LUAMA ARAÚJO DOS SANTOS
Estudo de associação de polimorfismos genéticos das citocinas IL-1 e
IL-6 e níveis séricos de Proteína C Reativa e Síndrome Metabólica
em uma amostra de indivíduos de Salvador, Bahia.
Salvador – BA
Dezembro de 2016
LUAMA ARAÚJO DOS SANTOS
Estudo de associação de polimorfismos genéticos das citocinas IL-1 e
IL-6 e níveis séricos de Proteína C Reativa e Síndrome Metabólica
em uma amostra de indivíduos de Salvador, Bahia.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação Strictu Sensu Processos Interativos dos Órgãos e Sistemas, da Universidade Federal da Bahia como requisito parcial para obtenção do título de mestre.
Orientadora: Prof.ª Dra. Denise Lemaire
Salvador – BA
Dezembro de 2016
Araújo dos Santos, Luama
Estudo de associação de polimorfismos genéticos das citocinas IL-1 e IL-6 e níveis séricos de Proteína C Reativa e Síndrome Metabólica em uma amostra de indivíduos de Salvador, Bahia. / Luama Araújo dos Santos. -- Salvador-BA, 2016.
85 f.
Orientador: Denise Carneiro Lemaire.
Dissertação (Mestrado - Programa de Pós-graduação em Processos Interativos dos Órgãos e Sistemas - PIOS) --Universidade Federal da Bahia, Instituto de Ciências e Saúde (ICS) ? Universidade Federal da Bahia (UFBA), 2016.
1. Síndrome Metabólica. 2. Polimorfismos de Nucleotídeos Únicos. 3. Gene IL1. 4. Gene IL6. 5. Proteína C-reativa. I. Carneiro Lemaire, Denise. II. Título.
À Dona Lúcia (vulgo, mãe) que mesmo sem entender muito bem o que eu fazia, sempre me deu apoio nesta jornada; e à Edilene, uma
AGRADECIMENTOS
Ao Dono de toda a ciência, sabedoria e poder. Deus, obrigada por sempre cuidar de mim.
À minha super complexa família, a entidade mais importante da minha vida. Especialmente à você, Mãe. Obrigada pela paciência de sempre, pelo cuidado e preocupação. Irmãos todos vocês são muitos especiais. Cada palavra de incentivo está bem guardada no coração. Desculpem as inúmeras ausências ou presenças incompletas. Amo-vos. NEOQEAV.
Aos amigos que fizeram muitas vezes questão de mudar a data dos encontros para que eu pudesse estar presente. Tenho plena consciência que Deus é sempre muito bom comigo, mas vocês são essa lembrança constante.
À minha orientadora Denise Lemaire, por todo o aprendizado no decorrer deste percurso.
Às instituições que foram parceiras diretas neste projeto: à UNEB, onde o cerne desta pesquisa ocorre e uma Universidade que eu tenho extremo carinho e amor; ao Hospital Geral Roberto Santos; à APAE, na figura de Dr Gildásio Carvalho; ao Laboratório de Endocrinologia/ICS, via Dr Helton Ramos, Fabiane Carrijo e Paula Barbosa; e ao Laboratório de Imunofarmacologia e Biologia Molecular/ICS, nas figuras de Dra. Camila Figueiredo, Norma, Héllen e Tamires.
Ao Programa em Processos Interativos dos Órgãos e Sistemas e à CAPES pelo financiamento.
À toda a equipe do GENUT, os que passaram e os que permanecem, pelo zelo com cada paciente, pela atenção com os colegas e pelo cuidado com os processos e a pesquisa. Vocês são 10. Em especial a Domingos, por todo ensinamento e pela disponibilidade na análise dos dados desse trabalho.
A essa turma incrível de mestrado. Muito obrigada a cada um de vocês por tornarem essa caminhada de intenso aprendizado, não apenas mais leve, mas também extremamente divertida. Vocês realmente são seres diferenciados que estarão pra sempre guardados em meu coração.
À Dila, uma das grandes responsáveis pelo início e pelo final dessa jornada. Maria, me faltam palavras pra agradecer, mas ainda acho que a melhor palavra é OBRIGADA! Te admiro demais como professora, como pesquisadora e acima de tudo, como pessoa. Acho que não faz ideia do quanto te admiro! Obrigada por ser meu bom exemplo.
“Quanto mais aumenta nosso conhecimento, mais evidente fica nossa ignorância”.
RESUMO
Introdução: A Síndrome Metabólica (SM) é um transtorno complexo de elevado
risco cardiovascular, que inclui obesidade visceral, dislipidemia, hiperglicemia e hipertensão. Todos esses fatores estão associados positivamente à secreção de citocinas proinflamatórias como interleucina 1 (IL-1) e interleucina 6 (IL-6). Uma vez na corrente sanguínea, estas citocinas estimulam a liberação hepática de Proteína C Reativa (PCR). Estudos têm mostrado associação entre os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) rs1800795 (IL6 -174G>C) e rs1143634 (IL1B +3954 C>T), com os níveis séricos de IL-6 e IL-1β bem como com a SM e seus cofatores. Material
e Métodos: Participaram deste estudo transversal, 285 indivíduos com SM e 210
indivíduos sem SM. A SM foi definida de acordo com o preconizado pela IDF, 2005. A genotipagem dos SNPs foi realizada com o uso da tecnologia de TaqMan probe-based 5´-nuclease assays. Resultados: A amostra foi composta majoritariamente por
indivíduos do sexo feminino (84%). Não foi encontrada associação dos genótipos dos SNPs rs1800795 (IL6 -174G>C) e rs1143634 (IL1B +3954 C>T) e a SM, no entanto o polimorfismo rs1800795 (IL6 -174G>C) mostrou associação com aos níveis de pressão arterial diastólica. Conclusão: Não houve associação entre os SNPs estudados e a SM.
ABSTRACT
Introduction: Metabolic Syndrome (MS) is a complex disorder of high cardiovascular risk, which includes visceral obesity, dyslipidemia, hyperglycemia and hypertension. All these factors are positively associated with the secretion of proinflammatory cytokines such as interleukin 1 (IL-1) and interleukin 6 (IL-6). Once in the bloodstream, these cytokines stimulate hepatic C-reactive protein (CRP) release. Studies have shown an association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) rs1800795 (IL6 -174G> C) and rs1143634 (IL1B +3954 C> T), with serum levels of IL-6 and IL-1β as well as with MS and their cofactors. Material and Methods: 285 individuals with MS and 210 individuals without MS participated in this cross-sectional study. The MS was defined as recommended by the IDF, 2005. Genotyping of the SNPs was performed using the TaqMan probe-based 5'-nuclease assays technology. Results: The sample consisted mainly of female subjects. We found no association between the SNPs rs1800795 (IL6 -174G> C) and rs1143634 (IL1B +3954 C> T) with MS, however the polymorphism rs1800795 (IL6 -174G> C) showed association with diastolic blood pressure. Conclusion: There was no association between the studied SNPs and MS.
