1.
Lípidos
– Insoluvéis em água e solúveis em solúveis em solventes apolares;
– Funções biológicas: estruturas membranares, reserva energética, mensageiros (hormonas); – Classificação:
• Apolares (gicerideos ceras esteroides); • polares (acidos gordos lipidos complexos); • especiais ( terpenos prostangladinas)
– Éstere de ácidos gordos -ácido esterifica um álcool – glicerol – Amidas de ácidos gordos - Ácidos ligam-se a uma amina alcoólica
a) Glicerídeos
Ésteres de ácidos gordos, saturados ou (possuírem uma ou mais duplas ligações) insaturados.Os ácidos gordos são insolúveis na água porque a molécula é formada por CH2-, (composto hidrofóbico), sendo somente o radical carboxílico hidrofílico.
O glicerol é um tri-álcool com três carbonos. É solúvel na água e insolúvel ou pouco solúvel nos solventes orgânicos.
Os glicerofosfolípidos (vulgarmente referidos como fosfolípidos) são igualmente ésteres do glicerol.
Hidratos de Carbono
– constituidos por grupo OH ( permite fortes interacções com agua, grupos funcionais e intra/inter moleculares)
– funções: metabolismo energetico, reservas, estrutural, reconhecimento celular); – monossacarídeos (açucar simples)(ribose-pentoses-5Carbonos, glucose-hexoses-6C):
pequenas moléculas que contêm tipicamente de 3 a 9 carbonos e variam no tamanho e na configuração estereoquímica ao redor de 1 ou + carbonos, sao a molecula que serve de base aos HC;
– oligossacarídeos():conjunto de monossacarídeos, de 1 a 9 ligações.aparecem ligados a outras biomoléculas, como os lípidos e proteínas;
– polissacarídeos(celulose, glicogenio):10 ou + ligações entre monossacarídeos;
Ácidos nucleicos
Os ácidos nucleicos encontram-se em todas as células vivas. Forma descobertos por Friedrich Miescher em 1871.
DNA – ácido desoxirribonucleico (a pentose é uma desoxirribose) RNA – ácido ribonucleico (a petose é uma ribose)
São polímeros de nucleótidos ligados entre si através de uma ligação fosfodiéster (A ligação é feita entre o grupo químico hidroxilo (OH) ligado ao carbono 3’ da pentose de um nucleótido e o grupo fosfato do nucleótido seguinte ligado ao carbono 5’. Ocorre na direcção 5’ ->3’)
Nucleótido:
- pentose (açúcar com 5 átomos de carbono) - grupo fosfato
- base nitrogenada ou azotada
. bases púricas (um anel duplo): adenina e guanina - complementaridade de bases (T-A e C-G)
Funções dos nucleótidos:
- armazenamento e transmissão da informação genética - transporte de energia (ATP)
- constituição de co-enzimas (o nucleótido adenina faz parte da estrutura de muitas co-enzimas; se retirarmos a porção adenina resulta numa diminuição drástica da actividade da co-enzima)
- mensageiros químicos (actuam na resposta das células a hormonas ou outros estímulos extracelulares)
Tipos de RNA:
- rRNA (RNA ribossómico)- componente dos ribossomas, onde ocorre a síntese de proteínas - mRNA (RNA mensageiro)- transportam a informação genética para codificar uma proteína para o ribossoma, onde esta pode ser sintetizada. O processo de formação do mRNA através e uma porção de DNA que lhe serve de molde denomina-se transcrição. Com o processamento, são retirados os intrões e o mRNA fica funcional. No citoplasma ocorre a tradução : transformação da mensagem contida no mRNA numa sequência de aminoácidos que constituem uma cadeia polipeptídica.
- tRNA (RNA de transporte ou transferência)- traduzem a informação contida no mRNA numa sequência específica de aminoácidos
Estrutura do DNA:
Cadeia dupla anti-paralela com forma helicoidal (As bases estão ligadas entre si por pontes de hidrogénio de acordo com a regra da complementaridade de bases)
Estrutura do RNA:
Cadeia simples cuja forma pode variar
PROTEÍNAS
Funções das proteínas:
– Estruturais (ex: colagénio) – fornecem apoio mecânico; – Enzimáticas (ex. hexocinase sacarase);
– Hormonais (ex: insulina) – controlam o crescimento e a diferenciação; – Anti-corpos (ex: IgG) – protecção imunitária;
– Balanço dos fluidos;
– Balanço do ácido-base (ex: hemoglobina); – Servem de canais (ex: receptores);
– Transportam e armazenam outras moléculas (ex: hemoglobina transferrina).
