PALAVRAS CHAVE: Análise Histopatológica; Fisioterapia; Irritação Cutânea; Ultra-som Terapêutico. KEY WORDS: Histopathological Analysis; Physiotherapy; Skin Irritation; Therapeutic Ultrasound. * Autor a quem correpondência deve ser enviada: E-mail: larissabriet@yahoo.com.br
(formerly Acta Farmacéutica Bonaerense) Lat. Am. J. Pharm. 28 (3): 325-30 (2009)
Received: July 4, 2008 Accepted: February 4, 2009
Avaliação da Escala de Draize comparada com
a Análise Histopatológica na Irritação Cutânea
Larissa S. BRIET *, Juliana M. SCORISA, Gustavo N. GUIMARÃES, Paula S. PRESTES, Gislaine R. LEONARDI, Maria L.O. POLACOW & Maria S.M. PIRES-DE-CAMPOS
Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Metodista de Piracicaba (UNIMEP), Rodovia do Açúcar, Km 156, CEP: 13400-911, Piracicaba, São Paulo, Brasil
RESUMO. O objetivo deste trabalho foi comparar a Escala de Draize com análise histopatológica, no re-conhecimento da irritação cutânea, em coelhos tratados com sistemas nanoestruturados associados ou não ao ultra-som (US). O dorso de cinco coelhos foi tratado por 15 dias, nas áreas: controle, sistema S1, siste-ma S2, S1+US, S2+US. Pela Escala de Draize foram avaliados eritesiste-ma e edesiste-ma; e comparada com análise histopatológica. Os resultados obtidos pela Escala de Draize foram similares aos resultados da análise his-topatológica em três (S1, S2 e S1+US) dos quatro tratamentos. Conclui-se que a Escala de Draize é coinci-dente com a avaliação histológica em condições do presente trabalho.
SUMMARY. “Evaluation of the Draize Test compared to Histopathological Analysis on Skin Irritation”. The pur-pose of this work was to compare the Draize test to histopathological analysis, on the recognition of skin irrita-tion, in rabbits treated with nano-emulsions associated or not to ultrasound (US). The back of five rabbits was treated daily for 15 days, on the following areas: control, system S1, system S2, S1+US, S2+US. Erythema and edema were evaluated through the Draize test; and compared to histopathological analysis. The results obtained for the Draize test were similar to the results from histopatological analysis in three (S1, S2 and S1+US) of the four treatments. This study concludes that Draize test matches the histological evaluation under the conditions presented in this work.
INTRODUÇÃO
Para uma formulação farmacêutica ser bem sucedida é necessário que ocorra a permeação da substância ativa até o tecido alvo em nível terapeuticamente relevante, sem causar descon-forto ou efeitos colaterais ao paciente. À esse respeito, a administração transdérmica supera a administração oral, pois diminui a degradação do fármaco antes de entrar na circulação sistê-mica, e aumenta o conforto do paciente 1.
Porém, devido à função de barreira da pele, há limitação na escolha de uma formulação tó-pica, pois a mesma deve ser capaz de causar uma penetração cutânea suficiente do fármaco sem provocar alterações irreversíveis à essa fun-ção, a qual é de extrema importância para a proteção do organismo humano. A partir disto,
tem sido estudado e descrito o sistema nanoes-truturado, que apresenta grande capacidade de aumentar a permeação cutânea tanto de subs-tâncias hidrofílicas quanto lipofílicas 1.
Pelo fato dos sistemas nanoestruturados au-mentarem a solubilidade e a estabilidade dos fármacos, são capazes de agir como sistema re-servatório, que proporcionam atividade terapêu-tica mais intensa, por tempo prolongado, além de diminuir a toxidade dos mesmos. Pode favo-recer a permeação cutânea dos fármacos, devi-do o seu conteúdevi-do em substância tensoativa, que interage com o estrato córneo desestrutu-rando a bicamada lipídica 2.
O produto cosmético deve ser seguro para o usuário em condições de uso normais, com au-sência razoável de risco de lesão. Entretanto,
tem sido relatado efeitos secundários indesejá-veis, entre eles está a irritação 3. Ela é definida como uma intolerância local que pode gerar reações de desconforto menores, ou reações mais ou menos agudas, na qual sua intensidade pode variar desde ardor, prurido e pinicação até a corrosão e destruição do tecido, restringindo-se a área de contato direto com o produto 4.
