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FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU Curso de Pós-Graduação em Zootecnia – Nutrição e Produção Animal
CROMATOGRAFIA À GÁS
DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
Maria Carolina W. Manco & Sandra R. S. T. Carvalho
Zootecnistas
Disciplina: Métodos de Avaliação da Qualidade de Carnes Prof. Roberto de Oliveira Roça
Departamento de Gestão e Tecnologia Agroindustrial Fazenda Experimental Lageado, Caixa Postal, 237 F.C.A. - UNESP - Campus de Botucatu CEP 18.603-970 - BOTUCATU - SP robertoroca@fca.unesp.br
CROMATOGRAFIA À GÁS
DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
I. Introdução
As idéias sobre a função dos óleos e gorduras na alimentação humana sofreram uma contínua mudança nos últimos 50 anos. Isso se aplica, principalmente, à importância atribuída aos ácidos graxos individuais , tais como o esteárico, o linoléico ou linolênico. Como resultado, o único conselho que pode ser oferecido aos consumidores de óleos e gorduras é o da moderação em seu uso (Hartman, 1993).
II. Importância dos óleos e gorduras na alimentação humana
É sabido que os óleos e gordura, tanto de origem animal como vegetal, constituem parte do triângulo da dieta humana, as outras duas partes sendo proteínas e carboidratos. As idéias sobre a importância dos óleos e gorduras na alimentação humana sofreram uma contínua mudança durante os últimos 50 anos.
Na década de 1940, foi estabelecido que, com exceção de uma quantidade mínima dos assim chamados ácidos graxos essenciais, os óleos e gorduras não são componentes necessários à dieta. A disputa se a calorias provenientes dos óleos e gordura devem constituir 3%, 30% ou 40% das calorias totais da dieta humana, até hoje não foi resolvida. Os ácidos graxos essenciais são produtos que formam uma parte do nosso organismo, mas não são produzidos pelo organismo humano, e portanto, devem ser incluídos em nossa alimentação. Ainda na década de 40, o ácidos linoléico, um produto com 18 carbonos e duas duplas ligações foi considerado essencial e o ácido linolênico, com 18 carbonos e três duplas ligações foi seu "primo pobre". Em 1957, Keyes et al , citados por Hartman (1993), afirmaram que os ácidos graxos saturados elevavam os níveis de colesterol no sangue, enquanto que os ácidos graxos poliinsaturados tinham efeito oposto. Como resultados, a gordura de carne bovina e ovina foram apontadas como um dos principais produtores de colesterol no corpo humano.
A Associação Americana do Coração recomendava como limite de gordura
graxos poliinsaturados (PUFA) e 10 % de energia derivada de ácidos graxos monoinsaturados (MUFA) e os outros 10% derivados de ácidos graxos saturados (SFA). A partir de 1988 o Programa Nacional Educacional do Colesterol alterou a recomendação aumentando para 15% de energia derivada de MUFA e a redução para 5% de energia derivada de PUFA.
Dentre os ácidos graxos saturados, o mais representativo é o ácido esteárico, com 18 carbonos, seguido de ácido palmítico com 16 carbonos, ácido mirístico com 14 carbonos, ácido láurico com 12 carbonos e assim por diante. SHORLAND durante o Congresso Internacional sobre Gorduras, em 1989, informou que o ácido esteárico, cujo ponto de fusão é o mais alto dentre os ácidos saturados comuns, não produz colesterol, pois quando ingerido sofre transformação e passa a ácido oléico, que tem dupla ligação e não participa da produção de colesterol no organismo humano. O mesmo não ocorre com os ácidos palmítico, mirístico e láurico que produzem colesterol e cujo consumo deve ser restrito.
III. Ácidos Graxos Insaturados e Poliinsaturados
Como já mencionado, houve um tempo em que o ácido linoleíco era considerado como o ácido graxo essencial. Porém um grande consumo deste ácido pode causar coagulação do sangue ou trombose, que é mais perigosa do que a arterosclerose ou o entupimento das artérias. Seu excessivo consumo pode também levar a altos níveis do poliinsaturados ácido araquidônico, criando hipersensibilidade e doenças inflamatórias. O remédios é, exatamente, a aplicação do ácido linolênico.
