PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE MICHELE MEDEIROS NOVOCHADLO
ESTUDO DO EFEITO NEUROPROTETOR DO ÁCIDO FÓLICO NA SEPSE EXPERIMENTAL
Tubarão 2018
MICHELE MEDEIROS NOVOCHADLO
ESTUDO DO EFEITO NEUROPROTETOR DO ÁCIDO FÓLICO NA SEPSE EXPERIMENTAL
LINHA DE PESQUISA: NEUROCIÊNCIAS
Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora: Profa. Fabricia Petronilho, Dra
Tubarão 2018
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por guiar meus passos.
À minha orientadora, Fabrícia Petronilho, pela paciência, preocupação e por toda a dedicação nesses dois anos trilhados.
À minha família e meu noivo Mauricio pelo apoio e por acreditar no meu desenvolvimento intelectual e espiritual.
Aos meus colegas do Laboratório de Neurobiologia de Processos Inflamatórios e Metabólicos – Neuroimet da UNISUL pelo coleguismo.
RESUMO
Sepse é uma resposta inflamatória sistêmica a uma infecção grave, podendo levar à falência de múltiplos órgãos e à morte. Sua fisiopatologia é caracterizada pelas respostas inflamatórias excessivas frente a uma infecção. O sistema nervoso central (SNC) é um dos primeiros órgãos afetados, por sua vulnerabilidade a danos, em resposta à inflamação sistêmica. Tem-se conhecimento das propriedades antioxidantes do ácido fólico (AF) e de sua capacidade em antagonizar a ativação de macrófagos e diminuir a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). Com isso, entende-se que o AF pode contribuir para minimizar o processo inflamatório, bem como combater o estresse oxidativo. Sendo assim, este trabalho objetivou avaliar o efeito neuroprotetor do AF em ratos submetidos à sepse. Ratos Wistar foram submetidos à sepse por ligação e perfuração cecal (CLP) ou sham (controle) e tratados com AF por via oral (10 mg / kg após CLP) ou veículo. Os animais foram divididos em grupos sham + H2O, sham + AF, CLP + H2O e CLP + AF. Vinte e quatro horas após a cirurgia, o hipocampo e o córtex pré-frontal foram dissecados e analisados quanto aos níveis de permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), concentração de nitrito / nitrato, atividade da mieloperoxidase (MPO), formação de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e carbonilação proteíca. A análise da sobrevida foi realizada durante 10 dias após a cirurgia. Verificou-se que o AF reduziu a permeabilidade da BHE, a atividade da MPO no hipocampo e no córtex pré frontal e a peroxidação lipídica no hipocampo em 24 horas e melhorou a taxa de sobrevida após a sepse. Nossos dados demonstraram que o AF pode aumentar a sobrevida e reduzir neuroinflamação e, consequentemente, o estresse oxidativo no cérebro.
ABSTRACT
Sepsis is a systemic inflammatory response to a severe infection, which can lead to multiple organ failure and death. Its pathophysiology is characterized by excessive inflammatory responses to the infection. The central nervous system (CNS) is one of the first organs affected because its vulnerability to damage in response to systemic inflammation. It´s known the antioxidant properties of folic acid (FA) and its ability to antagonize macrophage activation and decrease the production of reactive oxygen species (ROS). Thereby, it´s understood that FA can contribute to minimize the inflammatory process, as well as combat oxidative stress. Thus, this work aimed to evaluate the neuroprotective effect of FA in rats submitted to sepsis. Wistar rats were subjected to sepsis by cecal ligation and perforation (CLP) or sham (control) and treated orally with FA (10 mg/kg after CLP) or vehicle. Animals were divided into sham+H2O, sham+FA, CLP+ H2O and CLP+FA groups. Twenty four hours after surgery, the hippocampus and prefrontal cortex were obtained and assayed for levels of blood brain barrier (BBB) permeability, nitrite/nitrate concentration, myeloperoxidase (MPO) activity, thiobarbituric acid reactive species (TBARS) formation and protein carbonyls. Survival was performed during 10 days after surgery. FA reduced BBB permeability, MPO activity in hippocampus and pre frontal cortex and lipid peroxidation in hippocampus in 24 hours and improves the survival rate after sepsis. Our data demonstrates that FA can increase survival and decreasing neuroinflammation and,
consequently, oxidative stress parameters in the brain.
