QFL1201
Química Analítica Instrumental –Diurno 1º Semestre 2019
11 de maio de 2019
Luís Moreira Gonçalves
BSc, MD, PhD
Cromatografia líquida
Cromatografia líquida
⚫ Fase estacionária
⚫ Fase móvel
sólido líquida
Mecanismos de separação
físicos
químicos mecânicos
adsorção partição
troca iônica bioafinidade
- exclusão
Cromatografia líquida em coluna
HPLC
●colunas metálicas
●alta pressão
●bombas de propulsão
●colunas de vidro
●pressão atmosférica
●ação da gravidade
Clássica
Cromatografia líquida em coluna
Modalidades de HPLC
Cromatografia de partição
Cromatografia de adsorção (cromatografia líquido-sólido)
Cromatografia de troca iônica
Cromatografia de exclusão por tamanho
Cromatografia de bioafinidade
Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
FASE NORMAL fase estacionária polar fase móvel apolar
FASE REVERSA fase estacionária apolar fase móvel polar
Cromatografia de partição
Cromatografia de adsorção
• FE polares - água e trietilenoglicol adsorvidos sobre sílica ou alumina
• FM apolares - hexano ou éter isopropílico
componente menos polar elui primeiro
Polaridade do soluto: a > b > c
c b a
tempo
c b a
tempo
Polaridade da fase móvel
Cromatografia de fase normal
• FE apolares – hidrocarbonetos (C8, C18)
• FM polares – água, metanol, acetonitrila
componente mais polar elui primeiro
Polaridade do soluto: a > b > c
c a b
tempo
c a b
tempo
Polaridade da fase móvel
Cromatografia de fase reversa
hidrocarbonetos éteres
ésteres cetonas aldeídos amidas aminas álcoois ácidos
água
Ordem de polaridade
Instrumentação
Reservatório da fase móvel
Sistemas de bombeamento
pressões de até 6000 psi (600 bars)
fluxo livre de pulsação - amortecedor de pulsos
vazões de 0,01 a 10 mL/min
controle de vazão - reprodutibilidade melhor que 1 %
• bombas pneumáticas
• bombas mecânicas recíprocas deslocamento (tipo seringa)
Bombas pneumáticas
☺ Fluxo livre de pulsação
☺ Custo baixo
coluna
Móvelfase (líquido)
gás
Fluxo depende da impedância hidrodinâmica e da viscosidade
Requer troca de solvente
Pressão de saída alta
Não é possível eluição por gradiente
Bomba recíproca
Fluxo pulsado
Custo mais elevado
☺ Vazão constante
☺ Pressões de saída até 10000 psi
☺ Eluição por gradiente
☺ Volume interno (35 a 400 mL)
☺ Fluxo independe da impedância hidrodinâmica e da viscosidade
85% das bombas utilizadas em CLAE
Bombas tipo seringa
☺ Fluxo independe da impedância hidrodinâmica e da viscosidade
☺ Fluxo livre de pulsação Volume de solvente ( 250 mL)
Não é possível eluição por gradiente
coluna
motor móvelfase
Injeção de amostra
Fator limitante da precisão
Volumes 0,5-500 L
Injeção de amostra sem despressurizar o sistema
Injeção rápida para evitar obstrução do fluxo
Cuidados para não introduzir bolhas no sistema
alça de injeção (loop) ● pressões de até 7000 psi
● precisão melhor que 1%
seringas ● despressurização
● precisão > 2-3%
Injetores
amostragem injeção
seringa seringa
coluna solvente coluna solvente
alça de amostragem
Coluna Empacotada
saída coluna
entrada
pré-coluna
discos
porosos disco
poroso L = 5 a 30 cm; d = 1 a 5 mm
d < 1 mm (100 μm) tem dimensões capilares
Colunas para HPLC
Cromatografia a gás
Difusão em líquidos é ~ 100 vezes menor que difusão em gases.
Eficiência diâmetro da coluna
Cromatografia a líquido
HPLC é sempre feito em colunas empacotadas.
Eficiência diâmetro das partículas
Eficiência difusão longitudinal (B/u)
Aquecimento (40-50
oC)
Viscosidade pressão TR
Resolução
Aumento da velocidade de difusão do soluto – menor C
Colunas para HPLC
Colunas empacotadas
HPLC
Eficiência tamanho da partícula (1-5 m) Vazão mais uniforme - menor A
Melhor difusão do soluto na fase móvel – menor C
tamanho da partícula resistência ao fluxo pressão
ux L
r2 dp2 P =
H = A + B/u + Cu
Diâmetro de partícula x N
vazão (mL/min)
Altura do prato (mm)
sílica
dp = 10 m dp = 5 m
Fases estacionárias
Sílica microporosa
Sílica modificada
● quimicamente ligada
aplicação
● deposição de carbono grafítico
retenção de compostos apolares
faixa de pH
Materiais poliméricos
Sílica modificada
Grupos C18
(quimicamente ligados)
Grupos C18 – quimicamente ligados com estrutura bidentada (Zorbax Extend-C18®)
A.M. Faria et al., Química Nova, 29 (2006) 300.