LISTA DE ABREVIATURAS
AACE - American Association of Clinical Endocrinologists
AGL - Ácido Graxo Livre
AHA-NHLBI - American Heart Association/National Heart, Lung and Blood Institute
APAE - Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais
EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético AngII – Angiotensina II
CA - Circunferência Abdominal CC - Circunferência da Cintura CQ - Circunferência do Quadril DCV - Doenças Cardiovasculares DM2 - Diabetes Mellitus Tipo 2 DNA - Ácido Desoxirribonucleico
EGIR - European Group for the Study of Insulin Resistance
ELSA-BRASIL - Estudo Brasileiro Longitudinal da Saúde do Adulto
EROS - Espécies Reativas de Oxigênio
GENUT - Núcleo de Pesquisa e Extensão em Genômica Nutricional e Disfunções Metabólicas
GLUT-4 - Transportador De Glicose Tipo 4
HDL-c - Lipoproteína de Baixa Densidade-Colesterol HGRS - Hospital Geral Roberto Santos
HOMA-IR - Homeostasis Model Assessment Insulin Resistence
FMN/BA – Fórum de Mulheres Negras / Bahia
ICS - Instituto de Ciências da Saúde
I-DBSM – I Diretriz Brasileira de Síndrome Metabólica
IDF – Federação Internacional de Diabetes IL-1 - Interleucina 1
IL1B - gene IL1B
IL-6 - Interleucina 6
IL6 - gene IL6
IMC - Índice de Massa Corporal
NLRP3 - NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3
LGMH - Laboratório de Genética Molecular Humana
NHANES - National Health and Nutrition Examination Survey
NCEP - ATP-III - Programa Nacional de Educação para o Colesterol – Painel de Tratamento em Adultos III
NFκB - Fator Nuclear Kappa-B
OMS - Organização Mundial da Saúde
JAK-STAT - Janus kinase/signal transducers and activators of transcription PAI-1- Inibidor do Ativador do Plasminogênio tipo 1
PAS - Pressão Arterial Sistêmica
PCR - Proteína C Reativa
PI3K - fosfatidil inositol 3 quinase
SOCS 3 - Suppressor of cytokine signaling 3
IRS-1 – Substrato do receptor de insulin tipo 1 RI - Resistência à Insulina
SM - Síndrome Metabólica
SNP - Polimorfismo de Nucleotídeo Único
TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TNF - Fator de Necrose Tumoral
TLR – Toll like receptor
UFBA - Universidade Federal da Bahia UNEB - Universidade do Estado da Bahia
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 14 2. JUSTIFICATIVA ... 16 3. HIPÓTESE ... 19 4. OBJETIVOS ... 21 4.1. OBJETIVO GERAL ... 22 4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 22 5. REFERENCIAL TEÓRICO ... 23 5.1. Síndrome Metabólica ... 24
5.2. Epidemiologia da Síndrome Metabólica ... 27
5.3. Etiopatogenia da Síndrome Metabólica ... 30
5.4. Interleucina 6 ... 32 5.5. Interleucina 1 ... 35 5.6. Proteína C Reativa ... 37 6. MATERIAL E MÉTODOS ... 41 7. RESULTADOS ... 47 8. DISCUSSÃO ... 59 9. CONCLUSÃO ... 66 10. LIMITAÇÕES DO ESTUDO ... 68 REFERÊNCIAS ... 70
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1. INTRODUÇÃO
A Síndrome Metabólica (SM) é um transtorno complexo cuja etiologia é multifatorial envolve fatores metabólicos, ambientais e genéticos. Esta desordem possui elevado risco cardiovascular que inclui obesidade abdominal, dislipidemia e alteração da glicemia e da pressão arterial. De acordo com a Federação Internacional de Diabetes (ALBERTI; ZIMMET; SHAW, 2005), cerca de 25% da população adulta mundial tem SM, sendo a mesma atualmente considerada um emergente problema de saúde pública (I-DBSM, 2005).
Existem distintos parâmetros para diagnóstico desta síndrome, sendo os mais citados na literatura científica aqueles preconizados pela Organização Mundial da Saúde (OMS, 1999), pelo Programa Nacional de Educação sobre Colesterol – Painel de Tratamento em Adultos nos Estados Unidos da América (NCEP, 2002) e pela Federação Internacional de Diabetes (ALBERTI; ZIMMET; SHAW, 2005). Embora os parâmetros sejam diversos, todos concordam a respeito do papel da obesidade e da resistência à insulina (RI) no desenvolvimento desta síndrome, especialmente pelo potencial inflamatório de ambas (KAUR, 2014; VASQUES et al., 2010; AGUIRRE et al., 2002; ALBERTI; ZIMMET; SHAW, 2005; ISHII et al, 2014).
Em relação ao tecido adiposo, este é um tecido metabolicamente ativo que estimula a produção de adipocinas e outras citocinas como a interleucina 6 (IL-6) e a interleucina 1 (IL-1), as quais estão envolvidas na fisiopatogênese da resistência à insulina, da inflamação sistêmica e da aterogênese, com consequente aumento do risco cardiovascular (PERIYALIL, GIBSON & WOOD, 2013; TAHERGORABI & KHAZAEI, 2013; LEON-CABRERA et al, 2013). Estas citocinas, especialmente a IL-6, são também capazes de estimular a produção e secreção de proteínas de fase aguda, cujas dosagens permitem, monitorar os processos inflamatórios subclínicos. Dentre estas proteínas, o biomarcador mais estudado e utilizado na prática clínica é a proteína C reativa (PCR). No entanto, além de atuar no processo inflamatório, a PCR parece estar também envolvida na instalação e progressão de eventos aterogênicos, sendo uma das principais moléculas responsáveis pelo elevado risco cardiovascular da SM (WEISMANN & BINDER, 2012, KUMAR et al, 2013).
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2. JUSTIFICATIVA
A Síndrome Metabólica é um problema de saúde pública, que atinge cerca de um quarto da população mundial adulta e tem relevante impacto nas taxas de morbimortalidade. Pesquisas apontam que indivíduos que possuem SM têm duas vezes mais chances de desenvolver um infarto agudo do miocárdio ou acidente vascular cerebral que uma pessoa saudável, tendo sido sugerido que o elo entre a SM e as doenças cardiovasculares (DCV) seja a resposta inflamatória (NCEP, 2002; I-DBSM, 2005; SPEDM, 2006).
Essa inflamação é caracterizada pela redução de moléculas antiinflamatórias, como a leptina, e aumento das citocinas inflamatórias a exemplo da IL-1 e IL-6, que podem estimular a secreção de diversas proteínas de fase aguda. Dentre estas proteínas, o biomarcador mais estudado e utilizado na prática clínica é a PCR, cuja síntese é significativamente aumentada, especialmente em hepatócitos (ISHII et al, 2014).
Devido à influência da genética no desenvolvimento da SM, diversos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) têm sido estudados, inclusive polimorfismos nos genes que codificam a IL-6 (IL6) e IL-1β (IL1B). Estudos publicados previamente, mostram associação entre o polimorfismo rs1800795 de IL6 e aumento do risco cardiovascular; maiores concentrações séricas de PCR; maior risco de doenças associadas à obesidade e suas complicações, a exemplo da Síndrome Metabólica e seus cofatores (ZHANG et al, 2011; LEE et al, 2016; LI et al, 2016; ZHANG et al, 2014). Com relação ao gene IL1B, outros estudos sugerem que há associação significativa entre o polimorfismo rs1143634 e níveis séricos de PCR; elevação da circunferência da cintura; diabetes mellitus e suas complicações; hipertensão arterial e desenvolvimento de síndrome metabólica (CARTER et al, 2008; HONG et al, 2011; LATKOVSKIS & LICIS & KALNINS, 2004; LUOTOLA et al, 2011).
Todos estes resultados no entanto foram obtidos com populações ocidentais e europeias. Por outro lado, nenhum estudo de associação entre os genes IL6 e IL1B e SM e seus cofatores, desenvolvido em população com elevado grau de miscigenação como a de população de Salvador, Bahia, foi publicado até o momento. Assim, a identificação de marcadores genéticos de predisposição à SM e seus fatores associados é relevante para esta população, que possui características
significativamente diferentes de outras regiões do país e do mundo (KEHDY et al., 2015).
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3. HIPÓTESE
H0: Não há associação entre síndrome metabólica ou fatores associados à mesma e os SNPs rs1800795 (IL6 - 174 G>C) e rs1143634 (IL1B +3954 C>T)
H1: Há associação entre síndrome metabólica ou fatores associados à mesma e os SNPs rs1800795 (IL6 - 174 G>C) e rs1143634 (IL1B +3954 C>T)
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4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar a possível associação entre os SNPs rs1800795 do IL6 e rs1143634 do
IL1B e a síndrome metabólica (SM) e seus fatores associados em uma amostra da
população de Salvador, Bahia
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Descrever a frequência do SNP rs1800795 do IL6 em indivíduos de Salvador, Bahia, que possuem, ou não, SM.
Descrever a frequência do SNP rs1143634 do IL1B em indivíduos de Salvador, Bahia, que possuem, ou não, SM.
Comparar as frequências dos SNPs rs1800795 e rs1143634 entre o grupo de indivíduos portadores de SM e o grupo sem SM.
Verificar se existe associação entre estes SNPs e os cofatores da SM (circunferência da cintura, pressão arterial, glicemia de jejum, níveis séricos de HDL-c e triglicerídeos) nos grupos.
Avaliar a possível associação entre estes SNPs e os níveis séricos de PCR, nos indivíduos com SM.
Investigar se há associação entre estes SNPs e fatores associados à síndrome metabólica (índice HOMA-IR, Índice de Massa Corporal, circunferência abdominal, circunferência do quadril e percentual de gordura).
