FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
IARA TERSIA FREITAS MACEDO
ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE
PLANTAS DO NORDESTE BRASILEIRO
IARA TERSIA FREITAS MACEDO
ATIVIDADE ANTI-HELMÍNTICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS
DO NORDESTE BRASILEIRO
Tese apresentada ao programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de pequenos ruminantes.
Orientador (a): Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Bibliotecário(a) Responsável – Giordana Nascimento de Freitas CRB-3/1070
IARA TERSIA FREITAS MACEDO
M141a Macedo, Iara Tersia FreitasAtividade anti-helmíntica de óleos essenciais de plantas do nordeste brasileiro / Iara Tersia Freitas Macedo. — 2012.
CD-ROM. 120f. il. (algumas color) ; 4 ¾ pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm)”.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária, Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2012.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade animal. Orientação: Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua.
Co-orientação: Profa. Dra. Ana Lourdes Fernandes Camurça Vasconcelos.
1. Fitoterapia. 2. In vivo. 3. In vitro. 4. Meriones unguiculatus. 5. Ovinos. 6.
Haemonchus contortus. I. Título.
Aos meus pais, Antônio Albuquerque de Macedo e Adeilza Freitas de Carvalho; Á Deus
AGRADECIMENTOS
À Deus por sua grande misericórdia me guiando e dando forças em mais esta etapa da minha vida.
À FUNCAP e o CNPq pelo apoio financeiro fundamental durante estes anos de trabalho.
À professora Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua por ter me ensinado e acompanhado durante todo esse período, pelo incentivo, paciência e acima de tudo, amizade e orientação.
Ao Dr. Marcel Teixeira, à Dra. Ana Carolina Fonseca Lindoso Melo e à Dra. Lúcia de Fátima Lopes dos Santos por terem gentilmente aceitado participar da banca de doutorado e colaboração na defesa da tese.
Ao professor Dr. Haroldo Cesar Beserra de Paula pela ajuda e colaboração que foram importantes para a concretização e aos membros do seu Laboratório de Química de Biopolímeros-UFC, especialmente o mestrando Erick Falcão pelo nanoencapsulamento.
À todos os meus companheiros do Laboratório de Doenças Parasitárias – PPGCV-UECE, que contribuíram para realização deste projeto e estiveram ao meu lado durante este período, Ana Carolina Rodrigues, Cícero Temístocles, Eudson Maia, Fernanda Cristina, Maria Vivina, Michelline do Vale, Juliana de Carvalho, Mayara de Aquino, Rafaella Albuquerque, Marina Parissi, Vitor Luz, Diana Romão, Vilemar Júnior, Andressa Panassol, João Batista, Rafaele de Almeida, Jessika Nunes, Aline Araguão, Camila de Albuquerque, Fabrício Rebouças, Renata Simões, Bruno Granjeiro, Roberta da Rocha. Em especial, Ana Lourdes, Wesley Lyeverton, Kaline das Chagas, Jessica Maria e minhas amigas Lorena Mayana e Sthenia Santos cuja ajuda foi de fundamental importância para a realização desse trabalho.
À Dra Selene Maia de Morais e os membros do seu Laboratório de Produtos Naturais-UECE , pela disponibilidade de realização da extração e análise dos produtos, principalmente, a doutoranda Lyeghyna Karla Machado e o agronômo Raimundo Menezes.
Aos membros do Laboratório de Análises de Traços-UFC, em especial o Prof. Ronaldo Ferreira e os doutorandos Clerton Linhares e Ari Clecius, por terem disponibilizado os equipamentos para análise dos óleos essenciais.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), em especial ao Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha e ao Prof. Dr. Davide Rondina, que coordenaram o Programa durante o doutorado.
Aos funcionários do fazenda Piamarta-Itaitinga, pela atenção e colaboração na realização experimento com ovinos, especialmente ao Sr. Lino, Sr. Luciano e o Sr. Carlos.
Ao doutorando Rosivaldo Quirino pela colaboração na defesa da tese.
Aos funcionários PPGCV-UECE, Selmar Alves, Antônio César, Elisangela e Adriana Maria Sales, que em muito ajudaram durante o doutorado.
À minha família que sempre me apoiou, principalmente nos momentos difíceis da realização deste trabalho, em especial a meu pai Antonio Albuquerque de Macedo e minha mãe, Adeilza de Andrade Freitas, exemplo de dedicação.
Aos meus irmãos, Inês Freitas de Carvalho e Tarcisio Freitas de Carvalho Junior, pelo companheirismo e pela amizade que nos une.
Ao meu namorado, Ronny Nunes de Araújo, pelo amor, carinho e compreensão.
RESUMO
O parasitismo por nematoides gastrintestinais representa um dos principais problemas para a produção de ovinos e caprinos. Plantas com atividade anti-helmíntica vêm sendo pesquisadas como uma alternativa de controle destes parasitos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade anti-helmíntica de óleos essenciais e decoctos de Lantana camara, Tagetes minuta,
Coriandrum sativum, Mentha villosa, Alpinia zerumbet e Cymbopogon citratus. Os óleos
foram avaliados in vitro através dos testes de eclosão de ovos (TEO) e de desenvolvimento larvar (TDL) com Haemonchus contortus. Os decoctos foram avaliados in vitro usando o TEO e o teste de desembainhamento artificial larvar sobre H. contortus. O óleo essencial de
C. citratus (OECc) na dose de 800 mg/kg foi avaliado in vivo utilizando Meriones unguiculatus (gerbis) infectados experimentalmente com H. contortus. Posteriormente, OECc
foi submetido ao processo de nanoencapsulamento utilizando como matriz a quitosana, para a formação de uma nanoemulsão contendo o óleo esssencial de C. citratus nanoencapsulado (OECcN). Posteriormente, foi realizada a avaliação da atividade anti-helmíntica in vivo com ovinos naturalmente infectados com nematoides gastrintestinais utilizando as doses de 500 mg/kg do OECc e 450 mg/kg do OECcN. As concentrações efetivas que inibiram em 50% (CE50) a eclosão das larvas foram de 0,9; 0,6 e 0,5 mg/mL para os decoctos de A. zerumbet,
T. minuta e M. villosa. Os decoctos inibiram o desembainhamento larvar de H. contortus na
concentração de 310µg/mL para A. zerumbet e M. villosa e na concentração de 620µg/mL para T. minuta e L. camara. As CE50 obtidas no TEO e TDL para os óleos essenciais de A.
zerumbet, C. sativum, T. minuta e C. citratus foram de 0,9 e 3,8 mg/mL; 0,6 e 2,8 mg/mL;
0,53 e 1,6 mg/mL; 0,14 e 1,9 mg/mL, respectivamente. OECc teve eficácia de 38,5% na redução da carga parasitária de H. contortus em gerbis. No teste in vivo com ovinos, OECc e OECcN apresentaram eficácia de 48,9 e 69,2% na redução da eliminação de ovos de nematoides gastrintestinais nas fezes de ovinos e eficácia de 52,9% e 71,2% sobre redução da carga de H. contortus, respectivamente. O óleo essencial de C. citratus demonstrou eficácia anti-helmíntica a qual foi aumentada após o nanoencapsulamento, no entanto, não foi obtido o nível terapêutico de anti-helmínticos comerciais.
