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CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES NA CAPACIDADE IN VITRO

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EFEITO DO pH E CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES NA CAPACIDADE IN VITRO DE FORMAÇÃO DE BIOFILME

POR Salmonella sp. ISOLADA DE INDÚSTRIA DE PROCESSAMENTO DE AVES

A. M. Schneider¹, G. R. Fonseca2, S. A. Costa3, M. J. Sereno4, K. Pegoraro5, L. S. Bersot6

1- Departamento de Ciências Veterinárias - Universidade Federal do Paraná – Setor Palotina, CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: +55 (45) 9999-4914 – e-mail: (andressamaisa@gmail.br).

2-Departamento de Ciências Veterinárias - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina – CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: +55 (45) 9931-4576 – e-mail: (giovanarfonseca@gmail.com).

3- Departamento de Ciências Veterinárias - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina – CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: +55 (44) 9927-3407 – e-mail: (sarah.almeida@ufpr.br).

4- Departamento de Ciências Veterinárias - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina – CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: +55 (44) 3211-8513 – e-mail: (mallusereno@gmail.com).

5- Departamento de Ciências Veterinárias - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina – CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: +55 (44) 3211-8513 – e-mail: (kadigiapegoraro@gmail.com).

6- Departamento de Ciências Veterinárias - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina – CEP: 85950-000 – Palotina – PR – Brasil, Telefone: +55 (44) 3211-8516 – e-mail: (lucianobersot@gmail.com).

RESUMO – Salmonella sp. é um importante patógeno associado aos produtos de origem animal sendo o principal agente de enfermidades causadas pela ingestão de carne e ovos. Além disso, possui a capacidade de formar biofilme, uma fonte de contaminação importante para os alimentos. O objetivo desse estudo foi verificar como os fatores estressantes: pH (4,5, 7,0 e 9,0), concentração de nutrientes (30%, 50% e 100%) em função da temperatura de incubação (7°C, 36°C e 42°C), podem interferir diretamente na habilidade de formação de biofilme por Salmonella sp. Esta avaliação foi realizada através de metodologia internacionalmente conhecida. Encontrou-se que a concentração de nutrientes do meio de cultura e o pH, associados a temperatura, influenciaram diretamente na formação de biofilme. Contudo, os fatores estressantes não maximizaram a capacidade de formação de biofilme que se mostrou sempre maior quando as condições ótimas estavam presentes.

ABSTRACT – Salmonella sp. is an important pathogen associated with animal products and is the main agent of diseases caused by eating meat and eggs. Moreover, it has the ability to form biofilm, a significant food contamination source. The aim of this study was to determine how stress conditions:

pH (4.5, 7.0 and 9.0), concentration of nutrients (30%, 50% and 100%) depending on incubation temperature (7°C, 36°C and 42°C), can directly interfere with biofilm formation ability of Salmonella sp. This evaluation was made using international recognized methodology. It was found that the concentration of nutrients from the culture medium and the pH associated with the temperature, influenced directly on the biofilm formation. However, stress conditions not maximized the biofilm forming ability that proved always larger when the optimal conditions were present.

PALAVRAS-CHAVE: Salmonella sp.; biofilme; pH; nutrientes.

KEY-WORDS: Salmonella sp.; biofilm; pH; nutrients.

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1. INTRODUÇÃO

As enfermidades ocasionadas pelo o consumo de alimentos constituem uma grande preocupação para a saúde pública mundial, em especial, as causadas por Salmonella sp., sobretudo pelo consumo de produtos avícolas como carnes e ovos (BELL & KYRIAKIDES, 2002). De acordo com o relatório anual do CDC, em 2014, Salmonella sp. foi o principal agente causador das toxinfecções alimentares nos EUA, com 7.439 mil casos reportados e 32 mortes (CDC, 2014). Adicionalmente, Salmonella sp. tem capacidade de formar biofilmes sendo uma das principais fontes de contaminação dos alimentos (BELL & KYRIAKIDES, 2002).

