UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CAMPUS REITOR JOÃO DAVID FERREIRA LIMA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E PARASITOLOGIA
Jamille da Silva Marques
CARACTERIZAÇÃO DA BACTÉRIA JOA-1 ISOLADO DA PRAIA DA JOAQUINA, FLORIANÓPOLIS/SC
Florianópolis 2022
Jamille da Silva Marques
CARACTERIZAÇÃO DA BACTÉRIA JOA-1 ISOLADO DA PRAIA DA JOAQUINA, FLORIANÓPOLIS/SC
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à disciplina BIO 7016 - Trabalho de Conclusão de Curso II (TCC) como requisito de conclusão da disciplina, sob orientação do Prof. Dr. Rubens Tadeu Delgado Duarte.
Florianópolis 2022
Jamille da Silva Marques
CARACTERIZAÇÃO DA BACTÉRIA JOA-1 ISOLADO DA PRAIA DA JOAQUINA, FLORIANÓPOLIS/SC
Este trabalho foi julgado adequado para obtenção de Título de “Licenciatura em Ciências Biológicas”, e aprovado em sua forma final pelo Curso de Graduação em Ciências Biológicas.
Florianópolis, Julho de 2022.
Profa . Dra . Daniela Cristina de Toni
Coordenadora do Curso de Graduação em Ciências Biológicas
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Rubens Tadeu Delgado Duarte Orientador
MIP/UFSC
Prof. Dr. Carlos José de Carvalho Pinto Avaliador
MIP/UFSC
Dr. Thomas Schröder Avaliador
Profa. Dra. Norma Machado da Silva Avaliadora
BEG/UFSC
À minha família.
AGRADECIMENTOS
À minha amada família, por ser minha fonte inesgotável de amor e apoio. Em especial, ao meu pai, Márcio; à minha irmã, Juliene; ao Willian; aos meus tios, Flávia e Allan;
à minha falecida mãe, Jadna; e também à minha falecida avó, Tereza. Sou imensamente feliz e grata por ter vocês em minha vida e meu amor é imensurável.
Aos meus amigos, obrigada por terem tornado meus dias mais leves, terem me divertido e terem sido tão presentes em minha trajetória. Em especial, à Bruna, Luísa e Mezeco, por acreditarem em mim e sempre me motivarem. Aos amigos que a UFSC me presenteou, vocês tornaram a minha vida acadêmica muito mais feliz de ser vivida e são responsáveis pelas melhores lembranças que levarei pra sempre.
Agradeço ao meu orientador, professor Rubens, o qual esteve presente em minha vida acadêmica desde o início do curso e aceitou me acompanhar nessa etapa tão importante.
Foi paciente, compreensivo e amigo. Tem todo meu respeito, carinho e admiração.
Aos meus professores acadêmicos, toda minha gratidão pelo conhecimento mediado e por terem tornado inesquecível essa jornada de aprendizado. Agradeço também à banca examinadora pela honra de aceitar o convite.
Por fim, agradeço à UFSC, por toda estrutura, suporte, oportunidade de estudo e experiência de vida que adquiri nesses anos fazendo parte dela, agora é ela quem faz parte de mim para o resto de minha vida.
"Em algum lugar, algo incrível está esperando para ser descoberto."
Carl Sagan
RESUMO
Ecossistemas marinhos representam um dos ambientes menos conhecidos em termos de diversidade microbiana. O isolado JOA-1 foi obtido a partir de amostras de água marinha da praia Joaquina, em Florianópolis – SC, utilizando meio Ágar Marinho e incubação a 25 °C.
Após análise do sequenciamento do gene RNAr 16S do isolado JOA-1, foi averiguado similaridade de 99% com as espécies do gênero Cellulophaga sp, que possui a característica de habitar ambientes marinhos, além de apresentar a produção de um pigmento verde iridescente. Devido à similaridade na sequencia do gene, houve uma identificação no que se refere ao gênero a que pertence a bactéria JOA-1, no entanto, não há similaridade suficiente para diferenciar esse microrganismo ao nível de espécie. O presente trabalho obteve adaptações para as circunstâncias da pandemia e, por esse motivo, foi realizada uma análise comparativa com as demais espécies que constituem esse gênero, com o intuito de caracterizar a JOA-1, oportunizando posteriormente novas pesquisas para a identificação de sua espécie.
Palavras-chave: Microbiologia. Taxonomia. Iridescência. Cellulophaga sp.
ABSTRACT
Marine ecosystems represent one of the least known environments in terms of microbial diversity. The isolate JOA-1 was obtained from samples of marine water from Joaquina beach, in Florianópolis - SC, using Marine Agar medium and incubation at 25 °C. After analyzing the sequencing of the 16S rRNA gene from the JOA-1 isolate, a similarity of 99%
with the species of the genus Cellulophaga sp was verified, which has the characteristic of inhabiting marine environments, in addition to presenting the production of an iridescent green pigment. Due to the similarity in the sequencing of the gene, there was an identification regarding the genus to which the bacterium JOA-1 belongs, however, there is not enough similarity to differentiate this microorganism at the species level. The present work obtained adaptations to the circumstances of the pandemic and for this reason, a comparative analysis was carried out with the other species that constitute this genus, in order to characterize JOA- 1, subsequently providing opportunities for further research to identify its species.
Keywords: Microbiology. Taxonomy. Iridescence. Cellulophaga sp.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 11
2. REVISÃO DE LITERATURA 12
2.1. DIVERSIDADE MICROBIANA 12
2.2. TAXONOMIA MICROBIANA 15
2.3. FILOGENIA MICROBIANA 15
2.4. O GÊNERO Cellulophaga 17
2.5. O ISOLADO JOA-1 19
3. OBJETIVOS 20
3.1. OBJETIVO GERAL 20
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 20
4. METODOLOGIA 21
4.1. ISOLAMENTO E CULTIVO INICIAL 21
4.2. IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR 21
4.3. MORFOLOGIA 22
4.4. METABOLISMO 23
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 26
5.1. IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR 26
5.2. CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA 27
5.3. ANÁLISES METABÓLICAS 29
5.4. COMPARAÇÃO DO PERFIL METABÓLICO DE JOA-1 E OUTRAS Cellulophaga 30
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 40
6.1 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 40
REFERÊNCIAS 41
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1. INTRODUÇÃO
A bactéria explorada neste estudo foi coletada em uma amostra de água marinha da praia da Joaquina, Florianópolis/SC em 2016. O microrganismo isolado, denominado JOA-1, foi provisoriamente identificado como pertencente ao gênero Cellulophaga, pois possui capacidade de produzir uma cultura verde-iridescente. O presente trabalho discrimina informações obtidas através de diversos experimentos realizados com esta bactéria no Laboratório de Ecologia Molecular e Extremófilos (LEMEx), MIP-CCB, UFSC e revisão bibliográfica sobre outros representantes do gênero Cellulophaga.