LISTAS
Lista de abreviaturas AF - Ácido Fólico AAL - Ácido α-lipóico
BDNF - Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (do inglês Brain-Derived Neurotrophic Fator)
BHE - Barreira Hematoencefálica CAT - Catalase
CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais CK - Creatina Quinase (do inglês Creatine kinase)
CLP - Ligação e Perfuração Cecal (do inglês Cecal Ligation and Puncture) DBCA - Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais
DFX - Deferoxamina
DNA - Ácido Desoxirribonucleico
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético (do inglês Ethylenediamine Tetraacetic Acid)
ERNs - Espécies Reativas do Nitrogênio EROs - Espécies Reativas do Oxigênio EUA - Estados Unidos da América GPx - Glutationa Peroxidase H2O2 - Peróxido de hidrogênio IL - Interleucina
LPS - Lipopolissacarídeo MIA - Morte Indolor Assistida MPO - Mieloperoxidase NAC - N-acetilcisteína NO - Óxido Nítrico OH- - Hidroxila
PAMPs - Padrões Moleculares Associados a Patógenos (do inglês Pathogen-Associated Molecular Pattern)
ROOH - Hidroperóxido
SIRS - Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (do inglês Systemic Inflammatory Response Syndrome)
Quick SOFA - Avaliação Sequencial de Falência de Órgãos (do inglês Quick Sequential Organ Failure Assessment)
S.C. - Subcutâneo
SNC - Sistema Nervoso Central SOD - Superoxido Dismutase
TBARS - Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (do inglês Thiobarbituric Acid Reactive Substances)
TLR - Receptores Toll-like (do inglês Toll-like Receptors) TMB - Tetrametilbenzidina
TNF-α - Fator de Necrose Tumoral α (do inglês Tumor Necrosis Factor α) UTI - Unidade de Terapia Intensiva
Lista de figuras
Figura 1 – Experimento 1: Quebra BHE...23 Figura 2 – Experimento 2: Análises bioquímicas...23
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 9
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO... 10
1.1.1 Sepse: definição e dados epidemiológicos... 10
1.1.2 Fisiopatologia da sepse... 12
1.1.3 Disfunção cerebral na sepse ……… 13
1.1.4 Barreira hematoencefálica... 14
1.1.5 Estresse oxidativo na disfunção cerebral na sepse... 15
1.1.6 Possibilidades antioxidantes na disfunção cerebral na sepse... 16
1.1.7 Ácido fólico... 18 2. OBJETIVOS………. 20 2.1 OBJETIVO GERAL ... 20 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 20 3. MÉTODOS……… 21 3.1 TIPO DE ESTUDO ... 21 3.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ... 21 3.3 ANIMAIS ... 21 3.4 DELINEAMENTO DO ESTUDO ... 22
3.4.1 Tratamento e grupos experimentais... 22
3.4.2 Amostras... 22
3.5 MODELO DE LIGAÇÃO E PERFURAÇÃO CECAL (CLP)... 23
3.6 ANÁLISES………... 24
3.6.1 Determinação da permeabilidade da barreira hematoencefálica... 24
3.6.2 Atividade da mieloperoxidase (MPO)... 24
3.6.3 Determinação de nitrito/ nitrato... 25
3.6.4 Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)... 25
3.6.5 Carbonilação protéica... 25
3.6.6 Determinação de proteínas totais... 26
3.6.7 Análise de sobrevida .. ……… 26
3.7 PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS ... 26
4. RESULTADOS………... 27 5. DISCUSSÃO………..……….. 31 6. CONCLUSÂO………... 34 6.1 PERSPECTIVAS FUTURAS... 34 REFERÊNCIAS... 35 ANEXO……….. 46
1. INTRODUÇÃO
Cerca de 20% das internações em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs), a nível mundial, são causadas pela sepse e suas complicações, constituindo as causas mais comuns de mortalidade nessas unidades1,2. Apesar dos consideráveis avanços, uma estimativa projeta cerca de 17 milhões de casos de sepse anualmente em todo o mundo, com elevadas taxas de letalidade3.
A sepse é caracterizada por desenvolvimento de alterações clínicas, hematológicas, bioquímicas e imunológicas decorrentes de uma resposta inflamatória sistêmica, desencadeada por um agente infeccioso4,5. Quando acompanhada de disfunção orgânica e hipotensão refratária à reposição volêmica, passa a denominar-se choque séptico6.
Pesquisadores concentram suas pesquisas na disfunção de múltiplos órgãos, do ponto de vista de órgãos periféricos, ficando a disfunção do sistema nervoso central (SNC) em segundo plano. Entretanto, cresce o número de estudos que buscam investigar a disfunção neurológica na sepse7-9. Os mecanismos associados a estas alterações permanecem pouco esclarecidos, mas sabe-se que o estresse oxidativo e o processo inflamatório estão entre as suas causas10.
