Métodos Eletroforéticos de Análise

(1)

1

Aula 04

Métodos

Eletroforéticos de

Análise

Eletroforese Capilar em Solução Livre

Instrumentação

Microfluídica

27/11/12

Objetivos

2

- Compreender o funcionamento do mecanismo de separação relacionado à separação eletroforética em solução livre.

- Compreender os efeitos no fluxo eletrosmótico, a dependência do potencial elétrico aplicado e os métodos de determinação.

- Diferenciar os termos: mobilidade aparente, mobilidade eletroforética e mobilidade eletrosmótica. - Diferenciar os termos: polaridade normal e polaridade invertida.

- Familiarizar com a instrumentação básica.

3

L

_T

= 30 - 50 cm

Controle Capilar Fonte de Alta Tensão

Tampão _Amostra Tampão

Detector

(2)

4

L

T

= 30 - 50 cm

Controle Capilar Fonte de Alta Tensão

Tampão Amostra Tampão

Detector

Eletroforese Capilar

0 2 4 6 8 1,0 1,1 1,2 1,3 Sin al d o D et ect o r ( U .R .) Tempo (min) eletroferograma 5 0 2 4 6 8 10 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 25 kV 20 kV 10 kV 7,5 kV 5,0 kV Na+Mg 2+ Ca2+ K+ Li+ Sin al ( U. R) Tempo (min)

Efeito do Potencial Aplicado

6 Íons em solução Migração Fonte de Potencial

+

-

+

-

+ +

-

zeE

F



Migração Difusão

(3)

7 Íons em solução Migração

+

F _F R F’ F’

)

(

'    







F

Total R F: Força elétrica FR: Força de relaxação F´: Força de retardamento + Deformação da atmosfera iônica 8 Mobilidade Eletroforética (mep)

E

v

ep

F

e

F’’

r

ze

E

v

ep ep



m

6 



9 r ze e _ m 6  0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 z i / r i Li + Mobilidade Eletroforética Cs + K + NH 4+ Rb + Cs + K + NH 4+ Rb + Ni 2+ Na + Ba 2+ Ca 2+ Cd 2+ Ce 3+ Co 2+ Cu 2+ Dy 3+ Er 3+ Eu 3+ Gd 3+ Ho 3+ La 3+ Nd 3+ Pb 2+ Pr 3+ Sm 3+ Sr 2+ Tm 3+ Yb 3+ Zn 2+ Mn 2+ Mg 2+ Mg 2+ Mn 2+ Na + Ni 2+

(4)

10 Mobilidade Eletroforética Detector L n l (comprimento total) (comprimento até o detector)

capilar plug

t

s

v





m

t

l

v



11 Mobilidade Eletroforética m

t

l

v



L

V

E

v



m

_e



m

_e (1) (2) Combinando-se (1) e (2), temos:

L

V

t

l

e m

m



V

t

lL

m e



m

V

lL

t

e m



m

12 0 5 10 15 0 5 10 15 20 tem p o d e m ig ração ( m in ) Potencial (kV) Tempo de Migração

(5)

13 0 5 10 15 20 25 30 0 1 2 3 4 5 a = 1/R y = ax + b U = R x i C o rren te ( m A) Potencial (kV)

Quanto maior o potencial, mais rápida a análise?

14 Fluxo Eletrosmótico (EOF)

O O O O O O O O O O Si Si Si Si Si Si Si Si Si Si

Estrutura da sílica fundida

OH O O O O Si Si Si Si O O O- O H H OH OH Silanol isolado Silanóis vicinais Silanol dissociado Siloxano Silanóis geminais 15 Fluxo Eletrosmótico (EOF)

Fenômenos Eletrocinéticos

• Eletrosmose • Potencial de fluxo

(streaming potential)

Oldham, K. B.; Myland, J. C.; Fundamentals of Electrochemical Science, Academic Press, San Diego, CA, USA, 1994.