A identificação de uma espécie de bactéria proporciona inúmeras possibilidades de estudos, que variam sobre questões clínicas, ambientais, industriais e biotecnológicas.
Existem diversos estudos e tecnologias que estão em processo de desenvolvimento utilizando microrganismos como principal ferramenta e, nesse contexto, a bactéria JOA-1 pode apresentar potencial interesse biotecnológico, principalmente considerando a sua característica diferenciada, a iridescência.
Reconhecer uma espécie microbiológica na qual faz parte do ambiente marinho, que possui um número de identificação de microrganismos bem reduzido de acordo com estimativas em diversidade de espécies nos oceanos, faz com que seja possível cada vez mais compreender os diferentes ecossistemas e suas interações, sobretudo, relacionando as ameaças ao meio ambiente e perda de biodiversidade em todos os níveis.
Com o registro das informações obtidas, espera-se contribuir para que futuras pesquisas sejam realizadas com a bactéria JOA-1, permitindo identificá-la em nível espécie.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. DIVERSIDADE MICROBIANA
O segundo artigo da Convenção sobre Diversidade Biológica (CDB), define à biodiversidade como “a variabilidade de organismos vivos de todas as origens, compreendendo, dentre outros, os ecossistemas terrestres, marinhos e outros ecossistemas aquáticos e os complexos ecológicos de que fazem parte; compreendendo ainda a diversidade dentro de espécies, entre espécies e de ecossistemas”. A biodiversidade é referida em três níveis: ecossistemas, espécies e recursos genéticos (MMA, 1992).
A diversidade biológica e genética está presente em todos os ambientes e por essas diferenciações é que foi possível permitir a adaptação ou não adaptação dos organismos a ambientes diversos, configurando a variedade de seres vivos que observamos nos dias atuais (WWF, 2006).
O Domínio Bacteria contém representantes dentro do grupo dos procariotos e uma variedade enorme de indivíduos com diversas características. Por meio de análises morfológicas, com raríssimas exceções, é impossível indicar a fisiologia, ecologia, filogenia ou outra propriedade de uma célula procariótica (MADIGAN et al., 2010). Desse modo, a identificação de uma bactéria não pode restringir-se apenas a análises morfológicas, pois, para esse propósito são necessários também métodos genéticos, bioquímicos e fisiológicos (BALLOWS et al., 1991).
As mais aceitas teorias de origem da vida sugerem que os primeiros seres vivos foram células procarióticas similares a bactérias (GALANTE, et al., 2016). Com o surgimento das primeiras células ao longo das primeiras centenas de milhões de anos, as populações ficaram sujeitas a modificações morfofisiológicas e genéticas, ocasionando na evolução de diferentes linhagens microbianas. O mesmo processo vem ocorrendo até os dias atuais, há quase 4 bilhões de anos, o que resultou em uma ampla diversidade de microrganismos (MADIGAN, et al., 2016).
Diferentemente de outros organismos, como as plantas e os animais, que permitem estudos por meio de fósseis, folhas, ossos e outras estruturas, que auxiliam à construção de uma árvore evolutiva, estudar à diversidade microbiana só foi possível após o surgimento de algumas ferramentas, pois à diferenciação e identificação desses organismos é muito mais enigmática. Contudo, as descobertas dos últimos 40 anos mostram que cada microrganismo
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possui registrado em seus genes a sua história evolutiva. Comumente são utilizados para identificação do conteúdo genético dos RNAs ribossomais, no qual apresentam características que os tornam excelentes indicadores da diversidade microbiana (MADIGAN, M. T. et al, 2016).
Ambientes marinhos ainda são os menos explorados no que diz respeito à identificação de organismos se comparado a outros ecossistemas, devido à sua grandiosidade, variação e dificuldades em realizar determinadas observações. Quando se fala no aspecto microbiológico, essa escala de objeção se torna ainda maior, pois o estudo taxonômico em microrganismos já é, por si só, de muita complexidade, independentemente do ambiente em que ele está inserido. Antes do desenvolvimento da ecologia microbiana ocorrida na década de 1970, os microrganismos não eram considerados nos estudos de ecologia marinha.
(PEDRÓS-ALIÓ, 2006).
Os principais produtores primários nos oceanos, são os microrganismos e suas atividades biológicas têm grande participação nos processos químicos terrestres. As plantas microscópicas presentes nos plânctons marinhos estão distribuídas por todo o mundo e exercem uma atividade importante, que é a fixação do nitrogênio nos oceanos. Andrew D.
Barton e profissionais do Instituto de Tecnologia de Massachusetts (MIT), nos Estados Unidos, pesquisaram sobre a distribuição de microrganismos no ambiente marinho conforme a latitude localizada (BARTON, et al, 2010). O resultado desse estudo concluiu que, assim como a maioria das espécies, os microrganismos marinhos têm maior biodiversidade nas regiões tropicais do que próximo aos polos do planeta. O MIT chegou a resultados de alguns padrões de distribuição, em que a maior parte das espécies se encontram em zonas de latitudes médias, entretanto, menos espécies mas e maior número de indivíduos estão presentes em latitudes mais altas.
Definir um conceito de espécie é algo de muita complexidade. Existem inúmeros conceitos que podem ser questionados em suas designações. Entre os padrões de estudos criados para classificar os organismos, também irão existir diversas exceções, pois foram metodologias empregadas para facilitar o estudo, entretanto, na natureza muitas técnicas podem não ser aplicáveis em sua totalidade dependendo das circunstâncias do organismo em estudo (MADIGAN, et al, 2016).
Não existe atualmente um conceito universal de espécie em microrganismos. À forma como espécie é determinado em microbiologia que condiciona sua distinção e classificação sobre os variados representantes que constituem os microrganismos. Para a taxonomia microbiana, os pontos fenotípico e genotípico, devem ser coesos e suas
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características devem se diferenciar das demais espécies já descritas, além de compartilharem de um ancestral comum recente (ser monofilético). É difícil compreender as relações filogenéticas entre as espécies e na maior parte da história, os estudos com microrganismos e suas descrições, não definiam a história evolutiva dos mesmos. As sequências moleculares fornecem um registro evolutivo sobre os microrganismos e fez com que fosse necessário conciliar as descrições clássicas com o conhecimento adquirido mais recentemente com análise molecular sobre as espécies. É necessário considerar que os genomas microbianos são muito heterogêneos e também possuem muitos genes adquiridos de forma horizontal e isso dificulta ainda mais a diferenciação das espécies de microrganismos (MADIGAN, et al, 2016).
Em 1998, William B. Whitman , David C. Coleman e William J. Wiebe, estimavam que o número de espécies microbianas fosse de alguns milhões no máximo e Moreira et al, no mesmo ano, pressupunham que entre os microrganismos menos de 1% das bactérias e vírus e menos que 5% dos fungos que existiam já tinham sido catalogados. Kenneth J. Locey e Jay T.