Apesar da sua relevância na taxa de mortalidade global em UTIs11, atualmente apenas terapias suportivas estão disponíveis para o tratamento da sepse e da encefalopatia séptica, o qual estão associadas à elevada mortalidade12,13. Desta ma-neira, terapias antioxidantes e anti-inflamatórias têm sido consideradas como trata-mentos farmacológicos em potencial para atenuar ou combater a disfunção cerebral na sepse14,15.
Tem-se conhecimento das propriedades antioxidantes do ácido fólico (AF) e de sua capacidade em antagonizar a ativação de macrófagos e diminuir a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) ou nitrogênio (ERNs), especialmente peroxinitrito, um mediador chave do dano tecidual na sepse16. Com isso, entende-se que o AF pode contribuir para minimizar o processo inflamatório decorrente da ativação do sistema imune, bem como combater o estresse oxidativo17, mecanismos estes envolvidos na fisiopatologia da sepse16.
Considera-se portanto a hipótese de que a administração de AF tem o potencial de prevenir ou amenizar o estresse oxidativo na sepse e com isso a disfunção cerebral. Além disso, um melhor entendimento da fisiopatologia da sepse pode fornecer dados preliminares e novos protocolos experimentais de tratamento, para serem posteriormente validados em ensaios clínicos e empregados na prática médica18, sendo que o tratamento com AF pode ser promissor nesse sentido.
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1.1 Sepse: definição e dados epidemiológicos
A sepse é uma resposta inflamatória sistêmica a uma infecção grave, podendo levar à falência de múltiplos órgãos e, consequentemente, à morte19, sendo, então, definida como a presença dos critérios para síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS) com infecção comprovada2. Sua fisiopatologia é caracterizada inicialmente pelas respostas inflamatórias excessivas frente a uma infecção20-23.
Segundo o consenso de sepse realizado no ano de 2001, essa síndrome é entendida como um contínuo agravamento da inflamação frente à infecção, começando com SIRS e evoluindo para sepse grave e choque séptico. Os critérios para definir SIRS foram baseados na temperatura, frequência cardíaca, frequência respiratória e contagem de glóbulos brancos alterados, tendo que apresentar pelo menos dois destes critérios2,3.
A sepse grave, caracterizava-se por disfunção orgânica aguda2. No que refere-se aos sinais e sintomas que caracterizam o choque séptico, destaca-refere-se: hipotensão (requerendo terapia vasopressora para manter a pressão arterial) e níveis de lactato maiores que 2mmol/L após ressuscitação adequada de fluidos24.
No atual consenso publicado no início de 2016, a sepse passou a ser definida como a disfunção de órgãos com potencial risco de vida, causada por uma resposta desregulada do hospedeiro frente à infecção. Em outras palavras, a sepse passa a ser definida como um processo infeccioso com a presença de disfunção orgânica. Com a nova definição, extinguiu-se a nomenclatura sepse grave, que identificava a sepse associada à disfunção orgânica, mantendo-se apenas os termos sepse e
choque séptico, este último utilizado quando há hipotensão refratária à reposição volêmica e uso de vasopressores6,24.
Associado a isso, recomendou-se diagnosticar a disfunção orgânica através do escore quick SOFA (avaliação sequencial de falência de órgãos), medida sequencial rápida de falências orgânicas, que analisa frequência respiratória, pressão sanguínea sistólica e alterações do estado mental6,25. A disfunção orgânica é característica acentuada da sepse, quanto maior o número de órgãos em falência pior o prognóstico do paciente, na qual cada órgão em disfunção representa um acréscimo de 15-20% na mortalidade26. Uma das disfunções orgânicas na sepse que vem ganhando maior número de evidências é a disfunção neurológica, uma vez que representa elevação da mortalidade em curto e longo prazo27.
Dentre os fatores de risco relacionados a pré disposição de desenvolver infecção e levar à sepse estão: idade, sexo masculino, raça negra e comorbidades crônicas associadas. A incidência de sepse aumenta desproporcionalmente em idosos e mais da metade dos casos, ocorrem em adultos com mais de 65 anos de idade28. As mulheres parecem apresesentar menor risco de desenvolver sepse em comparação aos homens29, provavelmente pelas diferenças na carga de doenças crônicas, fatores ambientais e predisposição genética, que causam diferenças na resposta imune do hospedeiro à infecção30.