Não há na literatura relatos sobre os efeitos que os sistemas nanoestruturados podem causar na pele. Todavia, devido às grandes proporções de tensoativos, suspeita-se que possam causar uma irritação local.
A transmissão transdérmica de fármacos po-de ser realizada pelo uso do ultra-som (US), o que é denominado fonoforese. O US pode ser definido como uma onda mecânica longitudinal, cuja finalidade é transmitir energia através das vibrações das moléculas do meio pelo qual pas-sa 5. A freqüência usada para fonoforese varia de 20 KHz à 10 MHz 6.
Os efeitos térmicos, mecânicos e químicos do US sobre o tecido, aceleram a difusão dos ativos presentes nos medicamentos para uso tó-pico 7.
Entre os efeitos mecânicos, a cavitação pro-duz uma oscilação de partículas levando à for-mação de microbolhas gasosas que se rompem violentamente, desorganizando a bicamada lipí-dica da camada córnea, a qual se transforma nu-ma fase fluida, permitindo a passagem do fár-maco. Além da cavitação, ocorre, também, dimi-nuição do potencial da membrana celular, o que leva à quebra das ligações intercelulares e consequentemente aumento da permeabilidade da membrana. O efeito térmico do US aumenta a energia cinética das moléculas do medicamen-to e da membrana celular, que dilata os ponmedicamen-tos de entrada, além de aumentar a circulação na área tratada, facilitando a difusão através da ca-mada córnea até os capilares da derme. A indu-ção de um grande número de reações de oxida-ção, inativação de enzima, aumento da ativida-de do trifosfato ativida-de aativida-denosina são alguns dos possíveis mecanismos químicos do US 8,9,10,11.
Segundo Draelos 12 a irritação de um produ-to depende também da condição intacta da ca-mada córnea. Se a barreira estiver danificada o produto que não era irritante pode tornar a sê-lo. Assim, o US poderia aumentar a irritação que o próprio sistema nanoestruturado já causaria por conter muito tensoativo e por ser muito oleoso, uma vez que uma das alterações que o US promove é a alteração da pele.
Em um estudo sobre métodos para avaliação
da irritação de substâncias aplicadas topicamen-te na pele, Draize et al. 13 relataram o uso de um grande número de novos componentes in-corporados nas preparações para aplicação tópi-ca. Muitas dessas preparações contêm agentes ativos que são capazes de alterar a pele, resul-tando na penetração de um grande número de componentes orgânicos e inorgânicos, e conse-quentemente, gerando toxicidade local.
A fim de transformar observações qualitativas de efeitos fisiológicos em medidas quantitativas objetivas, foi desenvolvido um método para avaliar clinicamente a irritação cutânea, o qual consiste em aplicar topicamente substâncias na pele tricotomizada de coelhos. Posteriormente são designados valores para eritema e edema, dependente da gravidade dos mesmos (Escala de Draize), e o escore combinado desses dois fenômenos determina se ocorreu irritação suave, moderada ou severa decorrente da aplicação do produto testado 13,14. Esse método é bastante útil na prática clínica para avaliação da irritação cu-tânea, visto que é fácil de ser usada, e por não ser invasivo.
Informações valiosas, quantitativas e qualita-tivas, à respeito dos produtos para aplicação tó-pica podem ser obtidas por meio deste teste, porém é necessário que testes mais apurados sejam realizados antes que uma decisão à res-peito da conveniência ou não do uso do produ-to seja produ-tomada 13.
Para isso, deve-se realizar uma avaliação his-topatológica, visto que ela permite a análise do tecido epitelial, da derme e das características dos diferentes tipos celulares. A análise histopa-tológica consiste na observação visual de bió-psias ao microscópio óptico de luz que permite a avaliação das diversas estruturas presentes no tecido cutâneo 15,16. A avaliação da irritação cu-tânea, segundo as normas do “Guia para Avalia-ção de Segurança dos Produtos Cosméticos” 4, deve ser realizado em coelhos machos adultos.
