Separação e caracterização dos componentes
de hemoglobina de Pterygoplichthys partialis, o acaribodó (*)
M. Brunori ('}; J . Bonaventura (s); A . Focesi J r . ('); M . I. Galdames-Portus ['); M . T . W i l s o n (s)
Resumo
Os quatro componentes de hemoglobina princi-pais do hemolisado de Pterygoplichthys pardalis fo-ram isolados e caracterizados. As propriedades fun-cionais investigadas para os componentes isolados compreendem o efeito de pH e ATP sobre: (i) o equilíbrio de 02, (ii) a cinética da dissociação de Oa (iii) a cinética da combinação de CO. O compo-nente I, corresponde a aproximadamente 50% da hemoglobina total, é caracterizado por proprieda-des funcionais que são diferentes das dos compo-nentes II, III e IV, os quais são semelhantes. Assim, é provado, uma vez mais, que componentes múlti-plos num hemolisado caem na categoria de hemo-globinas caracterizadas por propriedades funcio-nais distintas e complementares.
I N T R O D U Ç Ã O
Este a r t i g o é u m e s t u d o d o s c o m p o n e n t e s d e h e m o g l o b i n a d e Pterygoplichthys pardalis, p e i x e da B a c i a A m a z ô n i c a p e r t e n c e n t e à s u p e r
-o r d e m O s t a r i -o p h y s i , -o r d e m C y p r i n i f -o r m e s , s u b o r d e m S i l u r o i d e i ( G r e e n w o o d e í ai, 1 9 6 6 ; Fink, 1977) . É u m d o s n u m e r o s o s b a g r e s q u e p o v o a m a s á g u a s a m a z ô n i c a s e , p r o v a v e l m e n -t e , o m a i s c o m u m e n -t r e o s m e s m o s .
A i n v e s t i g a ç ã o d a s h e m o g l o b i n a s c o n c e r -n e -n t e ao h e m o l i s a d o d o s a -n g u e d e Pterygo-plichthys f o i e f e t u a d a p e l a s s e g u i n t e s r a z õ e s :
(1) Entre o s h e m o l i s a d o s i n v e s t i g a d o s e m a l -g u n s p o r m e n o r e s , d u r a n t e a e x p e d i ç ã o d o " A l p h a H e l i x " , a g r a n d e m a i o r i a , e s c o l h i d a , p o r ó b v i a s r a z õ e s p r á t i c a s , c o n t i n h a a p e n a s u m o u d o i s c o m p o n e n t e s h e m o g l o b í n i c o s . U m e s t u d o c u i d a d o s o d e , p e l o m e n o s , u m m u l t i -c o m p o n e n t e d o h e m o l i s a d o p a r e -c i a , p o r t a n t o , e s s e n c i a l p o r s e r n e c e s s á r i o r e t i r a r c o n c l u
-s õ e -s r e l e v a n t e -s a p r o b l e m a -s f i -s i o l ó g i c o -s . (2) D o p o n t o d e v i s t a da f i s i o l o g i a r e s p i r a t ó r i a , Pterygoplichthys é u m a e s p é c i e m u i t o i n t e r e s -s a n t e p o r q u e , a l é m d a -s g u e l r a -s é p r o v i d o d e u m s i s t e m a a l t e r n a t i v o d e t r o c a d e 02, asso-c i a d o a o s s e u s i n t e s t i n o s , o q u e o t o r n a u m a e r ó b i c o o p c i o n a l . Esta h a b i l i d a d e r e p r e s e n t a u m a razão i m p o r t a n t e j u n t o c o m s u a e s t r u t u r a c o r i á c e a , para a r e s i s t ê n c i a i n c o m u m d e s t a s e s p é c i e s . ( 3 ) É u m p e i x e m u i t o c o m u m e a b u n d a n t e , q u e p o d e s e r f a c i l m e n t e o b t i d o e m boa q u a n t i d a d e ; a l é m d i s s o , e l e r e p r e s e n t a , c o m o u m a e r ó b i c o o p c i o n a l , u m p a s s o i n t e r m e -d i á r i o na e v o l u ç ã o -d e o r g a n i s m o s -d e v i -d a aquá-t i c a e aquá-t e r r e s aquá-t r e . ( 4 ) F i n a l m e n aquá-t e , é aquá-t a m b é m u m a n i m a l i m p o r t a n t e d o p o n t o d e v i s t a c o m e r c i a l , s e n d o u s a d o c o m o a l i m e n t o na r e g i ã o .