Lennon em 2016, preveem que a Terra seja o lar de até 1 trilhão de espécies microbianas. De acordo com essa estimativa, existem cerca de um trilhão de espécies de microrganismos na Terra e 99,999% deles ainda não foram descobertos. No ano de 2019, Parfrey et al, defendem que as estimativas existentes são inteiramente baseadas em modelos teóricos ou extrapolações de conjuntos de dados pequenos e tendenciosos. Suas estimativas refutam previsões de que existam trilhões de espécies microbianas. Eles presumem que existam globalmente entre 0,8 e 1,6 milhão de unidades taxonômicas procarióticas.
A partir das estimativas referentes a esse universo dos microrganismos, portanto, espera-se que ainda haja muitas possíveis descobertas com grandes potencialidades a serem exploradas (SANTOS et al., 2009). Descobrir novas espécies de bactérias contribui não somente para o desenvolvimento de novas tecnologias, mas também devem ser considerados todos os estudos e suas aplicações que foram e são de grande importância para diversas áreas, tais quais: sustentabilidade, monitoramento ambiental, tratamento de efluentes, biorremediação, reciclagem, mudanças climáticas, ciclos biogeoquímicos, taxonomia, ecologia, origem e evolução, etc. (OLIVEIRA, 2015).
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2.2. TAXONOMIA MICROBIANA
A taxonomia em microrganismos ainda possui poucos registros comparados às estimativas de espécies não catalogadas (MOREIRA et al., 1998). Isso se justifica por enfrentar dificuldades e ainda limitações, como a complexidade para realizar a identificação de uma espécie, pois são necessárias análises em diversos aspectos: morfológicos, fisiológicos, genéticos e bioquímicos (BALLOWS et al., 1991). Tendo em vista que as bactérias, além de terem seu papel fundamental no equilíbrio ecológico, podem trazer benefícios em diversos processos tecnológicos, como em áreas referentes à saúde, alimentos, produção, decomposição de substâncias, etc. O reconhecimento de uma bactéria é importante tanto para contribuir para os registros taxonômicos e dessa forma, compreendermos melhor os ecossistemas, quanto para proporcionar objetos de estudo que podem nos direcionar a descobertas e eficiências (OLIVEIRA, 2015).
O estudo da sistemática permite que consigamos entender a diversidade de organismos e as relações entre eles. A sistemática relaciona a filogenia, que trata da relação evolutiva de uma espécie ou grupo com um ancestral comum, à taxonomia, que nomeia e classifica os organismos em grupos de acordo com suas semelhanças e diferenças em sua naturalidade. Portanto, taxonomia e filogenia são conceitos envolvidos na classificação dos organismos que se relacionam, embora tenham objetivos diferentes (MADIGAN, et al, 2016).
2.3. FILOGENIA MICROBIANA
As árvores filogenéticas, embora hipotéticas, são representações da história evolutiva e os relacionamentos entre as espécies e seus grupos, o que se torna uma ferramenta útil ao classificar os organismos na taxonomia. Na filogenia, uma espécie é conceituada por compartilhar características detectadas e possuir convergências genéticas, indicando possuir um ancestral comum. Esse conceito não baseia-se no modelo evolutivo de especiação, dessa forma, as espécies descritas não necessariamente se unificam em termos ecológicos ou em processos evolutivos, ele foi desenvolvido para facilitar o estudo taxonômico e as justificativas de espécies derivadas, são fundamentadas em sua maioria por avaliação dos taxonomistas (MADIGAN, et al, 2016).
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Tendo em vista esse obstáculo em definir-se uma espécie em microbiologia, especialmente em bactérias, o cientista Carl Woese (FOX et al., 1977) descobriu o gene que codifica a subunidade menor do ribossomo (RNAr 16S) possui propriedades de um bom marcador molecular para estudos de filogenia e reconhecimento de espécies microbianas.
Entre as principais características do gene RNAr 16S destacam-se: a) é um gene universal; b) taxa de mutações relativamente constante ao longo do tempo; c) porções conservadas e variadas com relação à frequência de mutação; d) número de 1540 nucleotídeos é longo o suficiente para análises filogenéticas; e) possui função essencial na célula; f) tem origem ancestral; e g) há pouca ou ausência de taxa de transferência horizontal de genes ribossomais entre organismos.
Atualmente o uso da informação genética se faz mais presente e, com o sequenciamento do DNA, permite que a taxonomia decifre melhor as relações filogenéticas.
A taxonomia microbiana foi substancialmente modificada nas últimas décadas, incluindo novos métodos de identificação de microrganismos e novos critérios para a descrição de novas espécies. A abordagem polifásica da taxonomia possui três tipos de métodos:
fenotípico, genotípico e filogenético, cada um deles contribui e juntos se complementam, para a identificação das bactérias: “A análise fenotípica examina as características morfológicas, metabólicas, fisiológicas e químicas da célula. A análise genotípica considera aspectos comparativos das células no que se refere ao genoma. Esses dois tipos de análise agrupam os organismos com base nas similaridades. Eles são complementados pela análise filogenética, que procura posicionar os organismos em um arcabouço de relações evolutivas utilizando dados de sequências moleculares.” (MADIGAN, et al, 2016).
Para a efetiva abordagem polifásica, faz-se necessário o sequenciamento de regiões de marcadores filogenéticos no genoma, como o gene RNAr 16S citado anteriormente no caso de bactérias. O acesso a essa informação genética se dá inicialmente pela amplificação do gene marcador por meio da técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction).
A PCR é uma clonagem rápida que inicia com o genoma inteiro, sendo possível selecionar a região de interesse do DNA amplificado em várias bilhões de vezes,
“purificando” a região de interesse do genoma. Um par de oligonucleotídeos de DNA é escolhido para flanquear a sequência de nucleotídeos é sintetizado por reações químicas.
Esses marcadores são então utilizados para iniciar a síntese de DNA de fita simples realizada pelo aquecimento do genoma inteiro. A nova fita de DNA é sintetizada por uma reação catalisada in vitro por uma DNA-polimerase purificada e os indicadores permanecem nas
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extremidades 5’ dos fragmentos finais das fitas de DNA produzidas. A cada ciclo, duplica a quantidade de DNA sintetizada no ciclo anterior e essa amplificação de forma geral requer 20 a 30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo servindo de “molde” para o ciclo posterior. O tamanho da sequência clonada de DNA sintético é determinada de acordo com a distância entre os dois iniciadores originais (ALBERTS et al., 2010). A partir do produto da PCR é possível realizar o sequenciamento do fragmento de interesse e realizar análises comparativas em bioinformática.
2.4. O GÊNERO Cellulophaga
O gênero Cellulophaga é um grupo pertencente à Família Flavobacteriaceae, dentro do Filo Bacteroidetes. Este gênero foi inicialmente descrito por Lewin et al. (1969) como
“Cytophaga lytica”, e em seguida foi reclassificado por Johansen et al. (1999) como o novo gênero Cellulophaga. O grupo possui atualmente nove espécies: C. lytica, C. algicola, C.
baltica, C. fucicola, C. pacifica, C. uliginosa, C. tyrosinoxydans, C. geojensis e C.
omnivescoria. O gênero recebeu essa nomeação pela junção das palavras: cellulosum (=celulose) + phagein (=comer), indicando o termo “consumidor de celulose” (EUZEBY, 1997; BOWMAN, 2010), embora não seja inteiramente adequado, pois nenhuma das espécies pertencentes ao gênero é realmente capaz de degradar celulose.