(6)

16

O O O O O O O

H H H H H H H

CAPILAR

Fluxo Eletrosmótico (EOF)

+ + + ₊ + + + + + + + + + + +

-

+

-IHP OHP PC (z ) 17 Fluxo Laminar (pressão) EOF

18

Fatores que afetam o EOF  pH (z) 

 Potencial Aplicado (E) 

 Concentração (ou Força Iônica) do Tampão (z)  Temperatura () 

 Solventes Orgânicos (, e, z)

 Modificação da Superfície do capilar

 Aplicação de um potencial radial externo

(7)

19 mEOF / 1 0 -4 cm 2 V -1 s -1

Fatores que afetam o EOF

pH

20

Fatores que afetam o EOF

mEOF / 1 0 -8 m 2 V -1 s -1 0.5 1.5 1.0 2.0

Concentração

21

Modificação e Controle do EOF

Modificação da Superfície do Capilar

 Alterações Dinâmicas

Adição de Tensoativos (Surfactantes)

 Ligação Covalente

Através de reações de silanização

(8)

22 Modificação e Controle do EOF

Alterações Dinâmicas - Adição de Tensoativos (Surfactantes)

23 O O O O N + N + N + N + N + N + N + N + Brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) Modificação e Controle do EOF

24 Como medir o EOF ?

V

t

lL

eof eof



m

• Sinal de um marcador Neutro

(9)

25 Monitoramento do EOF 26 Monitoramento do EOF

Detector

0 V

+ HV

(a) (b) (c)

27 Monitoramento do EOF 5,5 Vdc Filter HVPS OPT101 White LED Diaphragm & Len Microchip 100x Objective

(10)

28 Monitoramento do EOF 29 0 20 40 60 80 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 10 20 30 40 O PT 1 0 1 O u tpu t / V time / s Current C u rr e n t / m A OPT101 Monitoramento do EOF 30 Mobilidade Aparente

m

_a



m

_ef



m

_eof ma > 0 ma < 0 mef meof ma = 0 mef meof ma mef meof ma

(11)

31 Controle de Temperatura

• Efeito Joule

32

• Efeito Joule

• Decréscimo no campo elétrico

Efeito proporcional na geração de calor Reduz a eficiência e resolução

• Redução do diâmetro do capilar

Decréscimo significativo na corrente Diminui a sensibilidade

Pode causar aumento na adsorção

• Decréscimo na concentração do tampão

Decréscimo proporcional da corrente Pode causar aumento na adsorção

•Controle ativo da temperatura

Termostatos; remoção de calor do capilar

Dispersão (s2₎ 33 Resolução

R



N













1

4 

m

_



















2 1 1 2

2 w

w

t

R

m m

 

R V D EOF                  1 4 2 1/ 2 m m m_ tm1 tm2 wb1 wb2

(12)

34 Resolução 0 180 360 540 720 900 1080 PDMS Nativo 0,1 URF R=3,0 R=2,7 R=2,4 R=2,6 R=2,7 R=1,8 R=1,9 Fl uo rescênci a Tempo (s) 35 Resolução 0 150 300 450 600 750 900 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Poliéster-toner R = 1,6 R = 1,4 R = 1,5 R = 1,6 R = 1,9 R = 2,3 R = 2,7 Fluo re s c ê nc ia ( ua ) Tempo (s) 36 Eficiência da Separação 2

16 _













b m

w

t

N

(13)

37 Eficiência da Separação 2

16 _













b m

w

t

N

0 30 60 90 120 150 180 0,0 0,1 0,2 0,3 F lu o re s c ê n c ia ( U R F ) Tempo (s) Toner preto (Imp. Monoc.) 0 30 60 90 120 150 180 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 F lu o re s c ê n c ia ( U R F ) Tempo (s) Toner preto (Imp. Colorida) 38 Seletividade (a)

Tampão: Borato 100 mM; Capilar 25 mm, 17 cm até o detector; Potencial 30 kV; Detecção UV em 200 nm.

39

m

_a



m

_ef



m

_eof

Análise de Cátions

Após uma análise eletroforética, a mobilidade aparente de uma espécie catiônica foi igual a 1,610-4_cm2_V-1_s-1_.

Considerando o valor de meof = 1,010-4 cm2 V-1 s-1,

calcule o valor da mobilidade eletroforética da espécie analisada.

