Avaliação da correlação dose / concentração plasmática da doxiciclina com evolução clínica, alterações hematológicas e plaquetárias em cães portadores de Erliquiose Canina / Evaluation of the dose / plasma correlation of doxycycline with clinical evolutio

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 53774-53782 jul. 2020. ISSN 2525-8761

Avaliação da correlação dose / concentração plasmática da doxiciclina com

evolução clínica, alterações hematológicas e plaquetárias em cães portadores de

Erliquiose Canina

Evaluation of the dose / plasma correlation of doxycycline with clinical evolution,

hematological and platelet changes in dogs with Canine Ehrlichiosis

DOI:10.34117/bjdv6n7-863

Recebimento dos originais: 03/06/2020 Aceitação para publicação: 31/07/2020

Marcello Fernandes Carrijo

Graduando de Medicina pelo Centro Universitário Barão de Mauá Endereço: Rua Ramos de Azevedo, 423 – Jardim Paulista –S.P., Brasil

E-mail: marcellocarrijo@gmail.com

Márcia Regina Medeiros Malfará

Mestre pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo Farmacêutica Chefe, Coordenadora do Serviço de Farmácia Clínica da Divisão de Assistência Farmacêutica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade

de São Paulo.

Av. Bandeirantes, 3900 - Vila Monte Alegre, Ribeirão Preto - SP, E-mail: marciafarma@hcrp.usp.br

Luiz Alberto Beraldo de Moraes

Mestre e Doutor em Química pela Universidade Estadual de Campinas

Professor associado do Departamento de Química da FFCLRP da Universidade de São Paulo Av. Bandeirantes, 3900 - Vila Monte Alegre, Ribeirão Preto - SP,

E-mail: luizmoraes@ffclrp.usp.br

Wilson Roberto Malfará

Mestre em Fármacos e Medicamentos e Doutor em Toxicologia pela FCFRP-USP Docente do curso de Medicina do Centro Universitário Barão de Mauá Endereço: Rua Ramos de Azevedo, 423 – Jardim Paulista –S.P., Brasil

E-mail: wilson.malfara@baraodemaua.br

RESUMO

A erliquiose é uma doença causada por bactérias do gênero Ehrlichia. A transmissão ocorre pelo vetor Rhipicephalus sanguineous. A doença manifesta-se na fase aguda, subaguda ou crônica e as manifestações clínicas e alterações hematológicas variam de acordo com a fase em que os animais se encontram. O presente estudo teve como objetivo a avaliação em parâmetros hematológicos e plaquetários e correlaciona-los com doses de 5, 7,5 e 10,0mg/kg de doxiciclina administrados em cães portadores de erliquiose. Ainda avaliou-se a concentração plasmática dos animais por UPLC-MS/MS. Com os resultados, observou-se que o método analítico demonstrou-se aplicável para a quantificação em questão. Dentre os parâmetros avaliados, somente as plaquetas demonstraram a elevação quando se comparou o valor do primeiro dia, com o do 28º dia. As concentrações plasmáticas demonstraram-se dentro de valores similares, porém, na dodemonstraram-se de 10mg/kg uma diferença entre as concentrações dos animais foi constatada. Embora nas mesmas não tenha se observado uma proporcionalidade entre dose e concentração plasmática, sugere-se que a dose de 7,5mg/kg talvez seja a mais aplicável pelo

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fato da mesma não ter propiciado variações tão frequentes entre as concentrações detectadas nos animais. Ressalta-se ainda, a importância de estudos clínicos que visem correlacionar a dose administrada com concentração plasmática, o que induz a compreensão de que há um número significativo de variáveis que precisam ser consideradas, e que de forma frequente e acentuada interferem na terapêutica medicamentosa.

Palavras Chaves: Estudo de Correlação, Cães, Erliquiose, Doxiciclina, Efeitos Adversos. ABSTRACT

Ehrlichiosis is a disease caused by bacteria of the genus Ehrlichia. Transmission occurs through the vector Rhipicephalus sanguineous. The disease manifests itself in the acute, subacute or chronic phase and the clinical manifestations and hematological changes vary according to the phase in which the animals are. The present study aimed to evaluate hematological and platelet parameters and correlate them with doses of 5, 7.5 and 10.0 mg / kg of doxycycline administered to dogs with ehrlichiosis. The animals plasma concentration was also evaluated by UPLC-MS / MS. With the results, it was observed that the analytical method proved to be applicable for the quantification in question. Among the parameters evaluated, only the platelets showed an increase when the value of the first day was compared with that of the 28th day. Plasma concentrations were found to be within similar values, however, at the dose of 10mg / kg a difference between the concentrations of the animals was found. Although there was no proportionality between dose and plasma concentration, it is suggested that the dose of 7.5mg / kg is perhaps the most applicable because it did not provide such frequent variations between the concentrations detected in the animals. It is also emphasized the importance of clinical studies that aim to correlate the dose administered with plasma concentration, which leads to the understanding that there are a significant number of variables that need to be considered, and that frequently and accentuatedly interfere with drug therapy.