Os biofilmes são agregados de micro-organismos, que se anexam e crescem sobre uma superfície (SREY et al., 2013) como uma maneira de autoproteção bacteriana frente à fatores ambientais adversos (SHI & ZHU, 2009). A formação do biofilme ocorre quando os micro-organismos se aderem à uma superfície de contato, se fixam, constituem uma matriz de exopolissacarídeos e iniciam então seu crescimento (DONLAN, 2002). Na indústria, a formação do biofilme está relacionada a fatores ambientais como pH, temperatura, composição de nutrientes e as características da população de bactérias, bem como fatores relacionados a limpeza e desinfecção de equipamentos e utensílios (SHI &

ZHU, 2009).

Os biofilmes de Salmonella sp. possuem grande importância na indústria, pois as superfícies em que se formam entram em contato com os alimentos diariamente (SCHLISSELBERG & YARON, 2013). Além disso, são resistentes à vários desinfetantes e antibióticos (STEENACKERS et al., 2012) e permanecem viáveis no ambiente por longos períodos de tempo, se tornando uma fonte de contaminação crônica para o alimento (VESTBY, et al., 2009). De acordo com o órgão norte-americano National Institutes of Health, biofilmes estão associados a aproximadamente 80% de todas as infecções humanas no mundo (NIH, 2002).

De acordo com a Instrução Normativa n° 70 (2003), para garantir a higiene e a segurança dos alimentos produzidos, as indústrias devem ter um controle minucioso sobre o processo de abate. Além disso, devem realizar o processo adequado de limpeza para remover todos os resíduos de alimentos e de outros compostos (SIMÕES et al., 2010). A limpeza adequada é muito importante para prevenção da formação de biofilmes e a desinfecção é indispensável para eliminação dos biofilmes já formados (SREY et al., 2013).

O objetivo do trabalho foi verificar como os fatores estressantes pH adverso e redução da concentração dos nutrientes em meio de cultura, incubados à diferentes temperaturas, podem interferir na habilidade de formação de biofilme por Salmonella sp.

2. MATERIAL E MÉTODOS

As cepas de Salmonella sp. testadas no presente trabalho foram obtidas de um estudo prévio o qual avaliou a habilidade de formação de biofilmes através da metodologia descrita por Stepanović et al. (2000) de cepas de Salmonella sp. isoladas de esteiras condutoras de abatedouros de aves (ZIECH et al., 2016).

Foram selecionadas três cepas do patógeno com habilidade diferente de formação de biofilmes (uma fortemente, uma moderadamente e uma fracamente formadora) e foram submetidas frente aos tratamentos com os fatores estressantes: pH (4.5, 7.0 e 9.0), concentração do meio de cultura (30%, 50%

e 100%) em função da temperatura de incubação (7°C, 36°C e 42°C), tendo sido realizada a combinação de um delineamento experimental 3x3x3 com as variáveis testadas para avaliar a formação de biofilmes.

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A partir de cada cepa numa concentração celular de 108 UFC/mL (escala 0,5 de MacFarland) utilizando caldo Luria Bertani (Difco™) preparado de acordo com cada tratamento, foi semeado 200μL em triplicata, em microplaca de poliestireno de 96 poços com fundo chato (Nest®). Foram utilizados para o controle negativo, três poços contendo o meio de cultura de acordo com cada tratamento não inoculado. As placas contendo as cepas de Salmonella sp. e os controles foram incubadas a 7, 35 e 42ºC/96h. Em seguida as placas foram lavadas três vezes com solução salina tamponada (PBS pH 7,2) e coradas com violeta cristal 1% por 15 minutos. Após três lavagens com água destilada e secagem em temperatura ambiente, foi verificada a absorbância em uma leitora de microplacas Polaris (Celer®) a 620nm. O controle negativo foi o branco, utilizado para corrigir o valor da absorbância (resultado da média aritmética dos quatro orifícios).