Propriedades das proteínas:
As proteínas são polímeros lineares feitos de monómeros denominados aminoácidos; As proteínas contêm uma ampla faixa de grupos funcionais (alcoóis, tióis, tioéteres, ácidos carboxílicos, carboxamidas e vários grupos básicos);
As proteínas podem interagir uma com a outra, e com outras macromoléculas biológicas, formando montagens complexas;
Algumas proteínas são bem rígidas, enquanto outras apresentam uma considerável flexibilidade.
As proteínas são polímeros lineares de aminoácidos. Cada um destes é constituído por 1 átomo de carbono tetraédrico central ligado a um grupo amina, um grupo carboxilo, um radical (cadeia lateral diferenciada) e um átomo de hidrogénio. Todas as proteínas naturais são construídas a partir do mesmo
conjunto de 20 aminoácidos. As cadeias laterais destes 20 blocos de construção variam em tamanho e forma, e na presença de grupos funcionais.
Estrutura primária: sequência de aminoácidos. Os aminoácidos de um peptídeo são unidos por ligações amida formadas entre o grupo carboxilo de um aminoácido e o grupo amina do seguinte. Esta união é chamada de ligação peptídica.
Estrutura secundária: conformação adoptada por regiões locais de uma cadeia peptídica. Dois elementos importantes da estrutura secundária são a hélice alfa e a fita beta. Na hélice, a cadeia peptídica retorce-se, formando um bastão firmemente compacto. Dentro da hélice, o grupo carboxilo de cada aminoácido forma pontes de hidrogénio com o grupo amina a quatro monómeros adiante na cadeia peptídica. Na fita beta, a cadeia é quase totalmente distendida. Duas ou mais fitas B ligadas por pontes de hidrogénio do grupo amina para o carboxilo reúnem-se formando folhas beta.
Estrutura terciária: descreve o enovelamento global da cadeia. Estrutura compacta e assimétrica assumida por cadeias peptídicas individuais.
Estrutura quaternária: refere-se à associação específica de várias cadeias peptídicas formando complexos com múltiplas subunidades. A estrutura quaternária pode ser bem simples, com duas subunidades
idênticas, ou bem complexa, com dúzias de subunidades diferentes. Na maioria dos casos as subunidades são mantidas juntas por interacções não covalentes.
Estrutura dos aminoácidos: Os aminoácidos são substâncias anfotéricas, ou seja, ora reagem como bases ora reagem como ácidos. A sua carga depende do pH do meio em que se encontrem.
Tipos diferentes de representação de proteínas:
Modelos compactos: Todos os átomos são mostrados, com excepção dos de hidrogénio. Estes são frequentemente omitidos porque as suas posições não são facilmente determinadas por métodos de cristalografia com raios X e porque a sua omissão melhora um pouco a clareza da representação da estrutura. É o tipo mais realista de representação. É um modelo útil para mostrar mudanças de conformação. Tem como desvantagens o facto das estruturas secundárias e terciárias serem difíceis de serem vistas e não é eficaz para distinguir uma proteína de outra.
Modelos em esferas e bastões: O arranjo das ligações é mais fácil de ser visto. Há maior clareza do que no modelo anteriormente referido. As hélices alfa ou os locais potenciais de ligação são difíceis de serem notados. Tanto este modelo como o anterior mostram estruturas de proteínas ao nível de átomos.
Modelos esqueléticos: Mostram apenas os átomos do arcabouço de uma cadeia peptídica, ou até mesmo apenas o carbono alfa de cada aminoácido. Mostra o trajecto global de uma cadeia
peptídica muito melhor do que os anteriores modelos. Os elementos da estrutura secundária ainda são difíceis de serem vistos.
Diagramas em fita: Modelos mais esquemáticos. Destaca-se bem a hélice alfa, a fita beta e alças, proporcionando visões claras dos padrões de enovelamento das proteínas. Acompanha o percurso de uma cadeia peptídica e mostra muito bem a estrutura secundária. As proteínas aparentadas evolutivamente são semelhantes, enquanto as proteínas não aparentadas evolutivamente são claramente distintas. O espaço aberto é uma ilusão, as proteínas são muito compactas e têm pouco espaço livre.
2.