Keywords: Correlation Study, Dogs, Ehrlichiosis, Doxycycline, Adverse Effects.

1 INTRODUÇÃO

A erliquiose canina é uma doença riquetsial também conhecida como Tifo Canino, Pancitopenia Canina Tropical, Febre hemorrágica Canina e Doença do Cão Rastreador (STORTI, 2006). O agente etiológico foi reconhecido pela primeira vez na Argélia em 1935, por Donatien e Lestoquard. (DUBIE, et. al., 2014).

Há uma grande prevalência da doença no Brasil (BORIN, et. al., 2009), evidenciando-se maior frequência na região Nordeste (43%) e menor frequência na região Sul, coincidindo com a prevalência do seu vetor (SILVA, 2015). É considerada importante zoonose, devido à exposição de humanos aos vetores e a locais onde a doença é enzoótica (SILVA, et al., 2011). O agente causal é uma riquétsia pertencente ao gênero Ehrlichia, Família Rickttsiaceae, Ordem Rickettsiales (SILVA, 2015), que são bactérias gram negativas, consideradas parasitas intracelulares obrigatórias de células mononucleares (SILVA, et al., 2011). A Ehrlichia canis é a espécie que desempenha maior frequência de parasitismo dos cães, mas estes também podem ser infectados por E. equi, E. platy, E. ewing, E. chaffensis (BORIN, et. al., 2009).

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O carrapato Rhipicephalus sanguineous é o principal vetor da erliquiose (Dubie, et. al., 2014), entretanto, Amblyomma americanum e Octobius magnini também são capazes de transmitir a doença (BORIN, et. al., 2009). A multiplicação da bactéria no vetor ocorre nos hemócitos e nas células da glândula salivar, propiciando a transmissão transestadial (SILVA, 2015). Deste modo, o carrapato ao ingerir sangue do animal para sua alimentação inocula os microorganismos presentes na saliva (SILVA, et. al., 2011). Além desta, outra maneira de infecção de cães suscetíveis é por meio da transfusão sanguínea (BORIN, et. al., 2009). A infecção ocorre principalmente dos agranulócitos, como monócitos e linfócitos, onde os principais agentes envolvidos são E. canis e E. chaffensis, que causam a Erliquiose Monocítica Canina. No caso de envolvimento dos granulócitos, como neutrófilos, comumente há envolvimento E. equi e E. ewingii, caracterizando a Erliquiose Granulocítica Canina. Quando o microorganismo riquetsiano se replica nas plaquetas ocorre a

Trombocitopenia Cíclica Canina, causada principalmente pela E. platys (STORTI, 2006). Após a infecção por E. canis, a Erliquiose Monocitica pode se apresentar clinicamente em três

fases aguda, subclínica e crônica. (VIEIRA, et. al., 2011). A severidade dos sinais clínicos é afetada por diversos fatores, entre eles estão, a virulência da cepa, idade do animal, predisposição racial, doença coexistente e alimentação (SILVA, 2015). Cães imunocompetentes são capazes de eliminar o parasita e não desenvolve a forma crônica da doença, caso contrário, os animais são cronicamente infectados (SILVA, et al., 2011).