M A T E R I A L E M É T O D O S
A p r e p a r a ç ã o d a h e m o g l o b i n a d e s a n g u e r e c é m c o l e t a d o s e g u i u o m é t o d o d e r o t i n a ( v i -d e A n t o n i n i & B r u n o r i , 1 9 7 1 ) . A p u r i f i c a ç ã o f o i f e i t a p o r p a s s a g e m a t r a v é s de c o l u n a d e S e p h a d e x G-25 a p H 7,5, s e g u i d a p o r p a s s a g e m a t r a v é s d e c o l u n a d e t r o c a i ô n i c a " m i x e d b e d " .
A e l e t r o f o r e s e f o i r e a l i z a d a e m gel p o l i a -c r i l a m i d a . A s e p a r a ç ã o d o s -c o m p o n e n t e s f o i f e i t a e m c o l u n a c r o m a t o g r á f i c a d e DEAE, da s e g u i n t e m a n e i r a : a c o l u n a e o h e m o l i s a d o f o -r a m e q u i l i b -r a d o s c o m T -r i s 0,05 M p H 8,5; a p ó s a p l i c a ç ã o da a m o s t r a , a c o l u n a f o i lavada c o m a p r o x i m a d a m e n t e 2 0 0 m l d o m e s m o t a m p ã o e p o s t e r i o r m e n t e f o i i n i c i a d a e m g r a d i e n t e d e p H c o m 5 0 0 m l d e T r i s 0,05 M p H 8,5 e 5 0 0 m l d e T r i s - a c e t a t o 0,05 M p H 6 , 0 .
( • ) — Versão original Inglesa publicada e m C o m p . Btochem. Physiol, v o l 6 2 A ( 1 1 . 1 9 7 9 .
( 1 ) — C N R C e n t r e f o r Molecular Biology, Institutes o f C h e m i s t r y and Biochemistry. Faculty of M e d i c i n e , University Rome, Rome, Italy.
( 2 ) * - D u k e University, M a r i n e Laboratory, Beaufort, N . C . 28516, U . S . A . Established Investigator of t h e A m e r i c a n Heart A s s o c i a t i o n .
( 3 ) — D e p a r t a m e n t o d e Bioquímica, I . B . , Universidade Estadual de Campinas, 13100 C a m p i n a s , SP, Brasil. ( 4 ) — Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, 69000 M a n a u s , A M , Brasil.
( 5 ) — D e p a r t m e n t of Chemistry, University of Essex. W l v e n h o e Park, Colchester. Essex, U . K .
O e q u i l í b r i o d e o x i g ê n i o f o i m e d i d o s e g u n -d o o m é t o -d o -d e R i g g s & W o l b a c h ( 1 9 5 6 ) .
E x p e r i m e n t o s c i n é t i c o s f o r a m e f e t u a d o s e m u m a p a r e l h o " S t o p p e d f l o w " G i b s o n D u r -r u m e q u i p a d o c o m u m a c é l u l a d e o b s e -r v a ç ã o de 2 c m . A c i n é t i c a d a d i s s o c i a ç ã o d e o x i g ê -n i o f o i m e d i d a u s a -n d o - s e o m é t o d o d o d i t i o -n i t o
( A n t o n i n i & B r u n o r i , 1 9 7 1 ) . S o l u ç õ e s d e C O f o r a m o b t i d a s d i l u i n d o - s e q u a n t i t a t i v a m e n t e u m a s o l u ç ã o e s t o q u e d e água d e s t i l a d a e q u i l i -brada c o m C O a 1 a t m e 3 0 ± 1 ° C , c o n e . = 0,86 m M ( T a b e l a s C r í t i c a s I n t e r n a c i o n a l , W a s h b u r n , 1 9 2 6 ) .