Sílica modificada
Grupos silixanos sofrem hidrólise pH < 2
Grupos isobutil protege a FE contra hidrólise
fases polares R= (CH2)3NH2 (amino) R= (CH2)3CN (ciano)
R= (CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH (diol) fases apolares R= (CH2)17CH3 (octadecil)
R= (CH2)7CH3 (octil) R= (CH2)3C6H5 (fenil) Sílica cromatografia de adsorção
cromatografia de partição líquido-líquido
modificada
Si-OH + Cl-Si-R Si-O-Si-R + HCl CH3
CH3
Fase móvel
pureza custo
remoção de gases dissolvidos
não decompor ou dissolver a FE
ter baixa viscosidade
compatibilidade com o detector
polaridade adequada
aditivos
pré-coluna fase ligada
trietilamina (aminas)
acetato de amônio (ácidos)
Tipos de Eluição
Eluição isocrática
É feita com um único solvente ou com uma mistura de solventes de composição constante (água – solvente).
Eluição com gradiente
É feita com variação contínua na composição do solvente para aumentar a força do eluente.
fase estacionária: C18 fase móvel:
A – tampão aquoso (pH 3,5) B – acetonitrila
OH OH O
O O
OH O
O O
O O O
1 2 3
4 5
6 7 8
Eluição isocrática
fase estacionária: C18 fase móvel:
A – tampão aquoso (pH 3,5) B – acetonitrila
OH OH O
O O
OH O
O O
O O O
1 2 3
4 5
6 7 8
Eluição por gradiente
fase normal
pentano tolueno clorofórmio diclorometano
éter etílico acetato de etila
dioxano acetonitrila
acetona
tetraidrofurano isopropanol
metanol
fase reversa
fase estacionária: sílica fase estacionária: C18
Força do solvente
Otimização da separação
=0,57
=0,95
=0,65
C H3
O
OH
C H3
O
O-
C H3
O
OH
C H3
O
O-
+
+
H+
H+
água solvente orgânico
(coeficiente de partição)
Porque usamos uma solução tampão na fase móvel?
sensibilidade
resposta rápida
faixa de resposta (linear)
dependência temperatura e vazão
resposta independente da fase móvel
alargamento do pico
não destrutivo
informações qualitativas sobre os analitos
Detector ideal
Ópticos
(espectro)fotométricos
índice de refração
fluorimétricos
Eletroquímicos
condutométricos
amperométricos
Espectrometria de massas
Detectores
A t
Detectores espectrofotométricos
0 2 4 6 8 10
A UV (254 nm)
Tempo
UV-vis multicanal (Tempo x λ)
Detector por arranjo de diodos
Permite detecção para determinação quantitativa
A obtenção do espectro permite identificação
Detector por arranjo de diodos
(ajuda nas identificações qualitativas)
Detecção em =250 nm (fixo) Espectro do antraceno pós coluna
Celas de medida UV-Vis
entrada saída
fonte de
radiação detector
✓ Mais comum em HPLC
✓ Lâmpadas Hg, D2, W, Xe
✓ Solvente não deve absorver a radiação
✓ Compatíveis com eluição por gradiente
Escolha de fase móvel x comprimento de onda
λ / nm
200 300 400
pentano (190 nm) tolueno (284 nm) clorofórmio (245 nm) acetonitrila (190 nm) acetona (330 nm) metanol (205 nm)
Detecção por fluorescência
riboflavina (vitamina B2) amostra: urina
λex= 340 nm λem= 550 nm
Detector de índice de refração
✓ Não específico e menos sensível (1000 x UV-Vis)
✓ Luz visível colimada é defletida pela presença da amostra
✓ Não são compatíveis com eluição por gradiente
5-10L
Lei de Fresnel
Detector por espalhamento de luz
✓ Não específico
✓ Analito menos volátil que a fase móvel
✓ Compatível com eluição por gradiente
✓ Não produz curva linear
Medidor de pressão Bomba
Injetor Fase Móvel
Coluna
LC – ESI – MS – MS
http://qbab.aber.ac.uk/roy/mss/qtof.htm
Detector MS – 2 Cela MS – 1 ESI
de Colisão
Detector de Espectrometria de Massas
Comparação dos detectores usados em HPLC
E. W. Yeung e R. E. Synovec, Analytical Chemistry, 58 (1986) 1237 A.
Detectores Limites de detecção
aproximados (ng) Possível o uso de gradiente?
Ultravioleta
Índice de refração Espalhamento de luz Eletroquímico
Fluorescência Condutividade
Espectrometria de massas
0,1 – 1
100 – 1000 0,1 – 1
0,01 – 1
0,001 – 0,01 0,5 – 1
0,1 - 1
Sim Não Sim Não Sim Não Sim