Palavras-chave: Fitoterapia. In vivo. In vitro. Meriones unguiculatus. Ovinos. Haemonchus
ABSTRACT
Gastrointestinal parasites represent one of the main problems for sheep and goat production. Plants with anthelmintic activity are being researched as alternative for the control of these parasites. The objective of this work was to evaluate the anthelmintic activity of essential oils and decoctions of Lantana camara, Tagetes minuta, Coriandrum sativum, Mentha villosa,
Alpinia zerumbet and Cymbopogon citratus. The oils were evaluated in vitro through egg
hatching test (EHT) and larval development test (LDT) against Haemonchus contortus. The decoctions were evaluated in vitro using EHT and artificial exsheathment larval on H.
contortus. The C. citratus essential oil (CcEO) in dose of 800 mg/kg was evaluated in vivo
using Meriones unguiculatus (gerbils) experimentally infected with H. contortus. Subsequently, CcEO was subjected to the nanoencapsulation process using chitosan as matrix, for the forming a nanoemulsion containing C. citratus essential oil nanoencapsuled (CcEOn). This was followed by the evaluation of anthelmintic activity in vivo with sheep naturally infected with gastrointestinal nematodes using doses of 500 mg/kg of CcEO and 450 mg/kg of CcEOn. The effective concentrations that inhibited 50% (EC50) larvae hatching were 0.9; 0.6 e 0.5 mg/mL for decoctions A. zerumbet, T. minuta and M. villosa. The decoctions were effective in inhibiting exsheathment H. contortus larvae in the concentration of 310μg/mL for A. zerumbet and M. villosa and the concentration of 620μg/mL for T. minuta and L. camara. The EC50 obtained in EHT and LDT for essential oils of A. zerumbet, C.
sativum, T. minuta and C. citratus were 0.9 and 3.8 mg/mL; 0.6 and 2.8 mg/mL; 0.53 and 1.6
mg/mL; 0.14 and 1.9 mg/mL, respectively. OECc had efficacy of 38.5% in reducing the H.
contortus parasitic load of gerbils. The in vivo test using sheep, CcEO and CcEOn present
efficacy of 48.9 and 69.2% in reduction of the elimination of eggs gastrointestinal nematode in the feces of sheep and effectiveness of 52.9% and 71.2% on reduction of H. contortus burden, respectively. The C. citratus essential oil showed anthelmintic efficacy, which was increased after nanoencapsulation, however it was not yet obtained the therapeutic level of commercial anthelmintics.
Keywords: Phytotherapy. In vivo. In vitro. Meriones unguiculatus. Sheep. Haemonchus
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1. Folhas, flor e fruto de Lantana camara 24
Figura 2. Folhas e flores de Tagetes minuta 25
Figura 3. Folhas de Mentha villosa 26
Figura 4. Folhas e frutos de Coriandrum sativum 27
Figura 5: Folhas e flores de Alpinia zerumbet 27
Figura 6: Folhas de Cymbopogon citratus 28
CAPITULO I
Figure 1. Effect of 310µg/ml of Alpinia zerumbet decoction, with or without addition of PVPP, on the process of artificial in vitro exsheathment of
Haemonchus contortus third-stage larvae.
39
Figure 2. Effect of 310µg/ml of Mentha villosa decoction, with or without addition of PVPP, on the process of artificial in vitro exsheathment of
Haemonchus contortus third-stage larvae.
39
Figure 3. Effect of 620µg/ml of Tagetes minuta decoction, with or without addition of PVPP, on the process of artificial in vitro exsheathment of
Haemonchus contortus third-stage larvae.
Figure 4. Effect of 620µg/ml of Lantana camara decoction, with or without addition of PVPP, on the process of artificial in vitro exsheathment of
Haemonchus contortus third-stage larvae.
40
LISTA DE TABELAS
CAPITULO I
Table 1. Mean efficacy (percentage of reduction inhibition of egg hatching) ± standard error by decoction of Lantana camara (DLc), Alpinia zerumbet (DAz), Tagetes minuta (DTm) and Mentha villosa (DMv) on Haemonchus contortus egg hatching.
38
CAPITULO II
Table 1. Mean efficacy (± standard error) of Lantana camara, Alpinia zerumbet,
Coriandrum sativum and Tagetes minuta essential oils on Haemonchus contortus egg
hatching.
53
Table 2. Mean efficacy (± standard error) of Alpinia zerumbet, Coriandrum sativum,
Tagetes minuta and Lantana camara essential oils on Haemonchus contortus larval
development.
54
Table 3. Effective concentration (mg mL-1) to inhibit 50% (EC50) of egg hatching test (EHT) and larval development test (LDT) of Alpinia zerumbet, Coriandrum sativum,
Tagetes minuta and Lantana camara essential oils on Haemonchus contortus.
54
Table 4. Percentage relative composition of Alpinia zerumbet, Lantana camara, Tagetes
minuta and Coriandrum sativum essential oils.
55
CAPITULO III
Table 1. Mean efficacy (± standard error) of Cymbopogon citratus essential oil, decoction and citral on Haemonchus contortus egg hatching.
72
Table 2. Mean efficacy (± standard error) of Cymbopogon citratus essential oil, decoction and citral on Haemonchus contortus larval development.
73
Table 3. Mean efficacy and Haemonchus contortus burden (± standard error) in
Meriones unguiculatus (gerbil) treated with 800 mg/kg of Cymbopogon citratus essential
oil.
73
CAPITULO IV
Table 1. Mean efficacy (± standard error) of Cymbopogon citratus essential oil and nanoencapsulated oil on Haemonchus contortus egg hatching.
89
Table 2. Mean efficacy and epg ( standard error) of 500 mg/kgCymbopogon citratus
essential oil and 450 mg/kg nanoencapsulated oil on sheep gastrointestinal nematodes.
89
Table 3. Nematode infective larval (%) recuperated in coprocultures of sheep before and after treatment with 500 mg/kg Cymbopogon citratus essential oil and 450 mg/kg
nonoencapsulated oil.
90
Table 4. Mean efficacy and worm burden ( standard error) of 500 mg/kgCymbopogon citratus essential oil and 450 mg/kg nonoencapsulated oil on sheep gastrointestinal nematodes.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AFA- Alcohol, formol, acetic acid and water;
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior;
CE50/EC50 - Concentração efetiva p/ inibir 50% da eclosão dos ovos ou desenvolvimento das larvas/Effective concentration to inhibit 50% of egg hatching or larval development;
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico; DAz- Decoctions of Alpinia zerumbet;
DCc- Decoction of Cymbopogon citratus; DLc- Decoctions of Lantana camara; DMv- Decoctions of Mentha villosa; Dp/sd – Desvio padrão/ Standart Deviation; DTm- Decoctions of Tagetes minuta; EP/SE – Erro padrão/ Standart error;
FUNCAP - Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico; GC- Gas chromatography;
Kg/g/mg - Kilograma/Grama/Miligrama; L/mL/L – Litro/Mililitro/Microlitro; L1/L3- First/third stage larvae; MS- Mass spectrometry;
OECc /CcEO - Óleo essencial de Cymbopogon citratus/ Cymbopogon citratus essential oil OECcn/nCcEO- Óleo essencial de Cymbopogon citratus nanoencapsulado/ nanoencapsulated
C. citratus essential oil;
OPG/EPG – Ovos por grama de fezes/ Egg counts per gram of feces; PVPP-Polyvinyl polypyrrolidone;
PBS- Phosphate buffer solution;
SUMÁRIO 1) INTRODUÇÃO--- 13 2) REVISÃO DE LITERATURA --- 14 2.1) Nematoides gastrintestinais--- 14 2.2) Uso de anti-helmínticos--- 15 2.3) Plantas medicinais --- 16 2.4) Óleos essenciais --- 18 2.5)Nanoncapsulamento --- 20 2.5.1) Quitosana--- --- 23
2.6) Plantas do Nordeste brasileiro --- 24
1. INTRODUÇÃO
O parasitismo por nematoides gastrintestinal constitui-se num dos fatores limitantes para a produção de caprinos e ovinos em todo o mundo, especialmente nas regiões tropicais, onde os prejuízos econômicos são mais acentuados (PINHEIRO et al., 2000). Dentre os nematoides gastrintestinais que comprometem a sobrevivência e produtividade de ovinos e caprinos, destaca-se Haemonchus contortus, sendo individualmente o mais importante de todos devido a sua maior patogenicidade, prevalência e intensidade (URQUHART et al., 1998).