Cromatografia
A coluna de Cromatografia é um dos métodos mais comuns de purificação de proteínas.
Esta técnica consiste na passagem da proteína através de uma coluna (fase estacionária) que é desenhada para reter ou diminuir a velocidade da passagem da fase móvel onde estão as macromoléculas (proteínas) e a técnica baseia-se numa propriedade particular, como o tamanho, carga ou afinidade química. A solução a analisar deve conter a proteína concentrada e o método deve ser rápido para evitar a degradação da mesma, devendo no entanto, utilizar-se inibidores de proteases.
Dependendo da escolha da coluna, as proteínas podem ser separadas de acordo com a sua carga (IEX – cromatografia de troca iónica), sua hidrofobicidade (HIC – cromatografia de interacção hidrofóbica), seu tamanho (GF – filtração em gel) ou pela sua capacidade de se ligar a grupos químicos particulares.
IEX – Cromatografia de troca Iónica
Baseia-se na carga da proteína que estamos a tentar isolar. Se esta possuir carga positiva, a solução deve passar por uma coluna com carga negativa (impedindo a passagem das proteínas com carga positiva).
Depois de fazer passar a solução pela coluna recorre-se ao procedimento “salting out” para separar a proteína, com carga positiva, da coluna com carga negativa (este tipo de coluna é denominado “coluna de troca de catiões” e possui iões de sulfato, imobilizados na fase estacionário).
Para impedir a passagem de uma proteína com carga negativa utiliza-se uma coluna de carga positiva designada por “coluna de troca de aniões” que, geralmente, possui iões de amónio.
HIC – Cromatografia de Interacção hidrofóbica
O HIC baseia-se nas propriedades hidrofóbicas de algumas proteínas.
As proteínas devem ser colocadas na presença de elevada concentração de sulfato de amónio, o qual aumenta a entropia da água, aumentando, assim, as interacções hidrofóbicas. Este também estabiliza as proteínas.
As porções hidrofóbicas da coluna são colocadas com uma matriz de agarose de fenil. Na presença de elevadas concentrações de sal, os grupos de fenil da matriz impedem a passagem de porções das proteínas hidrofóbicas. Pode-se controlar a separação de diferentes ligações à coluna das proteínas, reduzindo a concentração do sal ou adicionando solventes.
GF – Cromatografia de filtração em gel
A cromatografia de filtração em gel separa as proteínas com base no seu tamanho. A coluna é constituída por uma matriz de pequenas esferas porosas empacotadas.
Ao fazer passar a solução de proteínas pela matriz da coluna, as moléculas pequenas entram nos poros das esferas demorando a
atravessá-los, enquanto que as grandes passam entre as esferas sendo separadas primeiro.
Outro tipo de coluna é o AC (Cromatografia de Afinidade), que é um procedimento mais eficiente que os outros, acima citados.
AC – Cromatografia de Afinidade
A cromatografia de afinidade baseia-se nas funções biológicas da proteína que se liga à coluna.
O tipo mais comum envolve um ligando (pequena biomolécula específica por exemplo anticorpo), que é imobilizado e ligado a uma matriz da coluna, como a celulose ou poliacrilamida.
A proteína a analisar passa depois através da coluna e liga-se a ela pelo seu ligando, enquanto que outras proteínas serão libertadas. A separação da proteína alvo é normalmente feita, passando através da coluna uma solução que contenha uma elevada concentração de ligando livre.
Isto é um método muito eficiente de purificação, uma vez que se baseia numa especificidade biológica da proteína que se pretende analisar, tal como a afinidade de uma enzima a um substrato ou a ligação entre antigénio e anticorpo.
Contudo, apesar das inúmeras vantagens que a cromatografia convencional oferece, esta está limitada pela não homogeneidade nas matrizes (como celulose), que causa uma desigual fluidez do solvente através da coluna. Com o objectivo de colmatar esta falha foi desenvolvida uma nova cromatografia, o HPLC (High Performance Liquid Cromatography). Para além disso também permite que as proteínas sejam separadas mais rapidamente do que pelos métodos convencionais e separar moléculas com estruturas e tamanhos muito semelhantes.
Electroforese
A electroforese é uma técnica de separação de moléculas que consiste na migração de moléculas com carga, numa solução, em função da aplicação de um campo eléctrico.
