PREDIÇÃO DA NEUTRALIZAÇÃO DO EFEITO COAGULANTE DA
PEÇONHA DE Bothrops pauloensis PELO EXTRATO AQUOSO DE Hedychium
coronarium
(ZINGERBERACEAE) ATRAVÉS DE MODELOS DE
REGRESSÃO
PREDICTION OF NEUTRALIZATION OF CLOTTING EFFECT OF VENOM
Bothrops pauloensis BY AQUEOUS EXTRACT OF Hedychium coronarium
(ZINGEBERACEAE) THROUGH OF REGRESSION MODELS
Janser Moura PEREIRA2; Quintiliano Siqueira Schroden NOMELINI3; Luiz Fernando Moreira IZIDORO6; Suelen Xavier OLIVEIRA1; Veridiana Melo RODRIGUES4; Maria Inês HOMSI-BRANDEBURGO4; Amélia HAMAGUCHI4; Mirian Machado MENDES5; Lívia Maria ALVES1
1. Graduanda em Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências Integradas do Pontal – FACIP, Universidade Federal de Uberlândia – UFU, Ituiutaba, MG, Brasil; 2. Professor, Doutor, Faculdade de Matemática, FAMAT - UFU, Uberlândia, MG, Brasil; 3. Professor, Mestre, Faculdade de Matemática, FAMAT - UFU, Uberlândia, MG, Brasil, quintiliano@famat.ufu.br; 4. Professoras, Doutoras, Instituto de Genética e Bioquímica – INGEB - UFU, Uberlândia, MG, Brasil; 5. Doutoranda em Genética e Bioquímica, INGEB – UFU,
Uberlândia, MG, Brasil; 6. Professor, Doutor, FACIP – UFU, Ituiutaba, MG, Brasil.
RESUMO: Envenenamentos com serpentes do gênero Bothrops podem causar sequelas no local da picada, que não são revertidas mesmo após o tratamento com soro antiofídico. A incubação do extrato aquoso de Hedychium
coronarium (Zingeberaceae) com a peçonha da serpente Bothrops pauloensis em diferentes concentrações foi capaz de
inibir a atividade coagulante. No presente trabalho ajustou-se um modelo de regressão entre níveis de concentração de extrato e tempo de coagulação (segundos). O modelo ajustado conseguiu captar cerca 96 % da variação total do tempo de coagulação.
PALAVRAS-CHAVE: Bothrops pauloensis. Extrato aquoso. Inibição. Modelos de regressão.
INTRODUÇÃO
Há atualmente cerca de 2.900 espécies de serpentes no mundo distribuídas em 465 gêneros e 20 famílias. No Brasil estão representadas as famílias de 75 gêneros e 321 espécies correspondentes a 10% do total de espécies conhecidas (CARDOSO et al., 2003). O gênero Bothrops possui mais de 30 espécies e subespécies que estão distribuídas do sul do México a Argentina e em algumas ilhas do Caribe (GREENE, 2000).
Estima-se que acidentes ofídicos afetam mais que 2,5 milhões de pessoas anualmente no mundo, dos quais 100 mil resultam em morte (WRITE, 2005). As peçonhas de serpentes são provavelmente as mais complexas de todas as peçonhas animais. De acordo com características estruturais e funcionais, as proteínas tóxicas presentes na peçonha das serpentes do gênero Bothrops podem ser divididas em várias classes, tais como: metaloproteases, serinoproteases, fosfolipases A2, L-aminoácido oxidases, etc; agindo sempre de forma isolada ou sinérgica no organismo das vítimas (RAMOS; SELISTRE-DE-ARAÚJO, 2006).
As metaloproteases denominadas fatores hemorrágicos (hemorraginas) são enzimas dependentes Zn++, e apresentam grande diversidade em relação à massa molecular (20 a 100 kDa). Elas são responsáveis pela maioria dos efeitos sistêmicos, tais como, hemorragia, mionecrose, lesões na pele, inflamação, influxo celular inflamatório dependente de citocinas, ativação do sistema complemento e ativação de metaloproteases endógenas de matriz (MMPs) (BJNARSON; FOX, 1994). O mecanismo de ação destas toxinas consiste na degradação das proteínas da matriz extracelular e pelo efeito citotóxico direto nas células endoteliais, sua ação ocorre quase que exclusivamente na membrana basal dos vasos capilares (BARRAVIEIRA, 1994), promovendo sua dissolução. Observa-se nas vítimas quadros hemorrágicos como: equimoses, sangramentos gengivais e até viscerais. Dentre as proteases existem as enzimas fibrinogenolíticas que atuam sobre o fibrinogênio, podendo hidrolisar suas cadeias (Aα, Bβ e γ), levando a incoagulabilidade sangüínea (MATSUI et al., 2000).
