VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica
27 a 30 de julho de 2009 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil
CRESCIMENTO CELULAR E PRODUÇÃO DE BETA-GALACTOSIDASE E CELULASE
POR ASPERGILLUS NIGER EM SORO DE LEITE
1
Nathacha Kare Gonçalves Silva, 1 Raquel Chamone Barbosa, 2 Ubirajara Coutinho Filho,
2
Vicelma Luiz Cardoso
1
Bolsistas do Programa de Educação Tutorial (PET) da UFU, discentes do curso de Engenharia Química
2
Professor (a) da Faculdade de Engenharia Química da UFU/MG
1,2
Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. Av João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K, Campus Santa Mônica, Uberlândia - MG, CEP 38408-100)
e-mail: ucfilho@feq.ufu.br
RESUMO - O leite é uma importante matéria-prima utilizada na geração de alimentos, entre os quais os queijos. A fabricação de queijo gera soro de leite na forma de subproduto abundante que, muitas vezes, é descartado no ambiente gerando poluição. Esta pode ser reduzida pelo reaproveitamento do soro na geração de novos produtos. Entre aqueles de especial interesse estão as enzimas, que apresentam alto valor agregado no mercado mundial. Este trabalho avalia a produção enzimática por Aspergillus niger, em fermentação submersa no soro de leite. O fungo escolhido destaca-se por ser um dos poucos classificados como seguro (GRAS) e por produzir enzimas variadas. Durante as fermentações, foram avaliados o consumo de lactose e carboximetilcelulose, a formação de biomassa e a produção das enzimas β-galactosidase e celulase, por um período de oito dias. Os resultados obtidos mostram que A. niger cresce em soro de leite apresentando um tempo de fase lag de 3,7 horas, velocidade específica de crescimento celular de 0,102 h-1 e que são produzidas quantidades apreciáveis de enzimas, sendo 1113 U/L a máxima atividade enzimática de celulase e 2267 U/L a de β-galactosidase, para 46h de fermentação (U representa a geração de um micromol de lactose minuto nas condições reacionais ótimas).
Palavras-Chave: Aspergillus niger, β-galactosidase, soro de leite
INTRODUÇÃO
As indústrias de laticínios são responsáveis pelo processamento do leite e produzem os mais diversos derivados, dentre os quais o queijo. Nesse processo, entretanto, uma porção aquosa, conhecida como o soro de leite é também gerada como subproduto. Estima-se que a produção mundial de soro seja superior a 145 milhões de toneladas anuais, pois embora o rendimento da produção de queijo varie de acordo com a sua consistência, para cada quilo de queijo fabricado são produzidos de nove a doze litros de soro, com média de onze litros (Dumais et al, 1991; Richards et al, 1997; Güven et al, 2008).
O soro é reconhecido como um produto nobre, já que apresenta em sua composição lactose (44–52 g/L), proteínas (6–8 g/L) e minerais (4–9 g/L). Em face dessa rica composição nutricional permite, por um lado, uma série de aplicações na indústria alimentícia. Por outro lado, pode atuar como agente de poluição em cursos d’água devido a sua alta demanda bioquímica de oxigênio (DBO), capaz de comprometer a vida de seres bióticos neles presentes (Güven et al, 2008; Bonnet et al, 1999).
O estudo da produção de enzimas torna-se, então, uma proposta interessante para o aproveitamento desse subproduto que é gerado em quantidades maiores do que o mercado consegue utilizar na produção de alimentos, rações e outros derivados, pois as enzimas apresentam um alto valor de mercado, com uma vasta aplicação em indústrias farmacêuticas, alimentícias e em outros segmentos variados, como o de produção de detergentes. Anualmente o gasto mundial com enzimas é superior a US$ 2,5 bilhões de dólares e acredita-se que o mercado mundial de produção de enzimas terá um crescimento anual superior a 7.6%, sendo que em 2011 poderá atingir o valor correspondente a US$ 6 bilhões (Djick et al, 2003; Learly et al, 2009).
Entre as enzimas de interesse crescente consta a β-galactosidase, utilizada na produção de doces e de leite com baixo teor de lactose, e em fermentações de meios contendo lactose. O mercado de leites com baixo teor de lactose é significativo pelo fato de aproximadamente 70% da população mundial ser intolerante à lactose, e porque a hidrólise envolvida nesse processo ocasiona a melhora da qualidade de produtos
alimentares por evitar a cristalização da lactose e gerar características organolépticas desejáveis, como um sabor peculiar dentro da indústria de sorvete (Reed e Nagodawithana, 1993). Além da beta-galactosidase a fermentação do soro é capaz de gerar celulase que apresenta uso na produção de etanol de celulose, produção de papel e uso medicina (Couto , Sanroman ,2006).