Se tratando de aspectos epidemiológicos, estudos mostram um aumento em nível mundial na incidência de sepse31, sendo ela a principal causa de morte em pacientes criticamente doentes32,33. E a causa mais comum de mortalidade em UTIs não coronarianas, com taxas de letalidade entre 50-60%2, que variam de acordo com as características socioeconômicas do país3,34.
Em 2011, os maiores gastos em hospitais dos Estados Unidos da América (EUA) foram por sepse, custando 20,3 bilhões de dólares, ou seja, representaram 5,2% do custo total para todas as internações35. Sendo a sepse considerada o motivo de mais alto custo de hospitalização31,36.
De acordo com dados levantados, atualmente são tratados um número muito maior de pacientes criticamente doentes nas UTIs em todo o mundo em comparação com os números de mais de 10 anos atrás. Uma análise retrospectiva da Austrália e Nova Zelândia mostrou um aumento no número de pacientes críticos e sépticos nos últimos 12 anos34. Estudos retrospectivos e prospectivos na Europa indicam uma alta
taxa de mortalidade por sepse, 45-55%, acompanhada por um tempo de internação hospitalar prolongado37.
Em estudo multicêntrico internacional, foram verificadas diferenças consideráveis na taxa de mortalidade entre o Brasil (67,4%) e outros países do mundo (49,6%)3. Um estudo de prevalência de um só dia em cerca de 230 UTIs brasileiras concluiu que 30% dos leitos estão ocupados por pacientes com sepse ou choque séptico, com letalidade próxima dos 50%. Esses dados demonstram o custo elevado da sepse no Brasil3, reforçando o fato que esta síndrome é um importante problema de saúde pública2.
1.1.2 Fisiopatologia da sepse
A imunidade inata é a primeira linha de defesa do organismo, presente em todos os organismos multicelulares com a finalidade de detectar invasores potencialmente agressivos, através da detecção de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) presentes nos invasores por meio de receptores toll-like (TLR)38. Entre os PAMPs, encontra-se o lipopolissacarídeo (LPS), uma toxina presente na membrana externa de bactérias gram-negativas. Sua liberação no hospedeiro gera um estimulo inflamatório celular39 que pode resultar em um aumento de marcadores inflamatórios na circulação, tais como as citocinas TNF-α, IL-6 e IL-1β e, consequentemente, uma resposta a nível sistêmico40.
O TNF-α, produzido por macrófagos ativados e outras células, é liberado de modo sistemático, quase que imediatamente, após o reconhecimento de LPS através do receptor TLR-4, resultando em diapedese de neutrófilos. Além disso, através de quimiotaxia, o TNF-α causa aumento da migração de neutrófilos, e induzindo a liberação de outras citocinas, como IL-6 e IL-1β, e, consequentemente, a ativação de novas células e uma perpetuação da resposta inflamatória como o que ocorre na sepse41. Algumas citocinas podem apresentar efeito endócrino promovendo reações fora dos limites inflamatórios localizados e resultando em manifestações sistêmicas21. Nesse sentido, a transcrição de genes relacionados à resposta inflamatória, permite a exacerbação da inflamação, ocasionando alterações na circulação sistêmica, gerando vasodilatação e hipotensão, resultando em alterações na microcirculação e distúrbios na cascata da coagulação. O envolvimento dos
elementos do sistema imune, das vias de coagulação e do sistema endócrino induzem uma resposta imune e metabólica exacerbada3.
Contudo, além de ser um mecanismo microbicida, neutrófilos ativados aumen-tam a produção de EROs, que segundo estudos, está exacerbada na sepse tanto a nível periférico como no SNC42-44. Estes eventos comprometem a hemostasia celular e induzem a hipóxia citopática, podendo ocorrer apoptose celular45. Todas estas alte-rações em tecidos periféricos podem ser potencializadas, e serem responsáveis, pelo menos em parte, pela disfunção neurológica na sepse46.
1.1.3 Disfunção cerebral na sepse
Durante a sepse, o SNC é um dos primeiros órgãos afetados47, por sua vulnerabilidade a danos, em resposta à inflamação sistêmica. A inflamação, induzida por infiltração de células imunes e mediadores inflamatórios no cérebro, leva a profundas mudanças estruturais e funcionais celulares48. Como consequência, até 81%49 dos pacientes sépticos desenvolvem uma condição clínica conhecida como encefalopatia, que é caracterizada por comprometimento cognitivo, podendo apresentar de delirium leve a coma profundo50,51.