Outro grupo de proteases são as enzimas “Thrombin-like”, que são serinoproteases. Estas enzimas convertem o fibrinogênio em fibrina liberando os fibrinopeptídeos A e B, formando, portanto o microcoágulo de fibrina, porém as “Thrombi-like” não ativam o fator XIIIa, responsável por unir de forma cruzada os monômeros de fibrina, tornando o coagulo mais denso. Deste modo o coágulo fica mais suscetível à degradação pela plasmina, induzindo assim um estado de desfibrinogrnação in vivo (FAN et al, 1999). As serino proteases também são capazes, de ativar o fator V da coagulação e a proteína C plasmática e clivar o componente C3 do sistema complemento (PETRETSKI et al, 2000).
A quantidade de acidentes ofídicos notificados no Brasil central, apesar de baixa é considerada como um problema de saúde pública, pois quando o paciente é tratado com soro antiofídico de forma efetiva, os efeitos sistêmicos são neutralizados, enquanto os locais não são revertidos, havendo uma possibilidade real de surgirem sequelas (ANAI et al, 2002). Diante disso, muitos pesquisadores vêm buscando as plantas medicinais como terapia alternativa, devido ao seu papel antiofídico (IZIDORO et al., 2003; SOARES et al., 2005; VALE et al., 2008; MENDES et al., 2008; MENDES et al., 2010). Segundo Matsuda et al. (2002) e Chimnoi et al. (2009) da planta Hedychium coronarium já foi isolado alguns tipos de diterpenos que baseado na literatura, estas
moléculas são caracterizadas como antiofídicas (MORS et al., 2004).
O objetivo deste trabalho foi avaliar por meio de modelos de regressão linear o grau de eficiência da neutralização da peçonha de Bothrops pauloensis pelo extrato aquoso de Hedychium coronarium.
MATERIAL E MÉTODOS
Para a preparação do extrato aquoso de Hedychium coronarium, raízes da planta foram levadas em H2O deionizada e as partes secas desprezadas. Em seguida o material foi macerado com H2O deionizada, filtrado em peneira comum e centrifugado durante 27 minutos a 4ºC com rotação de 5000 xg. O sobrenadante resultante foi congelado a -80°C, liofilizado e armazenado a -20°C até o momento do uso.
A atividade coagulante foi realizada utilizando-se como substrato plasma bovino citratado, conforme descrito por Assakura et al. (1992). Foi utilizado para cada ensaio um volume de 100 µl de plasma bovino previamente incubado a 37ºC. A atividade coagulante foi determinada medindo-se o tempo de coagulação no aparelho coagulômetro Quick Timer II (DRAKE LTDA) ao primeiro sinal de formação da rede de fibrina, após adição de 25µg da peçonha bruta de Bothrops pauloensis incubada ou não com extrato aquoso de Hedychium coronarium nas proporções de 1:5, 1:10 e 1:50 (m/m; peçonha/extrato). O tempo necessário para a formação da rede de fibrina na forma de coágulo foi medido em segundos, sendo que a inibição da atividade foi observada de acordo com aumento médio do tempo da coagulação em relação aos controles contendo apenas peçonha e extrato vegetal, respectivamente.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com 3 repetições. Foram utilizados 4 tratamentos: T1: peçonha bruta de Bothrops pauloensis; T2: peçonha bruta de Bothrops pauloensis incubada durante 30 minutos com extrato aquoso de Hedychium coronarium na proporção de 1:5 (m/m; peçonha/extrato); T3: peçonha bruta de Bothrops pauloensis incubada por 30 minutos com extrato aquoso de Hedychium coronarium na proporção de 1:10 (m/m; peçonha/extrato); T4: peçonha bruta de Bothrops pauloensis incubada por 30 minutos com extrato aquoso de Hedychium coronarium na proporção de 1:50 (m/m; peçonha/extrato).
por objetivo estudar a relação entre níveis de concentração de extrato e tempo de coagulação visando descobrir uma curva que a descreva, utilizando-se esta para fins de estimativa ou predição do tempo de coagulação.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A inibição da coagulação do plasma bovino citratado pelo extrato aquoso de Hedychium coronarium foi dose dependente, conforme a Tabela 1. Para os testes realizados como controles, contendo somente tampão fosfato e extrato vegetal não houve coagulação. Resultados semelhantes foram obtidos por Izidoro et al. (2003).