Segundo Bowman et al. (2010), as células pertencentes a esse grupo tem parede do tipo gram-negativa, são aeróbias, com metabolismo oxidativo e possuem forma de bastonete com extremidades arredondadas e dimensões entre 1,5–5 × 0,4–0,8 µm. Em laboratório as Cellulophaga crescem em temperaturas entre 10 e 25 ºC e requerem a presença de íons Na+, além de pH entre 7,0 e 7,5. Essas bactérias são quimiorganotróficas, ou seja, obtêm energia através de reações químicas utilizando moléculas orgânicas como fonte doadora de elétrons.
Todas as espécies fazem hidrólise de ágar, carragenina, gelatina, amido, esculina e formam ácido a partir de carboidratos. Alguns indivíduos do gênero são proteolíticos, degradam elastina e fibrinogênio, além de serem capazes de lisar células eucarióticas vivas ou mortas.
Com exceção da espécie Cellulophaga pacifica, as demais são capazes de degradar carboximetilcelulose. As espécies de Cellulophaga produzem muitas exoenzimas ativas contra polissacarídeos marinhos, especialmente em substâncias produzidas por macroalgas marinhas, como alginatos e ágar. Bactérias do gênero Cellulophaga possuem uma motilidade de deslizamento rápido, que é melhor evidenciada em situações de baixa disposição de
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nutrientes. Em termos ecológicos, elas habitam ecossistemas marinhos e tem distribuição cosmopolita, sendo assim, são encontradas em sedimento costeiro marinho, na coluna d´água, no gelo marinho, na areia, em superfícies de rochas bentônicas marinhas e associados à superfície de micro- e macroalgas.
Uma característica interessante das colônias de Cellulophaga é a produção de uma pigmentação iridescente de padrão esverdeado metálico, o que ocorre principalmente devido à produção de uma zeaxantina carotenóide (LEWIN et al., 1969). A iridescência é um fenômeno óptico que ocorre devido ao espalhamento dos raios de luz. A interação da luz com algumas estruturas físicas de dimensões micro ou nanoscópicas criam um espalhamento de comprimentos de onda específicos que geram os “brilhos” característicos da iridescência.
Uma propriedade dos materiais iridescentes é a organização geométrica e periódica das nanoestruturas, que causa um espalhamento específico a depender do ângulo de incidência da luz (DOUCET et al. 2009).
Figura 1. Fotografias de culturas de Cellulophaga lytica CECT 8139 crescendo aerobicamente a 25 °C, demonstrando o crescimento das colônias bacterianas com iridescência. A) C. lytica crescendo em meio ágar marinho; B) C. lytica em meio ágar marinho em fundo preto (Paper Mate 1% v/v); C) C. lytica em ágar Cytophaga (CYT); D) C. lytica em meio Low Nutrient (LN). Adaptado de Kientz et al., 2016.
Segundo Kientz et al. (2016), a iridescência na espécie Cellulophaga lytica ocorre durante a formação de biofilme, no qual as células estão dispostas num arranjo periódico, criando uma matriz de cristais hexagonais capazes de dar origem à iridescência que é observada (KIENTZ et al., 2016). Esta espécie é uma das únicas estudadas quanto à iridescência em microrganismos, mesmo comparando com outras espécies do mesmo gênero.
Isso se deve ao fato de C. lytica ter sido uma das primeiras Cellulophaga isoladas (LEWIN et al., 1969), mas também pelo fato de que sua iridescência é intensa e facilmente observada
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quando exposta a luz natural (KIENTZ et al., 2016). Ainda assim, os mecanismos que controlam a iridescência em C. lytica ainda não foram completamente elucidados. Por exemplo, sabe-se que alguns fatores abióticos afetam a ocorrência da iridescência em C.
lytica, enquanto outros fatores não têm qualquer efeito. Kientz et al. (2012) testaram a influência do meio de cultura e das condições de crescimento do isolado CECT 8139 de C.
lytica e observou que a iridescência só ocorria quando a bactéria era cultivada em meio de cultura com salinidade marinha. O crescimento em condições frias (psicrofílicas) e de estresse hídrico (anidrobiose) também permitiram a iridescência. As autoras também testaram a incubação na presença e ausência de luz, bem como diferentes ângulos de incidência da luz, mas nenhum desses fatores afetou a produção da iridescência.
2.5. O ISOLADO JOA-1
A bactéria JOA-1 foi isolada no segundo semestre de 2016, em uma amostra de água marinha coletada na praia da Joaquina, Florianópolis/SC. Batizada de JOA-1, esta bactéria foi integrada à coleção de microrganismos do Laboratório de Ecologia Molecular e Extremófilos (LEMEx), coordenado pelo Prof. Dr. Rubens T. D. Duarte da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC). O microrganismo foi isolado em meio de cultura ágar marinho e crescido em temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC) e provisoriamente identificado como pertencente ao gênero Cellulophaga devido à sua iridescência em meio de cultura Ágar Marinho 2216.
Para auxiliar na identificação do isolado JOA-1 foram utilizadas técnicas laboratoriais de rotina que incluem testes morfológicos, bioquímicos e genéticos. Entretanto, estes testes não foram, até o momento, analisados em conjunto a fim de estabelecer a taxonomia do isolado JOA-1.
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3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Analisar as características morfológicas, metabólicas e genéticas apresentadas pelo isolado bacteriano JOA-1 e determinar sua identificação taxonômica.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
JOA-1;
a) Estabelecer a taxonomia do isolado bacteriano JOA-1;
b) Compreender os resultados dos experimentos realizados com a bactéria
c) Comparar o isolado JOA-1 com outras bactérias de seu gênero;
d) Atualizar a árvore filogenética do gênero identificado, incluindo o isolado JOA-1.
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4. METODOLOGIA
Para o desenvolvimento deste trabalho, foi realizada uma revisão bibliográfica do gênero Cellulophaga, bem como análise de resultados obtidos sobre o isolado JOA-1 no Laboratório de Ecologia Molecular e Extremófilos (LEMEx), MIP-CCB, UFSC.
4.1. ISOLAMENTO E CULTIVO INICIAL
O isolado JOA-1 foi obtido a partir de uma amostra de água marinha coletada em outubro de 2016 na Praia Joaquina, Florianópolis-SC. A amostra de água foi transportada até o LEMEx/UFSC e armazenada em geladeira (4 °C) até o isolamento. O microrganismo foi isolado em meio de cultura ágar marinho (15 g de ágar bacteriológico, 5 g de peptona, 1 g de extrato de levedura, 0,1 g de sulfato de ferro, volume final de 1 L de água marinha autoclavada) e crescido em temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC).