Para avaliar os resultados de absorbância o valor da densidade óptica de cada amostra (Doa) foi comparado com a média da absorbância dos controles negativos (Docn). Para determinar o grau de formação de biofilme foi utilizada a seguinte classificação: não formadora de biofilme (Doa≤Docn), fracamente formadora de biofilme (Docn< Doa≤ 2.Docn), moderadamente formadora de biofilme (2.Docn< Doa≤ 4.Docn) e fortemente formadora de biofilme (4.Docn<Doa).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na verificação do efeito das variáveis, concentração de nutrientes (100%, 50% e 30%) e pH (9,0, 7,0 e 4,5) de acordo com a temperatura de incubação na formação de biofilme, verificou-se que para a cultura de Salmonella sp. classificada como fortemente formadora de biofilme (Tabela 1), a temperatura de refrigeração (7ºC) mostrou diminuir a capacidade de adesão de biofilmes independentemente das variáveis estudadas (pH e concentração do meio de cultura). Efeito semelhante foi observado com esta cultura quando incubada a 42ºC.

Tabela 1 - Efeito das variáveis concentração de meio de cultura (100%, 50% e 30%) e pH (4,5; 7,0 e 9,0) na capacidade de formação de biofilme em microplaca de poliestireno de cultura de Salmonella sp. FORTE formadora de biofilme em função da temperatura de incubação (7°C, 36°C e 42ºC).

Temperatura de incubação

Concentração de nutrientes no

meio de cultura (%) pH

100 50 30

7ºC

FR FR FR 4,5

FR FR FR 7,0

FR FR FR 9,0

36ºC

MO MO MO 4,5

FO FR FR 7,0

FO FR FR 9,0

42ºC

MO FR FR 4,5

FR FR FR 7,0

FR AU FR 9,0

FR = fraca, MO = moderada, FO = forte, AU = ausente

Já a 36ºC (Tabela 1), temperatura considerada ótima para a formação do biofilme, o pH ácido reduziu a capacidade de adesão, independentemente da concentração do meio de cultura, sendo que no pH alcalino (9,0) esse efeito foi ainda mais pronunciado, mostrando que a alcalinidade associada a inanição da cultura (50 e 30%), interferiram na capacidade de formação de biofilme. Em condições

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ótimas (36ºC; 100% de meio; pH 7,0) a capacidade considerada “forte” na formação de biofilme foi mantida, o que ocorreu também em pH 9,0.

Comportamento semelhante também foi observado com a cultura de Salmonella sp.

classificada como moderadamente formadora de biofilme (Tabela 2), cujas temperaturas de 7º e 42ºC mostraram interferir negativamente na capacidade de formação de biofilme. Mais uma vez, na temperatura de 36ºC, houve redução da capacidade de formação de biofilme em microplacas de poliestireno, nas combinações de pH 7,0 x 50% e pH 9,0 x 50%, nas demais combinações de 36°C a formação de biofilme se manteve moderada. Lianou & Koutsoumanis (2012) obtiveram resultados similares, onde a maior quantidade de biofilme foi formado a 25°C, quando comparado à temperaturas mais baixas. Nas outras condições a capacidade de formação de biofilme não sofreu interferência.

Tabela 2: Efeito das variáveis concentração de meio de cultura (100%, 50% e 30%) e pH (4,5; 7,0 e 9,0) na capacidade de formação de biofilme em microplaca de poliestireno de cultura de Salmonella sp. MODERADA formadora de biofilme em função da temperatura de incubação (7°C, 36°C e 42ºC).

Temperatura de incubação

Concentração de nutrientes no

meio de cultura (%) pH

100 50 30

7ºC

FR FR FR 4,5

FR FR FR 7,0

FR FR FR 9,0

36ºC

MO MO MO 4,5

MO FR MO 7,0

MO FR MO 9,0

42ºC

MO FR FR 4,5

FR FR FR 7,0

FR FR FR 9,0

FR = fraca, MO = moderada, FO = forte

Com relação a cultura de Salmonella sp. fracamente produtora de biofilme (Tabela 3), por se tratar de uma cultura já avaliada com baixa capacidade de adesão, os efeitos observados foram de ausência de formação de biofilmes em algumas situações específicas, notadamente quando a cultura foi incubada a 42ºC. Mas esta cultura não mostrou sofrer com o efeito da temperatura de incubação a 7ºC, cuja capacidade de formação de biofilme permaneceu inalterada.

Tabela 3: Efeito das variáveis concentração de meio de cultura (100%, 50% e 30%) e pH (4,5; 7,0 e 9,0) na capacidade de formação de biofilme em microplaca de poliestireno de cultura de Salmonella sp. FRACA formadora de biofilme em função da temperatura de incubação (7°C, 36°C e 42ºC).

