Estudo de alterações comportamentais em ratas Wistar
prenhes, induzidas pelo fipronil com avaliação da
neuroproteção pelo alfa-tocoferol (vitamina E).
Bianca Campos Cezar¹, Wilson Roberto Malfará
1*1
Centro Universitário Barão de Mauá
1bicamposcezar@gmail.com, 1*wilson.malfara@baraodemaua.br
Resumo
Fipronil é um inseticida de amplo-espectro de ação, muito utilizado em campos agrícolas do Estado de São Paulo, bem como nas residências, para combater insetos pragas. O atual trabalho teve como objetivo avaliar as alterações comportamentais em ratas prenhes Wistar induzidas com o fipronil, observando provável neuroproteção com a administração da vitamina E. Foi utilizado para tal o teste de habituação em arena de campo aberto para avaliação da atividade
motora e o teste de reconhecimento espontâneo de objetos para avaliação de atividade cognitiva. De acordo com resultados obtidos observou-se apenas uma diferença estatisticamente relevante entre o grupo controle e o grupo fipronil na observação de avaliação de atividade motora e nas observações com a atividade cognitiva nenhuma diferença estatisticamente relevante foi observada, induzindo a necessidade de estudos complementares utilizando animais machos com doses diferenciadas em esquemas terapêuticos distintos, para uma melhor elucidação dos achados.
Introdução
Nos últimos anos houve um crescente aumento na utilização de inseticidas nas áreas produtivas e mais fortemente nos ramos agropecuários pelos efeitos positivos que tem gerado sobre o controle de pragas, otimizando o rendimento e qualidade promovida pelos setores que os utilizam. Por isso, há muitas preocupações, sobre os riscos, principalmente quando utilizado em quantidades não recomendadas.
O Brasil é um dos maiores produtores e exportadores de produtos agrícolas e, consequentemente, um dos maiores consumidores de pesticidas do mundo. O fipronil é um inseticida extensivamente utilizado em uma variedade de infestações, tais como baratas, mosquitos, cupins, formigas, gafanhotos, além de pulgas, piolhos e carrapatos de cães, gatos e bovinos (CHANTON et al., 2001; AAJOUD et al., 2003; PAIM et al., 2010). Seu mecanismo de ação é baseado no bloqueio não competitivo dos canais de cloro ligados aos receptores do ácido gama-aminobutírico (GABA), levando os insetos à morte por hiperexcitação neuronal e paralisia (ZHAO, 2004). Apesar de ser amplamente utilizado, muito se fala sobre a segurança da utilização deste produto, alguns estudos demonstraram que o
fipronil exerce efeito tóxico às células do fígado de ratos (TAVARES et al.,2015; GUELFI et al., 2015). Além dos efeitos tóxicos para o fígado o fipronil também tem apresentado efeitos sobre a reprodução, sendo que estudos demonstram que o uso do fipronil afeta o sistema reprodutor em ratas (TINGLE et al., 2003; OHI et al.,2004; COX, 2005). Baseado no fato de que as crianças são geralmente mais sensíveis que os adultos aos efeitos neurotóxicos e comportamentais (POHL et al., 1998; COSTA et al., 2004), a reversibilidade dos efeitos neurotóxicos nos adultos deve ser avaliada com critério, mesmo na ausência sinais clínicos neurológicos evidentes (KIMMEL, 1998).
Figura 1- Estrutura química do Fipronil
Objetivos
Estudar as alterações comportamentais e cognitivas induzidas pelo fipronil com a possível proteção da vitamina E, em ratas prenhes.
Materiais e Métodos
Os animais foram distribuídos em 4 grupos com 8 animais cada grupo:
GC (Controle): recebeu óleo de milho por
gavagem gástrica e uma mistura de dimetilsulfóxido (DMSO) e solução salina (NaCl 0,9%) (1,5:1) via intraperitoneal;
GF (Grupo Fipronil): recebeu solução de fipronil
na dosagem de 5 mg/kg de peso vivo (1/20 da DL50) dissolvido em DMSO mais salina via intraperitoneal;
GT (Grupo Vitamina E): recebeu vitamina E
dissolvida em óleo de milho na dosagem de 100 mg/kg de peso vivo por gavagem gástrica.