4.2. IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR
Para a identificação molecular do isolado JOA-1 foi utilizado o sequenciamento do gene RNAr 16S a partir da amplificação deste gene com a técnica de PCR. Essa técnica de biologia molecular consiste na síntese enzimática de cópias de ácidos nucléicos (COSTA, 2010), com a finalidade de aumentar a quantidade de DNA in vitro e permitir o posterior sequenciamento. Nesse caso, com fins taxonômicos da aplicação dessa técnica em bactérias, a escolha do gene RNAr 16S é vantajosa para um diagnóstico rápido na identificação filogenética bacteriana (GIONGO et al., 2007).
A sequência completa do gene RNAr 16S do isolado JOA-1 foi obtida a partir da amplificação deste gene com os primers 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') e 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') (LANE et al. 1991; TURNER et al. 1999). A sequência foi submetida à ferramenta Classifier do banco de dados Ribosomal Database Project (RDP - Universidade de Michigan, USA) e apresentou maior similaridade (98-99%) com sequências do gênero Cellulophaga.
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A partir desta informação, a sequência foi analisada através da construção de uma árvore filogenética contendo todas as sequências de RNAr 16S de “organismos tipo”
(microrganismos depositados em coleções de cultura) do gênero Cellulophaga. Estas sequências de referência foram obtidas do banco de dados do NCBI/GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov).
As sequências de referência e a sequência do isolado JOA-1 foram alinhadas pelo software Mothur (SCHLOSS et al, 2009). Os nucleotídeos que não foram alinhados nas extremidades 5´ e 3´ das sequências, bem como os espaços (gaps) em comum foram eliminados. O alinhamento resultante foi utilizado na construção de uma árvore filogenética com o método de Máxima Verossimilhança (Maximum Likelihood), utilizando a correção de Felsenstein e bootstrap de 1000 repetições. Uma árvore filogenética foi construída no software ARB (LUDWIG et al. 2004).
4.3. MORFOLOGIA
A morfologia do isolado JOA-1 foi definida a partir dos métodos descritos em Trüper
& Schleifer (2006). O objetivo desta caracterização foi identificar o tipo de parede bacteriana, forma e dimensões das células, arranjo ou formação de agregados celulares, motilidade e a presença de estruturas internas (endósporos, cápsulas, etc.).
Para a identificação da forma, arranjo e tipo de parede foi realizada a coloração de Gram. Para realizar o teste de Gram foi preparado um esfregaço em lâmina de vidro, seguido de fixação por um breve aquecimento em bico de Busen. Foi adicionado o corante cristal violeta por 2 minutos, seguido de lugol pelo mesmo tempo. Essa interação de soluções formam o complexo iodo-pararrosalina na parede celular das bactérias, que coram-se de roxo, tanto as Gram positivas quanto as Gram negativas (BURNETT & SCHUSTER, 1982;
NISENGARD & NEWMAN, 1994). Em seguida foi adicionado solvente álcool-acetona e a lâmina foi lavada em água corrente. As bactérias gram-negativas descolorem-se após a interação com o solvente, uma vez que sua camada de peptidoglicanos e ácidos teicóicos é mais delgada e sua proporção lipídica é mais espessa, dificultando a retenção do corante cristal violeta. Após esta etapa, a lâmina foi corada com o contra-corante safranina por 30 segundos, com a finalidade de tornar corada as células que eventualmente perderam o cristal violeta com o solvente (BURNETT & SCHUSTER, 1982; NISENGARD & NEWMAN,
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1994). Por fim, as células foram observadas em um microscópio óptico Zeiss Primo Star acoplado com câmera Axiocam Erc 5s, sob um aumento de 1000 X.
As dimensões celulares foram obtidas através da coloração de DAPI e observação em microscópio de fluorescência. Foram realizadas mensurações de comprimento e largura de aproximadamente 600 células divididas em pelo menos 20 campos. As células que constituíram 5% das maiores e menores dimensões observadas foram desconsideradas. A média e desvio padrão foi calculado para as 90% mensurações restantes. Esta etapa foi realizada em parceria com os Profs. Leonardo Rorig e José Barufi do Laboratório de Ficologia (LAFIC-UFSC).
A morfologia das colônias do isolado JOA-1 foi determinada conforme o método descrito em Breakwell et al. (2007). Os parâmetros avaliados foram forma, tamanho, borda, brilho, textura, elevação, pigmento (cor) e opacidade. Os testes foram realizados em meio Ágar Marinho a 25 °C.
4.4. METABOLISMO
A caracterização bioquímica do isolado JOA-1 foi realizada conforme os métodos clássicos de provas bioquímicas disponíveis no website da Sociedade Americana de Microbiologia (ASM) e da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (BRASIL, 2004). Alguns meios de cultura foram adaptados para possibilitar o crescimento de Cellulophaga, tal como descrito em Bowman (2000).
As provas bioquímicas realizadas foram: catalase, fermentação de açúcares redutores (glicose, lactose, sacarose, manitol, manose, xilose), Voges Proskauer, utilização de citrato, utilização de proteínas e aminoácidos (lisina, indol), produção de sulfeto de hidrogênio (H2S), motilidade e redução de nitratos.
Os testes de fermentação de açúcares redutores foram realizados em meio de cultura líquida contendo um único tipo de carboidrato como fonte de carbono. A bactéria foi inoculada nos meios de cultura com açúcares e incubada por 24 horas. Após este período, o teste resulta em positivo caso a coloração do meio de cultura passe da tonalidade vermelha para amarela, indicando a fermentação do açúcar.
Para realizar o teste da catalase, ou seja, identificar se o microrganismo em estudo produz a enzima responsável por converter o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água, foi feito o repique do microrganismo na placa de Petri com meio de cultura ideal para o seu
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crescimento e, após o intervalo de 18 a 24 horas de incubação, adicionou-se a solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) sobre a colônia isolada. O resultado é interpretado pela formação ou não de bolhas sobre a colônia, sendo que a formação indica que o microrganismo produz a enzima catalase e tem como resultado dessa reação os subprodutos água e oxigênio, sendo o oxigênio responsável pela formação de bolhas (JORGENSEN et al., 2015).
O teste do indol identifica se a bactéria tem capacidade de converter o triptofano em indol. A reação acontece por uma série de enzimas intracelulares pertencentes ao sistema da triptofanase. Os produtos finais dessa reação bioquímica são indol, ácido pirúvico, amônia e energia. O isolado foi inoculado em meio de cultura caldo triptofano, incubado por 24 a 48 horas e, após esse período, foi adicionado 5 gotas do reagente Kovac no meio de cultura. A indicação do resultado positivo se dá pela aparência da cor vermelha ou vermelho-violeta na camada mais superficial do meio, já o resultado negativo é indicado pela cor amarela. A cor laranja também pode indicar um resultado variável (BACHOON; DUSTMAN; 2008).