Com os dados obtidos no teste clínico, por meio da Escala de Draize, somados aos obtidos por análise histopatológica, é possível realizar uma avaliação da extensão da injúria e do prog-nóstico para reparação 13, no entanto, não existe nenhum estudo comparando os dois tipos de análise.
A partir do exposto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência da Escala de Draize quando comparada com a análise histo-patológica no reconhecimento da irritação cutâ-nea decorrente da aplicação de sistemas na-noestruturados associados ou não ao ultra-som, na pele de coelhos.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 5 coelhos machos, adultos, pesando entre 2-3 Kg, nos quais foi realizada a tricotomia de cinco áreas no dorso, um dia an-tes de iniciar os tratamentos, essas áreas foram divididas em: controle; tratado com Sistema S1 (10% de silicone fluido de copolímero glicol, 60% de poliéter funcional silixano e 30% de água destilada); tratado com S1 + US; tratado com Sistema S2 (10% de adipato de diisopropi-la, 60% de poliéter funcional silixano e 30% água destilada); tratado com S2 + US.
A aferição da calibração da intensidade do US na freqüência de 3 MHz foi realizada antes e durante o experimento utilizando água destilada e desgaseificada. A metodologia adotada foi a proposta por Guirro et al. 17, utilizando a balan-ça UPM-DT-10 OHMIC Instruments. Além disso, verificou-se a transmissividade da onda ultra-sô-nica nos sistemas nanoestruturados, consideran-do a variação de 10% consideran-do US e de 0,07% da ba-lança. O procedimento foi repetido 5 vezes para cada gel, e foram selecionados os sistemas na-noestruturados que apresentaram baixa atenua-ção e alta transmissividade, ou seja, acima de 80% 18(dados não demonstrados).
Nos tratamentos dos animais, o US foi regu-lado a uma freqüência de 3 MHz; intensidade de 0,2 W/cm2; modo de emissão contínuo e tempo de aplicação de 1 min/cm2.
Os coelhos foram submetidos a 15 dias de tratamento para análise do teste de irritabilidade cumulativa. A análise da irritabilidade foi reali-zada a partir da avaliação clínica por meio da graduação pela Escala de Draize 13, a qual avalia subjetivamente o eritema e edema presente na pele, com uma graduação de 1 a 4 graus para cada um deles.
Para eritema descreve a seguinte graduação: grau 1, eritema muito leve; grau 2, eritema bem definido; grau 3, eritema de moderado a severo; grau 4, eritema severo com ligeira formação de escara. Para edema segue a graduação: grau 1, edema muito leve; grau 2, edema leve (borda da área bem definida por elevação definitiva); grau 3, edema moderado (área elevada aproxi-madamente 1 mm); grau 4, edema severo (ele-vação maior que 1 mm e extensão além da área de exposição) 13.
Todas as análises foram feitas por três pes-quisadores diferentes, sendo que nenhum deles teve contato com as análises dos demais. Poste-riormente, foi realizado a média dos escores dos três observadores.
Para a análise histopatológica, após sacrifício
dos animais por CO2, as áreas tratadas foram
re-movidas e fixadas em solução de formol tampo-nado a 10% por 48 h e tratadas para inclusão em Paraplast Plus e coloração em Hematoxilina Eosina. Foram obtidos 3 cortes histológicos de 5 µm de profundidade para cada lâmina, sendo cinco lâminas por animal. Utilizou-se o micros-cópio óptico de luz (Zeiss Axiolab, ZEISS, Ale-manha) com lente objetiva em aumento de 40x e com uma microcâmera (Sony CCD IRIS / RGB COLOR, Japão), responsável pela digitalização das imagens histológicas transmitidas para o computador. Para cada corte histológico, obte-ve-se a densidade do número de leucócitos de três áreas (12600 µm2 cada) da derme papilar escolhidas aleatoriamente com o auxílio de um software de análise de imagens histológicas (KS 400 2.0 – Kontron Eletronics, Munique, Alema-nha).
Para análise estatística da irritabilidade cumu-lativa por meio da Escala de Draize utilizou-se o teste de Friedman, seguido de Rank; e ANOVA – F (ONE – WAY), seguido do Teste post - hoc de Tukey para análise histopatológica, conside-rando-se nível de significância igual a 5%.