Tabela 1. Inibição da atividade coagulante plasma bovino citratado pelo extrato aquoso de H. coronarium. Tratamentos (Peçonha/extrato) (*)X ±SX
(1:0; m/m) 73,87±0,82
(1:5; m/m) 85,60±1,53
(1:10; m/m) 94,67±1,77
(1:50; m/m) 110,67±1,76
(*) X: média do tempo de coagulação;
X
S : erro padrão da média do tempo de coagulação.
Os três graus de liberdade referentes a tratamentos (concentrações de extrato) foram decompostos em componentes individuais a fim de estudar separadamente os efeitos de 1° grau ou
linear, de 2° grau ou quadrático e de 3° grau ou cúbico. Na Tabela 2 é apresentada a análise de variância para a variável “tempo de coagulação”.
Tabela 2. Análise de variância para a variável “tempo de coagulação” (em segundos).
Causas de Variação GL SQ QM Fc p-valor
Tratamento 3 2168,32 722,773 104,184 <0,000**
Erro 8 55,50 6,937
Total 11 2223,82
** Significativo a 1 % de probabilidade
Ao nível de significância de 1%, os tratamentos são significativos, ou seja, existe uma diferença significativa entre níveis de concentração de extrato e tempo de coagulação. Portanto, os resultados permitem concluir que o nível de
concentração de extrato influencia no tempo de coagulação.
Na Tabela 3 é apresentada a decomposição em componentes linear, quadrático e cúbico referente à soma de quadrados de tratamentos (concentrações de extrato).
Tabela 3. Análise de Variância referente à decomposição da soma de quadrado de tratamentos.
Causas de Variação GL SQ QM Fc p-valor
Regressão linear 1 1836,62 1836,62 264,74 <0,000** Regressão Quadrática 1 331,22 331,22 47,74 <0,000** Regressão Cúbica 1 0,48 0,48 0,069 0,799 Erro 8 55,50 6,937 Total 11 2223,82 ** Significativo a 1 % de probabilidade
Cada um dos quadrados médios é testado por meio do erro e a hipótese de nulidade é a de que a média de população para a comparação é zero. Se somente o efeito linear é significativo, conclui-se que o aumento na resposta para níveis sucessivos do fator (concentração de extratos) é constante. Um efeito quadrático significativo indica que uma equação de regressão de 2° grau ajusta melhor os dados, isto é, o aumento ou decréscimo para cada
aumento de nível do fator não é constante, mas muda progressivamente. Portanto, a análise mostra que o efeito linear (ou 1° grau) e efeito quadrático são altamente significativos para as concentrações de extrato. O componente de 3° não significativo indica que não trariam melhora alguma ao ajustamento.
falta de ajuste dos modelos: linear (1° grau) e quadrático (2° grau). O teste para a falta de ajuste (Lack of fit) baseia-se nas seguintes hipóteses: Ho -
não há falta de ajuste e Ha- há falta de ajuste. Os resultados do teste são apresentados nas Tabelas 4 e 5.
Tabela 4. Análise de Variância referente ao teste para falta de ajuste para o modelo de regressão de 2° grau.
Causas de Variação GL SQ QM Fc p-valor
Regressão Quadrática 2 2167,8 1083,9 174,26 <0,000**
Erro 9 56,0 6,2
Lack of fit 1 0,5 0,5 0,07 0,799
Erro 8 55,5 6,9
Total 11 2223,8
Ao nível de significância de 5%, o modelo de regressão quadrático não apresenta falta de ajuste, pois o p-valor da falta de ajuste mostrado na
Tabela 4 de análise de variância é maior que 0,05 (0,799).
Tabela 5. Análise de Variância referente ao teste para falta de ajuste para o modelo de regressão de 1° grau.
Causas de Variação GL SQ QM Fc p-valor
Regressão Linear 1 1836,6 1836,6 47,43 <0,000**
Erro 10 387,2 38,72
Lack of fit 2 331,7 165,8 23,91 <0,000**
Erro 8 55,5 6,9
Total 11 2223,8
Ao nível de significância de 5% rejeita-se Ho, ou seja, o modelo de regressão de 1° grau ajustado apresenta falta de ajuste, pois o p-valor da falta de ajuste mostrado na Tabela 5 de análise de
variância é menor que 0,05 (<0,000**). Portanto, ajustou-se uma equação de 2° grau conforme Tabela 6.