(14)

40

m

_a



m

_ef



m

_eof Análise de Ânions ma < 0 ??? 41 0 50 100 150 200 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 F lu o re s c ê n c ia (U R F ) Tempo (s) 0 50 100 150 200 0,0 0,2 0,4 0,6 Poliéster-toner Fluxo Normal Poliéster-toner Fluxo Invertido FL CM

m

app

=

m

ep

+

m

eof

Análise de Ânions 5

10

0 ,

3





x

eof

m

4

10

0 ,

1





x

ep

m

???



ap

m

42 O O O O O O O H H H H H H H

CAPILAR

+ + + ₊ + + + + + + + + + + +

-

+

-Polaridade Normal

(15)

43 O O O O O O O H H H H H H H

CAPILAR

+ + + ₊ + + + + - - + - - - -

+

-

+

Polaridade Invertida 44 0 50 100 150 200 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 F lu o re s c ê n c ia (U R F ) Tempo (s) 0 50 100 150 200 0,0 0,2 0,4 0,6 Poliéster-toner Fluxo Normal Poliéster-toner Fluxo Invertido FL CM

m

app

=

m

ep

+

m

eof

Análise de Ânions 45 Instrumentação Básica Fonte de Alta Tensão

D

Pt Reservatórios

(16)

46 Instrumentos Comerciais

1987 – Perkin Elmer – Applied Biosystems

1989 – P/ACE – Beckman Coulter 1993 – P/ACE 5000

HP 3D_{CE System}

Agilent Technologies

P/ACE MDQ – Beckman Coulter

CE-L1 CE-Resources

(17)

49 Instrumentação Básica

Capilares

• Materiais: Sílica Fundida, PTFE, PEEK • Comprimento: 20 a 70 cm • Diâmetro Interno: 20 a 75 mm

Fonte de Alta Tensão

• Potencial: 0-30 kV • Corrente: 400 mA • Potência: 12 W Controle de Temperatura Injeção de Amostra Detecção Coleta de Frações 75 mm 360 m m 50 Injeção da Amostra

A introdução da amostra no capilar pode ser feita de duas maneiras:

Aplicando-se pressão ao capilar  Injeção Hidrodinâmica

Pressão positiva ou negativa Gravidade

Utilizando-se campo elétrico  Injeção Eletrocinética

51 Injeção da Amostra

Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Pressão)

P P

L

t

Pr

V





8

4





V : Volume Injetado P : Gradiente de Pressão r : Raio do capilar t : Tempo de Injeção  : Viscosidade L : Comprimento do Capilar

(18)

Injeção Hidrodinâmica da Amostra (Gravidade)

V : Volume Injetado r : Densidade

g : Aceleração da Gravidade h : Diferença entre os níveis r : Raio do capilar t : Tempo de Injeção  : Viscosidade L : Comprimento do Capilar h

L

t

hr

g

V





r

8

4





Injeção Eletrocinética da Amostra

Q : Quantidade de Material Injetado c : Concentração r : Raio do Capilar t : Tempo de Injeção mep: Mobilidade Eletroforética meo : Mobilidade do FEO L : Comprimento do Capilar





L

Vctr

Q



m

ep



m

eo 2 Fonte AT 54 Injeção da Amostra E K+ Na+ H₂0 t0 = 0

(19)

55 Injeção da Amostra E K+ Na+ H20 t₁ > 0 Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias)

Desvios na Injeção Eletrocinética da Amostra (Sample Bias)

Aspectos Práticos

O volume injetado não deve exceder 10 % do volume total do capilar. Isto corresponde a um volume em torno de 50 a 100 nL.

Na injeção eletrocinética há a discriminação da amostra. Variações na composição da amostra afetam a quantidade injetada.



(20)

58

Estratégias de Detecção

59



Volume de amostra : 10-100 nL



Quantidade de amostra : pmol-fmol



Dimensões da cela de detecção : 20-100 mm < 2 mm 75 mm 360 m m Introdução 60 Introdução  Fotométrica Absorção UV-visível Fluorescência Quimiluminescência Índice de Refração Lentes Térmicas SPR Infravermelho  Eletroquímica Amperométrica Condutométrica Potenciométrica Voltamétrica  Radiométrica

 Acoplamento com outras técnicas ICP, ICP-MS, RMN, MS

(21)

61 Detector UV-vis UV-vis (indireto) Fluorescência Fluorescência (Indireto) Fluorescência Induzida por Laser (LIF)

Espectrometria de Massa Amperometria Condutividade Índice de Refração LD / mol L-1 10-5_{– 10}-7 10-4_{– 10}-6 10-7_{– 10}-9 10-6_{– 10}-8 10-13_{– 10}-16 10-8_{– 10}-10 10-7_{– 10}-10 10-7_{– 10}-9 10-6_{– 10}-8 Introdução 62

• Tempo de resposta do detector • Taxa de aquisição de dados • Tempo de integração 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

1 ponto a cada 1 segundo.