Uma forma viável para a obtenção de enzimas consiste na fermentação com microrganismos capazes de catalisar a conversão de uma dada substância em um determinado produto. Nessas condições, a produção enzimática, quando comparada aos processos que utilizam subprodutos de origem vegetal e animal, é mais vantajosa por ser planejada de forma a evitar efeitos de sazonalidade de culturas, e ser mais versátil quanto à disponibilidade de matéria-prima. Entre os microrganismos de maior interesse para produção de enzimas constam os fungos. Do ponto de vista industrial, fungos são microorganismos especialmente valorizados, porque as enzimas por eles produzidas, normalmente, são extracelulares, o que facilita sua recuperação do meio de fermentação (Borzani et al, 1975; Baley e Ollis, 1986).
Entre os fungos em destaque para a produção de enzimas, Aspergillus níger, consiste em uma espécie de grande interesse comercial, que futuramente será um dos microrganismos mais utilizados na biotecnologia moderna (Andersen et al, 2008). Uma das razões para o notável interesse por Aspergillus niger pode ser explicada pela diversidade de reações por ele sintetizadas. Além disso, esse fungo tem a capacidade de produzir enzimas variadas e trata-se de uma das poucas espécies destrata-se reino classificadas como GRAS (Geralmente Reconhecido Como Seguro), pela Food and Drug Administration (FDA). Diante dessas características apresentadas, essa espécie é utilizada na produção de enzimas, sua massa celular é empregada como constituinte na alimentação animal e sua fermentação gera ácidos orgânicos, dentre outros compostos, de valor econômico interessante. A Tabela 1 apresenta a relação de algumas das enzimas produzidas por Aspergillus níger e suas respectivas aplicações. (Tzean et al, 1990; Couto e Sanroman, 2006; Shankar e Mulimania, 2007; Bailey e Ollis, 1986).
Tabela 1 – Enzimas de interesse comercial produzidas por Aspergillus niger
Tipo de enzima Aplicações
amilase indústrias de alimentos, têxtil, produção de papel e etanol
celulase produção de etanol e papel β-galactosidase produção de leite
deslacto-sado e etanol
α-galactosidase produção de rações, de papel e celulose e alimentos (gomas)
invertase produção de alimentos: confeitos e doces
naringinase indústria de alimentos: sucos pectinase produção de alimentos:
sucos
xilanase produção de papel
Diante das possíveis aplicações e da notória importância das enzimas β-galactosidase e celulase, este trabalho tem por objetivo avaliar o potencial de produção dessas enzimas por meio de fermentações submersas de Aspergillus níger, utilizando como substrato o soro de leite sem complementação de nutrientes.
MATERIAIS E MÉTODOS
Microrganismos
Foi utilizada a cepa ATCC 16404 de Aspergillus níger, escolhida dentre quatro cepas testadas em ensaios preliminares nos laboratórios de Engenharia Bioquímica da Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia. No decorrer dos ensaios, a cepa foi renovada por cultivo a cada 15 dias em agar batata glicose (PDA) e conservadas sob refrigeração.
Fermentações em estado líquido
Para o preparo do inóculo, foi utilizado como meio de cultura uma solução de batata 10g/L com glicose 20g/L, colocada em erlenmeyers tamponados com algodão envolto em gase e autoclavados a 121°C e 1,0 atm, durante vinte minutos. No preparo do inóculo o meio de cultura foi misturado a tubos de agar batata glicose e submetidos a fermentação em erlenmeyers para que pudessem ser utilizados como inóculo após 48h de fermentação.
Nas fermentações o inóculo foi transferido para erlenmeyers de 500 mL contendo soluções de soro de leite 60g/L na proporção volumétrica de um volume de inóculo com concentração celular aproximada de 108 células/mL para dez volumes de meio. A fermentações líquidas foram realizadas em erlenmeyers submetidos a movimento orbital, sob rotação de 120 rpm, com amostras de concentrações de 0, 10 e 20 g/L de carbonato de cálcio.
Concentração celular e crescimento celular
A concentração celular foi avaliada em termos de massa celular por volume de meio. Para tal, foi necessária a determinação da massa seca, obtida por centrifugação de um volume de meio fermentado correspondente a 10mL, sob uma rotação de 3000 rpm, seguido-se a secagem em estufa a 105oC até a obtenção de massa constante.
O crescimento celular foi obtido pelo ajuste dos pontos, que representam as concentrações celulares em diferentes tempos de fermentação, ao modelo logístico (Equação 1) feito no software Scilab 5.0.1 pelo método de Levenberg-Marquardt (Bates e Watts, 1999)
(1)
(2)
(3)
Nestas equações A, D e B são parâmetros do modelo logístico, tL representa o
tempo da fase lag, µM a máxima velocidade
específica de crescimento celular, X representa a concentração (g/L) e X0 a concentração inicial.