O método mais utilizado para controlar o parasitismo gastrintestinal nos pequenos ruminantes é o controle químico através do uso de anti-helmínticos desenvolvidos e empregados para controlar as nematodeoses e reduzir as perdas causadas pelo parasitismo (JACKSON E MILLER, 2006). No entanto, o uso intenso e contínuo destes produtos tem favorecido o desenvolvimento de populações de nematoides resistentes, sendo um dos mais importantes e atuais problemas do controle do parasitismo (MELO et al., 2009). Além da resistência, os anti-helmínticos disponíveis no mercado possuem algumas limitações, tais como, alto custo, resíduos nos alimentos e risco de poluição ambiental (WALLER, 2006) e redução da eficiência na produção de ovinos e caprinos devido à baixa eficácia.
O uso do controle químico não tem sido suficiente para controlar o parasitismo, além disto, a tendência pela valorização dos produtos orgânicos, originários de sistemas de produção em que o uso dos quimioterápicos é restrito ou proibido, tem estimulado a busca por abordagens alternativas de controle que ofereçam a perspectiva de não apenas reduzir a dependência da quimioprofilaxia, mas ao fazê-lo, ajudar a manter a eficácia dos atuais anti-helmínticos que são importantes para o controle de nematóides gastrintestinais (CEZAR E BIANCHIN, 2008). Tendo em vista esta problemática, a fitoterapia que etimologicamente significa tratamento por meio de plantas, é uma das alternativas que vem sendo pesquisada como auxiliar no controle das parasitoses gastrintestinais de pequenos ruminantes (ALMEIDA et al., 2006). Busca-se com a utilização da fitoterapia, promover a redução nos custos da produção e desenvolver uma estratégia para tentar minimizar a resistência que vem sendo desenvolvida pelos nematóides gastrintestinais (VIEIRA, 2008).
essenciais citadas pelo uso popular como anti-helmínticas encontram-se Lantana camara (cambará), Tagetes minuta (cravo-de-defunto) e Mentha villosa (hortelã) (ALBUQUERQUE et al., 2007) Coriandrum sativum (coentro) (HUSSAIN et al., 2008), Alpinia zerumbet (colônia) (ALMEIDA, 1993) e Cymbopogon citratus (capim santo) (RITTER et al., 2012).
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Nematoides gastrintestinais
A caprinovinocultura é uma atividade pecuária em expansão e praticada em todo o Brasil, com ênfase maior na região Nordeste, onde tem sido promovida no sentido de garantir à população uma fonte de renda, além de fornecer carne e leite, fontes proteicas, que passam a fazer parte da dieta desta população (AHID et al., 2007). A região Nordeste concentra aproximadamente 91% e 56% do efetivo dos rebanhos de caprinos e ovinos brasileiros, respectivamente (IBGE, 2010). Estes dados mostram a importância desta atividade para a balança econômica. Entretanto, a produtividade nesta região ainda é baixa, devido a vários fatores, entre eles a verminose gastrintestinal. Esta parasitose, constitui um dos mais importantes problemas do rebanho nacional e está presente em todos os sistemas de produção, representando grande parcela de prejuízo (MARTINS-FILHO E MENEZES, 2001).
Várias espécies de nematoides gastrintestinais parasitam ovinos e caprinos, entre estas se destacam: Haemonchus contortus, Trichostrongylus colubriformis, Cooperia pectinata,
Cooperia punctata e Oesophagostomum spp (SOUZA et al., 2012). Estudos têm mostrado
infecções com grande número de parasitas podem apresentar anorexia e diarréia (FURTADO, 2006).
As perdas causadas por nematóides são determinadas, não somente pelos efeitos agudos da doença, que, em muitos casos resultam em morte do animal afetado, mas, principalmente, pelos efeitos de infecções prolongadas que levam a um desenvolvimento corporal lento, perda de peso, redução na produção de carne e lã e custos monetários para o controle da verminose, incluindo o valor da aquisição do produto anti-helmíntico comercial e da mão-de-obra para a aplicação do medicamento (FURTADO, 2006). O controle destes parasitos é usualmente realizado com anti-helmínticos, visando reduzir os níveis de infecção dos animais e promover a descontaminação das pastagens (WALLER, 2006).
2.2. Uso de anti-helmínticos
Para prevenir ou minimizar perdas na produção ocasionadas pelo parasitismo gastritestinal, utilizam-se anti-helmínticos. Atualmente, existem disponíveis para tratamento e controle de nematóides três grupos anti-helmínticos de amplo espectro benzimidazóis, imidotiazóis/ tetraidropirimidinas e lactonas macrocíclicas (avermectinas e milbemicinas); e dois grupos de baixo espectro as salicilanilidas e os organofosforados (COLES et al., 2006). Após o surgimento dos benzimidazóis na década de 1960, uma nova classe de anti-helmínticos foi introduzida no mercado a cada década. Entretanto, a perspectiva de um fluxo contínuo de novas classes de anti-helmínticos não foi realizada, e durante o período de 25 anos pós-ivermectina não houve a introdução de uma nova classe no mercado. Os investimentos na descoberta e desenvolvimento de novos anti-helmínticos foram reduzidos e há poucas novas drogas candidatas no horizonte (KAPLAN, 2004). Uma destas é a recém-descoberta classe de anti-helmínticos derivados da amino-acetonitrila, que apresenta compostos sintéticos com alta atividade contra nematóides gastrintestinais, incluindo sobre os isolados que são resistentes a classes de amplo espectro já disponíveis comercialmente (KAMINSKY et al., 2008). O monepantel é o primeiro componente desenvolvido desta nova classe.
primeira manifestação em uma população de nematoides é o aumento de indivíduos capazes de sobreviver a uma dose de anti-helmíntico que seria letal para a maioria dos nematoides de uma população sensível da mesma espécie (TORRES-ACOSTA E HOSTE, 2008).
O grupo de anti-helmínticos já disponíveis comercialmente necessita de uma maior diversidade química. Entretanto, é importante salientar que a busca por novas moléculas anti-helmínticas que venham a colaborar no rodízio com as atuais drogas é um processo difícil e oneroso (WALLER, 2006). Desta forma, devido à limitação no número de alternativas terapêuticas e profiláticas, os compostos anti-helmínticos devem ser respeitados como recursos preciosos para serem usados adequadamente, porque o uso excessivo de qualquer ferramenta pode torná-la fraca ou sem efeito (JACKSON E MILLER, 2006). Desta forma, tem-se intensificado a busca por métodos alternativos de controle do parasitismo. Existe uma considerável e aparentemente expansão do interesse mundial em práticas tradicionais de saúde, tanto em países industrializados como em desenvolvimento, incluindo a utilização de plantas. Para pequenos produtores de países em desenvolvimento, remédios tradicionais à base de plantas locais oferecem uma alternativa aos caros e muitas vezes inacessíveis anti-helmínticos comerciais (WALLER E THAMSBORG, 2004).
2.3. Plantas Medicinais
A utilização de produtos de origem vegetal como fonte de princípios ativos para tratamento de enfermidades é prática bastante utilizada, sendo esta tão antiga quanto à civilização humana (BARBOZA et al., 2007). As plantas são produtoras de substâncias químicas que podem ter atividade sobre outros organismos vivos. Baseado nessa possibilidade é que se procuram os efeitos terapêuticos para o tratamento de doenças, bem como a redução de problemas sanitários que comprometem a produtividade dos animais (NIEZEN et al., 1996). Com a evolução da ciência, intensificaram-se os estudos sobre as plantas medicinais, relacionando sua composição química aos efeitos, confirmando, muitas vezes, a sua utilização popular (FRANCO, 2005).
um fitoterápico demanda consideravelmente menos investimento econômico podendo ser perfeitamente praticável em países em desenvolvimento (CALIXTO, 2000).