Para avaliar a capacidade do isolado em reduzir o nitrato a nitrito, empregou-se o meio de cultura contendo peptona (5,0 g), extrato de carne (3,0 g), KNO3 (1,0 g) e água destilada (1000 mL). Procedeu-se a repicagem da bactéria em três repetições e incubação em temperatura ambiente. Após 48 horas da incubação, foram adicionadas, em cada tubo, duas gotas da solução A (ácido sulfanílico e ácido acético) e duas gotas da solução B (α- naftilamina e ácido acético). A leitura foi realizada pela observação da mudança de cor, sendo a cor marrom-avermelhado indicativa de reação positiva.
O teste do citrato avaliou a capacidade de utilização de citrato de sódio como fonte de carbono. A bactéria JOA-1 foi inoculada em meio Ágar citrato com indicador de pH (azul de bromotimol). A cultura foi incubada por 24 h e após este período foi observado resultado positivo se houver mudança da coloração de verde a azul, sugerindo neste caso um pH > 7,5 em decorrência a alcalinização do meio pela liberação de hidróxido de amônio (NH4OH) e carbonato de sódio (Na2CO3).
Para avaliar a capacidade de descarboxilação de lisina, a bactéria foi inoculada em meio ágar ferro lisina por 24 h e, após crescimento, foi observado se ocorreu mudança da coloração do meio. A prova positiva é considerada pela mudança do indicador (púrpura de bromocresol) de amarelo para roxo, pois a descarboxilação da lisina gera aminas alcalinas (ex.
cadaverina).
O teste Voges-Proskauer (VP) foi realizado com o inóculo da bactéria JOA-1 em meio MR-VP (7,0 g de peptona tamponada, 5,0 g de glicose, 5,0 g de K2HPO4, para 1000 mL
26
de água destilada) e incubação por 24 horas. Após este período, observou-se o teste positivo em caso de mudança de coloração amarelo-laranja para uma tonalidade marrom no meio de cultura, somada à presença de um anel vermelho na superfície do meio (diacetila + alfa- naftol).
A produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) foi determinada a partir da cultura da bactéria JOA-1 em meio SIM (Sulphide-Indole-Motility) e incubação por 24 horas. Após o crescimento, o resultado positivo ocorreu em caso de coloração escura no fundo do tubo, resultando na produção de H2S a partir da degradação do tiossulfato de sódio.
Por fim foi avaliada a amplitude de temperatura de crescimento do isolado JOA-1.
Para isso foi realizado o repique do isolado em meio de cultura ágar marinho e a cultura foi incubada em estufa com temperatura controlada para ser observado a temperatura máxima, mínima e ótima de crescimento da colônia. As temperaturas testadas foram entre 6 e 37 °C.
27
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR
A árvore filogenética do gênero Cellulophaga (Figura 2) foi construída com base no alinhamento de sequências parciais (1273 pb) do gene que codifica a subunidade menor do ribossomo bacteriano (gene RNAr 16S). Para a construção da árvore foi empregado o programa ARB por meio do Método de Máxima Verossimilhança com filtro de máxima frequência entre as posições 1215-41562 do alinhamento, correção de Felsenstein e 1000 repetições de Bootstrap.
Figura 2. Árvore filogenética de sequências do gene RNAr 16S do isolado JOA-1 e outros microrganismos do gênero Cellulophaga. O resultado de Bootstrap em porcentagem está indicado nos nós da árvore. A escala aponta aproximadamente 0,03 substituições de nucleotídeos por posição. Os códigos da sequência no banco de dados GenBank estão representados pelos valores em parênteses. Polaribacter filamentus foi escolhido como membro externo ao gênero Cellulophaga (Arquivo do LEMEX-UFSC).
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A análise filogenética indicou que o isolado JOA-1 possui uma sequência de gene RNAr 16S distinta de outros organismos do gênero Cellulophaga. Entretanto, o limiar de 97%
de similaridade utilizado como padrão para este marcador molecular não se apresentou adequado para diferenciar as espécies do gênero. Por exemplo, as espécies C. geojensis M-M6 e C. omnivescoria possuem RNAr 16S com 99,99% de similaridade, mas ainda assim constituem espécies distintas.
Das espécies do gênero em discussão, JOA-1 apresentou maior similaridade com a Cellulophaga lytica (99%). Dessa forma, existe maior probabilidade para que JOA-1 pertença a essa espécie, no entanto, também não se descarta a possibilidade de ela ser pertencente a alguma outra do gênero ou ainda representar uma nova espécie. As análises morfológicas e bioquímicas são necessárias para melhor compreensão da taxonomia deste isolado.
5.2. CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA
Realizando a observação por meio do microscópio óptico de luz foi possível identificar sua forma de bacilo curvo (Figura 3), seus arranjos sendo mono, diplo e em cadeias (estrepto), sendo o arranjo diplo o predominante.
As dimensões de JOA-1 foram de 0,31 à 0,45 µm (0,38 ± 0,09) de largura, e 2,57 a 4,1 µm (3,34 ± 1,01) de comprimento. Foi possível observar sua motilidade por deslizamento (“gliding”) como descrito em literatura (BOWMAN, 2010; KIENTZ et al. 2016).
Para identificar sua parede celular foi realizado o teste de Gram, chegando ao resultado de ser uma bactéria Gram negativa, o que significa que sua parede celular é constituída de uma fina camada de peptideoglicano que não retém o corante cristal violeta quando são expostas à solventes em que o corante é solúvel.
A parede celular das bactérias Gram-negativas é composta por peptidoglicanos, lipoproteínas, membrana externa e lipopolissacarídeos. Essa arquitetura permite às bactérias Gram-negativas uma nutrição facilitada por meio das suas proteínas de ligação, que auxiliam a captação de açúcares e aminoácidos do meio, além da produção de enzimas que inativam alguns antibióticos (BURNETT & SCHUSTER, 1982; NISENGARD & NEWMAN, 1994).
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Figura 3. Registro de cultura pura do isolado JOA-1 através do microscópio de fluorescência com corante DAPI evidenciando sua forma e arranjos. Aumento de 1000 x com óleo de imersão (Acervo LEMEx, UFSC).
Quanto à morfologia da colônia, a bactéria JOA-1 apresentou o já descrito efeito óptico da iridescência (Figura 4). As estruturas responsáveis pela iridescência observada no gênero Cellulophaga estão sob investigação por microscopia eletrônica, embora se saiba que essas estruturas interagem com a onda luminosa e causam uma mudança na cor e brilho que é possível observar.
O crescimento da JOA-1 em meios de cultura não salinos (meio Luria-Bertani, ágar R2A, e ágar nutriente) resultou em colônias sem iridescência, sugerindo que a salinidade é necessária para a bactéria apresentar o efeito óptico. Esse fenômeno também indica potenciais papéis ecológicos e vantagens seletiva sob condições variáveis em seus habitats, como: alta salinidade, variação de temperatura, dessecação e exposição a luz (KIENTZ et al., 2012).