R E S U L T A D O S E D I S C U S S Ã O
C O M P O R T A M E N T O E L E T R O F O R E T I C O E C R O M A T O G R Á F I C O
O s h e m o l i s a d o s d e d i v e r s o s i n d i v í d u o s a d u l t o s f o r a m c a r a c t e r i z a d o s e l e t r o f o r e t i c a m e n t e . A s a n á l i s e s d e , p e l o m e n o s , 2 0 e s p é c i m e s p r o v o u q u e : ( i ) o s h e m o l i s a d o s c o n t i -n h a m m ú l t i p l o s c o m p o -n e -n t e s h e m o g l o b í -n i c o s ;
( i i ) a p r e s e n ç a d e u m a b a n d a p r i n c i p a l , cor-r e s p o n d e n d o a a p cor-r o x i m a d a m e n t e 5 0 % d a H b t o t a l e 3 o u t r o s c o m p o n e n t e s m e n o r e s : ( i ü ) o p a d r ã o f o i c o n s t a n t e d e u m i n d i v í d u o para o u -t r o . Es-te p a d r ã o c o r r e s p o n d e ao d e s c r i -t o p o r
Fyhn e t a l . (1978) para e s p é c i e s 1 d e Pterygopüchthys.
A s e p a r a ç ã o d o s v á r i o s c o m p o n e n t e s f o i e f e t u a d a p o r c r o m a t o g r a f i a e m D E A E - S e p h a d e x ( v e r m é t o d o s ) . A F i g . 1 i l u s t r a o p a d r ã o d e e l u i ç ã o , o qual é c o n s i s t e n t e c o m o p a d r ã o e l e t r o f o r é t i c o o b s e r v a d o . O c o m p o n e n t e p r i n -c i p a l (aqui d e n o m i n a d o C o m p o n e n t e I) f o i e l u í d o d a c o l u n a c o m o t a m p ã o i n i c i a l : a p ó s i n i c i a r o g r a d i e n t e , o s o u t r o s c o m p o n e n t e s f o
-r a m p -r o g -r e s s i v a m e n t e e l u í d o s . A s f -r a ç õ e s d o s 3 p i c o s m a i s p r o e m i n e n t e s ( d e n o m i n a d o s , C o m p o n e n t e s I I , III e IV r e s p e c t i v a m e n t e ) f o -r a m a g -r u p a d o s e c o l e t a d o s c o m o m o s t -r a a F i g . 1 . E s t e s 4 c o m p o n e n t e s p r i n c i p a i s f o r a m s u b -m e t i d o s a g e / - e l e t r o f o r e s e e -m a c r i l a -m i d a e m o s t r a r a m - s e h o m o g ê n e o s .
O u t r o s c o m p o n e n t e s a i n d a m e n o r e s f o r a m o b s e r v a d a s n o c r o m a t o g r a m a , m a s p a r e c e m c o n s t i t u i r u m a p e q u e n a f r a ç ã o d a h e m o g l o b i n a t o t a l e f o r a m , p o r t a n t o , i g n o r a d o s .
Fig. 1 — Cromatografia em DEAE — Sephadex do hemolisado de Pterygopüchthys (espécime n.° 772). As frações indicadas foram agrupadas e denomina-das de I a IV em ordem de eluição (da esquerda para a direita). A gradiente (500 ml de tris-HCl 0,05 M pH 8,5 + 500 ml tris-acetado 0,05 M pH 6,0) foi iniciado após aproximadamente 40 frações coletadas.