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5. REFERENCIAL TEÓRICO
Síndrome Metabólica
A Síndrome Metabólica é caracterizada por um transtorno complexo de origem multifatorial, que parece ter sua gênese na obesidade e resistência à insulina, e cuja etiologia inclui fatores genéticos, metabólicos e ambientais.
A associação dos cofatores da SM (obesidade, diabetes e hipertensão) entre si, tem sido relatada por pesquisadores desde meados de 1920 (KYLIN, 1923; VAGUE, 1947). Entretanto, apenas em 1988, a resistência insulínica ganhou destaque nesse distúrbio ao Reaven observar indivíduos que apresentavam simultaneamente RI e hiperinsulinemia compensatória, elevados níveis de triglicerídeos plasmáticos e baixos níveis de HDL (lipoproteína de alta densidade) – colesterol e hipertensão. Reaven constatou que estes indivíduos possuíam risco significativamente maior para desenvolver doenças cardiovasculares e denominou este fenômeno Síndrome X (REAVEN, 1988).
Posteriormente, esta síndrome foi também chamada de síndrome da resistência à insulina e síndrome plurimetabólica, de forma que outros conceitos semelhantes foram então propostos (KAPLAN, 1989; DEFRONZO;FERRANNINI, 1991; MATSUZAWA, 1997). Apenas 20 anos após a descoberta de Reaven, os critérios para diagnóstico desta síndrome (e seus pontos de corte) foram então propostos pela Organização Mundial da Saúde (OMS) a qual denominou-a de Síndrome Metabólica. Esta definição exigia um dos diversos marcadores de resistência insulínica (glicemia de jejum, glicemia pós-prandial ou diabetes mellitus tipo 2 - DM2) associada a dois fatores de risco adicionais: obesidade, hipertensão arterial sistêmica (HAS), hipertrigliceridemia, HDL baixo ou microalbuminúria (ALBERTI; ZIMMET, 1998; OMS, 1999). No ano seguinte, o European Group for the Study of Insulin Resistance (EGIR), propôs algumas alterações nos critérios sugeridos pela OMS, dentre eles, a exclusão de indivíduos diabéticos, e sugeriu que a síndrome fosse chamada de “síndrome da resistência à insulina”, devido à importância desta na progressão da síndrome (BALKAU et al., 2002).
Outra organização internacionalmente reconhecida, o National Cholesterol
Education Program - Adult Treatment Panel III (NCEP-ATP III) propôs em 2001,
novos critérios diagnósticos para a SM, sendo considerados como portadores desta, os indivíduos com pelo menos três dentre cinco critérios, a saber: circunferência da
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cintura elevada, HDL-c baixo, triglicerídeos, glicemia e pressão arterial elevados, ou em uso de medicamentos para normalização de qualquer destes parâmetros (NCEP, 2001). A proposta indicada pelo NCEP-ATP III, passou então a ter um critério mais operacional, colocando em foco o risco cardiovascular da SM.
Por sua vez, em 2003, A American Association of Clinical Endocrinologists (AACE), sugeriu novo critério para definição da SM, chamando novamente a atenção para a resistência insulínica e enumerando uma série de variáveis associadas a esta síndrome. No entanto, esta organização não determina o número mínimo de fatores presentes para diagnóstico da SM, visto que segundo a mesma, uma definição precisa é desnecessária e impossível (EINHORN et al., 2003). Em seguida, no ano de 2005, a Federaação Internacional de Diabetes (IDF) publicou novos critérios para diagnóstico da SM, sendo a obesidade abdominal critério obrigatório. A IDF sugere que os pontos de corte para este parâmetro, que deve ser medido pela circunferência da cintura (CC), levem em consideração diferentes etnias. Associada à CC elevada, o indivíduo para ser portador da SM de acordo com a IDF, deve possuir pelo menos dois dos fatores listados pelo NCEP -- ATP III (ALBERTI; ZIMMET; SHAW, 2005).
No mesmo ano, a American Heart Association juntamente com o National
Heart, Lung, and Blood Institute (AHA - NHLBI), sugeriu que os pontos de corte para
CC em europeus fosse o mesmo indicado pela OMS, sendo que este critério não seria obrigatório (GRUNDY et al., 2005). No ano de 2009, diversas instituições de pesquisa se reuniram (IDF, AHA, NHLBI, American Heart Federation, International
Atherosclerosis Society e International Association for the Study of Obesity) e
propuseram o diagnóstico da SM baseado no preconizado pela IDF, excluindo porém, a obrigatoriedade da obesidade abdominal. Os autores reforçam a importância de definir pontos de corte para a CC de acordo com a região (ALBERTI et al, 2009). Outros critérios foram criados por países específicos ao longo dos anos para a caracterização da SM, com o intuito de representar de maneira mais específica cada população.
A Tabela 1 resume os critérios de diagnóstico da SM de acordo com cada instituição previamente citada.
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27
Epidemiologia da Síndrome Metabólica
Devido à grande variabilidade nos critérios diagnósticos, os resultados epidemiológicos desta síndrome são também bastante diferentes nos países. No entanto, independentemente da diretriz utilizada, os dados de mostram que a SM é um grande problema de saúde pública no mundo todo e o número de pessoas afetadas é crescente. A prevalência em todo o mundo tem crescido de forma significativa a cada ano, sendo uma das alterações crônicas mais prevalentes. Isso se deve em parte ao aumento das taxas de obesidade, particularmente a obesidade visceral, a qual é considerada o elemento chave no desenvolvimento da SM (ALBERTI; ZIMMET; SHAW, 2005; ALBERTI et al, 2009; NISHIMURA et al, 2009).
Dados de artigos têm mostrado que a depender do critério diagnóstico utilizado, da população de estudo, local, gênero, idade e etnia, a prevalência desta síndrome pode variar entre 11,8% e 83 %, conforme Tabela 2. Além disto, a presença de algum dos cofatores da SM aumenta substancialmente a sua frequência.
Em estudo realizado por Churilla e colaboradores (2009), os mesmos avaliaram cinco diferentes diretrizes (AACE, OMS, EGIR, IDF, AHA-NHLBI) em uma amostra de 5620 adultos dos Estados Unidos. Foram analisados dados do National Health and
Nutrition Examination Survey (NHANES 1999–2004), e foi encontrado que a mais
alta frequência (38,9%) foi detectada pela diretriz da AACE, enquanto que o EGIR teve a frequência mais baixa (21,2%).
Embora o interesse pelo tema tenha crescido ao longo dos anos no Brasil, os estudos de prevalência desta síndrome na população geral do país, ou nos seus estados e regiões são escassos. De acordo com Lopes (2009), a prevalência desta síndrome no país pode variar entre 17,9% e 56,9 %.
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LOCAL TIPO DE
ESTUDO POPULAÇÃO
MÉTODO
DIAGNÓSTICO PREVALÊNCIA REFERÊNCIA
Islamadab (Paquistão) Observacional descritivo 300 pacientes com DM2 e idade entre 30 e 80 anos
IDF 83 % KIANI et al., 2016.