O ácido linolênico teve, também, efeitos benéficos nas experiências com macacos, frangos, peixes e insetos. Por ser mais insaturado é mais facilmente oxidado. Por isso muitos esforços foram feitos para reduzir o seu conteúdo no óleo de soja que contém até 10% dele. Agora estes esforços não são mais encorajados (Hartman, 1993).
Existem dois isômeros do ácido linolênico: o isômero encontrado em muitos óleos vegetais é o ácido alfa-linolênico com duas duplas ligações nos carbonos 9,12 e 15. O ácido gama-linolênico encontrado no óleo de prímula e no óleo de fígado de bacalhau tem duas duplas ligações nos carbonos 6, 9 e 12 e serve para a
medicação de várias doenças. É especialmente útil no combate À atopia, um conjunto de afecções alérgicas (Hartman, 1993).
Os óleos de peixe contêm ácidos graxos poliinsaturados, nos quais a inicial dupla ligação está colocada no terceiro carbono, contando do terminal ou ômega fim da molécula. Os dois mais importantes ácidos graxos nos óleos de peixes são o ácido icosapentaenoico (EPA), isto é, um ácido com 20 carbonos e 5 duplas ligações e o ácido docosahexaenoico (DPA), um ácido com 22 carbonos e 6 duplas ligações.
É recente o interesse por esses ácidos. Em 1988, Shorland citado por Hartman (1993), escreveu um artigo informando que os esquimós da Groenlândia, cuja dieta consiste de peixes, contendo quase 60% de calorias totais na forma de gordura, alto caonteúdo de colesterol e proteína e quase nenhuma fibra não apresentam casos de doenças coronarianas. Em contrapartida , durante o Congresso Internacional sobre Gorduras, David Kritchevsky, outro nutricionista afirma : " Os esquimós podem ter a mais baixa incidência de doenças cardíacas, mas eles têm também a mais alta incidência de derrame cerebral, o que pode ser atribuído a uma insuficiente coagulação de plaquetas no cérebro". Portanto, o que brilhantemente Hartman questiona é que temos uma escolha entre o enfarte e o derrame cerebral.
Porém o que podemos concluir é que com o avanço das pesquisas o que ontem eram consideradas verdades hoje podem ser dúvidas. A preocupação com o que se como, bem como sua quantidade
tem feito com que pesquisas sejam feitas com o propósito destes esclarecimentos.
A mensagem que Hartman (1993) baseada nos confusos resultados destas pesquisas sobre o efeito dos óleos comestíveis para a saúde, é a velha mensagem da moderação. Hartman (1993) ainda destaca a citação de Elizabeth Whelan, diretora do Conselho Americano de Ciência e Saúde,: " Uma comida só, seja brócolis ou batatas fritas não é determinante de saúde ou causa da doença: é a composição da dieta total que contribui para o bom estado da saúde". Ainda acrescentaria a qualidade de vida, atividade física, tabagismo e o consumo excessivo de álcool.
IV. Carne e Gordura
A carne tem sido classificada dentro da categoria de alimentos ricos em gordura e é apontada de maneira muito crítica, quanto ao aspecto de alimentação saudável. As tabelas de composição química da carne divulgadas normalmente, são antigas e ultrapassadas e apresentam um teor de matéria graxa elevado, o que não é observado atualmente.
A graxa ou gordura, está armazenada no tecido animal de quatro maneiras:
- extracelular: constituída dos depósitos de tecido adiposo subcutâneo e demais depósitos no organismo animal,
- intermuscular: como o próprio nome indica está localizada entre os músculos, - intermuscular: conhecida como marmorização, constituída de fibras muito finas no tecido muscular,
- em pequena quantidade de graxa no tecido muscular, a qual é encontrada formando pequenas gotículas no líquido intercelular.
A marmorização é desejável na carne, desde que não seja em excesso.
Contribui para a suculência, firmeza e sabor da carne. Um conceito errado está em relacionar maciez e gordura, quanto maior a quantidade de gordura maior a maciez na carne. Baseando-se nesta afirmação poderíamos concluir que de todos os cortes o cupim seria o mais macio e o filé mignon o mais dura, o que comprovadamente não o é. A gordura está mais diretamente relacionada com a suculência, quantidade de salivação durante a mastigação, do que unicamente com a maciez, como tem sido enfatizado.