PROPRIEDADES DA U N I Ã O DE O X I G Ê N I O
A c u r v a d e e q u i l í b r i o d e O2 d o C o m p o n e n t e I, s o b c o n d i ç õ e s d e f r a c i o n a m e n t o é c l a r a m e n -t e c o o p e r a -t i v a , c o m u m v a l o r d o p a r â m e -t r o d e
H i l l — n, a b r a n g e n d o d e 1.9 a p H 6,7 a 1,3 a p H 8 , 5 . C o m o m o s t r a a F i g . 2 , o c o m p o n e n t e I f r a c i o n a d o m o s t r a u m p e q u e n o e f e i t o B o h r r e -v e r s o c e n t r a l i z a d o e m c e r c a d e p H 7,2 a 2 5 ° C . D e v e - s e n o t a r q u e e s t e s e x p e r i m e n t o s f o r a m e f e t u a d o s n a p r e s e n ç a d e 1 m M d e EDTA para d i m i n u i r a v e l o c i d a d e d e a u t o - o x i g e n a ç ã o a b a i x o s v a l o r e s d e p H . O e f e i t o d o A T P ( 1 m M ) é i n s i g n i f i c a n t e a p H > 7 , 5 ; a p H m a i s b a i x a , a a d i ç ã o d e A T P é a s s o c i a d a c o m u m d e c r é s c i
-m o n a a f i n i d a d e d e O3, b e m c o m o u m l e v e d e -c r é s -c i m o e m n ( p o r e x : a p H 6,7 n v a i d e 1,87 a 1,4 p o r a d i ç ã o d e 1 m M d e A T P ) . A F i g . 3 m o s t r a a d e p e n d ê n c i a d a c o n c e n t r a ç ã o t o t a l d e A T P d e l o g P i /2 m e d i d a p a r a o C o m p o n e n t e
A s p r o p r i e d a d e s d a u n i ã o d e 02 d o c o m p o -n e -n t e IV f r a c i o -n a d o (-na p r e s e -n ç a d e 1 m M E D T A ) f o i i n v e s t i g a d a e m u m i n t e r v a l o d e p H d e 6.2 a 8 , 4 . A F i g . 2 m o s t r a o e f e i t o B o h r p a r a e s t e c o m p o n e n t e s o b c o n d i ç õ e s d e f r a -c i o n a m e n t o , b e m , -c o m o na p r e s e n ç a d e A T P
(1 m M ) . O s d a d o s m o s t r a m q u e , e m c o n t r a s t e a o c o m p o r t a m e n t o I, a d e p e n d ê n c i a d e p H d a a f i n i d a d e d e O j é , n a v e r d a d e , m u i t o m a r c a n t e ,
0 ( A l o g P i / j / A p H ) s e n d o a p r o x i m a d a m e n t e
1 a b a i x o d e 7 . O v a l o r d e n é s e m p r e a b a i x o d e 2 , a b r a n g e n d o d e 1,1 a 1,7 e m o s t r a o b s c u -ra d e p e n d ê n c i a d e p H o u A T P .
o s
o •
6 7 8 9 pH
Fig 2 — Efeito Bohr de oxigênio dos componentes de Pterygoplichthys. O componente I é indicado por círculos: O, fracionado; 9, + 1 mM ATP, $ in-dica experimentos efetuados a 20°C e deslocados de 0,05 nas escalas de log p 1/2. O componente IV é indicado por quadrados • , fracionado; • + 1 mM ATP. O componente III é indicado por triângu-los A- Condições: bis-tris 0,05 M ou tampão tris + 1 mM EDTA e 25°C. Concentração de H h ~ 1 mg/ml.
O c o m p o n e n t e III f r a c i o n a d o p a r e c e t e r e s s e n c i a l m e n t e a m e s m a a f i n i d a d e c o m 02 q u e o c o m p o n e n t e I V . É m u i t o s i g n i f i c a t i v o q u e a a f i n i d a d e p e l o Oa d o c o m p o n e n t e I V , e m b o r a d e p e n d e n t e d e p H , é i n d e p e n d e n t e d e A T P , m e s m o na r e g i ã o d e b a i x o p H o n d e A T P t e m u m e f e i t o n o c o m p o r t a m e n t o d o c o m p o n e n t e I.
N o s s o s r e s u l t a d o s a m p l i a m o t r a b a l h o d e W e b e r et al. ( 1 9 7 8 ) , q u e i s o l a r a m d u a s f r a -ç õ e s h e m o g l o b í n i c a s , a e b, d o h e m o l i s a d o d e Pterygoplichthys p o r f o c a l i z a ç ã o d o p o n t o i s o e -l é t r i c o . P a r e c e q u e a f r a ç ã o b ( F i g . 4 B d e W e b e r e f al., 1 9 7 8 ) c o n t é m a m b o s o s c o m p o n e n t e s IV e o u t r o s c o m p o n e n t e s c o m p r o p r i e -d a -d e s m a i s s e m e l h a n t e s às -d o c o m p o n e n t e I.