Esmirna (Turquia) Estudo transversal 12876 indivíduos acima de 30 anos NCEP-ATP III e IDF IDF: 36,9% NCEP: 27,4% SOYSAL et a., 2016. Maastricht (Holanda)* Estudo transversal 574 caucasianos acima de 40 anos com alto
risco para DM2 e doenças cardiovasculares
NCEP – ATP III
53,8 % ANNEMA et al., 2016
Malir
(Paquistão) Prevalência 155 pacientes com DM2 IDF 66,5 %
AHMED; AHMED; ALI, 2010
Ta’if (Arábia Saudita) Estudo transversal 203 pacientes da Unidade de Cuidados Cardíacos acima de 18 anos
IDF 47.8 % ALAKKAS et al., 2016
Burlington (EUA)
Estudo de coorte
818 pacientes em
reabilitação cardíaca IDF 65 %
KHADANGA; SAVAGE & ADES, 2016
Espanha Estudo transversal 3844 espanhóis entre 35 e 74 anos de idade Harmonizing the Metabolic Syndrome 31,2 % MARTINEZ-LARRAD et al., 2016 Roterdã (Holanda) Estudo prospectivo 8643 indivíduos holandeses IDF; AHA-NHLBI e EGIR 3 critérios: 47, 6 % IDF: 42,2 % AHA/NHLBI: 35 % EGIR: 19,4 %
VAN HERPT et al., 2016 Tabela 2. Prevalência da SM de acordo com diversos critérios e em diferentes regiões
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Niterói – RJ (Brasil)
Estudo
transversal 243 indivíduos idosos
OMS; NCEP-ATP III e IDF OMS: 51,9 % NCEP: 45,2 % IDF: 64,1 % SAAD et al., 2014 Taiwan (China) Estudo retrospectivo 45542 indivíduos entre
35 e 74 anos de idade NCEP-ATP III 30,69 %
LI et al., 2016 Nairobi (Quênia) Estudo transversal 539 moradores acima de 18 anos sem história
médica de doença debilitante
IDF (2009) 34,6 % KADUKA et al., 2012
Coimbra –
MG (Brasil) Estudo transversal
435 indivíduos das zonas urbana e rural com idade
acima de 60 anos
NCEP – ATP III
Zona urbana: 40 % (M);22 % (H) Zona Rural: 37 % (M); 13 % (H) DE PAULA el al., 2014 * Prevalência calculada
Etiopatogenia da Síndrome Metabólica
A SM é resultado de forte interação entre meio ambiente e genética, de forma que diversos polimorfismos parecem estar envolvidos na gênese e progressão desta síndrome. No que diz respeito aos fatores ambientais, o ambiente obesogênico, caracterizado especialmente pelo sedentarismo, estresse e elevado consumo energético, desencadeia uma variedade respostas nos diversos sistemas, contribuindo assim para a instalação da SM (KAUR, 2014; ALSALEH et al., 2011).
Dado o acúmulo de tecido adiposo, especialmente o tecido adiposo visceral no indivíduo com a síndrome, e visto que este não é meramente uma reserva energética, mas sim um tecido com intensa atividade metabólica, o papel do mesmo no desenvolvimento da SM é crucial.
Fisiologicamente, o tecido adiposo é responsável pela produção de, entre outras substâncias, adiponectina e leptina. A primeira é uma adipocina de característica antiinflamatória positivamente relacionada à redução de ácidos graxos livres circunlantes e ao controle glicêmico visto que aumenta a sensibilidade á insulina. Por sua vez, a leptina age mais especificamente no sistema nervoso central, atuando principalmente na redução da ingestão alimentar por favorecer a saciedade e no aumento do gasto energético (FUENTES et al., 2013). Assim, o tecido adiposo tem significativa importância na homeostase do organismo.
No entanto, em situação de obesidade, as células adiposas crescem por hipertrofia e hiperplasia estimulando assim, a ativação de vias de sinalização de estresse muitas vezes relacionadas com o quadro de morte celular (CHAWLA; NGUYEN & GOH, 2011). Este quadro estimula então a infiltração de células de defesa no tecido adiposo.
Entre as células imunológicas que infiltram o tecido adiposo, os macrófagos possuem destaque numérico e funcional. Em indivíduos magros, predomina o fenótipo M2, cujos macrófagos são alternativamente ativados, sendo menos inflamatórios e estando dispersos uniformemente pelo tecido adiposo. Por sua vez, o fenótipo M1 (clássico), mais prevalente em indivíduos obesos tem ação altamente inflamatória (BAI & SUN, 2015; HILL; BOLUS & HASTY, 2014). A Figura 1 mostra as diferenças entre tecido adiposo do indivíduo obeso e o tecido adiposo do indivíduo saudável. Pelo seu potencial anti-inflamatório, o primeiro fenótipo está associado ao aumento da sensibilidade à insulina enquanto o segundo favorece a instalação da resistência a este hormônio. Também, os macrófagos residentes (fenótipo M2) estão
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envolvidos na homeostase do tecido adiposo, inclusive por atuar na apresentação de antígenos e sintetizar catecolaminas (HILL; BOLUS & HASTY, 2014; JOHNSON; MILNER & MAKOWSKI, 2012; BAI & SUN, 2015).
Por sua vez, os macrófagos com o fenótipo M1, uma vez infiltrados no tecido adiposo, potencializam a produção de citocinas inflamatórias, especialmente o Fator de Necrose Tumoral (TNF), a IL-6 e a IL-1 (XU & SHI, 2012). Todas estas citocinas têm grande influência na resistência à insulina, citada por alguns autores como principal responsável pelo surgimento da SM. Entre estas citocinas, o TNF é o que tem sido mais citado na literatura científica como responsável pela instalação da resistência à insulina. Tem sido relatado que o papel desta citocina na RI, parece ser pela fosforilação de tirosina em serina na porção interna do receptor de insulina, impedindo a translocação do transportador de glicose tipo 4 (GLUT-4) para a superfície da célula (CHEN et al., 2015; ROBERTS; HEVENER & BARNARD, 2013).
Essa resistência à ação da insulina é citada por muitos autores como principal causador da SM. Por sua vez, a gênese da RI parece ocorrer devido ao crescimento dos adipócitos, que provoca um aumento nos ácidos graxos livres e na secreção de citocinas inflamatórias. Este quadro estimula a síntese de lipoproteínas de baixa densidade (com consequente dislipidemia) e a alteração no funcionamento das células beta pancreáticas com risco de desenvolvimento de DM2. Além disto, pode haver um
aumento da síntese de angiotensina e aldosterona, com consequente aumento da concentração e reabsorção de sódio, que pode levar à instalação da HAS. Outra consequência da RI e do exesso de tecido adiposo é a síntese auentada de moléculas de adesão vascular, que promovem uma disfunção endotelial e estado protrombótico característicos da SM (KAUR, 2014; SAFIEDEEN; ADRIANTSITOHAINA; MARTINEZ, 2016; CAI e LIU, 2012; JUNQUEIRA; COSTA; MAGALHÃES, 2011). A Figura 2, resume o papel do tecido adiposo no desenvolvimento dos cofatores desta síndrome.
Todos estes fatores da SM, podem ter sua gênese devido à presença de um quadro inflamatório crônico, e de forma semelhante possuem caráter altamente inflamatório, aumentando a secreção de diversas citocinas, a exmplo da IL-1 e IL-6
Interleucina-6
A IL-6 foi descoberta no ano de 1986, por Hirano e colegas, sendo proposta como um fator que poderia diferenciar células B ativadas em células produtoras de imunoglobulinas. A partir de então, foi chamada de Fator II Estimulador de Células B
Figura 2. Interrelação entre os fatores da Síndrome Metabólica
AGL=Ácido Graxo Livre; PAI-1= Inibidor do Ativador do Plasminogênio Tipo 1; PCR= Proteína C-Reativa; CO2= Gás Carbônico; SNS=Sistema Nervoso Simpático; VLDL= Lipoproteína de Muito Baixa Densidade; IL-6= Interleucina 6; IL1β = Interleucina 1 beta. Adaptado de: Fauci et al., 2008.
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(BSF-2). Posteriormente, outros dois grupos de pesquisa encontraram que o BSF-2 era idêntico a outros fatores reportados como interferon-β2 e fator estimulador do hepatocito (HIRANO et al., 1986; SEHGAL et al., 1987).
Esta citocina é secretada por múltiplas células, sendo as principais: macrófagos, neutrófilos, fibroblastos e células endoteliais, especialmente nas respostas inflamatórias. Em monócitos e macrófagos, o principal estímulo à produção de IL-6 parece ser toxinas bacterianas, embora a IL-1 também possam fazê-lo. Por sua vez, em fibroblastos e células endoteliais, IL-1 e TNF agem via segundo-mensageiro estimulando a secreção da IL-6, sendo considerados responsáveis pela amplificação dos efeitos biológicos desta proteína (GARCIA; ISSY; SAKATA, 2002).