GFT (Grupo Fipronil + Vitamina E): recebeu
solução de fipronil na dosagem de 5 mg/kg de peso vivo (1/20 da DL50) dissolvido em DMSO mais salina via intraperitoneal e vitamina E dissolvida em óleo de milho na dosagem de 100 mg/kg de peso vivo por gavagem gástrica. Tanto o grupo controle quanto os tratados receberam os fármacos por 21 dias, onde no 7º dia de tratamento os animais serão submetidos aos dois testes de avaliação comportamental escolhidos, sendo o primeiro teste o de habituação em arena de campo aberto (open-field test) para avaliação da atividade motora. Os animais foram colocados no centro da arena e foram avaliados durante 3 minutos, os seguintes parâmetros: frequência de ambulação (número de unidades pintadas no assoalho onde o animal coloca as quatro patas), frequência de levantar (apoiar-se sobre as patas traseiras com as dianteiras levantadas, apoiadas ou não na parede lateral), congelamento (tempo total de imobilidade sobre as quatro patas, sempre com os olhos abertos e dilatados e respiração irregular, após ter permanecido imóvel por pelo menos um segundo) e limpeza (tempo total utilizado para se limpar – os seguintes comportamentos são entendidos como limpeza: agitar as patas dianteiras, lamber ou limpar as patas, corpo, genital, focinho ou cabeça, agitar a cabeça).
Além deste foi realizado o teste de reconhecimento espontâneo de objetos para avaliação cognitiva. Como pré-testagem, os animais foram submetidos a 2 sessões de habituação ao aparato do teste, com duração de 3 minutos cada e sem objetos, 24 horas antes do teste. Na sessão de treinamento, 2 objetos idênticos (A1 e A2) foram colocados nos cantos opostos da arena, separados por espaço suficiente para exploração de todas as suas faces. Os ratos foram colocados na região mediana da
arena, de costas para os objetos e pode explorá-los livremente durante 3 minutos. A exploração é definida como dirigir o nariz a uma distância igual ou menor a 2 cm do objeto, ou tocá-lo com o nariz. Após 2 minutos, na sessão de teste, os objetos da arena foram trocados por um idêntico aos anteriores, que foi chamado de A3 e por um objeto novo chamado B, colocados nas mesmas posições da sessão de treino. Após intervalo de tempo pré-determinado (1 minuto a 24 horas), o rato foi novamente colocado na arena de testagem por 3 minutos de forma a explorar a nova dupla de objetos (A3 e B1), sessão de reteste.
A exploração global dos objetos é a soma dos tempos de exploração de A1+A2 na sessão de treino e de B+A3 no teste. A habituação é aferida pela diferença da exploração entre a sessão de treino e o teste ([A1+A2]-[B+A3]). A simples medida de reconhecimento ou discriminação é a diferença entre o tempo gasto na exploração do novo estímulo (B) e o tempo gasto na exploração do estímulo familiar (A3), ou seja, B-A3. Entretanto, para minimizar influência dos níveis totais de exploração, é mais preciso utilizar a diferença no tempo de exploração dividida pelo tempo de exploração total: B-A3/B+A3.
Tabela 1 - Cálculos referentes a exploração
As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa GraphPad Prism versão 5.0 Os valores foram expressos em medianas (Q1-Q3) e limites inferior e superior. Para comparação de resultados entre os grupos controles e experimentais, foram aplicados testes estatísticos para análise de variância (ANOVA) com o teste “a posteriori” de Kruskal-Wallis, com o “A posteriori” teste de Dunn’s. Diferenças foram consideradas significantes quando p <0,05.
O trabalho foi aprovado pelo Cepan sob número de protocolo 336/18. Explora ção Habituação Discriminação Treino (A1 e A2) E1=A1+ A2 E1-E2 B-A3 ou B-A3/B+A3. Teste ou reteste (A3 e B1) E2=A3+ B1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Controle Fipronil Vit. E Vit.E+Fipronil Tempo de Congelamento(segundos) Gr u p o s 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Controle Fipronil Vit. E Vit.E+Fipronil *
Tempo de limpeza (segundos)
Gr u p o s 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Controle Fipronil Vit. E Vit.E+Fipronil Unidades do assoalho Gr u p o s Resultados/Discussão
Figura 1 – Gráficos de avaliação da atividade motora: A (frequência de ambulação), B (frequência de levantar), C (tempo de congelamento) e D (tempo de limpeza)
A B
C D
p< 0,05 em relação ao grupo controle
Para avaliação comportamental escolheu-se o teste de habituação em arena de campo aberto (open-field test) como também como avaliador da atividade motora, animais foram colocados no centro da arena e foram avaliados durante 3 minutos os seguintes parâmetros: frequência de
ambulação (número de unidades pintadas no
assoalho onde o animal coloca as quatro patas),
frequência de levantar (apoiar-se sobre as patas