Temperatura de incubação

Concentração de nutrientes no

meio de cultura (%) pH

100 50 30

7ºC

FR FR FR 4,5

FR FR FR 7,0

FR FR FR 9,0

36ºC

FR FR FR 4,5

FR AU AU 7,0

FR FR FR 9,0

42ºC FR AU AU 4,5

AU AU AU 7,0

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AU AU AU 9,0 FR = fraca, MO = moderada, FO = forte, AU = ausente

De uma maneira geral, observou-se que a maioria das cepas não conseguiu se desenvolver bem quando condições estressantes foram cruzadas. Tanto a concentração de nutrientes, o pH e a temperatura influenciaram positivamente ou negativamente na formação de biofilmes. A temperatura foi o fator estressante que mais teve influência, pois a 7°C e a 42°C a formação de biofilmes foi diminuída quando comparada com as cepas incubadas a 36°C. Assim como encontrado por Yang et al.

(2016), onde a contagem de células foram mais elevadas em biofilmes obtidos a 25 °C do que a 4 °C, indica que a temperatura do ambiente pode ter um efeito significativo sobre a capacidade do micro- organismo se aderir nas superfícies.

Além do efeito da temperatura, também foi observado o efeito do pH na formação de biofilme, sendo a associação dos fatores, temperatura mais baixa e pH reduzido, a combinação que teve maior capacidade de retardo na formação de biofilme. Nguyen & Yuk (2013) comprovaram que a temperatura, o pH e a idade dos biofilmes estão diretamente ligados com a resistência dos biofilmes à desinfetantes.

A concentração de nutrientes no meio de cultura também mostrou interferir na formação de biofilme, principalmente quando associado a temperatura. Nguyen et al. (2014) relatou que menores concentrações de nutrientes foram mais eficazes na promoção da formação de biofilme de Salmonella sp., e também relatou que os diferentes efeitos da menor concentração de nutrientes sobre a formação de biofilme podem estar relacionados às diferentes temperaturas de incubação. Contudo, no presente estudo, as condições estressantes impostas às culturas testadas não maximizaram a capacidade de formação de biofilme que se mostrou sempre maior quando as condições estressantes não estavam presentes.

4. CONCLUSÃO

Segundo os resultados obtidos tanto a concentração de nutrientes, o pH e a temperatura influenciaram positivamente ou negativamente na formação de biofilmes. A temperatura foi o fator estressante que mais influenciou, pois a 7°C e a 42°C esta formação foi diminuída quando comparada com as cepas incubadas a 36°C. Diante disso, temperaturas mais baixas e pH reduzidos podem ser utilizadas como obstáculo tecnológico para retardar a formação de biofilme em superfícies e equipamentos contaminadas com Salmonella sp. Além disso, é necessário enfatizar que a correta limpeza e desinfecção através dos programas de Boas Práticas de Fabricação, do Processo Padrão de Higiene Operacional e da Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle na indústria são importantes para prevenir a formação e erradicar biofilmes já formados.

5. AGRADECIMENTOS

A. M. Schneider, recebe apoio da Fundação Araucária, PR; S. A. Costa, G. R. Fonseca, L. S.

Bersot, recebem apoio do CNPq; M. J. Sereno, recebe apoio da CAPES e K. Pegoraro, recebe apoio do MEC.

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6. REFERÊNCIAS

Bell, C. & Kyriakides, A. (2002). Salmonella: A practical approach to the organism and its control in foods. OsneyMead, Oxford: Blackwell Science.

Brasil, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. (2003). Programa de Redução de Patógenos-Monitoramento Microbiológico e Controle de Salmonella sp. em Carcaças de Frangos e Perus. (Instrução Normativa n° 70, de 06 de outubro de 2003). Diário Oficial da União.

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Ziech, R. E., Perin A. P., Lampugnani C., Sereno M. J., Viana C., Soares V. M., Pereira J. G., Pinto J.

P. A. N., Bersot L. S. (2016). Biofilm-producing ability and tolerance to industrial sanitizers in Salmonella spp. isolated from Brazilian poultry processing plants. LWT-Food Science and Technology, 68, 85-90.

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