Esta citocina é multifuncional com atividade fortemente proinflamatoria. Dentre suas funções, a IL-6 é reconhecida como uma das principais moléculas estimuladoras da síntese de proteínas hepáticas na reação inflamatoria de fase aguda, a exemplo da PCR. Além disto, esta citocina possui ação na hematopoiese de células-mãe primitivas. (GARCIA; ISSY; SAKATA, 2002; PERIYALIL, GIBSON & WOOD, 2013; TAHERGORABI & KHAZAEI, 2013; LEON-CABRERA et al, 2013)
Níveis séricos de IL-6 elevados têm sido associado com diversas doenças como o câncer, sendo uma das citocinas circulantes mais presentes em estados catabólicos, tendo efeitos semelhantes ao TNF. Assim, é sugerido por alguns autores que muitos achados previamente atribuídos ao TNF, possam na verdade ser causados pela IL-6 estimulada pelo Fator de Necrose Tumoral. Além do câncer, a IL-6 tem sido relacionada também a: dislipidemias; esteatose hepática; obesidade; resistência à insulina e síndrome metabólica (DONTSOV; VASIL'EVA, 2016; SAFRANOW et al., 2016; PENG et al., 2016; MEDENWALD et al., 2015). Em relação à RI, a IL-6 parece estar envolvida em sua gênese, por reduzir a expressão de GLUT-4, proteína translocada à membrana celular para favorecer a entrada da glicose na célula, via NFκB (Fator nuclear-κB). Isto se dá pela ativação da via JAK-STAT (Janus
kinase/signal transducers and activators of transcription) e aumento da expressão de
SOCS 3 (Suppressor of cytokine signaling 3) (Figura 3). Também, a IL-6 induz RI bloqueando a via da PI3K (Fosfatidil inosil 3 quinase) (YE, 2013; CHEN et al., 2015; ROBERTS; HEVENER & BARNARD, 2013).
A interleucina 6 é codificada pelo gene IL6. Este gene está localizado no braço curto do cromossomo 7 em humanos (7p15.3). Dentre os diversos polimorfismos neste gene, o mais estudado é o rs1800795 (IL6 -174G>C). Este SNP está localizado na posição -174 (região promotora) do IL6, e foi descrito pela primeira vez no ano de 1998, em ingleses com e sem artrite crônica. Neste estudo, os autores encontraram associação significativa entre o referido polimorfismo e as concentrações séricas de IL-6 (FISHMAN, 1998). O estudo de Fishman e colabradores (1998) e diversos outros estudos têm mostrado que indivíduos carreadores do alelo C, têm concentrações séricas de IL-6 significativamente menores (CONTRERAS-SESVOLD, 2015; WALSTON et al, 2005; PHULUKDAREE et al., 2013). No entanto, Potaczek e colaboradores (2007), encontraram em seu estudo que indivíduos que possuíam os genótipos C/C ou G/C tinham níveis séricos de IL-6 significativamente maiores.
Com relação à SM, em estudo realizado por Teixeira e colaboradores (2015), estes avaliaram a relação entre o referido polimorfismo e a Síndrome Metabólica (IDF, 2005) numa amostra de 612 indivíduos brasileiros. Os autores encontraram que tanto
Figura 3. Influência da IL-6 na secreção de insulina
JAK-STAT: Janus kinase/signal transducers and activators of transcription; SOCS 3: Suppressor of
cytokine signaling 3; NFκB: Fator nuclear-κB; TLR: Rceptor tipo Toll; IRS-1:Substrato do recptor
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nos indivíduos com SM e nos que não possuíam a síndrome, o genótipo G/G foi mais frequente. No entanto, ao avaliar entre os indivíduos carreadores do alelo C (G/C e
C/C) com e sem síndrome, os autores puderam notar que a frequência do alelo citado
era significativamente maior entre os indivíduos que possuíam a SM, e que estes apresentavam maiores médias de Índice de Massa Corporal (IMC), CC, lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) e menores médias de HDL-c. Os autores chamam a atenção para o papel deste alelo na relação com o risco cardiovascular do individuo, devido à sua já documentada influência na obesidade e resistência à insulina (WERNSTEDT et al., 2004; CARULLI et al., 2009; STEPHENS et al., 2004; HERBERT et al., 2006). Noutro estudo, um caso-controle realizado com a população chinesa, os autores ao avaliarem o polimorfismo -174G>C, não encontraram associação com doença arterial coronariana (JIYUAN; HONGMEI; YONGPING, 2016).
Interleucina 1
A 1 é encontrada sob duas formas bioquimicamente distintas: a 1α e a IL-1β. As duas formas compartilham o mesmo receptor e compartilham diversas atividades biológicas, embora a forma predominante seja a IL-1β. Esta citocina é sintetizada especialmente por monócitos e macrófagos, embora células endoteliais e queratinócitos também sejam capazes de produzi-la (GARCIA; ISSY; SAKATA, 2002).
Assim como a IL-6, os níveis séricos desta citocina estão aumentados em situações de obesidade, hiperglicemia e hiertrigliceridemia, bem como Síndrome Metabólica e resistência à insulina (DONTSOV; VASIL'EVA, 2016; SATPATHY et al., 2015).
Tem sido postulado por alguns autores que esta proteína esteja envolvida na instalação da RI. Tais autores sugerem que a IL-1β impede a sinalização de insulina em tecidos periféricos por macrófagos e pela via do inflamassoma. Esta via consiste de um complexo de proteínas citosólicas, incluindo NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3 (NLRP3) e caspase-1. O NLRP3 pode ser ativado pela disfunção mitocondrial (um dos resultados da obesidade). Por sua vez, a caspase-1 é uma protease que contribui para a RI, especialmente por mediar a infiltração de
macrófagos ao tecido adiposo (Figura 4) (CHEN et al., 2015; ROBERTS; HEVENER & BARNARD, 2013; FUENTES et al., 2013; YE, 2013).
Esta citocina é codificada pelo gene IL1B, que em humanos, está localizado no braço longo do cromossomo 2 (2q14.1). Este gene possui 7153 pares de base, e sete éxons conhecidos. Entre os polimorfismos de IL1B, o rs1143634 (IL1B +3954 C>T) é um dos mais estudados. Este polimorfismo está localizado no éxon 5 do gene IL1B, e é caracterizado pela substituição de uma citosina por uma timina na posição 3954. Neste polimorfismo, os indivíduos com o genótipo C/C, parecem produzir quantidades normais de IL-1β. Por sua vez, indivíduos com o genotipo T/T têm sido associados a maior circunferência da cintura; maior glicemia e risco de diabetes; e maiores níveis séricos de PCR (NELSON et al, 2016; CARTER et al, 2008; LUOTOLA et al., 2009; LUOTOLA et al., 2011).
Luotola e colaboradores (2011), ao avaliarem se este polimorfismo poderia ser capaz de predizer a incidência de diabetes mellitus 2, encontraram associação positiva e significativa em homens. Nas mulheres porém, a associação foi inversa. Noutro estudo, realizado por Carter e coautores (2008), ao avaliarem a associação do referido polimorfismo com a síndrome metabólica e obesidade abdominal em uma população com doença arterial coronariana, os autores concluíram que os indivíduos
Figura 4. Influência da IL-1β na secreção de insulina
MTA: Macrófago do Tecido Adiposo; TLR: Receptores tipo Toll; NLRP3: NOD-like recptor P3; IRF3: Fator regulatório do interferon tipo 3; JNK: Quinase c-Jun N-terminal;NFκB: Fator Nuclear Kappa B. Adaptado de: Chen et a., 2015
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homozigotos para o alelo T, possuíam aumento significativo na média de circunferência da cintura, quando comparado aos homozigotos para o alelo C.
Os estudos no Brasil, especialmente na população da Bahia sobre polimorfismos nessas citocinas e sua relação com a síndrome metabólica ainda são escassos.
Proteína C Reativa
A IL-6 é a principal citocina na estimulação da produção de Proteína C Reativa no fígado e outros tecidos, embora a IL-1β também estimule a secreção desta proteína. Esta molécula faz parte da resposta imunológica inata, pertence à família das pentraxinas. Além disso, possui uma forma pentamérica com cinco subunidades idênticas, tendo cada uma em média 23 kD, e foi primeiramente descrita por Tillet e Francis em 1930 devido à sua habilidade em se ligar ao peptídeo C de Streptococcus
pneumoniae. (ZIMMERMANN et al, 2014; AGRAWAL; GANG & RUSIÑOL, 2014;
KAPUR, 2015).
Em condição fisiológica, a PCR é sintetizada em baixa quantidade no fígado, no entanto, sua secreção é rapidamente induzida diante de um quadro de injúria tecidual e inflamação. Em indivíduos saudáveis, os níveis desta proteína são normalmente menores que 0,5µg/mL, porém, a rápida secreção desta proteína durante a resposta de fase aguda resulta num aumento de até 1000 vezes nas primeiras 24-48h. Assim, esta proteína é altamente sensível, embora pouco específica como marcador de inflamação sistêmica. Após a resolução da inflamação, os níveis de PCR decaem rapidamente, tendo uma meia-vida entre 4 e 9 horas, e um retorno aos valores iniciais em um período de 7 a 12 dias (FRANGOGIANNIS, 2012; ZIMMERMANN, 2014; HABERSBERGER, 2012).