Após a infecção do cão sadio, ocorre um período de incubação de 8 a 20 dias, o animal infectado entra na fase aguda da doença, que perdura por duas a quatro semanas (HARRUS, et. al., 1999). Durante essa fase aguda os sinais clínicos são transitórios e podem ser resolvidos sem tratamento, em uma ou duas semanas (ETTINGER e FELDMAN, 2004).Na fase aguda os sinais clínicos são febre, perda de peso, anorexia, corrimento oculonasal, dispneia, linfadenopatia, hepatoesplenomegalia, vômitos, lesões oculares, edema dos membros ou do escroto (ETTINGER e FELDMAN, 2004; VIEIRA, et. al., 2011;). Além destes, também podem ser observados uma variedade de sinais neurológicos provocados por inflamação ou sangramento no interior das meninges (ETTINGER e FELDMAN, 2004). No hemograma pode-se identificar anemia normocítica normocrômica, leucopenia com desvio a esquerda e trombocitopenia (BORIN, et. al., 2009). A fase subclínica da infecção é iniciada seis a nove semanas depois da inoculação, e é caracterizada pela trombocitopenia, leucopenia e anemia regenerativa (VIEIRA, et. al., 2011), o animal não manifesta sinais clínicos e geralmente os carrapatos estão ausentes (SUZUKI,2013). Durante a fase crônica, os sinais clínicos podem ser discretos e ausentes ou graves, dependendo do cão (ETTINGER e FELDMAN, 2004). O diagnóstico da enfermidade pode ser sorológico, parasitológico direto, cultura ou através de técnicas de biologia molecular (DAGNONE et. al., 2003).

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Os métodos cromatográficos assumem no contexto analítico uma importância fundamental, especialmente quando se trata da quantificação de fármacos em matrizes biológicas, para que as mesmas possam ser comparadas a evolução clínica do animal, visto que, com a detecção da real concentração plasmática, pode-se estabelecer com certeza uma padronização de dose.

A cromatografia líquida é muito usada para técnicas analíticas de separação, devido as sua detectabilidade e sua adaptabilidade as determinações quantitativas com exatidão (HOLLER et al., 2009). O espectrômetro de massas é um instrumento que produz íons e os separa de acordo com sua razão massa/carga (m/z). Existem diversos tipos de espectrômetros de massas como, por exemplo, triplo quadrupolos, que são utilizados para quantificação de compostos 39 conhecidos, sendo monitoradas as transições de massas específicas (KOSJEK et al. 2007). No sistema MS/MS o íon é separado no primeiro quadrupolo Q1, no segundo quadrupolo Q2 ocorre a colisão entre as moléculas e o íon é fragmentado através de um gás inerte, geralmente nitrogênio. No terceiro quadrupolo Q3 fragmentos são separados de acordo com sua m/z e encaminhados para detecção (SKOOG et al, 2002)

2 OBJETIVOS

Avaliar as alterações hematológicas e plaquetárias em animais com diagnóstico de erliquiose canina e correlacioná-las com a dose versus concentração plasmática da doxiciclina, principal fármaco utilizado para tratamento da patologia.

2.1 MÉTODOS/PROCEDIMENTOS

Foram avaliados 19 cães, de ambos os sexos, de raças e idades variadas, atendidas no período de outubro de 2016 a novembro de 2016 e de maio a outubro de 2017 no Hospital Veterinário (HV) do Centro Universitário Barão de Mauá. Os cães receberam doxiciclina, cedida pelo laboratório Agener (Doxitrat ®) nas doses de 5, 7,5 e 10,0 mg/kg a cada 12 horas por 28 dias oral. Durante o procedimento, foram obtidas amostra de sangue venoso em tubos com EDTA, sendo encaminhadas para a realização de exames hematológicos e sorológicos. Os exames hematológicos e plaquetários foram executados seguindo as técnicas de rotina no laboratório de análises clínicas do próprio HV, no primeiro dia da consulta (diagnóstico) e no 28º dia no retorno. No 14º dia de tratamento os animais cederam sangue para quantificação plasmática do fármaco. Os proprietários receberam gratuitamente o tratamento para todos os animais durante todo o período necessário.

O experimento de quantificação das amostras e da solução padrão de Doxiciclina (figura 1) fornecida pela indústria Ouro Fino foi realizado por UPLC-MS / MS no modo de monitoração de reações múltiplas (MRM) no espectrômetro de massa quadripolar tandem Waters Xevo TQ-S equipado com uma fonte de pulverização Z operando no modo positivo. A fonte de ionização e os

