biến động của sự ion hoá theo pH, chứ không phải là độ mạnh của liên kết.
Nhựa trao đổi mạnh có khả năng hoạt động trong dải pH rộng hơn, bị ảnh hưởng bởi pH môi trường.
– Tinh chế protein bằng sắc ký trao đổi ion dựa trên cơ sở điểm đẳng điện pI. Nó là giá trị pH mà protein có tổng điện tích bằng 0. Như vậy:
Khi pH > pI, protein sẽ tích điện âm
Khi pH < pI, protein sẽ tích điện dương
– Lysozyme có pI = 10, còn các protein khác trong lòng trắng trứng có pI ≤ 6.
Do đó, ta sử dụng nhựa cationit tại pH = 8 thì lysozyme tích điện dương và bị giữ lại trên cột sắc ký, các protein khác tích điện âm và đi ra khỏi cột. Sau đó lysozyme được thôi ra bằng cách nâng pH lên 10, hoặc tăng nồng độ ion trong dung dịch để cạnh tranh và đẩy lysozyme ra ngoài.
II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Đường chuẩn được sử dụng trong bài này là đường chuẩn Bradford bài 5:
y = 0,0134x + 0,0032 (R2 = 0,9917) 1. Mẫu thử protein
Công thức tính toán
Lượng protein (μg) = Nồng độ protein mẫu đo (μg/ml) x Độ pha loãng x Thể tích (ml)
BÀI 10. TINH CHẾ LYSOZYME
BẰNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION
pI
0 14
Protein tích điện (–) Protein tích điện (+)
Mẫu gộp D Mẫu A
13,52 304,48
Bảng kết quả sắc ký trao đổi ion
Tổng lượng protein trong mẫu gộp D = 6,03 + 3,64 + 1,48 + 2,37 = 13,52 (µg) Tổng lượng protein trong mẫu B, C và D = 61,80 + 16,55 + 13,52 = 91,87 (µg) Hiệu suất (%) = x 100 = x 100 ≈ 4,44%
Nhận xét
– Hiệu suất tinh chế lysozyme là 4,44%, còn thấp.
– Theo lý thuyết, A = B + C + D. Thực tế A > B + C + D.
– Dịch B vả C chứa nhiều protein tạp. Mẫu tinh chế (dịch D) thì chứa rất ít protein đích.
Giải thích
– Thực tế lysozyme trong lòng trắng trứng chiếm tỉ lệ rất nhỏ. – Hiệu suất thấp có thể do:
Thao tác tinh chế chưa cẩn thận, còn làm tung nhựa trao đổi.
Thao tác bơm, hút dịch vào eppendoff chưa chính xác, ảnh hưởng đến kết quả đo
quang.
Chưa hoạt hoá tối đa khả năng trao đổi ion của cột sắc ký.
Mẫu A B C D1 D2 D3 D4 OD595 0,236 0,116 0,091 0,114 0,082 0,053 0,065 Độ pha loãng 20 20 1 1 1 1 1 Nồng độ protein mẫu đo (μg/ml) 15,13 6,18 4,31 6,03 3,64 1,48 2,37 Thể tích (ml) 1 0,5 3,84 1 1 1 1 Lượng protein (μg) 304,48 61,80 16,55 6,03 3,64 1,48 2,37
2. Câu hỏi
Sơ đồ tinh chế lysozyme bằng sắc ký trao đổi ion
Ly tâm lấy dịch 1ml lòng trắng trứng nạp lên cột
Rửa cột với đệm chạy, tốc độ 1–2 ml/phút, đến khi không còn protein
Thôi lysosym bằng đệm thôi, tốc độ 1 ml/phút
Hứng thu dịch B Tốc độ 0,5–1 ml/phút
Hứng dịch chảy ra C
Thu dịch theo từng ml Kiểm tra đến khi hết protein
Tái cân bằng cột bằng 5 thể tích đệm chạy
Định lượng đo quang
MỤC LỤC
Bài 1. Chọn lọc giống vi sinh vật
... Trang 1 Bài 3. Đánh giá một số đặc điểm có lợi của vi khuẩn probiotic
... Trang 4
Bài 4. Tinh chế enzyme amylase bằng alginate
... Trang 7
Bài 5. Cố định CGTase lên alginate
... Trang 11
Bài 10. Tinh chế lysozyme bằng sắc ký trao đổi ion