Esta proteína é sintetizada principalmente pelos hepatócitos, porém os tecidos adiposo, vascular, neuronal, arterial e renal também a produzem, além dos alvéolos pulmonares e macrófagos diante do aumento de IL – 6, especialmente, mas também de IL-1 e TNF (ROUBÍN et al, 2013). Sua função fisiológica está baseada principalmente na ligação a patógenos e células lesadas e/ou apoptóticas com consequente ativação da via clássica do sistema complemento. Também possui a capacidade de potencializar a produção de interleucinas como a IL-1β e IL-6, bem como TNF por macrófagos periféricos e monócitos sanguíneos, sendo largamente
utilizada como ferramenta nas inflamações agudas e crônicas (BEZERRA et al, 2008; DUCLOS, 2013).
A ativação do sistema complemento mediado pela PCR se dá através da ligação a C1q ativando desta forma a via clássica. Esta ativação difere da ativação por anticorpos visto a PCR recruta o fator H à superfície da célula, e então não há clivagem de C5. Por conseguinte, não é formado o complexo de ataque à membrana (MARNELL; MOLD & DUCLOS, 2005).
No corpo humano, esta proteína está presente sob duas formas: uma forma pentamérica (nativa) e outra monomérica (modificada). A dissociação dos pentâmeros da Proteína C Reativa pentamérica ocorre num microambiente inflamatório, e a PCR monomérica formada contribui para a resposta inflamatória localizada. Enquanto a primeira possui propriedades tanto antiinflamatórias (ao inibir a adesão de neutrófilos e células endoteliais através da inibição da expressão de L-selectina e ao inibir a produção de superóxido, pelos neutrófilos e estimular a síntese de antagonista do receptor de IL-1 pelos monócitos) quanto proinflamatórias, a forma monomérica tem atividade potencialmente proinflamatória, especialmente nas células endoteliais, leucócitos e plaquetas, potencializando desta forma a inflamação (Figura 4) (SANTOS et al, 2003; WU et al, 2015).
Figura 4. Proteína C Reativa e a Inflamação
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Esta proteína tem sido extensivamente estudada como preditora da doença arterial coronariana inclusive em indivíduos com SM dado o já conhecido risco cardiovascular desta síndrome. Estudos demonstram que a alteração nos níveis séricos de PCR está relacionada com todos os parâmetros da SM individualmente ou em conjunto e com o risco cardiovascular, motivo pelo qual a mesma tem sido utilizada nas pesquisas e na prátic clínica para avaliar a inflamação e o risco cardíaco do indivíduo (WIJK et al, 2016; RIDKER et al, 2003).
Especialmente o excesso de tecido adiposo – com infiltração de macrófagos - e a resistência à insulina e hiperglicemia são potentes estimuladores da secreção de interleucina – 6. Uma vez na corrente sanguínea, esta substância é responsável por promover a secreção da PCR no fígado. Esta, além de sinalizador de um quadro inflamatório tem também forte influência na progressão da aterosclerose. A influência da PCR na desordem cardiovascular se deve ao seu papel direto na instalação e progressão deste quadro. Plaquetas ativadas podem se ligar à PCR pentamérica, o que resulta na formação da forma monomérica desta proteína. Esta última aumenta a adesão de plaquetas no endotélio e estimula a formação de agregados plaquetas-neutrófilos promovendo assim a atividade protrombótica (FRANGOGIANNIS, 2012; WU et al., 2015).
Dados de um estudo publicado pelo GENUT (Núcleo de Pesquisa e Extensão em Genômica Nutricional e Disfunções Metabólicas) avaliou os níveis séricos de PCR em indivíduos com Síndrome Metabóica. Os resultados deste estudo mostraram que a maioria dos indivíduos possuía elevado risco cardiovascular, de forma que a média na população do estudo foi de 5,67 mg/L, e apenas 16,7% destes apresentavam risco baixo de desenvolver doenças cardiovasculares. Os demais apresentavam riscos médio (25,8%) e elevado (57,6%), como era de se esperar neste grupo (DOS-SANTOS et al., 2015).
Permanece ainda sem resposta, o questionamento sobre qual a influência de polimorfismos em citocinas envolvidas no estímulo a esta proteína, e a relação destes com a SM na população de Salvador, Bahia. Uma vez que, conforme dito previamente, as interleucinas 1 e 6 são grandes estimuladoras à síntese e secreção de PCR, é interessante estudar polimorfismos nos genes que os codificam.
ET-1: Endotelina -1; PAI-1: Inibidor do Ativador do Plasminogẽnio Tipo -1; PCR: Proteína C Reativa; EROS: Espécies Reativas de Oxigênio; Ang II: Angiotensina II; AT1R: Receptpr da Angiotensina do Tipo 1; VCAM: Molécula de Adesão Celular Vascular; ICAM:Molécula de Adesão Intercelular; ON: Óxido Nítrico; NAD(P)H Oxidase: fosfato de dinucleotídeo de adenina e nicotinamida oxidase; PA: Pressão Arterial; Adaptado de: Saviola, Schifrin (2007)
Cél. Esponjosas
Figura 5. Relação entre Proteína C Reativa e Aterosclerose
Cél. Espumosas Macrófagos Proteína da Matriz Extracelular Eritrócitos Plaquetas Lipídios
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6. MATERIAL E MÉTODOS
Delineamento do estudo
O presente estudo transversal foi parte de um projeto intitulado: “Influência da dieta sem lactose sobre a síndrome metabólica: papel de polimorfismos nos genes da lactase, adiponectina e seu receptor, GIP e receptor, TCF7L2, TNF, IL-6 e NFk-B”. O referido projeto é desenvolvido no Núcleo de Pesquisa e Extensão em Genômica Nutricional e Disfunções Metabólicas da Universidade do Estado da Bahia (GENUT/UNEB), sob a coordenação dos professores doutores Edilene Maria Queiroz Araújo e Domingos Lázaro Souza Rios.
A Figura 6 resume todo o processo da pesquisa, que será detalhado no decorrer desta seção.
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Amostra populacional
A população do estudo foi composta por 495 indivíduos, que foram distribuídos em dois grupos: um grupo de indivíduos com SM (grupo caso) e um grupo sem SM (grupo controle). Participaram da pesquisa os indivíduos que preencheram os seguintes critérios de inclusão:
1. Idade superior a 20 anos.
2. Assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). 3. Não possuir diagnóstico de: doenças inflamatórias intestinais crônicas (história clínica de Doença de Crohn, retococolite ulcerativa, doença do cólon irritável e diverticulite); insuficiência renal crônica; doenças hepáticas crônicas, à exceção de esteatose hepática; doenças autoimunes.
4. Não estar em uso de medicação para controle do apetite. 5. Não fazer uso contínuo de corticoide.
6. Não estar em período gestacional.
Recrutamento dos indivíduos
Os indivíduos com Síndrome Metabólica foram provenientes de demanda espontânea ou do ambulatório de endocrinologia do Hospital Geral Roberto Santos (HGRS). Após entrevista e explicação do projeto por nutricionista e estudantes do curso de nutrição da UNEB, os pacientes que preenchiam os critérios de inclusão foram convidados a participar do estudo e a assinar o TCLE. O grupo comparação foi composto por voluntários saudáveis, funcionários da Promédica (assistência médica) e participantes do Fórum de Mulheres Negras da Bahia (FMN/BA), ambas as instituições localizadas em Salvador, Bahia, bem como os participantes do grupo de acompanhamento de “exercício e saúde” da UNEB.
Diagnóstico da Síndrome Metabólica
O diagnóstico da SM foi feito com base nos critérios preconizados pela IDF (2005), conforme mostrado na Tabela 3.
Dados antropométricos e clínicos
Para coleta dos dados relativos a peso e altura foi utilizada balança digital e estadiômetro de chão, respectivamente, e a partir destes dados foi calculado o IMC. Para aferição das circunferências (quadril, cintura e abdominal) foi utilizada fita inelástica, seguindo as recomendações da I-DBSM (2005). O percentual de grudura dos indivíduos foi medido com auxílio de bioimpedância (modelo de quatro pontos), segundo o protocolo descrito nas Diretrizes de Utilização da Bioimpedância para Avaliação da Massa Corpórea (Associação Brasileira de Nutrologia, 2009). A aferição da pressão arterial sistêmica foi feita com auxílio de estetoscópio (Littmann®) e tensiômetro (Bic®), seguindo as orientações da VI Diretrizes da Sociedade Brasileira de Hipertensão, 2010.