As primeiras drogas orgânicas puras foram obtidas de plantas, que continuam a servir como fonte de novas e valiosas opções (THOMPSON, 1996) além de apresentarem vantagens ambientais já que são produtos biodegradáveis e seu suprimento é autossustentável devido à diversidade da flora medicinal (HAMMOND et al., 1997). O uso de plantas como medicamento é uma prática bastante difundida pela população em geral, porém sem a devida comprovação do nível de segurança e da atividade biológica. Vale ressaltar que o correto aproveitamento das plantas medicinais e seus derivados têm como etapa inicial obrigatória a sua validação pela pesquisa, envolvendo vários testes que visam confirmar a eficácia bem como determinar a segurança de sua utilização em organismos vivos (MATOS, 1995).
A maioria das plantas com atividade antiparasitária possui compostos diretamente ativos contra os parasitos. Obtêm-se compostos ativos através do isolamento de extratos vegetais que são inicialmente analisados qualitativamente por cromatografia, posteriormente faz-se a triagem para determinação da atividade biológica ou obtenção dos efeitos biológicos gerais (MELO, 2001). A identificação dos componentes ativos nos extratos vegetais e sua quantificação nas plantas são passos essenciais para tornar os resultados referentes à comprovação de sua atividade mais confiáveis (ATHANASIADOU et al., 2007).
Os compostos ativos das plantas podem ser originados de dois tipos de metabólitos: primários e secundários. Os metabólitos primários são substâncias amplamente distribuídas na natureza, ocorrendo em praticamente todos os vegetais. Nas plantas superiores tais compostos se concentram frequentemente em sementes e órgãos de armazenamento e são necessários para o desenvolvimento fisiológico, já que possuem papel importante no metabolismo celular básico. São usados principalmente como matéria prima industrial, alimento ou aditivo alimentar e inclui produtos tais como, óleos vegetais, ácidos graxos e carboidratos (CHAGAS, 2004).
Os metabólitos secundários são compostos derivados biologicamente dos metabólitos primários, e frequentemente têm um papel ecológico como atrativos para polinizadores, ou representam adaptações químicas à pressão ambiental ou servem como defensores químicos contra microrganismos, insetos e predadores superiores. Eles são usados comercialmente como compostos ativos biologicamente, farmacêuticos, conferindo sabor ou aroma e pesticidas (CHAGAS, 2004). As substâncias farmacologicamente ativas obtidas das plantas estão relacionadas, quase sempre, aos metabólitos secundários. Da mesma forma, a maioria dos compostos ativos responsáveis pela atividade anti-helmíntica que já foram identificados são derivados do metabolismo secundário (GITHIORI et al., 2006), dentre estes, estão presentes os óleos essenciais.
2.4. Óleos essenciais
nos óleos essenciais é formado de classes de ésteres de ácidos graxos, mono e sesquiterpenos, fenilpropanonas, alcoóis aldeidados e, em alguns casos, por hidrocarbonetos alifáticos, entre outros (SANTOS et al., 2004).
Há muitos anos, os óleos essenciais vêm sendo extraídos de plantas e usados nas indústrias de perfumes, cosméticos e fármacos de uso medicinal. Diversas funções biológicas são atribuídas a essas substâncias odoríferas, como, defesa contra predadores, atração de polinizadores, proteção contra perda de água, aumento da temperatura e como inibidores de germinação (VITTI E BRITO, 2003).
Os óleos essenciais estão entre as classes de substâncias vegetais que apresentam relatos de atividade antiparasitária descrita (ANTHONY et al., 2005). Trabalhos têm sido desenvolvidos no sentido de investigar a atividade anti-helmíntica de óleos essenciais. Em estudos in vitro, o óleo essencial de Eucalyptus globulus inibiu a eclosão e o densenvolvimento de larvas de H. contortus nas concentrações de 21,75 e 43,5 mg/mL, respectivamente (MACEDO et al., 2009), enquanto que o óleo essencial de Croton zehntneri teve melhor eficácia apresentando atividade ovicida e larvicida contra H. contortus nas concentrações de 1,25 e 10 mg/mL, respectivamente (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2007). No teste de eclosão de ovos, os óleos essenciais de Cymbopogon schoenanthus,
Cymbopogon martinii e Mentha piperita apresentaram CE50 (concentrações efetivas para
inibir 50%) de 0,04; 0,26 e 0,13 mg/mL, respectivamente (KATIKI et al., 2011). No teste de desenvolvimento larvar, as CE50 foram de 2,97 e 2,71 mg/mL para os óleos essenciais de
Lippia sidoides e Eucalyptus citriodora, respectivamente (CAMURÇA-VASCONCELOS et
al., 2007; MACEDO et al., 2011).
Em estudos in vivo, óleos essenciais conseguiram bons resultados na redução da contagem de ovos por grama de fezes (OPG), como os óleos essenciais E. citriodora e
Eucalyptus staigeriana na dose de 500mg/kg reduziram o OPG de caprinos em 76,57% e
60,3% 15 dias após o tratamento (MACEDO et al., 2010; 2011). O óleo de laranja na dose de 600 mg/kg causou 98% de redução no OPG de ovinos (SQUIRES et al., 2010).
Estes resultados demonstram o potencial de uso desses óleos, principalmente quando a resistência anti-helmíntica está presente. A alternativa da utilização de plantas pode ser uma ferramenta útil associada a outros métodos para controlar nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes, tendo seu uso justificado mesmo com eficácia inferior a 95% em situações onde anti-helmínticos sintéticos não são recomendados, como na pecuária orgânica, produção leiteira, ou quando o custo não é compensatório (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2008). Desta forma, plantas com moderada atividade anti-helmíntica devem ser consideradas, pois podem permitir uma abordagem integrada, especificamente desenhada para alcançar um controle sustentável de parasitas em sistemas de produção de ruminantes (GITHIORI et al., 2006).
O papel das plantas para estender a utilização e aumentar a eficácia dos anti-helmínticos já existentes merece ser estudado. Neste contexto, para que os óleos essenciais possam ser considerados como alternativa para o controle de nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes deve-se buscar maximizar a sua eficácia. Portanto, o aprimoramento da formulação dos óleos se faz necessário para tentar aumentar a eficácia e diminuir a dose. Uma ampla variedade de sistemas que visam condicionar a velocidade e o local de liberação dos princípios ativos tem sido objeto de investigação na área da indústria farmacêutica (IRACHE et al., 2011; LOPES et al., 2005; PEZZINI et al., 2007). Neste contexto, uma possibilidade seria o processamento do óleo essencial utilizando o nanoencapsulamento que pode promover à concentração do principio ativo, bem como sua liberação de forma gradativa no sítio alvo.
2.5. Nanoencapsulamento
sítio específico, diminuição da toxicidade, aumento da biodisponibilidade, aumento do índice terapêutico e diminuição da dose administrada (AZEVEDO, 2005). De acordo com Gonsalves et al. (2009), a utilização de sistemas carreadores resolve algumas limitações relacionadas com a estabilidade dos óleos essenciais, como volatilização e oxidação dos constituintes químicos.
Os sistemas de liberação controlada requerem administrações menos frequentes do princípio ativo em relação aos sistemas convencionais, nos quais a concentração do composto apresenta um aumento na corrente sanguínea, atinge um pico máximo e então, declina. Como cada fármaco possui uma faixa de ação terapêutica acima da qual ele é tóxico e abaixo da qual ele é ineficaz, os níveis plasmáticos são dependentes das dosagens administradas, isso se torna mais crítico se a dose efetiva estiver próxima à dose tóxica. Neste fato, reside uma das grandes vantagens dos sistemas de liberação controlada sobre os métodos convencionais, com a manutenção da concentração terapeuticamente efetiva de fármacos no sistema circulatório por um extenso período de tempo (LYRA et al., 2007). Além disso, tais sistemas reduzem as oscilações do princípio ativo na concentração sanguínea, evitando níveis subterapêuticos ou tóxicos (PEZZINI et al., 2007). O tempo de duração do efeito de um anti-helmíntico tem sido considerado uma característica importante nos programas de controle do parasitismo gastrintestinal. A duração da atividade de um anti-helmíntico pode ser associada com as suas propriedades físico-químicas, suas propriedades farmacocinéticas e com a tecnologia farmacêutica aplicada para aumentar sua disponibilidade sistêmica (LIFSCHITZ et al., 2007). Ademais, a possibilidade de liberação do princípio ativo em um sítio específico é uma característica de extrema importância dos sistemas de liberação controlada, pois o efeito dos óleos essenciais sobre os parasitos do trato digestivo inferior depende da capacidade de seus componentes permanecerem ativos após a passagem pelo rúmen (BENCHAAR et al., 2008).