30
Figura 4. Registro através de lupa estéreomicroscópia de colônia do isolado JOA-1 evidenciando sua iridescência. Aumento de 10 X (Acervo LEMEx, UFSC).
5.3. ANÁLISES METABÓLICAS
Os experimentos de caracterização bioquímica foram realizados conforme a metodologia proposta (Tabela 1).
As provas de fermentação de açúcares não foram conclusivas pois o isolado JOA-1 não foi capaz de crescer nos tubos de cultura. Este resultado pode ser explicado pela ausência de condições salinas adequadas para o crescimento de JOA-1. Apesar disso, a adição de NaCl em diferentes concentrações nos tubos de fermentação podem ter interferido na coloração final, não permitindo uma conclusão destes testes.
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Tabela 1. Resultados dos testes bioquímicos (metabólicos) do isolado JOA-1. Os resultados são apresentados como positivos (+), negativos (-) ou não determinado (n.d.).
Parâmetro Resultado
Motilidade “Gliding” +
Catalase +
Indol -
Degradação de Agar +
Redução de nitrato -
Produção de H2S -
Degradação de Lisina +
Fermentação de α-D-Glucose n.d.
Fermentação de α-D-Lactose n.d.
Fermentação de Maltose n.d.
Fermentação de D-Manitol n.d.
Fermentação de Sacarose n.d.
Fermentação de Citrato -
Teste Voges-Proskauer -
Com relação à temperatura de crescimento, a bactéria JOA-1 apresentou crescimento entre 6° e 30 ºC, sendo que aos 37°C a colônia não cresceu A temperatura ótima de crescimento, ou seja, a temperatura na qual a colônia cresceu com maior velocidade, foi determinada em 28 °C.
5.4. COMPARAÇÃO DO PERFIL METABÓLICO DE JOA-1 E OUTRAS Cellulophaga
Diante da análise do sequenciamento parcial do gene RNAr 16S, obteve-se um resultado insuficiente para identificar JOA-1 no que se refere à espécie. Com essa verificação, entretanto, foi possível o reconhecimento que JOA-1 pertence ao gênero Cellulophaga (JOHANSEN; NIELSEN; SOHØLM, 1999). Esse grupo pertence a família
32
Flavobacteriaceae e as nove espécies do gênero Cellulophaga incluem: Cellulophaga lytica, Cellulophaga algicola, Cellulophaga baltica, Cellulophaga fucicola, Cellulophaga pacifica, Cellulophaga uliginosa, Cellulophaga tyrosinoxydans, Cellulophaga geojensis e Cellulophaga omnivescoria.
Figura 5. Fotografia das culturas de Cellulophaga evidenciando a iridescência verde metálica.
A) C. lytica; B) Isolado JOA-1 (A - Kientz et al. 2012; B - Acervo do LEMEx/UFSC).
O Manual de Bergeys (BOWMAN, 2010) relata que os representantes de Cellulophaga formavam somente um agrupamento de genes RNAr 16S, composto por dois subgrupos: Cellulophaga lytica e Cellulophaga fucicola formariam um subgrupo, enquanto Cellulophaga algicola, Cellulophaga baltica e Cellulophaga pacifica constituiriam o outro subgrupo. As demais espécies do gênero não foram citadas e duas delas ainda não haviam sido descritas. Os dois subgrupos se diferenciam em aproximadamente 5-6% em termos de sequência do gene RNAr 16S. Inserindo outras espécies hoje conhecidas de Cellulophaga, a subdivisão do gênero apresenta C. lytica, C. fucicola, C. geojensis e C. omnivescoria formando um subgrupo, e C. algicola, C. baltica, C. pacifica e C. tyrosinoxydans formando o segundo subgrupo. A análise filogenética agrupou o isolado JOA-1 dentro do primeiro subgrupo, próxima a C. lytica (Figura 2).
Por meio de consulta aos estudos com as espécies pertencentes ao gênero Cellulophaga - C. fucicola (JOHANSEN et al. 1999), C. baltica (JOHANSEN et al. 1999), C.
lytica (LEWIN et al., 1969; REICHENBACH 1989), C. algicola (BOWMAN 2000), C.
Uliginosa (BOWMAN, 2000; BARBEYRON, et al., 2001), C. pacifica
33 (NEDASHKOVSKAYA et al., 2004), C. tyrosinoxydans (KAHNG et al. 2009), C. geojensis (PARK et al. 2012) e C. omnivescoria (VALDEHUESA et al. 2018.) - foi preparada uma tabela comparativa das características que as espécies compartilham ou as diferenciam (Tabela 2).
34
Tabela 2. Características gerais das espécies representantes do gênero Cellulophaga e do isolado JOA-1.
Espécie
C. fucicola (Johansen et al. 1999)
C. baltica (Johansen et al. 1999)
C. lytica (Lewin, 1969;
Reichenbac h 1989)
C. algicola (Bowman 2000)
C. uliginosa (Bowman 2000) Barbeyron et al 2001
C. pacifica (Nedashkov skaya 2004)
C.
tyrosinoxyda ns (Kahng et al. 2009)
C. geojensis (Park et al.
2012)
C.
omnivescori a
(Valdehuesa et al. 2018.)
JOA-1
Habitat Marinho Marinho Marinho Marinho Marinho Marinho Marinho Marinho Marinho
Localização geográfica
Alga parda (Fucus serratus), Mar do
Alga parda (Fucus serratus), Mar do
Sedimento de praia,
Diatomáceas de costa marinha e
Sedimentos marinhos rasos
Mar do Japão, Oceano
Costa oriental da Ilha Geju,
Areia marinha da Ilha de
Isolado de algas vermelhas em Yeosu,
Água marinha, Praia da Joaquina, Norte,
Oceano Atlântico
Norte, Oceano Atlântico
Costa Rica gelo marinho (ZoBell,
da Antártica 1944) Pacífico Coréia do Sul
Geoje,
Korea. Coréia do Sul.
Florianópoli s-SC, 2016
Isolado NN015860T NN015840T ATCC
23178T
ACAM 630T
KMM 3664T KMM 3669 KMM 3915
EM41T M-M6T JCM 32108T JOA-1
Morfologia
Forma Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
35
Tamanho
Largura:
0,23 - 0,30 µm Comprim.:
1,0 a 2,5 µm
Largura:
0,31 - 0,45 µm (0,38 ± 0,09) ; Comprim.:
2,57- 4,1 µm (3,34 ± 1,01)
Arranjo Mono, diplo Mono, diplo
Mono, diplo ou cadeias Largura: Largura: Largura: 0,4 Largura: 0,4 Largura: Largura: 0,4 Largura: 0,5
0,7-0,8 µm 0,6-0,8 µm µm – 0,5 µm 0,5-0,7 µm - 0,6 µm - 0,8 µm
Comprim.: Comprim.: Comprim.: Comprim.: Comprim.: Comprim.: Comprim.:
2,5-4,7 µm 2,2-4,5 µm 1,5-3,5 µm 1,5 – 4 µm 2,7-5,3 µm 1,3 a 2,2 µm 2,0 a 6 µm
ou cadeias ou cadeias (geralmente
diplo)
Parede Gram - Gram - Gram - Gram - Gram - Gram - Gram - Gram - Gram - Gram -
Entre 2-12 Entre 2-12 As colônias Em meio
°C e a 30 °C: °C e a 30 °C: são ágar marinho
redonda, redonda, 2 dias, 20°C: circulares, 2216 a 25°C;
lisa, lisa, colônias levemente levemente Em meio Levemente
levemente levemente circulares convexa, convexa e ágar marinho convexas,
convexa com convexa com irregulares. brilhantes circulares 2216, borda
Morfologia colônia borda borda Bordas com bordas com levemente irregular tipo
irregular tipo irregular tipo redondas ou inteiras, margens convexa e “chamas”.