A velocidade da migração depende da força do campo aplicado, da carga, do tamanho e da forma das moléculas e também da força iónica, viscosidade e temperatura do meio, onde estas se movem. De um modo geral, no transporte electroforético, à força do campo opõe-se a resistência do meio, produzindo, quando se igualam, uma velocidade constante das partículas.
É uma técnica que pode ser usada para análise de proteínas. As proteínas são moléculas anfotéricas, cuja carga é determinada pelo pH do meio onde estão suspensas. Numa solução com pH acima do ponto isoeléctrico, a proteína negativamente carregada migra para o ânodo do campo eléctrico. Abaixo do ponto isoeléctrico, a proteína é positivamente carregada e migra para o cátodo. Há diversos tipos de electroforese como:
Electroforese livre (frente móvel) Electroforese de zona
Electroforese em papel
Electroforese em acetato de celulose Electroforese em gel (SDS-PAGE) Focagem isoeléctrica
Dentro desta variedade centraremos a nossa atenção no SDS-PAGE.
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polycrylamide Gel Electrophoresis Laemmli, 1970)
O objectivo do SDS é desnaturar a proteína, isto é, converter a proteína numa estrutura linear (a sua forma nativa é, geralmente, globular) e conferir-lhe densidade de carga uniforme, de forma a poderem ser separadas por electroforese, somente, em função do tamanho (massa molecular). O SDS tem uma alta carga negativa e pH 7 e tem uma cauda hidrofóbica que interactua com as cadeias das proteínas (polipeptídeos). O número de moléculas de SDS que se ligam às proteínas é proporcional ao número de aminoácidos que constituem as mesmas, pois liga-se na razão de uma molécula por ligação peptídica.
Se as proteínas desnaturadas são postas num campo eléctrico, todas elas se moverão para o pólo positivo, na mesma proporção, sem possibilidade de avaliar a distância migrada. Então, é necessário colocá-las num ambiente que permita que proteínas de variados tamanhos se desloquem a velocidades diferentes, sendo o meio adequado o gel de poliacrilamida (polímero de monómeros de acrilamida).
De seguida, aplica-se uma corrente eléctrica e, como tal, as moléculas movem-se ao longo do gel de poliacrilamida (a todo este processo chama-se Electroforese em Gel de Poliacrilamida), migrando mais rapidamente as de menores dimensões.
Após as proteínas terem “corrido” o gel, é preciso fixá-las, para evitar que difundam quando se procede à coloração do mesmo. O ácido acético a 25% em H2O é um bom fixador, além de que mantém as proteínas desnaturadas.
O gel é, tipicamente, corado com azul de Coomasie (a fixação e coloração podem ser preparadas na mesma solução, usando como solvente o metanol ou sais de prata) e depois descorado.
Focagem isoeléctrica
Esta técnica baseia-se nas diferenças dos pontos isoeléctricos das proteínas para as separar.
As proteínas possuem uma carga nativa que pode ser positiva, negativa ou nula dependendo do pH do meio e para cada proteína existe um valor de pH do meio para o qual a carga da mesma é 0 (pI, ponto isoeléctrico), que geralmente se situa entre 3 – 12.
Quando uma proteína é colocada num tubo estreito de gel de poliacrilamida no qual o gradiente de pH é estabelecido pela mistura de soluções tampão especiais e sujeita a um campo eléctrico irá inicialmente mover-se em direcção ao eléctrodo com carga oposta. Durante a migração através do gradiente de pH, a proteína irá captar ou perder protões. Enquanto a proteína migra a sua velocidade vai diminuindo até chegar ao ponto em que o valor de pH será igual ao seu pI. Neste ponto a proteína terá carga total neutra e como consequência deixa de migrar. Se a proteína se difundir para uma região fora do seu pI, irá adquirir carga e consequentemente move-se novamente para a posição onde é globalmente neutra. Pode ter grupos ionizados, mas globalmente é neutra.
Electroforese Bidimensional
Como as bandas proteicas tendem a sobrepor-se, os métodos unidimensionais de separação, como a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS), podem apenas separar um número relativamente pequeno de proteínas (geralmente menos de 50), a electroforese de um gel bidimensional, ao combinar dois processos de separação distintos, pode ser usado para separar mais de 1000 proteínas.
Numa primeira etapa as proteínas são separadas em função da sua carga nativa. As cadeias polipeptídicas são, então, separadas por um processo de focagem isoeléctrica.