As nanopartículas são constituídas por um invólucro polimérico disposto ao redor de um núcleo, podendo o componente ativo de interesse estar dissolvido nesse núcleo e/ou adsorvido à parede polimérica. A retenção desses núcleos é regida por sua funcionalidade química, solubilidade, polaridade e volatilidade. O material de parede consiste na barreira externa e geralmente é feito de compostos que formam uma rede com a estrutura. Tais compostos normalmente são polímeros (ASSIS et al., 2012). As vantagens das nanopartículas utilizadas como transportadoras de drogas são a alta estabilidade, alta capacidade de carregamento de drogas, viabilidade da incorporação de ambas as substâncias hidrofílicas e hidrofóbicas e propriedade de liberação controlada. Essas habilidades das nanopartículas permitem melhorias tanto de biodisponibilidade do fármaco e modificação de perfis farmacocinéticos e a especificidade da ação e penetração intracelular para diferentes drogas (IRACHE et al., 2011).
O material encapsulante é escolhido em função das propriedades físicas e químicas do princípio ativo, da aplicação pretendida e do método utilizado para formar as partículas. O encapsulante ideal deve apresentar baixa viscosidade em concentrações elevadas e ser de fácil manipulação durante o processo; possuir baixa higroscopicidade para facilitar a manipulação e evitar aglomeração; não ser reativo com o material a ser encapsulado; ter habilidade de selar e segurar o material ativo dentro da estrutura da cápsula; liberar completamente o solvente ou outros materiais utilizados durante o processo de encapsulação; proporcionar máxima proteção ao material ativo contra condições adversas, tais como luz, pH, oxigênio e ingredientes reativos; ser solúvel em solventes comumente usados; possuir as propriedades desejadas de liberação do composto ativo; não apresentar sabor desagradável no caso de administração oral; e ser econômico (SANTOS et al., 2000).
dependendo do local de liberação do princípio ativo, o comportamento das partículas em diferentes pH é um fator de extrema importância a ser investigado (FUJIWARA et al., 2010).
Os materiais mais utilizados como encapsulantes incluem os polímeros sintéticos e naturais. Entre os polímeros sintéticos estão aqueles que são biodegradáveis, como os poliésteres, e os não biodegradáveis, como os derivados da celulose e os polímeros acrílicos. Polímeros naturais (ou biopolímeros) são usualmente biodegradáveis, oferecem excelente biocompatibilidade e apresentam baixo custo, mas sofrem variação de lote a lote devido às dificuldades na purificação. Entre os biopolímeros estão aqueles à base de proteínas, como colágeno e gelatina, e os polissacarídeos, como agarose e quitosana (OLIVEIRA E LIMA, 2006).
2.5.1. Quitosana
A quitosana é um polissacarídeo que é obtido pela desacetilação parcial da quitina, o segundo mais abundante polissacarídeo na natureza e encontrado naturalmente no exoesqueleto de crustáceos, insetos e, em alguns fungos. Tem sido documentado que partículas de quitosana podem ser utilizadas como transportadores para encapsulamento e liberação controlada de drogas (IRACHE et al., 2011).
A quitosana oferece várias vantagens, e estas incluem a sua capacidade para controlar a liberação de agentes ativos e evitar o uso de solventes orgânicos perigosos durante a fabricação das partículas, uma vez que é solúvel em solução ácida aquosa. Este biopolímero pode melhorar a taxa de dissolução de fármacos pouco solúveis, e, portanto, pode ser explorado para o aprimoramento da biodisponibilidade de drogas e sua entrega (DASH et al., 2011). Tem atraído atenção como um excelente polímero natural mucoadesivo que pode aderir a tecidos, já tendo sido encontrada boa adesão em tecidos epiteliais e no muco presente no revestimento de superfície dos tecidos. Além disto, a quitosana provou ser um excipiente seguro em formulações de drogas nas últimas décadas, pois testes clínicos realizados utilizando biomateriais à base de quitosana não relataram quaisquer reações inflamatórias ou alérgicas após sua aplicação (CHATELET et al., 2001).
preparação de nanopartículas, uma vez que possui propriedades ideais, tais como biodegradabilidade, biocompatibilidade, ser um polímero atóxico, além de ter excelentes propriedades bioadesivas e capacidade de aumentar a penetração de grandes moléculas através da superfície da mucosa (IRACHE et al., 2011).
2.6. Plantas do Nordeste brasileiro
As plantas medicinais são utilizadas com frequência pela população nordestina no tratamento de doenças, desta forma, o uso de fitoterápicos no controle de nematoides pode ser uma alternativa, principalmente quando a resistência anti-helmíntica já está presente, agregando, dessa forma, valor às plantas típicas dessa região. Dentre as espécies vegetais do nordeste brasileiro produtoras de óleos essenciais e consideradas possuidoras de atividade sobre helmintos segundo relatos populares, cita-se L. camara, T. minuta, M. villosa (ALBUQUERQUE et al., 2007), C. sativum (HUSSAIN et al., 2008), A. zerumbet (ALMEIDA, 1993) e C. citratus (RITTER et al., 2012).
2.6.1. Lantana camara
Lantana camara (Verbenaceae), conhecida popularmente como “Câmara” ou
“Cambará”, espécie nativa da América tropical e cultivada principalmente como planta ornamental, sendo um pequeno arbusto de caule ramificado formando muitos galhos cruzados (GHISALBERTI, 2000). A figura 1 ilustra as folhas, flor e fruto de L. camara.
Figura 1: Folhas, flor e fruto de Lantana camara
Suas folhas têm a indicação de uso na medicina tradicional para o tratamento de úlceras, erupções cutâneas, escabiose, reumatismo, asma, antioxidante e anti-helmíntico (KALITA et al., 2012). Alguns experimentos foram conduzidos para investigar as propriedades biológicas de L. camara tendo sido verificado que este apresenta efeito antimicrobiano (DEENA E THOPPIL, 2000), inseticida (SAXENA et al., 1992), anti-inflamatório (GIDWANI et al., 2009), atividade nematostática sobre o fitonematoide
Meloidogyne incognita (DIAS et al., 2000).
2.6.2. Tagetes minuta
Tagetes minuta pertence à família Compositae ou Asteracea, é popularmente
conhecida como vara-de-rojão, rabo-de-foguete, cravo-de-defunto, cravo-de-urubu (SOUSA et al., 2000). A figura 2 representa as folhas e flores de T. minuta. Esta espécie é nativa da América do Sul, e é usada na medicina popular como antimicrobiano e para tratamento de doenças gastrintestinais (TERESCHUK et al., 1997). Seu óleo tem inúmeras aplicações e é usado como componente de sabor em alimentos e como perfume, como repelente de insetos e no tratamento de certas doenças como a varíola, dor de ouvido, constipações e febres (SHAHZADI et al., 2010). Óleo essencial apresentou atividade nematocida, fungicida e inseticida (VASUDEVAN et al., 1997). T. minuta tem atividade antimicrobiana e analgésica (BEHTASH et al., 2008; TERESCHUK et al., 1997).
Figura 2: Folhas e flores de Tagetes minuta
Fonte:http://www.maison-deco.com/jardin/plantes-fleurs...