1.0 r 1
A T P ( m M ) Fig. 3 — Dependência de log p ( 02) na concen-tração total de ATP para o componente I. Condi-ções: pH 6,7 em bis-tris 0,05 M e 20°C.
PROPRIEDADES C I N É T I C A S
e x p e r i m e n t o s m o s t r a r a m q u e , a a m b o s v a l o r e s de p H , o s c o m p o n e n t e I I , 111 e IV são s e m e l h a n -t e s , e n q u a n -t o o c o m p o n e n -t e I é d i f e r e n -t e d o s o u t r o s t r ê s .
A F i g . 4 r e p r e s e n t a a d e p e n d ê n c i a d e p H
da t o t a l c o n s t a n t e m é d i a d e c o m b i n a ç ã o d e 29
o r d e m para C O ( O , a m b o s n a a u s ê n c i a e p r e s e n ç a d e A T P (1,25 m M ) , para o s c o m p o n e n -t e s I e I V . A c o n c o r d â n c i a d e s -t e s r e s u l -t a d o s c o m o d e s c o b e r t o s o b r e o e q u i l í b r i o d e Oa é i m e d i a t a m e n t e e v i d e n t e .
5 6 7 8
pH
Fig. 4 — Dependência de pH da constante média total para a ligação CO ( I ' ) à deoxiemoglobína (s). O
componente I , sem ( O ) e com (•) 1,25 mM de ATP. O componente I V sem ( A ) e com ( A ) 1,25 mM de ATP. Concentração de Hb aproximadamente 2,5 fM (heme). Tampão bis-tris 0,05 M ou tris e 20°C.
B o h r n o r m a l , t r o c a n d o a p r o x i m a d a m e n t e 3,5 v e z e s b a i x a n d o d e p H 5,5 para 7,7 ( F i g . 4 ) . A i n d a m a i s i m p o r t a n t e é a d e s c o b e r t a d e q u e a a d i ç ã o d e A T P ( 1 , 2 5 m M ) t e m u m e f e i t o m u i t o p e q u e n o s o b r e I' a t o d o s o s p H e x a m i n a -d o s . A p r e s e n ç a -d e u m m e n s u r á v e l e f e i t o c i n é t i c o Bohr, a ( q u a s e c o m p l e t a ) a u s ê n c i a d e
e f e i t o d e A T P e a s i m i l a r i d a d e n o c o m p o r t a -m e n t o c i n é t i c o d o s c o -m p o n e n t e s I I , III e I V , e s t ã o t o d o s e m c o n s o n â n c i a c o m o e q u i l í b r i o v e r i f i c a d o e r e f e r i d o a c i m a .
2 •
o ' '
• O 0 . 5 1.0
A T P ( m M )
Fig. 5 — Dependência de I* sobre a concentração total de ATP a pH 5,55 ( O ) e a pH 6,21 (•) para o componente I . Condições como na Fig. 4.
O c o m p o n e n t e c i n é t i c o d o c o m p o n e n t e I f r a c i o n a d o é i n d e p e n d e n t e d e p H e m o s t r a u m e f e i t o d e A T P a p e n a s na r e g i ã o d e p H á c i
-d o . A s s i m , a p H 5,5 a 6,0 a c o n s t a n t e m é -d i a d e c o m b i n a ç ã o d e C O d e c r e s c e c o m a d i ç ã o de A T P , c o m o m o s t r a a F i g . 5, a q u a l r e p r e -s e n t a a d e p e n d ê n c i a d e c o n c e n t r a ç ã o d e A T P d e I' para c o m p o n e n t e I a d o i s v a l o r e s d e p H . D e v e s e n o t a r q u e o c u r s o d e t e m p o d e c o m
-b i n a ç ã o d e C O é u m t a n t o h o m o g ê n e a ( 2?
or-d e m ) o u a l g o a u t o c a t a l í t i c o , or-d e p e n or-d e n or-d o or-d o pH e ( o u ) d a p r e s e n ç a d e A T P .