RESULTADOS
A avaliação da irritabilidade cumulativa por meio da Escala de Draize demonstrou que não existiu edema nas áreas submetidas aos trata-mentos que utilizaram somente a aplicação de S1 ou S2. Com relação à presença de eritema, embora tenha ocorrido diferença estatística sig-nificativa, em nenhum dos 15 dias de tratamen-to, a média ultrapassou o escore 2 da Escala de Draize, a qual considera irritação moderada quando o escore entre edema e eritema for maior que 2 e menor que 6 (Figs. 1 e 2).
Os tratamentos que associaram US ao siste-ma nanoestruturado também não apresentaram edema, segundo a Escala de Draize. Quanto ao eritema, ambos os grupos apresentaram diferen-ça estatística significativa, porém somente o tra-tamento S1+US apresentou média acima de 2, fato que ocorreu a partir do 10º dia de trata-mento (Fig. 3). Embora o grupo S2+US não te-nha obtido média superior à 2, à partir do 12º dia ela permaneceu numa região limítrofe entre irritação suave – escore de 2 ou menos – e irri-tação moderada (Fig. 4).
A análise histopatológica demonstrou que os tratamentos que utilizavam apenas os sistemas nanoestruturados não provocaram aumento do número de leucócitos. Entretanto, os tratamen-tos que associaram o US à aplicação das
formu-lações, apresentaram aumento significativo do número de leucócitos em relação ao controle (Fig. 5).
DISCUSSÃO
Embora o US de baixa freqüência seja bem tolerado pelos pacientes 19, e mais eficiente que o US de alta freqüência no transporte transdér-Figura 1. Comparação dos valores médios e desvio padrão do eritema na irritabilidade cumulativa segun-do o escore para irritação suave da Escala de Draize para os tratamentos com S1.
Figura 2. Comparação dos valores médios e desvio padrão do eritema na irritabilidade cumulativa segun-do o escore para irritação suave da Escala de Draize para os tratamentos com S2.
Figura 3. Comparação dos valores médios e desvio padrão do eritema na irritabilidade cumulativa segun-do o escore para irritação suave da Escala de Draize para os tratamentos com S1 + US.
Figura 4. Comparação dos valores médios e desvio padrão do eritema na irritabilidade cumulativa segun-do o escore para irritação suave da Escala de Draize para o tratamentos com S2 + US.
Figura 5. Média e desvio padrão do número de leu-cócitos encontrados na derme papilar numa área de 12600 µm2dos diferentes grupos experimentais. ** Diferente do controle.
mico de fármacos 20, foi utilizado neste trabalho o US de alta freqüência, no caso 3 MHz, pelo fa-to dele ser o mais utilizado nas clínicas de fisio-terapia do Brasil. Além disso, como o objetivo foi observar as alterações cutâneas que o mes-mo poderia causar associado aos sistemas na-noestruturados, era de fundamental importância que fosse usado o US de alta freqüência, pois sabe-se que a profundidade de penetração da onda ultra-sônica é inversamente proporcional à sua freqüência, fato explicado pela atenuação. A atenuação é definida como o decréscimo da in-tensidade da onda ultra-sônica quando ela atra-vessa um meio homogêneo, à medida que a dis-tância aumenta. A atenuação geralmente aumen-ta com a freqüência, poraumen-tanto a frequência de 3 MHz atua mais superficialmente, cerca de 1 a 2 cm de profundidade 5.
Muitos são os mecanismos que podem inten-sificar a absorção de fármacos através da pele 6. Segundo Mitragotri et al. 21, a cavitação é o prin-cipal mecanismo para que ocorra a fonoforese, por induzir uma desordem na bicamada lipídica, e conseqüente aumento da permeação cutânea. Já Hippius et al. 22, acreditam ser o efeito
térmi-co o principal mecanismo ligado à fonoforese, pois o aquecimento aumenta a energia cinética das moléculas do medicamento e da membrana celular, que dilata os pontos de entrada 10.