0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

1 ponto a cada 2 segundos.

0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Introdução

63

Detecção Direta ou Indireta ??

(22)

64

Métodos Ópticos

65 Absorção UV-vis

I

_o

_I

b 0

I

T



_A

_

_

_log

_T

_

e

_bc

66 Absorção UV-vis

(23)

67

Detecção UV-vis mono-canal

Absorção UV-vis

68

Detecção UV-vis mono canal - Exemplos Absorção UV-vis

69 Detecção UV-vis multi-canal

(24)

70 Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos

71 Detecção UV-vis multi-canal - Exemplos

72

Métodos Eletroquímicos

(25)

73 Adsorção irreversível Seletividade Manipulação dos eletrodos Reprodutibilidade Métodos Eletroquímicos Influência do campo elétrico de separação Detecção eletroquímica em CE 74 Métodos Eletroquímicos  Amperométricos • Constante • Pulsado  Voltamétricos  Potenciométricos  Condutométricos • Com contato • Sem contato 75 Métodos Eletroquímicos Células Eletroquímicas On-Capillary Contato _Cola Capilar WE Off-Column Capilar WE Membrana Desacoplador End-Column Capilar WE wall-jet On-Column Capilar WE Capilar e1 e2

(26)

76 Métodos Eletroquímicos

Detectores Condutométricos

Universais

Com contato (baixa freqüência) Sem Contato (alta freqüência) LD – 10-5₁₀-7_{mol L}-1

Baixo Custo de implementação

Opera em condições de alta eletrodispersão Com Contato V t R i(t) ) ( ) ( 0t Rit V  Sem Contato R i(t) ) ( ) ( 0t Rit V  V t 77 Métodos Eletroquímicos

Detecção Condutométrica sem Contato

da Silva, J. A. F.; Guzman, N.; do Lago, C. L.; J. Chromatogr. A 2002, 942, 249-258.

78 Detecção Condutométrica sem Contato

0 20 40 60 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Xc / k  f / Hz

fC

X

C

_

2

1 

Ce C_w2 Rs Cw1 Capilar

(27)

da Silva, J. A. F.; do Lago, C. L.; Anal. Chem. 1998, 70, 4339-4343.

4 5 6 7 8 9 10 -0.1 0.0 0.1 0.2 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Re s p o s ta / V Tempo / min EOF Picos 1. 2-propanol 2. 1-propanol 3. 2-metil-2-propanol 4. 2-butanol 5. 2-metil-1-propanol 6. 1-butanol 7. 2-metil-2-butanol 8. 3-metil-1-butanol 9. 1-pentanol

Tampão: fosfato 50 mM, SDS 50 mM, pH 6,9. Injeção por gravidade (10 cm por 30 s)

da Silva, J. A. F.; do Lago, C. L.; Electrophoresis 2000, 21, 1405.

Separação de alguns álcoois alifáticos por MEKC

81 Detecção Amperométrica Materiais dos Eletrodos

• Carbono (Fibra, disco, vítreo) • Diamante dopado • Metais (Pt, Cu, Ni, Au)

• Modificados (Hg, Pd, Sn, Ru, Co Ftalocianinas, óxidos, enzimas, etc.) Número e Tipo dos Eletrodos

• Simples • Duplo • Array • Microdisco • Tubular • Banda

Sinal de Estímulo (Potencial)

• Contínuo (AD) • Pulso (PAD)

Configuração da Celula Eletroquímica 2 Eletrodos : WE, RE

(28)

82 Detecção Amperométrica 83 Detecção Amperométrica 84 Detecção Amperométrica

(29)

85 Detecção Amperométrica DA: Dopamina NE: Norepinefrina Epi: Epinefrina IP: Isoproterenol 86 Detecção Amperométrica 87

Métodos Acoplados

 CE-MS

(30)

88 CE- Espectrometria de Massas

cela eletroquímica 0 1 + - concentração local de cargas Electrospray 89 CE- Espectrometria de Massas

Electrospray

capilar metálico solução

eletrodo metálico

(31)

Electrospray

evaporação

fissão