“chamas” “chamas” cônicas. fracamente inteiras. circulares, Iridescência
Entre 18-26 Entre 18-26 Meio ágar afundado Cresce em lisas, verde opaca
°C: varia °C: varia 2216. ágar e 1 a 3 AM, mas
conforme conforme mm de não em ágar
substrato substrato diâmetro em R2A, ágar
36
TSA ou CYT
TSA ou CYT
ágar marinho LB, TSA ou
2216. AN
Pigmentos:
Cor da colônia
Amarelo alaranjado (2-30°C) com aspecto metálico entre 18-26
°C
Amarelo alaranjado (2-30°C) com aspecto metálico entre 18-26
°C
Amarelo brilhante
Amarelo alaranjado no centro e pigmentação mais clara nas bordas.
São produzidos pigmentos amarelos não difusíveis.
Amarelo Amarelo brilhante
Amarelo e amarelo alaranjado
Amarelo brilhante
Metabolismo:
deslizamento (gliding)
‰ KOH)
Formação de endósporo - - -
Motilidade por
+ + + + + + + + +
Pigmento flexirubina (20
- - - + -
Temperatura (range) 2-30 °C 2-30 °C 2-28 °C 4-34°C 15-35,6ºC 4-40°C 6 - 30°C
Temp. máxima 35 °C 35 °C 35-40 °C 20-25°C 30-37 °C
Temp. ótima 26-30°C 26-30°C 22-30 °C 15-20 °C 25-30ºC 25°C 28°C 28°C
pH (4 dias) 7-8 7-8
pH (10 dias) 9 (fraco) 9 (fraco)
37
pH 6,5-9,0 5-9,5
pH ótimo 7,5 7,5-8,5 7,0-8,5 7-8 7-7,5
NaCl máx (%) 50 50 10 10 7 15
NaCl ótimo (%) 10 10 8 2 2-4 2 8
Catalase + + + + + + + +
Oxidase - - + + + + -
Indol - - -
Fosfatase alcalina +
Carragenina + + + - + +
Caseina
+ + - + - - +
Celulose (endo-cellulase)
+ + + + + - +
Elastina + + - -
Fibrinogenio - + - -
Gelatina - + - + + + + +
Amido + + + + + + + -
Quitina - - - - + +
38
Tirosina + + + - +
Redução nitrato p/ nitrito - + - + + + - - -
Ureia - - - - - - -
Produção H2S - - - -
Lisina +
Genética:
G+C (mol%) 32,40% 33,00% 33% 37,1% 42% 31,6% 33,50% 35,40% 32%
Carboidratos:
Tween 20 + + + - + + +
Tween 40 + - + + + +
Tween 60 + + +
Tween 80
+ + + + + + + +
L-Arabinose + - - - + -
D-Arabitol - +
D-Frutose + + + - + -
D-Manitol - - + - - +
39
N - Acetilglucosamina
D-Manose - + - + + +
- - - - + +
Glicerol - - + - -
Citrato -
VP -
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A organização dos dados da Tabela 2 permitiu comparar as características morfológicas, metabólicas e genéticas das espécies de Cellulophaga com o isolado JOA-1.
Em termos de morfologia, o isolado JOA-1 apresenta as mesmas características que outras Cellulophaga, sendo uma célula com forma de bacilo, arranjos que variam de mono a diplo e parede do tipo Gram negativa. Além disso, as dimensões de JOA-1 também são similares aos outros organismos do grupo (largura 0,31 - 0,45 µm, comprimento 2,57 - 4,1 µm). A motilidade de todas as espécies é através de deslizamento (“glidding”).
A comparação metabólica do gênero Cellulophaga revelou que há uma variabilidade de perfis metabólicos. Com base na subdivisão observada na análise filogenética, as espécies que formam o subgrupo 1 (C. lytica, C. fucicola, C. geojensis e C. omnivescoria) apresentaram alguns metabolismos em comum, tais como a incapacidade de redução do nitrato (NO3-) até nitrito (NO2-), a não produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) e a incapacidade de fermentar D-manose. Considerando esses fenótipos, o isolado JOA-1 apresentou resultados idênticos ao subgrupo 1, reforçando a classificação dele conforme apontado pela análise filogenética.
A classificação definitiva de JOA-1 como uma espécie nova depende de outras análises, incluindo a análise genética por hibridização DNA:DNA e sequenciamento genômico, degradação de proteínas (caseína, gelativa e elastina), teste da oxidase, e principalmente da análise da fermentação de açúcares redutores. Entretanto, a árvore filogenética construída já aponta para uma diferença entre JOA-1 e C. lytica (o organismo mais próximo), sugerindo que se o metabolismo desses dois grupos for diferente, provavelmente JOA-1 se posiciona como uma nova espécie de Cellulophaga.
41
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este trabalho apresentou as informações existentes até o momento sobre a bactéria JOA-1, por meio dos dados coletados pelo LEMEx diante aos experimentos realizados e por relações comparativas através da pesquisa bibliográfica com espécies que pertencem ao mesmo gênero desse microrganismo. Para chegarmos nos principais pontos analisados, foi necessário contextualizar a diversidade, taxonomia e filogenia microbiana, além de explorar o gênero Cellulophaga e comparar as características das espécies que o constituem com o isolado JOA-1.
Espera-se que os resultados apresentados neste estudo colaborem para a identificação de qual espécie gênero Cellulophaga esse isolado pertence, ou, se for o caso, seja reconhecida e descrita como uma nova espécie. Espera-se também possibilitar novos estudos e possíveis aplicações desse microrganismo a partir desta pesquisa.
6.1. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Analisar a morfologia da colônia, formação de endósporo, testes de temperatura, pH max., pH min., pH ótimo, NaCl max., NaCl min., NaCl ótimo, TSA com diferentes percentuais de sais marinhos.
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REFERÊNCIAS
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BOWMAN, J. P. 2010. Genus IX. Cellulophaga Johansen, Nielsen and Sjøholm 1999, 1238VP. In KRIEG NR, et al.. (Ed), Bergey’s manual of systematic bacteriology, 2nd ed., vol. 4, p. 948.