2.6.3. Mentha villosa
Mentha villosa pertence à família Lamiaceae, que contém espécies popularmente
Apresenta folhas opostas ovais lanceoladas, curtamente pecioladas, serreadas, de cor verde-escura com aroma forte e bem característico (figura 3). É uma planta medicinal e aromática originária da Europa e cultivada em todo o Brasil sendo largamente utilizada pelas indústrias químicas, farmacêuticas e de alimentos (PAULUS et al., 2005). Além do uso como vermifugo, esta espécie é comumente utilizada como antiespasmódica, antiemética, antisséptica, analgésica, anti-inflamatória e estomáquica (BIESKI, 2005; LORENZI E MATOS, 2002). O uso de M. villosa teve atividade contra ameba, giárdia e tricomonas (TOZZE JR. et al., 2006). Já foi verificada experimentalmente que o óleo essencial teve atividade antimicrobiana (NEDOROSTOVA et al., 2009). No teste in vitro, o hidrolato de M.
villosa apresentou atividade ovicida sobre nematoides gastrintestinais de bovinos
(NASCIMENTO, 2008).
2.6.4. Coriandrum sativum
Coriandrum sativum pertence à família Umbelliferae, sendo originário do
Mediterrâneo. É uma pequena erva com muitos ramos e sub-ramos, com folhas novas ovais, mas as folhas aéreas são alongadas e apresenta frutos ovalados com muitos sulcos longitudinais na sua superfície (figura 4) (MOMIN et al., 2012). Na medicina popular, apresenta ação cicatrizante, anti-inflamatória, antirreumática e anti-ulcerogênica. Trabalhos tem demonstrado atividade antifungica (FURLETTI et al., 2011), antioxidante (WANGENSTEEN et al., 2004) e atividade nematocida sobre fitonematoide Bursaphelenchus
xylophilus (KIM et al., 2008). Estudos utilizando extratos de C. sativum apresentaram
atividade anti-helmíntica sobre nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes (EGUALE et al., 2007).
2.6.5. Alpinia zerumbet
Alpinia zerumbet pertence à familia Zingiberaceae, conhecida popularmente como
colônia, cuité-açu e flor-da-redenção. É uma planta herbácea originária da Índia (ZOGHBI et al., 1999), que atinge de 2 a 3 metros de altura, possui folhas coriáceas, espessas e lanceoladas, verde-luzidias, com bainha aberta, língula desenvolvida e em disposição dística, e suas flores são ligeiramente aromáticas, dispostas em cachos grandes, amarelo-róseas com três lobos e um grande lábio (figura 5) (ALMEIDA, 1993). É usada na medicina popular para vários fins, tais como: diurética, carminativa, estomáquica, antiemética, espasmolítica, anti-inflamatória, antiofídica e vermífuga (BIESKI, 2005). Extratos de A. zerumbet apresentaram atividade antibacteriana (VORAVUTHIKUNCHAI et al., 2005). O óleo essencial apresentou atividade antioxidante (ELZAAWELY et al., 2007) e antimicrobiana (VICTÓRIO et al., 2009).
Figura 5: Folhas e flores de Alpinia zerumbet Fonte: Arquivo pessoal (MACEDO, 2012).
2.6.6. Cymbopogon citratus
Cymbopogon citratus (DC) Stapf, pertence à família Poaceae é originária da Índia e
encontra-se difundida em vários países (SANTOS et al., 2009). É encontrada em todo o território brasileiro e comumente citada em levantamentos de plantas medicinais e estudos etnobotânicos sendo conhecida popularmente por capim-limão e capim-santo (ALBUQUERQUE et al., 2007). Possui folhas longas, lanceoladas, de coloração verde-pálida, com nervura central proeminente (figura 6), são ásperas e com odor aromático característico de limão (GOMES E NEGRELLE, 2003). Na medicina popular, o chá preparado a partir das suas folhas, é utilizado como calmante, analgésico, em dores abdominais e de cabeça, antifebril, carminativo, antitussígeno e em distúrbios digestivos. A maior importância econômica de C. citratus reside na produção do seu óleo essencial, rico em citral e largamente utilizado na indústria de alimentos e de cosméticos (COSTA et al., 2005).
Diversas investigações tem mostrado que o óleo essencial C. citratus possui efeitos antibacteriano (NAIK et al., 2010), antifungico (NGUEFACK et al., 2012), antioxidante (PEREIRA et al., 2009), anti-Leishmania (MACHADO et al., 2012) inseticida (KUMAR et al., 2012) e atividade nematostática sobre fitonematoide M. incognita (DIAS et al., 2000). Em teste in vitro, 224mg/mL do extrato aquoso de C. citratus reduziram 95% das larvas Strongyloidea de caprinos (ALMEIDA et al., 2003). Em estudo in vivo, 20mg/Kg/PV do extrato alcoólico de C. citratus administrados por quatro dias consecutivos, reduziram em 95% o OPG de ovinos 10 dias após o tratamento, sendo a ação anti-helmíntica atribuída principalmente à presença de óleos voláteis (SILVA et al., 2005).
3. JUSTIFICATIVA
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
5. OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar espécies vegetais encontradas no nordeste brasileiro para auxiliar no controle de nematoides gastrintestinais em pequenos ruminantes.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar os constituintes dos óleos essenciais de L. camara, T. minuta, C.
sativum, A. zerumbet e C. citratus;
Determinar os constituintes dos decoctos L. camara, T. minuta, M. villosa, A.
zerumbet e C. citratus;
Avaliar in vitro os decoctos L. camara, T. minuta, M. villosa, A. zerumbet e C.
citratus sobre ovos e larvas de H. contortus;
Avaliar a atividade ovicida e larvicida dos óleos essenciais de L. camara, T.
minuta, C. sativum, A. zerumbet e C. citratus sobre H. contortus;
Avaliar a atividade anti-helmíntica do óleo essencial, com melhor resultado nos testes in vitro, em gerbis (Meriones unguiculatus) experimentalmente infectados com H. contortus;
Realizar o nanoencapsulamento do óleo essencial com melhor resultado nos testes in vitro;
6. Capitulo I
ARTIGO
In vitro activity of Lantana camara, Alpinia zerumbet, Mentha villosa and
Tagetes minuta decoctions on Haemonchus contortus eggs and larvae
(Atividade in vitro dos decoctos Lantana camara, Alpinia zerumbet, Mentha
villosa e Tagetes minuta sobre ovos e larvas de Haemonchus contortus)
Artigo publicado no periodico Veterinary Parasitology (v.190, p.504-509, 2012)
Iara T. F. Macedo a, Claudia M. L. Bevilaquaa*, Lorena M.B. de Oliveiraa, Ana L. F. Camurça-Vasconcelosa, Selene M. Moraisa, Lyeghyna K. A. Machadob, Wesley L.C. Ribeiroa
In vitro activity of Lantana camara, Alpinia zerumbet, Mentha villosa and Tagetes minuta decoctions on Haemonchus contortus eggs and larvae
RESUMO
A resistência de nematoides gastrintestinais aos anti-helmínticos tem aumentado à necessidade de avaliar produtos naturais que podem substituir ou auxiliar as atuais estratégias de controle dos nematoides gastrintestinais. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos decoctos de Lantana camara (DLc), Alpinia zerumbet (DAz), Mentha villosa (DMv) e
Tagetes minuta (DTm) contra Haemonchus contortus através de dois testes in vitro. Os efeitos
de concentrações crescentes de decoctos liofilizados (0,31 a 10 mg/ml) foram avaliados utilizando o teste de eclosão de ovos (TEO). Os decoctos foram depois testados através do ensaio de desembainhamento artificial larval. Larvas de terceiro estágio (L3) de H. contortus foram expostas a 0,31 mg/ml dos decoctos de A. zerumbet e M. villosa e a 0,62 mg/ml dos decoctos de T. minuta e L. camara durante 3 horas e, em seguida, observado o processo de desembainhamento em intervalos de 10 minutos. Foi utilizado um inibidor de taninos, polivinil polipirrolidona (PVPP), para verificar se os taninos foram os responsáveis pelo efeito inibitório sobre a eclosão e o desembainhamento larvar. A. zerumbet, M. villosa e T.
minuta mostraram um efeito dose dependente no TEO, que não desapareceu após a adição do
PVPP. Nenhum efeito foi observado para L. camara no TEO. No entanto, os decoctos inibiram o processo de desembainhamento larval, o que pode estar relacionado com a ação dos taninos, porque a adição de PVPP reverteu este efeito inibitório. Os decoctos de A.
zerumbet, M. villosa e T. minuta apresentaram atividade inibitória sobre a eclosão e o
desembainhamento larval de H. contortus. Os decoctos destas plantas podem ser utilizados para controlar os nematoides gastrintestinais após a confirmação da sua atividade anti-helmíntica in vivo.