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parâmetros operacionais foram otimizados da seguinte forma: tensão capilar = 3,20 kV: temperatura da fonte de pulverização Z = 150°C, temperatura de dessolvatação (N2) = 350 ° C, fluxo de gás de dessincipação = 600 L h-1.A solução padrão de referência foi preparada por diluições apropriadas da solução de reserva (1,0 mg / mL) com CH3OH resultando nas seguintes concentrações de Doxiciclina: 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 e 10,0 μg / mL. O composto Minociclina (figura 1) foi utilizado como padrão interno (PI) a uma concentração de 2,0 μg / mL.As amostras de plasma sanguíneo (100 μL) foram homogeneizadas e o PI foi adicionado. O homogenato foi submetido a desproteinização com 300 μL de acetonitrilo gelado e centrifugado a 9000 rpm durante 5 min. Foram injetados cinco microlitros de amostras de plasma e soluções padrão numa coluna Monochrom C18 (50 x 2,0 mm i.d., Tamanho de partícula de 5 μm) de Varian. A fase móvel utilizada para a eluição em gradiente consistiu em 0,1% de ácido fórmico (solvente A) e metanol contendo 0,1% de ácido fórmico (solvente B) a uma taxa de fluxo de 0,4 mL min-1. As injeções duplicadas foram feitas para a solução padrão de Doxiciclina e amostras de plasma sanguíneo. A curva de calibração (figura 2) obtida foi utilizada para quantificação de Doxiciclina e a concentração nas amostras de plasma sanguíneo foi expressa em μg / mL. Para este efeito, cada concentração testada foi corrigida utilizando um fator de diluição de três vezes. Os dados foram adquiridos e processados usando o software TargetLynx ™ Application Manager (Waters, Corporation). As análises cromatográficas foram realizadas no Departamento de Química (FFCL-USP) no Laboratório de Espectrometria de Massas e Produtos Naturais. Todas as análises estatísticas e gráficos foram realizados com auxílio dos “softwares” GraphPad Instat , Statgraphics e Prisma® empregando o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis através de medianas, limite superior e inferior A significância estatística foi avaliada usando valores de p<0,05 com um intervalo de confiança (IC) de 95%.

Figura 1- Estrutura química da Doxiciclina e da Minociclina (P.I.). Doxiciclina Minociclina

3 RESULTADOS

A figura abaixo ilustra a curva analítica demonstrando a linearidade da doxiciclina em plasma de cães, obtida na padronização analítica. Pela curva, observa-se que a linearidade está dentro dos parâmetros analíticos aceitáveis.

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Figura 2 – Linearidade da curva analítica da doxiciclina em plasma de cães

Não observou-se nesses parâmetros diferenças estatisticamente significativas entre as doses, que pudessem sugerir uma correlação dose/concentração plasmática, efetividade e superioridade no efeito farmacoterapêutico, exceto no parâmetro plaquetas (D), onde observou-se uma diferença significativa (p<0,05) apresentando elevação, quando se compara o primeiro dia com o 28º dia.

Figura 3 – Análise dos parâmetros hematológicos e plaquetários observados nos cães tratados com as doses de 5,0; 7,5 e 10,0mg/kg, administrados a cada 12 horas, no primeiro dia da consulta e no 28º dia.

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Na concentração plasmática a mediana não demonstrou diferença estatisticamente significativa entre as doses, porém, uma variação marcante entre os limites na concentração de 10mg/kg foi observada.

Figura 4 – Análise do parâmetro concentração plasmática observados nos cães tratados com as doses de 5,0; 7,5 e 10,0mg/kg, administrados a cada 12 horas, no primeiro dia da consulta e no 28º dia.

Na concentração plasmática a mediana não demonstrou diferença estatisticamente significativa entre as doses, porém, uma variação marcante entre os limites na concentração de 10mg/kg foi observada.

4 CONCLUSÕES

O método utilizado e padronizado para análise de doxiciclina em plasma por UPLC-MS/MS demonstrou-se aplicável para a quantificação proposta. Dos parâmetros eritrócitos, hematócrito e leucócitos, embora observou-se uma variabilidade grande entre os animais, estes se demonstraram superiores, conferindo que em todos os regimes de dosagem com o continuar da terapêutica há uma melhora progressiva nos mesmos. Uma diferença ainda mais marcante (p<0,05) observou-se no parâmetro plaquetas, fato este reforçado pelo uso do glicocorticóide prescrito (prednisona).

Na comparação entre as concentrações plasmáticas não se observou diferença estatisticamente significativa, porém, uma variabilidade bem acentuada no grupo que recebeu 10mg/kg, porém, ainda este não apresentou mediana tão diferente das demais doses.

O achado não é suficiente para a alegação de que exista uma dose padronizada para todos os casos, porém, destaca-se a importância da dose de 7,5mg/kg, pois neste grupo não observa-se variação entre os animais que receberam a mesma. Ainda, os achados ilustram o quão importante é a realização de estudos que possam correlacionar dose administrada, concentração plasmática e efeito, pois a variabilidade biológica e parâmetros farmacocinéticos estão fortemente ligados a variação de concentração plasmática dos fármacos, incorrendo em muitas situações modificações na terapêutica.