Numa etapa posterior o gel de poliacrilamida com forma de cilindro que contém as proteínas separadas por focagem isoeléctrica é sujeito, novamente, a electroforese mas numa direcção em ângulo recto àquela usada na primeira etapa. O gel original é mergulhado em SDS e depois colocado numa extremidade de um “slab” de gel de poliacrilamida SDS, através do qual cada cadeia polipeptídica migra em função do seu tamanho observando-se no resultado final como um ponto “sptot”.
As únicas proteínas que não são separadas serão aquelas que terão idêntico tamanho e ponto isoeléctrico, uma situação relativamente rara. Até quantidades vestigiais de cada cadeia polipeptídica pode
ser detectada no gel por vários processos de coloração – ou por autorradiografia se a amostra da proteína tiver sido previamente marcada por um radioisótopo.
O poder de separação é tão grande que duas proteínas que diferem em apenas um aminoácido carregado podem ser prontamente distinguidas.
Western blotting
O western blotting permite detectar uma proteína numa mistura de proteínas dando também informação acerca do seu tamanho.
Inicialmente as proteínas são separadas por SDS-PAGE e, posteriormente, são transferidas para uma membrana de nitrocelulose (do mesmo modo que foram separadas no SDS-PAGE). O polo negativo – cátodo, fica do lado do gel e o positivo - ânodo no lado da membrana de nitrocelulose para conduzir as proteínas carregadas negativamente em direcção à membrana (carregada positivamente). A razão para a transferência das bandas de proteínas para uma membrana de nitrocelulose é permitir a chegada dos anticorpos às bandas com maior facilidade e eficácia, já que o gel de poliacrilamida não permite a difusão de grandes moléculas.
A membrana de nitrocelulose é incubada com o anticorpo primário que se liga à proteína que se pretende detectar, formando um complexo anticorpo-proteína. Seguidamente é-lhe adicionado o anticorpo secundário conjugado, anticorpo-enzima, que se vai ligar ao anticorpo primário. A enzima (ex. fosfatáse alcalina ou peroxidase) funciona como um sinalizador molecular que permite a visualização do local da proteína detectada. No entanto, para que a enzima seja visualizada é necessário colocá-la na presença de uma mistura reactiva específica. É adicionado um substrato cromogénico, que ao ser degradado pela enzima conjugada com o anticorpo dará origem a um precipitado insolúvel colocalizado com o anticorpo primário que por sua vez se ligou à proteína.
Podem também ser utilizados outros tipos de marcadores como os fluorescentes ou os radioisótopos (que podem ser detectados por técnicas de autorradiografia).
Salting Out
Esta técnica usa uma solução de elevada concentração de sal que compete com a proteína na ligação à coluna. Como esta tem maior afinidade para a carga dos sais do que para a das proteínas, estas acabam por ser libertadas, mantendo-se os sais ligados à coluna. As proteínas com fracas interacções iónicas serão libertadas com uma concentração baixa de sal. A adição de sal deverá ser feita de uma forma gradual e, no final, para ter a certeza que todas as proteínas foram libertadas da coluna, deve ser colocado nesta uma solução de concentração de sal de 2-3mol/L.
Para remover os sais da solução de proteínas deve ser feita uma diálise contra tampão.
As mudanças no pH alteram a carga das proteínas, por isso é necessário conhecer o seu ponto isoelétrico (pH a que a carga da proteína é 0) e certificar-se de que o pH do sistema está convenientemente ajustado e tamponado.
Apesar do proteoma não ser objectivo directo do trabalho, achamos importante e pertinente falar sobre este assunto que, de certa forma, está directa ou indirectamente relacionado com as técnicas de análise de proteínas1.É integrativo dos estudos de análise de proteínas
1 Os métodos experimentais utilizados no estudo do proteoma dividem-se, fundamentalmente, em duas etapas:
-isolamento e separação das proteínas a partir do material biológico (fraccionamento cromatográfico - filtração em gel, afinidade, imunoafinidade, etc - métodos electroforéticos - SDS-PAGE, focagem isoeléctrica, etc);
Proteoma
O proteoma reflecte o estado actual de funcionamento do sistema em condições fisiológicas específicas, ou seja, a expressão do genoma funcional. Esta característica faz com que o estudo do proteoma se torne um grande desafio.
O proteoma da célula é bastante dinâmico dependendo do seu estado de desenvolvimento, da presença de activadores ou inibidores e também das condições específicas do meio ambiente.