Palavras-chave: Fitoterapia, anti-helmínticos, nematoides gastrintestinais.
ABSTRACT
The resistance of gastrointestinal nematodes to anthelmintics has increased the need to evaluate natural products that can replace or assist current strategies to control gastrointestinal nematodes. The objective of this study was to evaluate the effect of decoctions of Lantana
lyophilized decoctions (0.31 to 10 mg/ml) were assessed using the egg hatch test (EHT). The decoctions were then tested in the larval artificial exsheathment assay. H. contortus third stage larvae (L3) were exposed to 0.31 mg/ml A. zerumbet and M. villosa decoctions and 0.62 mg/ml T. minuta and L. camara decoctions for 3 hours and then exsheathment procedure at 10-minute intervals. An inhibitor of tannins, polyvinyl polypyrrolidone (PVPP), was used to study if tannins were responsible for the inhibitory effect on hatching and exsheathment of larvae. A. zerumbet, M. villosa and T. minuta showed a dose-dependent effect in the EHT, which did not disappear after the addition of PVPP. No effect was observed for L. camara in the EHT. However, the decoctions inhibited the process of larval exsheathment, which may be related to tannin action because the addition of PVPP reversed the inhibitory effect. A.
zerumbet, M. villosa and T. minuta decoctions showed inhibitory activity on H. contortus
larvae hatching and exsheathing. The decoctions of these plants could be used to control gastrointestinal nematodes following confirmation of their anthelmintic activity in vivo.
Keywords: Phytotherapy, anthelmintic, gastrointestinal nematodes
INTRODUCTION
The diseases caused by gastrointestinal nematode parasites occupy a prominent place among the factors limiting sheep and goat production and are responsible for high economic losses due to delayed growth, weight loss, reduced food consumption, decreased milk production, low fertility and, in cases of massive infections, high mortality rates (Nunes et al., 2007). The high prevalence associated with pathogenicity make the hematophagous nematode
Haemonchus contortus, the main parasite of small ruminants in Brazil (Amarante, 2004). The
control of parasitism is accomplished primarily through the use of commercial semi-synthetic and synthetic anthelmintics. However, these drugs are associated with drawbacks, such as high cost, the risk of residues in food and environmental contamination (Waller, 2006). Moreover, misuse and indiscriminate treatment with synthetic drugs have allowed the rapid selection of resistant helminth populations (Melo et al., 2003). Thus, it has become necessary to develop studies aimed at searching for complementary alternatives to traditional methods (Ademola and Eloff, 2010).
and aqueous decoctions are the main methods of preparation used in traditional medicine (Scudeller et al., 2009). Among the species of plant that have been documented as having medicinal effects against helminths are Lantana camara (Verbenaceae), Tagetes minuta
(Asteraceae), Mentha villosa (Lamiaceae) (Albuquerque et al., 2007) and Alpinia zerumbet
(Zingiberaceae) (Almeida, 1993). Recent studies have suggested that plants containing condensed tannins may offer a promising alternative approach to control parasitism (Rochfort et al., 2008). Condensed tannins are secondary plant metabolites that comprise the most widespread class in nature.
The value and credibility of herbal medicines depend on the recognition of the healing properties of some plants. Thus, scientific experimentation is a crucial and obligatory step to prove the effectiveness of plants popularly used as anthelmintics (Githiori et al., 2006). To assess the anthelmintic properties of plant extracts, in vitro testing can be used as a preliminary step to characterize the possible effects (Costa et al., 2002).
The objective of this study was to evaluate the effects of decoctions of L. camara (DLc), A. zerumbet (DAz), M. villosa (DMv) and T. minuta (DTm) on egg hatching and larval exsheathment of H. contortus.
MATERIALS AND METHODS
Decoction extraction
The plants used were collected in Fortaleza, State of Ceará, Brazil. All plants were authenticated and voucher specimens were deposited in the Herbarium Prisco Bezerra of the Universidade Federal do Ceará, under the numbers: L. camara - 46017, A. zerumbet - 49659,
M. villosa -49957 and T. minuta - 49676.
For the production of the decoctions, fresh plant material was cut from aerial parts and completely submerged in distilled water at 1:10 (g/ml) and boiled for 2 hours under heating at reflux with reconstitution of the evaporated volume. Subsequently, the solutions were filtered, frozen and lyophilized. The decoctions stored at 4°C until used.
Obtaining H. contortus eggs and larvae
benzimidazole-resistant were orally inoculated. Subsequently fecal samples were collected to confirm the establishment of the experimental infection, using a modified McMaster technique, obtaining an egg counts per gram of feces (epg) above 2000.
To recover H. contortus eggs, 10 g of feces collected directly from the rectum of the experimentally infected sheep was processed according to the technique described by Hubert and Kerboeuf (1992). L3 were collected from feces according to Ueno and Gonçalves (1998). Egg hatch test (EHT)
This test was performed based on the methodology described by Coles et al. (1992). To increase the solubility in aqueous medium, the decoctions were diluted in 3% Tween 80. An egg suspension (250 l) containing approximately 100 fresh eggs were incubated with 250 l decoctions at final concentrations of 0.31 to 10 mg/ml for 48 h at 25°C. Drops of Lugol were added, and the eggs and first stage larvae (L1) were counted under a microscope. This test had two controls: a negative control containing the diluent (Tween 80) and a positive control with 0.025 mg/ml thiabendazole (diluted with 3% dimethylsulfoxide-DMSO). Three repetitions with five replicates for each decoction concentration and for each control were performed.
To evaluate the role of tannins on the anthelmintic effect, a specific inhibitor of tannins, polyvinyl polypyrrolidone (PVPP; Sigma®), was used. The PVPP binds to tannins inhibiting from exercising their effect, i.e., allowing the egg hatch. The highest concentrations of DAz, DTm and DMv were pre-incubated overnight with 50 mg/ml PVPP (Alonso-Díaz et al. 2008).
Larval artificial exsheathment assay (LAEA)
This test was based on the methodology described by Bahuaud et al. (2006). One thousand H. contortus L3 were incubated for 3 hours in a solution containing decoction diluted in phosphate buffer solution (PBS) at concentrations of 310 μg/ml (DAz and DMv) or 620 μg/ml (DLc and DTm) or the negative control with 1 ml of PBS. Larvae were then washed and centrifuged three times in PBS and subjected to an artificial exsheathment process by contact with a solution of sodium hypochloride (2% w/v) diluted 1:300 in PBS. The kinetics of larval exsheathment were monitored microscopically for 1h to identify the exsheathed larvae at 0, 10, 20, 30, 40, 50 and 60 min. Six replicates were performed for each decoction and the control to examine the changes in the proportion of exsheathed larvae in relation to time.
Phytochemical analysis of decoctions
Phytochemical screening to characterize the major classes of secondary metabolites present in the decoctions was performed according to the methodology proposed by Matos et al. (2009). The chemical characterization was based on the addition of specific reagents to decoction aliquots and observing the changes in solution color or precipitate formation. The following experiments were performed: the identification of phenolic compounds (precipitation reaction with ferric chloride), the naphthoquinone reaction (acid/base), the characterization of flavonoids (cyanidin reaction and sulfuric acid), the presence of triterpenes and steroids (Liebermann-Burchard reaction), alkaloids (precipitation reactions with Dragendorff and Mayer reagents) and the characterization of saponins (Lieberman-Buchard reaction and the rate of spume).