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Deve-se ainda se complementar que os estudos clínicos envolvendo animais são de extrema complexidade, onde uma maioria de proprietários deste estudo em questão não retornou no 28º dia de tratamento, não se tendo uma condição de acompanhamento das administrações dos fármacos pelos tutores em seus animais, o que mostra a dificuldade de avaliação destes.

REFERÊNCIAS

BORIN, S.; CRIVELENTI, L. Z.; FERREIRA, F. A. Aspectos epidemiológicos, clínicos e hematológicos de 251 cães portadores de mórula de Ehrlichia spp. naturalmente infectados. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.61, n.3, p.566-571, 2009.

DAGNONE, A. S.; MORAIS, H. S. A.; VIDOTTO, O. Erliquiose nos animais e no homem. Ciências Agrárias, n. 2, p.191-201, 2001.

DAGNONE, A.S; MORAIS, H.S.A.; VIDOTTO, M.C.; JOJIMA, F. S.; VIDOTTO, O. Ehrlichiosis in anemic, thrombocytopenic, or tick-infested dogs from a hospital population in South Brazil. Veterinary Parasitology, Estados Unidos, v. 117, p.285-290, 2003.

DUBIE, T., MOHAMMED, Y., TEREFE, G., MUKTAR, Y. An insight review on canine ehrlichiosis with emphasis on its epidemiology and pathogenesity importance. Global Journal of Veterinary Medicine and Research, v.2 (4), p. 059-067, 2014.

ETTINGER, S.J.; FELDMAN, E.C. Riquetsioses. In: BREITSCHWERDT, E. B. TRATADO DE MEDICINA INTERNA VETERINÁRIA: DOENÇAS DO CÃO E DO GATO. 5ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. Cap. 86. p. 422-429.

HARRUS, S., WANER, T., BARK, H., JONGEJAN, F., CORNELISSEN, A. W. Recent Advances in Determining the Pathogenesis of Canine Monocytic Ehrlichiosis. American Society for Microbiology, v.37, n. 9, p. 2745–2749, 1999.

HOLLER, F.J.; SKOOG, A.D.; CROUCH, R.S.; Princípios de Análise Instrumental. 6ed. Porto Alegre, Bookman, 11, 296-316, 2009.

KOSJEK, T.; HEATH, E.; PETROVIC, M.; BARCELÓ, D.; Mass spectrometry for identifying pharmaceutical biotransformation products in the environmental. Trends in Analytical Chemistry, 26, 1076-1085, 2007.

MANOEL, C. S. Alterações clínicas, hematológicas e sorológicas em cães infectados por Ehrliquia Canis, 2010. 67f. Dissertação (Mestrado) – Curso de Medicina Veterinária, Universidade de São Paulo, São Paulo, 100.

SILVA, M. V. M., FERNANDES, R. A., NOGUEIRA, J. L., AMBRÓSIO, C. E.. Erliquiose Canina: Revisão de Literatura. Arquivo de Ciências Veterinárias e Zoologia da UNIPAR, v. 14, n. 2, p. 139-143, 2011.

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SILVA, I. P. M. ERLIQUIOSE CANINA – Revisão de Literatura. Revista Científica de Medicina Veterinária, 2015.

SKOOG, D. A.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, A.T.; Análise instrumental. 5 ed. Porto Alegre: Bookman, 2002.

STORTI, G. R. ERLIQUIOSE CANINA, 2006. 33 f. Monografia (Especialização) - Curso de Medicina Veterinária, Clinica Médica de Pequenos Animais, Universidade Castelo Branco Qualittas, Ribeirão Preto, 2006.

SUZUKI, F. T. Eficácia do medicamento Doxiciclina na resolução da enfermidade Erliquiose Monocítica Canina (EMC), 2013. 18 f. TCC (Graduação) - Curso de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Júlio de Mesquita Filho, Araçatuba, 2013.

VIEIRA, R. F. C., BIONDO, A. W., GUIMARÃES, A. M. S., SANTOS, A. P, SANTOS, R. P., DUTRA, L. H., DINIZ, P. P. V. P., MORAIS, H. A, MESSICK, J. B., LABRUNA, M., B., VIDOTTO, O. Ehrlichiosis in Brazil. Revista Brasileira Parasitologia Veterinária, v.20, n.1, p. 1-12, 2011.