No c a s o d o c o m p o n e n t e IV, o c u r s o d e t e m p o d e c o m b i n a ç ã o d e C O é e s s e n c i a l m e n t e h o m o g ê n e a a v a l o r e s d e p H a b a i x o d e 7, e n -q u a n t o p a r e c e s e r a l g o h e t e r o g ê n e o a p H > 7. A d e p e n d ê n c i a d e p H d e I', s e g u e u m e f e i t o
T i m e ( m s e c ) T i m e ( m s e c ' )
Fig. 6 — Efeito da extensão de íotólise no curso de tempo de combinação de CO a desoxiemoglobina do componente I. Os resultados citados referem-se a experimentos efetuados a pH 5,45 sem e com ATP (es-querda e direita respectivamente). Os resultados da íotólise total são mostrados como círculos (abertos ou fechados) e os de íotólise parcial (% de fotodissociação = 10°/o) como triângulos (aberto ou fechado).
Tam-pão bis-tris 0,05 M .
N o t a - s e q u e a a m b o s o s v a l o r e s d e p H , a a d i ç ã o d e A T P (1 m M } não t e m e f e i t o na r e c o m b i n a ç ã o d e C O c o m o o o b s e r v a d o na f o t ó lise p a r c i a l , e n q u a n t o t e m a l g u m e f e i t o na f o t ó -l i s e c o m p -l e t a ( v i d e f i g . 6 ) . Esta v e r i f i c a ç ã o e s t á e m c o n c o r d â n c i a c o m o s r e s u l t a d o s c i t a -dos a c i m a ( v i d e f i g . 4 ) .
b . D i s s o c i a ç ã o d e o x i g ê n i o
A d i s s o c i a ç ã o d e 02 p e l o m é t o d o d o d i t i o -n i t o f o i i -n v e s t i g a d o para t o d o s o s c o m p o -n e -n t e s e m p a r a l e l o , a p H ~ 5,6 e 7,7 na a u s ê n c i a d e ATP s o b c o n d i ç õ e s " f r a c i o n a m e n t o " . E m t o d o s o s c a s o s , o c u r s o d e t e m p o d e d i s s o c i a ç ã o d e 02 f o i d e 1
9 o r d e m p o r u m a b o a a p r o x i m a ç ã o . N o v a m e n t e f o i v e r i f i c a d o q u e o s c o m p o n e n t e s II, III e IV t e m c o n s t a n t e s m é d i a s m u i t o s i m i l a -r e s , e n q u a n t o o c o m p o n e n t e I é d i f e -r e n t e d o s o u t r o s t r ê s .
à f i g . 7 m o s t r a a d e p e n d ê n c i a d e p H da c o n s t a n t e m é d i a d e d i s s o c i a ç ã o d e 02 ( K ) p a r a o s c o m p o n e n t e s I e I I I , na a u s ê n c i a e na
pres e n ç a de A T P (1,25 m M ) . N o v a m e n t e o c o m p o r -t a m e n -t o é c o n s i s -t e n -t e -t a n -t o c o m o e q u i l í b r i o v e r i f i c a d o c o m o c o m a c i n é t i c a da c o m b i n a ç ã o d e C O . A s s i m , o c o m p o n e n t e I f r a c i o n a d o é c a r a c t e r i z a d o p o r u m e f e i t o Bohr r e v e r s o m u i t o p e q u e n o , e a a d i ç ã o d e A T P a u m e n t a s i g n i f i c a -t i v a m e n -t e a c o n s -t a n -t e " o f f " a p H a b a i x o d e 6,5
( u m e f e i t o n í t i d o é n o t a d o n o s e x p e r i m e n t o s p a r a l e l o s a p H 5,6 — 5 , 7 ) . O c o m p o r t a m e n t o III m o s t r a u m e f e i t o B o h r p o s i t i v o m u i t o f o r t e ( a b a i x o d e p H 7 ) , o v a l o r d e K a u m e n t a n d o d e
u m f a t o r d e ~ 1 0 , i n d o d e p H 7 a p H 5 , 3 . Em a d i ç ã o , n ã o f o i o b s e r v a d o e f e i t o de A T P na c i n é t i c a da d i s s o c i a ç ã o d e 02 d o c o m p o n e n -t e I I I .