Embora a identificação de todas as proteínas codificadas no genoma de um organismo pareça uma tarefa bastante difícil de concretizar, mesmo em organismos muito simples, são cada vez mais as informações completas, através de estudos proteómicos, sobre vias de sinalização celular, conjuntos de proteínas reguladoras, modificações pós-tradução, bem como outras informações cruciais sobre os estados fisiológicos e fisiopatológicos de células e organismos.
O estudo em questão pode levar a três vertentes básicas com implicações directas em vários campos da biologia e da biotecnologia.
Primeiro, o estudo do proteoma permite a descoberta de vias metabólicas nas diversas etapas celulares, gerando um conhecimento sem precedentes na biologia celular e na bioquímica. Tal conhecimento torna possível a identificação de novos alvos farmacológicos específicos.
Segundo, esse mesmo estudo permite viabilizar a identificação de novas moléculas bioactivas em extractos biológicos naturais, levando ao desenvolvimento de novos medicamentos.
Terceiro, permite também a identificação e caracterização de marcadores biológicos, ou seja, moléculas endógenas ou exógenas específicas de um determinado estado patológico. A capacidade de identificar essas moléculas é extremamente útil no diagnóstico precoce de doenças e no acompanhamento da evolução do tratamento.
O estudo do proteoma também tem largas aplicações na medicina, principalmente na caracterização de cancros e em doenças neurológicas (como a doença de Alzheimer), infecciosas ou cardíacas.
3.
O estudo de proteínas é muitas vezes utilizado como auxiliar de diagnóstico na prática clínica. Frequentemente, o profissional de saúde requer a realização de análises sanguíneas com o intuito de prescrever tratamento ao paciente, tendo em conta o desfasamento verificado entre valores normais e valores amostrais de determinados parâmetros. Neste caso, a avaliação de proteínas pode ser considerada quantitativa, uma vez que se baseia no número de biomoléculas da amostra: se, por um lado, há um défice de proteínas, classificamos como hipoproteinémia; se, por outro lado, há um excesso de proteínas, classificamos como hiperproteinémia.
Já em relação à análise qualitativa de proteínas tendo em vista a detecção de anomalias na sua estrutura (estrutura essa que é um reflexo directo da sequência genica responsável pela codificação da cadeia polipeptídica em questão) e o consequente diagnóstico de doença, podemos dizer que não é um método a que se recorre regularmente, uma vez que na maior parte dos casos os sintomas do paciente, juntamente com a sua história clínica, permitem fazer mais rápida e facilmente o diagnóstico.
(ver, eventualmente, mutações genicas relacionadas com síntese proteica)
Aplicações clínicas da electroforese das proteínas plasmáticas
Principais proteínas plasmáticas: Pré-albumina, Albumina, Alfa 1 globulinas, Alfa 2 globulinas, Beta globulinas e Gama globulinas.
Importância das principais proteínas:
A albumina é a proteína plasmática que existe em maior quantidade e tem funções importantes como a regulação da pressão osmótica e o transporte de moléculas.
Das α1 globulinas fazem parte, entre outras, proteínas importantes da fase aguda da inflamação como é o caso da α1 antitripsina.
Das α2 globulinas fazem parte proteínas como a haptoglobina, a α2 macroblobulina e a ceruloplasmina.
A transferrina e o fibrinogénio são exemplos de proteínas plasmáticas que migram na banda das β globulinas.
Das γ globulinas fazem parte as proteínas responsáveis pela resposta imune (imunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)
Num proteinograma observam-se 5 zonas de migração, ou bandas, em que a mais aniónica corresponde à albumina (menor peso molecular e maior carga eléctrica negativa), e as seguintes, respectivamente, às globulinas α1, α2, β e γ.
A análise electroforética das proteínas séricas ou proteinograma electroforético é um exame frequentemente requisitado na prática clínica diária, devido ao seu valor no auxílio do diagnóstico de variadas doenças, que permite avaliar o estado funcional do indivíduo.
A electroforese desempenha um papel importante, por exemplo, no diagnóstico de mieloma múltiplo, macroglobulinémia, enteropatia exudativa, sindroma nefrótico, cirrose, sarcoidose e variadas doenças do colagénio. Muitas doenças neoplásicas, metabólicas e infecciosas estão associadas a um distúrbio não específico das proteínas séricas, caracterizado por hipoalbuminémia e aumento da concentração de α-globulina.
O aspecto global do perfil electroforético é por vezes suficiente para referenciar de imediato algumas anomalias proteicas características de diferentes entidades patológicas, como por exemplo a cirrose hepática, síndrome nefrótico.