Exames bioquímicos
Os exames bioquímicos foram realizados na Associação dos Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE). A Tabela 4 resume os exames realizados, bem como seus métodos e valores de referência.
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No que diz respeito à resistência à insulina – calculada pelo índice HOMA - IR (homeostatic model assessment - insulin resistance), os valores foram obtidos a partir de um cálculo matemático que utiliza os valores de glicemia e insulina de jejum (MATTHEWS et al., 1985; OLIVEIRA; SOUZA; LIMA, 2006). A classificação de resistência insulínica foi definida de acordo com as orientações das Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes (2015-2016), baseado nos estudos de Sterne colaboradores, 2005, a saber: HOMA-IR IR > 4,65 ou IMC >28,9 Kg/m2 ou HOMA IR > 3,6 e IMC > 27,5 Kg/m2.
Coleta de sangue e extração de DNA
A amostra de sangue do paciente foi obtida por punção venosa da artéria braquial em tubo com EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético). O sangue foi acondicionado em freezer até o momento da extração do DNA genômico. O protocolo utilizado para a extração do DNA foi uma adaptação do método de extração salina de Miller, Dykes e Polesky (1988). Após a extração, foi realizada a quantificação por espectrofotometria com auxílio de Nanodrop, para avaliar qualitativa e quantitativamente cada amostra. A extração do DNA foi realizada no Laboratório de Genética Humana e Molecular (LGHM) da UNEB e a quantificação no Laboratório de Endocrinologia da UFBA.
Genotipagem dos SNPs rs1800795 (IL6 -174 G>C) e rs1143634 (IL1B +3954 C>T)
Após a quantificação, as amostras de DNA foram diluídas com água ultrapura para a concentração de 15,0 ng/μL e em seguida para 1,25 ng/μL. Uma alíquota das amostras (4,0 μL) na concentração final (1,25 ng/μL), foi então transferida para as placas de 384 poços e mantidas à temperatura ambiente para secagem. Após secagem, a genotipagem dos SNPs foi realizada usando a tecnologia de TaqMan probe-based 5´-nuclease assays (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Foram analisados os SNPs rs1800795 (IL6 -174 G>C) e rs1143634 (IL1B +3954 C>T). Os experimentos de genotipagem foram realizados no Laboratório de Imunofarmacologia e Biologia Molecular (IMUNOBIO) do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia, ICS/UFBA.
Análise Estatística
A análise estatística dos dados foi realizada com o auxílio do software para Windows SPSS (Statistical Package for the Social Sciences), versão 20. O equilibrio de Hardy-Weinberg foi testado com o uso do programa Arlequim versão 2000. Os estudos de associação com os polimorfismos foram realizados apenas nos grupos, mas não entre os grupos. Para as frequências de polimorfismos e outras variáveis categóricas foi utilizado o teste Qui-quadro ou do teste exato de Fisher, quando necessário. Por sua vez, as variáveis contínuas foram analisadas através do Teste T de
Student, Análise de variância ou testes não paramétricos quando necessário. A
normalidade de distribuição das variáveis foi testada através da análise da curva de Gauss, e as que não possuíam distribuição normal (pressão arterial sistólica e diastólica, glicemia, triglicerídeos, HOMA-IR e PCR) foram então transformadas em logaritmo decimal.
Aspectos Éticos
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisas da Universidade do Estado da Bahia (CEP/UNEB), sob CAAE: 03409712.9.3001.5023.
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7. RESULTADOS
Caracterização da população do estudo (casos e controles)
A amostra de estudo foi composta por 495 indivíduos, dos quais 285 foram incluídos no grupo caso e 210 no grupo controle. Em ambos os grupos foi observada maior prevalência de indivíduos do sexo feminino, conforme mostra a Figura 7.
Com relação à média de idade, foi notada uma diferença significativa entre os grupos (pvalor< 0,001). No grupo caso foi observada maior frequência indivíduos idosos (> 60 anos), com média de idade de 57,7 anos. Por outro lado, no grupo controle, a média de idade observada foi de 41,34 anos, sendo a maior prevalência de indivíduos com idade inferior a 60 anos. A Tabela 5 mostra os dados relativos à média de idade dos grupos.
Grupo n Média Desvio
padrão pvalor Idade Controle 209 41,34 13,56 <0,001 Caso 256 57,66 8,71
Figura 7. Distribuição dos voluntários da pesquisa dos grupos caso e controle de acordo com o sexo.
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Grupo n Média Desvio
padrão pvalor CC Controle (M) 33 82,14 8,91 <0,001 Caso (M) 41 108,81 12,20 Controle (F) 174 79,75 8,17 <0,001 Caso (F) 214 100,90 10,44 Sistólica Controle 25 126,4 10,36 <0,001 Caso 253 142,4 19,26 Diastólica Controle 25 76,4 8,10 <0,001 Caso 253 88,46 12,56 Glicemia Controle 207 85,72 17,11 <0,001 Caso 256 137,27 55,57 HDL-c Controle (M) 33 50,47 10,61 <0,001 Caso (M) 41 38,60 8,31 Controle (F) 176 54,91 12,51 <0,001 Caso (F) 215 45,40 8,77 Triglicerídeos Controle 205 92,57 49,72 <0,001 Caso 255 161,56 87,84
Com relação à SM, houve diferença significativa entre os grupos para todos os cofatores, de forma que o grupo caso apresentou maiores médias que o grupo controle para todas as variáveis, à exceção dos níveis séricos de HDL-c (Tabela 6). A análise da prevalência mostrou que o cofator mais frequente no grupo caso, após a obesidade abdominal (requisito obrigatório), foi a hipertensão arterial, presente em 95% dos indivíduos. Por sua vez, o segundo fator mais prevalente neste grupo foi a alteração na glicemia (82,4 %), seguido de níveis elevados de triglicerídeos (73,8 %) e reduzidos de HDL-c (68,8 %), como mostra a Figura 8. No grupo controle, a obesidade abdominal (medida pela circunferência da cintura) foi o fator mais frequente (48,3%) e a pressão arterial elevada foi o que mostrou menor prevalência (4,3%).
A respeito dos fatores associados à SM apresentados na Tabela 7, as médias observadas no grupo caso foram significativamente maiores do que aquelas encontradas no grupo controle para IMC, CA, CQ, HOMA-IR e PCR.
Figura 8. Comparação dos parâmetros da SM alterados entre os grupos
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Os valores de PCR foram também utilizados para análise do risco cardiovascular dos indivíduos. Esse resultado mostrou que apenas cerca de 35% dos indivíduos possuíam baixo risco (PCR-us <1,0 mg/dL) para desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Os indivíduos com valores de PCR superior a 8,0 mg/dL
Grupo n Média Desvio
padrão pvalor CA Controle (M) 33 84,94 8,41 <0,001 Caso (M) 40 109,54 11,98 Controle (F) 174 83,96 8,22 <0,001 Caso (F) 213 103,00 10,45 CQ Controle (M) 33 97,53 5,77 <0,001 Caso (M) 40 106,61 10,21 Controle (F) 174 98,85 8,41 <0,001 Caso (F) 214 107,42 11,09 IMC Controle 209 21,73 6,20 <0,001 Caso 255 32,11 5,40 HOMA-IR Controle 27 1,31 0,63 <0,001 Caso 254 4,28 4,42 PCR Controle 26 1,43 2,18 <0,001 Caso 255 4,53 5,31
foram excluídos desta análise, seguindo a referência do próprio exame, que define que os valores acima de 8,0 mg/dL são indicativos de processo inflamatório agudo. O risco cardiovascular não foi analisado no grupo controle porque este exame só foi realizado em 23 indivíduos deste grupo.