C O N C L U S Õ E S
q u e c o n t i n h a m u m (Pseudodoras e Brachypla-tystoma) o u d o i s (Hoplosterum) c o m p o n e n t e s h e m o g l o b í n i c o s . Pterygoplichthys pardalis f o i o ú n i c o c a s o c o m 4 c o m p o n e n t e s p r i n c i p a i s , c u i d a d o s a m e n t e e s t u d a d o , e c o m o t a l e l e p o d e d e s e m p e n h a r u m p a p e l i m p o r t a n t e n o s p a d r õ e s de e n t e n d i m e n t o d e c o m p o r t a m e n t o f u n c i o n a l d e h e m o g l o b i n a s d e b a g r e s d a A m a z ô n i a ,
í
O 1 1 1 1. 5 6 7 8
pH
Pig. 7 — Efeito de pH na constante média da disso-ciação de 02 (K) para componente I na ausência (O) e na presença (») de 1,25 mM ATP e compo-nente III na ausência (A) e na presença ( A ) de 1,25 mM de ATP. Tampões de bis-tris 0,05 M ou tris e 20°C. Concentrações de H b ~ 25 ^iM (heme).
A s p r i n c i p a i s d e s c o b e r t a s e c o n c l u s õ e s d e s t e t r a b a l h o p o d e m s e r r e s u m i d a s c o m o se s e g u e : ( i ) os q u a t r o m a i o r e s c o m p o n e n t e s he-m o g l o b í n i c o s p o d e he-m s e r d i v i d i d o s , funcional-mente, e m d o i s g r u p o s : u m r e p r e s e n t a d o p e l o c o m p o n e n t e I e o o u t r o c o m p r e e n d e n d o o s c o m p o n e n t e s I I , III e I V . A s s i m , d e n t r o d a p r e -c i s ã o d e n o s s a s m e d i d a s , o s t r ê s -c o m p o n e n t e s s ã o , na v e r d a d e , m u i t o , s e n ã o i d ê n t i c o s , n o e q u i l í b r i o e c i n é t i c a d a r e a ç ã o c o m 02 e C O
( i i ) . Em g e r a l , o s e x p e r i m e n t o s d e e q u i l í b r i o e s t ã o e m e x c e l e n t e ( s e m i q u a n t i t a t i v o ) h a r m o nia c o m os* r e s u l t a d o s c i n é t i c o s . Esta c o n c l u -são c o n f i r m a a m b o s o s e f e t o r e s a l o s t é r i c o s , e x . p r ó t o n s e A T P . ( i i i ) O c o m p o n e n t e I, q u e
r e p r e s e n t a a p r o x i m a d a m e n t e m e t a d e d a h e m o -g l o b i n a t o t a l p r e s e n t e n o h e m o l i s a d o , é carac-t e r i z a d o q u a n d o f r a c i o n a d o p o r u m e f e i carac-t o B o h r r e v e r s o d e O 2 , m u i t o p e q u e n o ; s u a a f i n i d a d e t o t a l c o m O 2 é A T P d e p e n d e n t e a p e n a s n o s I n -t e r v a l o s d e m a i s b a i x o p H . C i n é -t i c a m e n -t e , o e f e i t o d e A T P r e s u l t a n u m d e c r é s c i m o n a c o n s t a n t e m é d i a d e c o m b i n a ç ã o d e C O e u m a u -m e n t o n a c o n s t a n t e -m é d i a d a d i s s o c i a ç ã o d e 02. ( i v ) O s c o m p o n e n t e s I I , III e I V , o s q u a i s j u n t o s c o m p r e e n d e m a p r o x i m a d a m e n t e m e t a d e d a h e m o g l o b i n a t o t a l , s ã o f u n c i o n a l m e n t e s i -m i l a r e s u -m a o o u t r o e -m u i t o d i f e r e n t e s d o c o m p o n e n t e I. A s s i m , s e u e f e i t o B o h r d e 02 é g r a n d e , a a f i n i d a d e l i g a n t e d e c r e s c e n d o p o r u m f a t o r p r ó x i m o a ~ 2 0 , i n d o d e p H 8,5 a p H 6 , 2 . I s t o c o r r e l a c i o n a - s e c o m a c i n é t i c a e m (a) o g r a n d e a c r é s c i m o n a c o n s t a n t e m é d i a da d i s s o c i a ç ã o d e 02 e ( b ) o s i g n i f i c a t i v o d e -c r é s -c i m o n a -c o n s t a n t e d e -c o m b i n a ç ã o d e C O , c o m o d e c r é s c i m o d o p H . Em a d i ç ã o , o e f e i t o de A T P é d e s p r e z í v e l s o b r e o i n t e r v a l o d e p H e x a m i n a d o , ( v ) E s t e s r e s u l t a d o s s o m a d o s j u n t o s n o s l e v a m a c o n c l u i r q u e o s v á r i o s c o m p o