A análise electroforética das proteínas do líquido céfalo-raquideo é um exame laboratorial útil no diagnóstico de várias doenças neurológicas. Pode dar indicação da alteração da integridade da barreira Hemato-Encefálica e ainda do funcionamento celular do Sistema Nervoso Central.
Estudo sumário da urina
Elementos anormais (p. e.: hematúria, açucares, corpos cetónicos, bilirrubina):
Proteínas: normal até+/- 200 mg/l. Acima do normal, este parâmetro pode ser sinal de: Pielonefrite, Sindrome Nefrótico e/ou Glomerulonefrite.
Relevância clínica da determinação da actividade das transaminases (TGO e TGP)
TGOtransaminase glutâmico oxaloacética TGPtransaminase glutâmico pirúvica
As transaminases são enzimas (e portanto proteínas) intracelulares que permitem a transferência de grupos amina de α-aminoácidos para α-cetoácidos (reacções de transaminação).
Existem em quantidades mínimas no sangue de um indivíduo normal.
São indicadoras de lesão/morte celular. Após destruição celular extensa, os seus níveis aumentam significativamente no plasma.
Existem na maior parte das células mas em maior quantidade nas células hepáticas, cardíacas, musculares e pulmunares. A lesão nestas células levam ao aumento da actividade plasmática destas enzimas podendo levar a: hepatite, enfarte do miocárdio, miosite ou embolia pulmonar.
A determinação da actividade das transaminases é feita através do método de Reitman e Frankel.
Abaixo seguem-se alguns exemplos do estudo de proteínas no diagnóstico em medicina.
3.1 Avaliação quantitativa
1. A PCR (proteína C reactiva) é uma proteína plasmática produzida pelo fígado. Quando existe em elevadas quantidades pode ser sinónimo de infecção ou inflamação dos tecidos. O incremento dos níveis de PCR é determinado por um aumento da concentração de IL-6 (Interleucinas-6)* no plasma, predominantemente produzidas pelos macrófagos (tipo de leucócitos), intervenientes na resposta imunitária.
*As interleucinas são tipos de proteínas produzidas por células T, macrófagos e células teciduais. Possuem várias funções, mas a maioria delas está envolvida na activação dos linfócitos e na indução da divisão de outras células. Estes grupos (de interleucinas) são constituintes dos sistemas imunológicos dos organismos.
2. A albumina é a principal proteína do plasma humano, maioritariamente responsável pela pressão osmótica do plasma.
A síntese de albumina é afectada, particularmente, por doenças de fígado. Assim sendo, o plasma de pacientes com doença de fígado apresenta, frequentemente, um défice na taxa albumina-globulina.
Estudos electroforéticos mostram que o plasma de certos humanos carece de taxas normais de albumina por defeito. Destes indivíduos diz-se que apresentam analbuminemia ou
hipoalbuminemia. Este estado é comum em pacientes com insuficiência renal de último grau ou
síndrome nefrótico, e é causado pela combinação de dois factores: redução da síntese de albumina e incremento da degradação de albumina.
3.2 Avaliação qualitativa
1. A anemia falcifome, doença caracterizada pelo deficiente aporte de oxigénio aos tecidos por parte dos eritrócitos, que adquirem forma semelhante a foices, é provocada pela produção de uma via anormal de hemoglobina – a hemoglobina S, que se distingue da normal devido ao 6º aminoácido da cadeia polipeptídica que é a Valina em vez do Ácido Glutâmico. Assim, observando as hemácias ao microscópio é possível detectar a existência, ou não, de hemoglobina S, uma vez que a sua estrutura se reflectirá ao nível da própria célula na qual está inserida; não é necessário avaliar directamente a estrutura da proteína para se diagnosticar a anemia.
2. A amilóide é uma substância proteica rara e que, portanto, não está geralmente presente no organismo humano. Deste modo, quando há acumulação de amilóide ao nível de tecidos (exs: epitelial, muscular etc…) podemos diagnosticar amiloidose no paciente. A detecção desta substância proteica pode ser feita recorrendo à coloração dos tecidos com vermelho Congo, pois ela adquire cor verde esmeralda quando examinada com luz polarizada. Um dos sintomas da doença pode ser a proteinúria (perda de proteínas através da urina, o que numa situação normal não ocorreria pois o filtrado glomerular não possui macromoléculas).
