Manipulação do DNA
Uma vez que amostras puras de DNA tenham sido preparadas, o próximo passo
em um experimento de clonagem de genes é a construção de uma molécula de
DNA recombinante.
Para isso, o vetor e o DNA a ser clonado devem ser cortados em pontos específicos
e juntados de maneira controlada. As moléculas de DNA podem também ser
encurtadas, alongadas, copiadas em RNA ou em novas moléculas de DNA e
modificadas por adição ou remoção de grupos químicos específicos. Estas
manipulações podem ser conduzidas em tubo de ensaio e são o fundamento para a
clonagem de genes e estudos básicos da bioquímica do DNA, estrutura gênica e do
controle da expressão gênica.
Praticamente todas as técnicas de manipulação do DNA fazem uso de enzimas
que, dentro da célula, participam de processos essenciais como replicação e
transcrição do DNA, quebra de DNA estranho ou não desejado, reparo do DNA
mutado e recombinação de DNAs diferentes.
Enzimas para manipulação do DNA
1. Nucleases são enzimas que cortam, encurtam ou degradam DNA. 2. Ligases são enzimas que ligam moléculas de DNA.
3. Polimerases fazem cópias de moléculas.
4. Modificadoras removem ou adicionam grupos químicos. 5. Topoisomerases introduzem ou removem DNA circular. Algumas enzimas tem atividades múltiplas (ex: polimerases). Existem ainda enzimas similares para moléculas de RNA.
Nucleases.
Degradam DNA quebrando as ligações fosfodiester que ligam um nucleotídeo ao outro adjacente na fita do DNA. Existem dois tipos.
Exonucleases: removem nucleotídeos um por vez de cada ponta da molécula de DNA.
Endonucleases: Quebram ligações fosfodiester internas na molécula de DNA. Neste grupo, existem enzimas específicas chamadas de endonucleases de restrição (enzimas de restrição) que clivam DNA dupla fita em sítios específicos de reconhecimento.
Endonucleases de restrição.
A clonagem de genes requer que moléculas de DNA sejam cortadas de um modo preciso e de forma reproduzível. Cada molécula do vetor deve ser clivada em uma posição simples para abrir o círculo no qual o novo DNA será inserido. Se a molécula for cortada mais de uma vez, formará vários fragmentos separados e não será útil como vetor de clonagem.
Enzimas de restrição permitem o corte de um modo preciso e de forma reproduzível.
O descobrimento se deu no início dos anos 50 quando verificou-se que algumas linhagens de bactérias eram imune a infecção por bacteriófagos
Existem três (3) tipos de enzimas de restrição denominadas de tipo I, II e III. Os tipos I e III são complexas e tem um papel limitado na engenharia genética. O tipo II permite a clivagem do DNA apenas na seqüência de reconhecimento.
Formação de uma
molécula de DNA
Molécula de DNA de um plasmídeo circular
Clivagem com enzima de restrição
Molécula de DNA de um plasmídeo
linear com extremidades coesivas
DNA exógeno
Ligação covalente pela DNA ligase
Molécula de DNA plasmidial
contendo o inserto
Inserção em uma célula hospedeira
CONSTRUÇÃO DO DNA RECOMBINANTE
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Proteínas que reconhecem e clivam o DNA em pontos
específicos, geralmente em sequências de 4, 6 e 8 bases
Digestão do DNA em laboratório.
Para clivar uma molécula de DNA são necessários alguns elementos, tais como, o
DNA, enzimas de restrição em condições ótimas para sua atividade, ou seja, pH,
concentração de sal, agente redutor (DTT), todos contidos no tampão, e temperatura
ideal.
A análise do resultado da clivagem pode ser realizada pela separação das moléculas
de DNA por eletroforese, sendo visualizada com corante específico (brometo etídio)
ou autoradiografia de DNA marcado radioativamente. Finalmente pode-se
Mapeamento de sítios de restrição em uma molécula de DNA.
Outra parte da análise de restrição é a construção de um mapa de restrição para a molécula de DNA. Com esse mapa, pode-se selecionar as enzimas a serem utilizadas na manipulação da molécula de DNA. Para a construção do mapa são necessárias digestões simples e parciais.
Origem de replicação
Genes para resistência a
antibióticos
Permite que a célula hospedeira cresça em meio seletivo
Múltiplos sítios de clonagem
Permite a inserção de DNA exógeno
VETORES DE CLONAGEM: PRINCIPAIS
CARACTERÍSTICAS
Permite a auto-replicação, independente do cromossomo