Genotipagem dos SNPs rs1800795 (IL6 -174 G>C) e rs1143634 (IL1B +3954 C>T)
Os dados relativos às frequências do SNPs rs1800795 do IL6 revelaram que o genótipo C/C foi o menos frequente nos grupos caso e controle (3,8% e 3,2%, respectivamente). Por outro lado, foi observada maior frequência do genótipo G/G (70,3% e 72,2%, respectivamente). A frequência do alelo C foi menor do que a do alelo G no grupo caso (16,76 % e 83,24 %, respectivamente) e no grupo controle (15,51 % e 84,49%, respectivamente). Não houve diferença significativa entre as frequências genotípicas ou alélicas entre os grupos, conforme mostra a Tabela 6.
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Quando realizada comparação das médias dos cofatores da SM entre os genótipos para o rs1800795 foi encontrada associação significativa com a pressão arterial sistólica nos indivíduos do grupo caso (pvalor = 0,004), apresentando o genótipo C/C menor média que os demais genótipos. Dentre os indivíduos do grupo controle, nenhuma das variáveis apresentou diferença estatística significativa nas médias entre os genótipos, conforme mostram a Tabela 7 e a Figura 10.
Comparando as médias das demais variáveis (PCR, HOMA-IR, CA, CQ, IMC e %Gordura) entre os genótipos para o rs1800795 em cada grupo, foi possível perceber que não houve diferença significativa (Tabela 8).
Sobre o polimorfismo rs1143634 de IL1B, a Tabela 6 e a Figura 11 mostram que o genótipo T/T apresentou a frequência mais baixa em ambos os grupos (2,2%, grupo caso e 2,7%, grupo controle), e que o genótipo C/C foi o mais frequente nos dois grupos - caso e controle (69,6% e 72,7%, respectivamente). Por sua vez, com relação à frequência alélica, o alelo T apresentou frequência de 16,76 % no grupo caso e 14,97 % no grupo controle, enquanto que para o alelo C, foi encontrada frequência de
Tabela 6. Frequência genotípica e alélica dos SNPs em ambos os grupos
G/C
83,24 % e 85,03%, respectivamente. Assim como no polimorfismo de IL6 estudado, os grupos não apresentaram diferença significativa as frequências genotípicas e alélicas.
Para este polimorfismo (rs1143634 de IL1B) não foi encontrada diferença significativa nas médias entre os genótipos para os cofatores da SM (CC, glicemia, pressão arterial sistólica e diastólica, HDL-c o triglicerídeos) (Tabela 9), e nem para as demais variáveis estudadas (PCR, HOMA-IR, CA, CQ, IMC e % de gordura) em nenhum dos grupos (Tabela 10).
Neste estudo, ambos os polimorfismos estiveram em equilíbrio de Hardy-Weinberg.
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Tabela 7. Valores médios dos cofatores da SM entre os grupos, de acordo com os genótipos do rs1800795 (IL6 -174 G>C)
C/C G/C G/G C/C G/C G/G C/C G/C G/G C/C G/C G/G C/C G/C G/G C/C G/C G/G
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Tabela 8. Valores médios de PCR, índice HOMA-IR e dados antropométricos entre os grupos, de acordo com os genótipos do rs1800795
CA: Circunferência Abdominal; CQ: Circunferência do Quadril; PCR: Proteína C Reativa; IMC: Índice de Massa Corporal; HOMA-IR: homeostatic model assessment - insulin resistance. - : Sem dados suficientes para avaliar
CA: Circunferência Abdominal (cm); CQ: Circunferência do Quadril (cm); PCR: Proteína C Reativa (mg/dL); IMC: Índice de Massa Corporal (kg/m²); HOMA-IR: homeostatic model assessment - insulin resistance.
-: Sem dados suficientes para avaliar
C/C G/C G/G C/C G/C G/G C/C G/C G/G C/C G/C G/G C/C G/C G/G C/C G/C G/G
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Tabela 9. Valores médios dos cofatores da SM entre os grupos, de acordo com os genótipos do rs 1143634 (IL1 +3954 C>T)
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Tabela 10. Valores médios de PCR, índice HOMA-IR e dados antropométricos entre os grupos, de acordo com os genótipos do rs1143634
CA: Circunferência Abdominal (cm); CQ: Circunferência do Quadril (cm); PCR: Proteína C Reativa (mg/dL); IMC: Índice de Massa Corporal (kg/m²); HOMA-IR: homeostatic model assessment - insulin resistance.
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8. DISCUSSÃO
Os dados sociodemográficos da população estudada mostram que houve predomínio do sexo feminino, e este resultado pode ser devido a questões culturais. Pimentel e colaboradores (2011) afirmam que as mulheres têm maior tendência a buscar de maneira espontânea os atendimentos médicos ambulatoriais do que os homens. Assim, enquanto a busca por auxílio médico pelas mulheres está mais associada à preocupação com a saúde, os homens tendem a buscar serviço médico especialmente por motivos ocupacionais e de seguridade social.
Com relação à idade, conforme mostrado na Tabela 5, a diferença deste parâmetro entre os grupos foi estatisticamente significativa (aproximadamente 41 e 58 anos, respectivamente). Este resultado era esperado, apesar dos esforços de pareamento dos grupos, tendo em vista que o grupo caso apresentava possuía média de idade muito mais elevada que o grupo controle, e a prevalência de SM aumenta com o avançar da idade (PENALVA, 2008).
Também foram observadas diferenças significativas dos cofatores da SM entre os grupos caso e controle, de forma que enquanto o grupo controle apresentou valores médios de normalidade para todos os parâmetros, a média destes parâmetros nos indivíduos do grupo caso esteve alterada.
Este resultado parece ser devido ao número de fatores da SM alterados em cada grupo. À exceção da obesidade abdominal presente em 100% dos indivíduos com SM por ser critério obrigatório pela IDF, a alteração na pressão arterial foi o cofator mais frequente (95%). Esses dados estão em acordo com estudo prévio do GENUT cuja prevalência de pressão alta alcançou 94,5% dos indivíduos (DOS-SANTOS et al., 2015), e em acordo com resultados de outros estudos realizados no Brasil (GORSANE et al., 2015; CHUANG et al., 2016; MANMEE, AINWAN, JANPOL, 2016). Dados da VII Diretriz Brasileira de Hipertensão Arterial (2016) apontam que 32,5% e 60% dos indivíduos adultos e idosos, respectivamente, possuem HAS, sendo a responsável por cerca de 50% das mortes por DCV, de forma direta ou indireta. Ademais, a VII Diretriz mostra que ntre as doenças avaliadas para cálculo da taxa de mortalidade por DCV no Brasil, as doenças hipertensivas merecem atenção especial devido ao fato de serem as únicas cuja incidência aumentou nos anos analisados (2000 a 2013), conforme mostra a Figura 10. Além disso, estudos comparando grupos de indivíduos de diferentes etnias, têm notado que em afrodescendentes, a prevalência
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desse agravo é maior do que em brancos (FLACK, et al, 2010; LAI, WARD, BOLIN, 2015).
Enquanto a pressão arterial elevada foi mais frequente no grupo caso, no grupo controle houve maior prevalência de obesidade abdominal (medida pela CC), o que parece confirmar a crescente incidência de obesidade no Brasil. Em estudo realizado por Malta e colaboradores (2014), os autores avaliaram a prevalência de sobrepeso/obesidade nas capitais do Brasil e Distrito Federal, entre os anos de 2006 e 2012. Foi encontrada prevalência de 47,3% de obesidade em Salvador no último ano do estudo, com aumento de 7,6% de obesos entre 2006 e 2012. Cabe ressaltar que indivíduos com obesidade abdominal possuem maior risco de desenvolvimento de SM, e que a circunferência da cintura está positivamente associada com o risco de doenças cardíacas (ALBERTI; ZIMMET; SHAW, 2005; JUNQUEIRA; COSTA; MAGALHÃES, 2011; CORRÊA et al., 2016)
Além da obesidade, tem sido sugerido por alguns autores que a RI está fortemente envolvida na gênese da SM (KUROZUMI et al., 2016; TACK et al., 2012). Os valores médios do índice HOMA-IR mostram que os indivíduos com SM tiveram valores médios indicativos de resistência à insulina de acordo com o preconizado pelas Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes (2015-2016), enquanto que a média do grupo controlou indicou normalidade para este parâmetro. Os resultados do presente estudo em relação à RI, estão em acordo com outros trabalhos previamente publicados (DOS-SANTOS et al., 2015; DINIZ et a., 2016). Este resultado pode ser explicado pelo acúmulo de tecido adiposo visceral, que é capaz de estimular a
Figura 10. Taxa de mortalidade por DCV no Brasil entre 2000 e 2013