Tabela 6. Estatísticas referentes a composição do modelo de regressão de 2° grau estimado. 95% de confiança Parâmetros Estimativas LI LS (1)R2 (2)R2 Ajustado β0 74,0128 70,98037 77,04525 0,9748 0,9623 β1 (X*) 24,2132 18,58325 29,84311 β2 (X2) -3,3766 -4,42341 -2,32988 (*)X: nível ou dose de concentração de extrato; (1) R2: coeficiente de determinação e (2)R2
Ajustado: Coeficiente de determinação ajustado.
De acordo com a Tabela 6, todos os parâmetros do modelo são significativos, ao nível de 5% de significância. Segundo Anderson et al., (2007), para dados na área de ciências biológicas, valores de R2 iguais ou maiores a 0,60 frequentemente são considerados úteis. Portanto, o modelo quadrático pode ser indicado para predição do tempo de coagulação em função do nível (ou dose) de concentração de extrato aquoso de Hedychium coronarium. Com base no coeficiente de determinação ajustado pode-se dizer que o modelo estimado (2° grau) consegue captar cerca 96% da variação total do tempo de coagulação.
Na Figura 1 é apresentado o gráfico de dispersão referente aos níveis de concentração de extrato (em µl) versus tempo de coagulação (em segundos) para o modelo de 2° grau.
Para verificar as pressuposições de normalidade, independência e homogeneidade dos resíduos foram realizados os testes de Shapiro-Wilk, de Durbin-Watson e de Bartlett, respectivamente. Os resultados dos testes estão apresentados na Tabela 7.
70,0 85,0 100,0 115,0
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
Níveis de concentração de extrato (µl)
T e m p o d e c o a g u la ç ã o ( s e g u n d o s )
Figura 1. Gráfico de dispersão de níveis de concentração de extrato versus tempo de coagulação para o modelo de 2° grau.
Tabela 7. Resultados dos testes de Shapiro-Wilk, Durbin-Watson e Bartlett para o resíduo do modelo de regressão de 2° grau com n = 12.
Teste Durbin-Watson Teste Estatística p-valor
Estatística - D 3,0313
Shapiro-Wilk 0,8751 0,0759 Di du
Bartlett 1,03 0,794 0,812 1,579
(1) D: valor da estatística de Durbin-Watson; (2) di: Limite inferior do teste (3) du: Limite superior do teste.
O teste de Durbin-Watson determina se existe ou não a correlação entre os resíduos. A regra de decisão é: Se D > du (limite superior), não existe correlação nos resíduos; Se D < di (limite inferior), existe uma correlação positiva; Se di < D < du, o teste é inconclusivo (MINITAB Inc., 2006). Portanto, o modelo de 2° grau estimado possui resíduos independentes. Logo, o modelo escolhido para predizer o tempo de coagulação em função do nível (ou dose) de concentração de extrato aquoso de Hedychium coronarium é: Tempo = 74,0128 + 24,2132 Dose – 3,3766 Dose2.
CONCLUSÕES
Os resultados mostram que o extrato aquoso da raiz Hedychium coronarium possui compostos
com a capacidade de inibir alguns dos efeitos tóxicos induzidos pela peçonha de B. pauloensis.
O modelo quadrático estimado apresentou um bom ajuste, pois conseguiu captar cerca 96 % da variação total do tempo de coagulação. Porém, em estudos futuros, pretende-se estudar a relação entre níveis de concentração de extratos aquoso de Hedychium coronarium nas proporções de 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 e 1:50 (m/m; peçonha/extrato), a fim de determinar se esta relação quadrática é mantida.
Dessa forma, fica evidente que uma possível purificação desses inibidores pode ser útil na complementação dos antivenenos utilizados no tratamento contra os danos causados por picadas de serpentes.
ABSTRACT: Envenomations with snakes Bothrops genus can cause dependency at the sting site, which are not reversed even after treatment with snake antivenoms. Incubation of the aqueous extract of Hedychium coronarium (Zingeberaceae) with snake venom Bothrops pauloensis in different concentrations was able to inhibit some enzymatic activities. This work has set a model of regression between concentrations of extract and clotting time (seconds). The adjusted model has captured about 96% of the total variation of clotting time.
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