-n e -n t e s d e h e m o g l o b i -n a d e Pterygoplichthys c a e m e m d u a s c a t e g o r i a s c a r a c t e r i z a d a p o r p r o p r i e d a d e s f u n c i o n a i s q u e s ã o complemen-tares c o m r e s p e i t o à i n f l u ê n c i a d e t í p i c o s e f e -t o r e s a l o s -t é r i c o s . I s -t o s u g e r e q u e : ( a ) a
p r e s e n ç a d e m ú l t i p l o s c o m p o n e n t e s c o m p r o -p r i e d a d e s f u n c i o n a i s a l t a m e n t e d i f e r e n t e s é u m p a d r ã o c o m u m , e m b o r a n ã o u n i v e r s a l , e m s a n g u e d e p e i x e e ( b ) e m b o r a n ã o s e p o s s a o f e r e c e r u m a e x p l i c a ç ã o t o t a l no p r e s e n t e , n ó s c o n s i d e r a m o s i g u a l m e n t e u m a r e l a ç ã o , a i n d a a s e r d e f i n i d a , e n t r e p r o p r i e d a d e s f u n c i o n a i s e p a p e l f i s i o l ó g i c o d e s t a s h e m o g l o b i n a s . Tal r e l a ç ã o f o i p r o p o s t a e s u b s t a n c i a d a para a s h e m o g l o b i n a s d e t r u t a (Salmo irideus) ( B r u -n o r i , 1975) . A e x i s t ê -n c i a d e subgrupos de he-moglobinas com funções complementares pa-r e c e , p o pa-r t a n t o , pa-r a z o a v e l m e n t e g e pa-r a l , p o i s t e m s e v e r i f i c a d o t a m b é m e m o u t r a s e s p é c i e s e s -t u d a d a s a b o r d o d o " A l p h a H e l i x " , p o r e x . p a r a o s i s t e m a d e 2 c o m p o n e n t e s d e Mylosomma
( M a r t i n e f al., 1 9 7 8 ) .
A G R A D E C I M E N T O S
E s t e t r a b a l h o f o i f i n a n c i a d o p o r N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n G r a n t P C M 7 5 0 6 4 5 1 . S o m o s g r a t o s ao G o v e r n o B r a s i l e i r o p e l a p e r m i s -s ã o d e o " A l p h a H e l i x " p e r c o r r e r á g u a -s d o A m a z o n a s . M . B r u n o r i e x p r e s s a s e u s a g r a d e -c i m e n t o s a N a t i o n a l R e s e a r -c h C o u n -c i l ( C N R ) da I t á l i a p e l a c o b e r t u r a f i n a n c e i r a para a via-g e m . M . T . W i l s o n a via-g r a d e c e o s f u n d o s para a v i a g e m r e c e b i d o s d a R o y a i S o c i e t y , U . K. e D u k e U n i v e r s i t y , U S A . A . F o c e s i J r . f o i par-c i a l m e n t e a s s i s t i d o p e l o C o n s e l h o N a par-c i o n a l d e C i ê n c i a e T e c n o l o g i a .
S U M M A R Y
The four main hemoglobin components of the hemolysate of Pterygoplichthys pardalis have been isolated and characterized. The functional properties investigated for the isolated components comprise the effect of pH and A T P on (i) the 02 equilibrium, (ii) the 02 dissociation kinetics, (iii) the CO combination kinetics. Component I, corres-ponding to approximately 50% of the total hemo-globin, is characterized by functional properties •which are distinctly different from those of Components II, III and IV, which are alike. Thus it is shown, once more, that multiple components in an hemolysate fall into categories of hemo-globins characterized by distinct and comple-mentary functional properties.
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