Machet & Boucaud 23 dizem que o aumento na temperatura é um dos principais fatores que explica o incremento na absorção cutânea nas freqüências de 1-3 MHz e no modo contínuo. Miyazaki et al. 24 mostraram um aumento de 6 °C com US de 1 MHz na intensidade de apenas 0,25 W/cm2. Asano et al. 25 encontraram um au-mento na temperatura em 6 °C com 1 W/cm2e 11 °C com 2 W/cm2, ambos na freqüência de 1 MHz. Mitragotri et al. 21 constataram que a ab-sorção do estradiol dobrou quando a temperatu-ra aumentou 10 °C. Porém é importante salien-tar que a cavitação e o aumento na temperatura estão intimamente relacionados, visto que a ca-vitação pode causar o aquecimento 26. Isto por-que quando ocorre a ruptura das microbolhas, há liberação de energia com conseqüente au-mento da temperatura local 23.
Sabendo-se que o incremento na temperatu-ra aumenta a permeabilidade, e que a ttemperatu-ransição da fase dos lipídios intercelulares da camada córnea – os quais se transformam numa fase fluida – pode ocorrer em temperatura perto da fisiológica, é possível que os efeitos térmicos contribuam para o aumento no transporte trans-dérmico de fármacos decorrentes do uso do US 27.
Os resultados dos tratamentos que utilizaram apenas os sistemas nanoestruturados mostraram a ausência de irritação segundo avaliação tanto por meio do escore da Escala de Draize, quanto pela análise histopatológica, a qual demonstrou que não houve aumento significativo no núme-ro de leucócitos, células de defesa que aumen-tam em número num processo inflamatório, po-dendo-se afirmar que os tratamentos isolados não causam irritação cutânea, embora alguns trabalhos, como o estudo de Changez et al. 28, mostrem que os altos níveis de óleo e tensoati-vos podem causar irritabilidade cutânea.
Entretanto, nos tratamentos que associaram o US aos sistemas S1 e S2, houve aumento signifi-cativo de leucócitos em relação ao controle. Co-mo viCo-mos anteriormente, o US provoca altera-ções na camada córnea, como desorganização de sua bicamada lipídica, a qual se transforma numa fase fluida, e permite a passagem do fár-maco; quebra das ligações intercelulares e con-sequente aumento da permeabilidade da mem-brana; dilatação dos pontos de entrada, dentre outros 8,9. Essas alterações prejudicam a função
de barreira da pele, e, segundo Draelos 12 a irri-tação de um produto depende também da con-dição intacta da camada córnea. Se a barreira estiver danificada o produto que não era irritan-te pode tornar a sê-lo.
Polacow et al. 9demonstraram que áreas tra-tadas com gel + tiratricol associado ao US apre-sentaram a camada córnea menos espessa do que as tratadas somente com gel + tiratricol. Provavelmente, isto se deve a ação do US, o qual provoca desnaturação da queratina e remo-ção das células mortas 29.
Assim, o US, por diminuir a principal barrei-ra da pele, que é a camada córnea, poderia au-mentar a permeação dos sistemas nanoestrutura-dos. Este trabalho confirma o efeito do US como potencializador da irritação, uma vez que o tra-tamento com o sistema nanoestruturado S1 as-sociado ao US levou à irritabilidade cutânea cu-mulativa a partir do 10º dia de tratamento, se-gundo o escore da Escala de Draize; e o trata-mento S2 associado ao US, a partir do 12º dia fi-cou na região que limita a irritação suave da moderada.
Segundo Tornier et al. 14 a escala de Draize, apresenta-se como um dos melhores métodos para avaliar irritabilidade cutânea, fato este con-firmado por este estudo, visto que os resultados obtidos por meio da avaliação pela Escala de Draize coincidiram com os obtidos pela análise histopatológica em três dos quatro tratamentos.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos por meio da avaliação pela Escala de Draize coincidem com os da aná-lise histopatológica nos tratamentos que utiliza-ram os sistemas S1 e S2, e no tratamento que associou o US ao S1. Apenas o tratamento que associou o US ao S2 não obteve o mesmo resul-tado. Conclui-se, desta forma, que a Escala de Draize é coincidente com a avaliação histológica em condições do presente trabalho.
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