Atividades Enzimáticas
A concentração das enzimas presentes no meio de cultura foi determinada pelo método das taxas iniciais de reação. Nesse método, reali-zou-se a medição da velocidade de formação de açúcar redutor (AR), expressa em unidades/mL, sendo a unidade (U) definida como a conversão de um micromol de produto por minuto. As veloci-dades iniciais foram determinadas pela utilização de soluções de lactose e carboximetilcelulose, preparadas na concentração de 1g/100mL, e a formação de AR foi avaliada pelo método espec-trofotométrico do ácido dinitrossalicílico (DNS) (Miller, 1959). Neste método 1 mL de extrato en-zimático, separado das células por centrifugação a 3000 rpm, era misturado a 15 mL de solução padrão de substrato em pH 7,0 e a formação de açúcar redutor nos tempos de 5, 10 e 15 minutos era quantificada pela medida da absorbância. A atividade enzimática era, então, calculada como sendo a derivada que expressa como a concen-tração de açúcar redutor varia em função do tem-po.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
A Figura 01 mostra o ajuste deste cresci-mento na ausência de carbonato de cálcio com o respectivo ajuste ao modelo logístico que
apre-sentou os parâmetros tempo de fase lag de 3,7 horas e velocidade específica máxima de cresci-mento de 0,102 h-1. O pequeno valor do tempo da fase lag sugere que fungo se encontra bem adap-tado ao crescimento no leite sem o acréscimo de nutrientes adicionais. O valor da velocidade es-pecífica de crescimento encontrada corresponde a valores usais observados por vários outros au-tores. Conforme pode ser observado, o modelo representa bem os dados experimentais. Os re-sultados obtidos mostram que o modelo logístico ajustado representa o crescimento celular do A. niger em soro de leite de forma satisfatória.
Figura 01 – Ajuste do crescimento celu-lar ao modelo logístico
A Figura 02 mostra o crescimento do fungo em soro de leite contento carbonato de cálcio nas concentrações de 0, 10 e 20 g/L. É possível ob-servar que o aumento na concentração desse sal contribui para o crescimento do fungo, sendo que na faixa de concentração utilizada, maiores con-centrações de carbonato favorecem um maior crescimento celular.
Figura 02 – Concentrações celulares para dife-rentes tempos de fermentação
As Figuras 03 e 04 mostram as atividades enzi-máticas para as enzimas β-galactosidase e celu-lase, respectivamente, em diferentes tempos de
fermentação. É possível observar que o soro de leite, por meio de reações fermentativas, é um meio propício para a produção de celulase e lac-tase, pois para todos os tempos de fermentação essas enzimas foram geradas. Pode ser observa-do, também, que para ambas as enzimas a maior atividade enzimática obtida corresponde a tem-pos de fermentação de aproximadamente 40 ho-ras.
A comparação entre as Figuras 02, 03 e 04 mos-tra que embora a maior concenmos-tração de carbo-nato seja a que mais favoreceu o crescimento celular, tem-se que a maior concentração de car-bonato gera redução na produção das enzimas de interesse. A comparação entre os valores ob-tidos e da literatura mostram que as atividades geradas foram coerentes: YANG e colaboradores (2003) trabalhando com um consórcio de micror-ganismos melhorados geneticamente em condi-ções otimizadas obtiveram como máxima ativida-de em celulase ativida-de 4 U/g e o presente trabalho foi obtido 1,2 U/g, Santiago e colaboradores (2004) obtiveram 10 U/mL para β-galactosidase e o
pre-sente trabalho 2,5 U/mL.
Figura 03 – Atividades da enzima β-galacto-sidase obtidas para diferentes tempos de fer-mentação
Figura 04 - Atividades da enzima celulase ob-tidas para diferentes tempos de fermentação
CONCLUSÕES
O uso do soro de leite para fermentação por Aspergillus niger sem complementação de nutrientes é satisfatório para a produção das en-zimas celulase e lactase. Porém, o acréscimo de carbonato de cálcio, que propicia um meio com um pH mais estável, promove melhorias no pro-cesso tanto em termos de crescimento celular, quanto em termos de atividade enzimática. A concentração de carbonato de cálcio associada a maior produção enzimática é inferior a que favo-rece o maior crescimento celular.
NOMENCLATURA
X0 concentração celular inicial (g/L)X concentração celular (g/L) t tempo de fermentação (h) A parâmetro do modelo logístico B parâmetro do modelo logístico D parâmetro do modelo logístico tL tempo da fase lag
µM velocidade específica de crescimento celular
(h-1)
U unidade internacional de atividade enzimática (µmol/min)
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