As graxas de búfalos, bovinos e ovinos possuem maior proporção de ácidos graxos saturados, enquanto que em suínos e aves predominam os ácidos graxos insaturados.
Tab.1. Composição em ácidos graxos e triacilgliceróis em depósitos de gordura subcutânea (em % total de ácidos graxos ou % de triacilgliceróis).
Componente Frango Suíno Bovino Ovino
Ácidos Graxos Láurico Mirístico Palmítico
- 0,1 25,6
traços 1,3 28,3
0,1 4,5 27,4
0,1 3,2 28,0
Esteárico
Saturados Totais Palmitoleico Oleico Linolênico Linoleico
Insaturados Totais
0,7 32,7 7,0 20,4 21,3 - 67,3
11,9 41,5 2,7 47,5 6,0 0,2 58,5
21,1 53,7 2,0 41,6 1,8 0,5 46,3
24,8 57,7 1,3 36,4 3,5 0,5 42,3
Triacilgliceróis
Totalmente Saturados Tripalmitina
Dipalmitoestearina Palmitodiestearina Mono-oleo-dissaturados Oleodipalmitina
Oleopalmitoestearina Oleodiestearina
Di-oleo-monossaturados Palmitodioleína
Estearodioleína
Trioleína
1 2 2
5 27 -
53 7 3
3 8 6
15 32 2
23 11 0
traços 3 2
13 28 1
46 7 0 FORREST et al., 1979, citado por ROÇA , 2000.
V. Métodos de Análise de Ácidos Graxos
O método mais utilizado para quantificar os ácidos graxos na carne é através da Cromatografia Gasosa, mesmo que amostra obtida seja líquida.
A cromatografia a gás , agora com mais de 30 anos de existência, tem mostrado ser a técnica mais importante da química analítica instrumental (Ciola, 1985).
1. Conceito
A cromatografia pode ser conceituada como um método físico-químico de
particionados entre duas fases, uma estacionária e de grande área e a outra um fluído insolúvel que percola através da primeira.
A cromatografia se baseia, portanto, na partição, da amostra entre uma fase móvel (FM) líquida e gasosa e uma fase estacionária (FE) - líquida ou sólida.
De um modo geral, o processo cromatográfico é levado a efeito introduzindo a fase estacionária num tubo, chamado coluna cromatográfica. A amostra é introduzida no topo da coluna e a fase móvel é bombeada continuamente a uma velocidade constante.
Com o passar da fase móvel, as substâncias começam a migrar de acordo com as interações de suas propriedades físico-químicas com as da fase estacionária.
No término da coluna instala-se um monitor que detecta as substâncias separadas e transmite para um registrador um sinal proporcional à sua concentração. O gráfico obtido é chamado cromatograma.
Dispositivos especiais e ás vezes sofisticados, são necessários para manter a vazão da fase móvel com grande precisão. Para as fases líquidas empregam-se, geralmente, gases superpuros pressurizados em cilindros de aço. A pressão de trabalho e as vazões são controladas com equipamento especial.
2. Preparação da Amostra
O método de extração de ácido graxo da carne é o recomendado po Folch et al (1957), específico para carne e tecido animal.