The content of total phenol was determined using the Folin-Ciocalteu spectrophotometric method (Bonoli et al., 2004). Briefly, 100 μl of each extract solution (150 ppm) was shaken for 1 minute with 500 μL of Folin-Ciocalteu reagent. Then, 2 ml of 15% sodium carbonate (Na2CO3) was added and the mixture was shaken again for 30 seconds. The solution was adjusted to 10 ml by adding distilled water. After 2 hours, measurements were performed on a spectrophotometer at 750 nm. The readings, with three replicates per sample, were performed with a negative control. The total phenol content was assessed by plotting the gallic acid calibration curve. For the total tannin content, 100 mg/ml PVPP was used to isolate these metabolites from extract. Then total tannins were measured as the difference of total phenol before and after treatment with PVPP (Oliveira et al., 2011). The results for total phenols and tannins were expressed as mg/g (equivalent to gallic acid).
Statistical analysis
RESULTS
The average efficacy of the decoctions to inhibition of hatching is shown in Table 1. At a concentration of 2.5 mg/ml, DTm and DMv showed efficacies of 96.8 and 97.6%, which was not statistically different from the anthelmintic thiabendazole (P > 0.05). The EC50 values were 0.96 mg/ml for DAz, 0.66 mg/ml for DTm and 0.5 mg/ml for DMv. DLc was not effective at any concentration tested. DMv produced a more pronounced inhibitory effect on
H. contortus larvae inhibition hatching as compared with DAz and DTm.
Table 1. Mean efficacy (percentage of reduction inhibition of egg hatching) ± standard error by decoction of Lantana camara (DLc), Alpinia zerumbet (DAz), Tagetes minuta (DTm) and
Mentha villosa (DMv) on Haemonchus contortus egg hatching.
Concentrations
(mg/ml) DLc DAz DTm DMv
0.31 - 12.7± 1.2Aa 12.1± 1.77Aa 24.7 ± 1.74Ab
0.62 18.3 ± 0.84ABa 18.5± 1.57Aa 44.6± 4.01Bb 62.7 ± 2.87Bc 1.25 18.8 ± 0.74ABa 74.6 ± 1.96Bb 85.8 ± 2.4Cc 90.0 ± 2.18CDc 2.5 14.0 ± 1.13Aa 82.7 ± 1.55Cb 96.8 ± 0.77Dc 97.6 ± 0.79Cc 5 15.7± 1.66ABa 97.5 ± 0.84Db 100 ± 0.0Db - 10 19.7± 2.15B - - - Pvpp + decoction - 82.6± 1.46Ca 92.8± 2.04CDa 84.3± 4.5Da Tween 80 (3%) 13.0 ± 0.77Ba 14.3 ± 1.05Aa 13.7 ± 1.84Aa 11.2± 1.46Ea
Thiabendazole (0.025mg/ml)
96.4 ± 0.47Ca 96.4 ± 0.47Da 96.4 ± 0.47Da 96.4 ± 0.47Ca
Capital letters compare mean in the columns and small letters compare mean in the lines. Different letters indicate significantly different values (P < 0.05).
0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 Alpinia zerumbet PBS A. zerumbet + PVPP Time(min) E x s h e a th e d l a rv a e ( % )
Figure 1. Effect of 310µg/ml of Alpinia zerumbet decoction, with or without addition of PVPP, on the process of artificial in vitro exsheathment of Haemonchus contortus third-stage larvae. 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 Mentha villosa PBS M. villosa + PVPP Time(min) E x s h e a th e d l a rv a e ( % )
Figure 2. Effect of 310µg/ml of Mentha villosa decoction, with or without addition of PVPP,
0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 Tagetes minuta PBS T. minuta + PVPP Time(min) E x s h e a th e d l a rv a e ( % )
Figure 3. Effect of 620µg/ml of Tagetes minuta decoction, with or without addition of PVPP,
on the process of artificial in vitro exsheathment of Haemonchus contortus third-stage larvae.
0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 Lantana camara PBS L. camara + PVPP Time(min) E x s h e a th e d l a rv a e ( % )
Phytochemical screening showed the presence of condensed tannins and flavonoids in all decoctions. In the DLc, saponins were also present. The total phenols of the DLc, DAz, DMv and DTm were 87.5, 116.2, 117.7 and 45.2 mg/g (gallic acid equivalent), respectively and the total tannins were 69.4, 107.1, 87.5 and 34.6 mg/g (gallic acid equivalent), respectively.
DISCUSSION
The problem of anthelmintic resistance in addition to the growing concern regarding the presence of drug residues in animal products has led to an increased interest in the use of phytotherapeutics (Githiori et al, 2006). In vitro tests with free-living stages of H. contortus have been used for the preliminary assessment or screening of new plants with anthelmintic activity (Asase et al., 2005; Camurça-Vasconcelos et al., 2005).
Plants were selected and evaluated based on information about their traditional use against helminths. The use of decoctions to extract active ingredients from plants mimics popular methods because decoctions have a greater ease of preparation and are less toxic to manipulate (Schuch et al., 2008). However, the technique of decoction may alter many active substances by prolonged heating, and are therefore considered to be a restriction on their use (Falkenberg et al., 2000). This study verified the existence of biologically active compounds with ovicidal effects on H. contortus in DAz, DTm and DMv, even after heating for two hours. However, the low activity of DLc on the eggs can be attributed to the lack of the ovicidal action of metabolites or the alteration of these compounds by heating. In the study of the aqueous extract of Cucurbita moschata, Marie-Magdeleine et al. (2009) suggested that potentially bioactive molecules could have been denatured, thereby influencing the anthelmintic activity.
squamosa had an EC50 of 3.8 mg/ml and the EC50 of ethyl acetate extracts of Solanum torvum and Catharanthus roseus were 8.82 and 6.46 mg/ml, respectively (Kamaraj and
Rahuman, 2010). The EC50 of the aqueous and hydro-alcoholic extracts of Melia azedarach were 2.04 and 1.97 mg/ml, respectively (Kamaraj et al., 2010). The EC50 of the acetone extract of the stem of Myracrodruon urundeuva was 2.44 mg/ml (Oliveira et al., 2011). The EC50 of the aqueous methanol extracts of Musa paradisiaca and Trianthema portulacastrum were 2.13 and 2.41 mg/ml, respectively (Hussain et al., 2011).
Another in vitro test used to evaluate the effects of the decoctions was the LAEA. The L3 exsheathment represents the transition from the free-living to the parasitic phase, and is essential in the life cycle of nematodes. It has been reported that tannins interrupt the process of exsheathment, thus preventing the establishment of infective larvae in the host and consequently the infection (Brunet et al, 2007). The results demonstrated that 310 μg/ml DAz or DMv and 620 μg/ml DLc or DTm inhibited the process of H. contortus larvae exsheathment, showing superior efficacy as compared to 1000 µg/ml Jatropha curcas extract (Monteiro et al., 2011).
The biological effects of plants are mainly attributed to the presence of secondary metabolites. The investigation of chemical components from natural products is of fundamental importance for the development of new anthelmintic drugs (Assis et al., 2003). In this study, phytochemical tests revealed the presence of metabolites that may be responsible for anthelmintic activity. Among these components, saponins (Eguale et al, 2007; Ademola and Eloff, 2010), flavonoids (Lee et al., 2008) and tannins (Oliveira et al., 2011) were detected.
The role of condensed tannins in many biological processes related to different nematode stages have been confirmed by in vitro studies (Hounzangbe-Adote et al., 2005). The mechanisms by which condensed tannins neutralize the parasites can vary, depending on the nature and composition of the different forage species (Brunet and Hoste, 2006; Brunet et al, 2007).