traseiras com as dianteiras levantadas, apoiadas ou não na parede lateral), congelamento (tempo total de imobilidade sobre as quatro patas, sempre com os olhos abertos e dilatados e respiração irregular, após ter permanecido imóvel por pelo menos um segundo) e limpeza (tempo total utilizado para se limpar – os seguintes comportamentos são entendidos como limpeza: agitar as patas dianteiras, lamber ou limpar as patas, corpo, genital, focinho ou cabeça, agitar a cabeça). O teste de campo aberto é considerado como um indicador do estado emocional do animal
(ARCHER, 1973) e é comumente utilizado para triagem farmacológica de drogas que atuam sobre o sistema nervoso central (EIDMAN et al., 1990). Neste teste, os comportamentos de locomoção e de levantar são considerados, respectivamente, como medidas das atividades locomotora e exploratória, enquanto que os de limpeza e de congelamento são positivamente correlacionados com medo ou emocionalidade (BARROS et al., 1994; BHATTACHARYA, 1994). Verificou-se que em relação FA (frequência de ambulação) (figura 1A) a mediana entre o grupo controle e tratados não apresentou diferença estatisticamente significativa, porém, quando se observa os valores mínimos e máximos com os grupos com fipronil e vitamina E, há diferenças que sugerem que os animais que receberam o fipronil o qual variou de 18 a 35 unidades pintadas na gaiola. O mesmo ocorreu com o FL (frequência de levantar) (figura 1B) tendo uma mediana sem diferença estatística considerável entre controle e tratados, porém, com
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Controle Fipronil Vit. E Vit.E+Fipronil Frequência de levantar Gr u p o s
Controle Fipronil Vit. E Vit.E+Fipronil 0 5 10 15 20 25 Grupos Te m p o (s e g u n d o s )
Controle Fipronil Vit. E Vit.E+Fipronil 0 5 10 15 20 Grupos Te m p o (s e g u n d o s )
Controle Fipronil Vit. E Vit.E+Fipronil
-20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 Grupos Te m p o (s e g u n d o s )
Controle Fipronil Vit. E Vit.E+Fipronil -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 Grupos Te m p o (s e g u n d o s )
diferenças nos valores mínimos e máximos não consideráveis. No número de ocorrências de
congelamento o grupo controle teve uma
mediana superior em relação aos grupos tratados, porém, sem relevância estatística. Nesse parâmetro os valores mínimos e máximos oscilaram bastante, principalmente com o grupo que recebeu fipronil (figura 1C). Em relação ao número de limpeza (figura 1D), as medianas de ocorrências do grupo controle e do grupo vitamina E foram menores em relação ao grupo fipronil, porém, sem relevância estatística. A relevância estatística observada ocorreu entre o grupo controle em relação ao grupo tratado com fipronil
com medianas de 3,125 minutos e 22,25 minutos, respectivamente. Segundo os dados obtidos no presente estudo com relação a avaliação da atividade motora, os resultados são díspares aos observados por MAZZO, 2017, que evidenciou uma proteção considerável da vitamina E em espermatozoides em ratos machos. Talvez por se tratar de ratas prenhes a questão ligada ao gênero e ao contexto hormonal tenha desempenhado alterações endógenas que contribuíram com as diferenças observadas, além da dose empregada, e do tempo de exposição das substâncias (fipronil e vitamina E).
Figura 2 – Gráficos de avaliação da atividade cognitiva: A (tempo de exploração treino), B (tempo de exploração teste), C (habituação) e D (discriminação)
A B
C D
Com relação a atividade cognitiva (figura 2 A, B, C e D), não observou-se diferenças estatisticamente em nenhuma das avaliações no tempo de
exploração dos objetos, habituação e discriminação dos mesmos.
Conclusões
Pelos resultados obtidos não foi possível inferir que a vitamina E ofereceu neuroproteção, frente a exposição de ratas prenhes ao fipronil, nas doses empregadas de ambas as substâncias e nos esquemas terapêuticos propostos, fato que se contrapõe a trabalhos na literatura que evidenciaram um efeito anti-oxidante importante,
fato que talvez seja explicado por se tratar de trabalhos executados com animais do gênero masculino, onde acredita-se que o componente hormonal tenha destaque nas referidas observações feitas com as ratas prenhes. Embora as diferenças observadas não tenham sido estatisticamente significativas as observações não descaracterizam uma possibilidade de alteração neuropsicobiológica induzida pelo fipronil e uma
provável neuroproteção induzida pelo uso da vitamina E. Para averiguação de tal hipótese propõe-se estudos complementares com doses diferenciadas de ambas as substâncias e emprego de animais machos, que possam ilustrar e elucidar numericamente e com comprovação estatística as observações ora observadas.
Referências
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