• Retirar amostra da carne
• Triturar
• Pesar 4 g da amostra tritura em becker
• Adicionar 40 ml de metanol P.A. (com proveta)
• Misturar no homogeneizador (Turrax por ±2 minutos)
• Adicionar 80 ml de clorofórmio (com auxílio da proveta)
• Misturar novamente no homogeneizador (Turrax por± 5 minutos)
• Filtrar (papel de filtro comum, com funil de buchner, kitassato e bomba de vácuo)
• Raspar com cuidado todo resíduo que ficou no filtro para o becker
• Adicionar 40 ml de metanol e 80 ml de clorofórmio (com proveta)
• Filtrar novamente (no mesmo aparato anterior)
• Colocar o filtrado em uma proveta de 500 ml com boca e tampa esmerilhada, medir o volume
• Adicionar 1/4 do volume de KCl 0,88%
• Agitar, tirando a pressão que forma dentro da proveta
• Deixar descansar por + 1 minuto, para separar
• Com o auxílio da bomba de vácuo, tirar o sobrenadante e desprezá-lo
• Medir novamente o volume e adicionar 1/4 de metanol (1:1, 1 parte de metanol para 1 parte de água)
• Agitar, tirando a pressão que forma dentro da proveta
• Deixar descansar por ± 1 minuto, para separar
• Com o auxílio da bomba de vácuo retirar o sobrenadante e desprezá-lo
• Adicionar um pouco de sulfato de sódio anidro, no que ficou na proveta
• Filtrar em papel de filtro comum, contendo um pouco de sulfato de sódio anidro, recolhendo o filtrado em um balão com fundo redondo, próprio para a evaporação
• Enxaguar a porveta com um pouco de clorofórmio e filtrar
• Colocar o balão contendo o filtrado no evaporador rotativo (45°C)
• Lavar o que ficou de gordura no balão, com clorofórmio
• Com o auxílio de uma pipeta transferir para um balão volumétrico de 10 ml e completar com clorofórmio.
Utilização do Evaporador Rotativo
• Colocar água no banho-maria
• Ligar
• Acertar a temperatura (45°C)
• Colocar gelo na caixa de isopor
• Abrir torneira de água
• Colocar balão no evaporador
•
• Ligar a bomba de vácuo
• Ligar a rotação
• Quando estiver seco, desligar a rotação
• Abrir a torneira do aparelho (para que não haja refluxo)
• Desligar a bomba de vácuo
• Retirar o balão
Técnicas recomendadas para a injeção da amostra de líquidos com microsseringas:
• Lavar cuidadosamente a seringa com o solvente de amostra puro
• Introduzir de 3 a 4 microlitros de solvente na seringa e ajustar o volume a 1 microlitro
• Aspirar 1 micrlitro de ar
• Aspirar, exatamente, um volume conveniente da amostra (3-5 microlitros)
• Aspirar 1 microlitro de ar
• Injetar rapidamente.
Com esta técnica evita-se fracionamento da amostra e os processos de difusão que podem acarretar alteração da composição ou da massa analisada.
Recomendações Finais
A determinação da composição em ácidos graxos da carne deve ser realizada por cromatografia gás-líquido, sendo a gordura extraída com mistura de clorofórmio:metanol como descrito acima e a esterificação dos ácidos graxos pelo uso de cloreto de amônio, metanol e ácido sulfúrico (Hartman e Lago, 1973).
Os ésteres de ácidos graxos foram podem ser analisados em cromatógrafo CG-500, utilizando coluna capilar de sílica fundida, modelo FI-547, com Carbowax 20M, de 25m x 0,25mm de d.i..A temperatura inicial da coluna deve ser 150°C, velocidade de acréscimo 6°C/min, temperatura do detector e do vaporizador a 250°C. Para a identificação dos picos os cromatogramas podem ser compardos com
cromatogramas de padrões de ésteres de ácidos graxos da SIGMA®, avaliando-se individualmente o tempo de retenção. A quantificação dos ácidos graxos pode ser feita através de intergrador CG-300 (SANT'ANA, 1998)
Referências Bibliográficas
CIOLA,R.. Fundamentos da Cromatografia a gás, 2ª Edição revista e ampliada, Ed. Edgar Blücher Ltda, 297p, 1985.
FOLCH,J.,LEE,M.,SLOANE STANLEY,G.H.A simple method for isolation and purification of total lipids from animal tissue. J.Biol.Chem., Baltimore, v.226, p.497-509, 1957.
HARTMAN, L.. A evolução de idéias sobre a função dos óleos e gorduras na alimentação humana - Palestra, Bol. SBCTA, 27 (1):55-58, jan/jun.1993.
ROÇA, R.,O.. Apostila da Disciplina de Tecnologia de Produtos de Origem Animal, p.14-15, 2000.
SANT'ANA, L.S.,FILHO,J.M.. Efeito da adição de antioxidantes invivo na composição em ácidos graxos de filés de Pacu (Piractus mesopotamicus) cutivados.Rev.Farm.Bioquím.Univ.São Paulo, v.34, n.1, p.29-32, jan/jun.1998.