A encefalopatia associada à sepse é a causa mais comum de encefalopatia na UTI49,50. No que refere-se à mortalidade entre os pacientes sépticos, é duas vezes maior em pacientes que desenvolvem sepse associada ao delirium em qualquer momento durante a hospitalização49.
Em condições saudáveis, os principais tipos de células presentes no cérebro são neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e micróglia. Os neurônios se conectam entre si através de longos processos axonais com sinapses. Os oligodendrócitos suportam axônios com bainhas de mielina. Os astrócitos interagem com os vasos sanguíneos para formar a barreira hematoencefálica (BHE) e manter as sinapses neuronais, enquanto a micróglia é responsável por processos de defesa imunológica do cérebro52. No entanto, em condições patológicas, onde a resposta inflamatória periférica está aumentada, como ocorre na sepse, a função de tais células pode ser comprometida53,54. Vários estudos recentes têm sugerido que fatores vasculares estão relacionados à encefalopatia séptica, devido ao dano do endotélio vascular cerebral, alterando a permeabilidade da BHE e a disfunção microcirculatória53-55.
Em estudo realizado por Dal-Pizzol e colaboradores56, em modelo animal de sepse polimicrobiana, foi verificado aumento na permeabilidade da BHE, observado tanto no córtex pré-frontal, como no hipocampo, em 24 horas após a indução da doenca. Com o aumento da permeabilidade da BHE, há um grande recrutamento de neutrófilos57 que potencializam o processo neuroinflamatório e causam o estresse oxidativo no parênquima cerebral58.
A produção de citocinas e o estresse oxidativo parecem ter um efeito neurotóxico e estão envolvidos na apoptose neuronal. Nesse contexto, algumas regiões cerebrais, como o hipocampo, por possuirem maior receptores para citocinas, são mais vulneráveis à apoptose do que outras59.
Adicionalmente, para suprir suas demandas energéticas, o cérebro é altamente dependente de um fornecimento constante de nutrientes. Entretanto, o fornecimento de nutrientes através de vasos sanguíneos pode ser comprometido através de alterações na BHE60. Ao todo, com tais alterações, as evidências atuais indicam que o comprometimento cognitivo é perceptível na sepse e que mesmo após a resolução de casos de sepse aguda, cognição e comportamento podem permanecer alterados52. Na sepse experimental, observou-se comprometimento cognitivo persistente em ratos completamente recuperados e com hemoculturas negativas. Isto indica que a eliminação do gatilho da sepse não impede o aparecimento de lesões cerebrais persistentes61. E um dos principais fatores relacionados a isso é a quebra da BHE 60.
1.1.4 Barreira hematoencefálica
O cérebro humano é caracterizado pela alta complexidade arquitetônica62. Devido a esta complexidade, a capacidade de reparação é limitada, sendo altamente susceptível a danos nos tecidos. Como medidas preventivas primárias, o cérebro é protegido de várias maneiras, por exemplo, pelo osso do crânio contra danos mecânicos ou pela BHE de agentes patogênicos transmitidos pelo sangue63. A BHE é um importante componente da rede de comunicação que conecta o SNC e os teci-dos periféricos, além de funcionar como uma interface que regula a troca de substân-cias entre sangue e o SNC64.
Entre os componentes da BHE estão células endoteliais e astrócitos63. As camadas de células endoteliais são ligadas por proteínas de junção apertadas
célula-célula. As junções apertadas entre as células formam uma barreira altamente seletiva63,65 que se torna mais permeável durante a inflamação sistêmica63,66.
Um fator determinante na fisiopatologia das lesões cerebrais é a manutenção da integridade da BHE67. As alterações na BHE na sepse podem ocorrer devido à liberação de mediadores inflamatórios e agentes oxidantes na periferia causando o aumento da sua permeabilidade e levando à infiltração no SNC de imunoglobulinas e citocinas pró-inflamatórias52,68. Além disso, com a ruptura da barreira, ocorre a infiltra-ção de células do sistema imune, passagem de toxinas e ativainfiltra-ção de células gliais, como a micróglia, que estimularão a potencialização do estresse oxidativo e resposta inflamatória local68.
1.1.5 Estresse oxidativo na disfunção cerebral na sepse
Radicais livres são moléculas instáveis por possuírem um ou mais elétrons desemparelhados44. Essas substâncias em altas concentrações podem causar danos em organelas celulares, ácidos nucleicos, lipídeos, carboidratos e proteínas69.
Os radicais livres podem conter moléculas com oxigênio e nitrogênio, sendo caracterizadas respectivamente como EROs e ERNs. Tais espécies reativas derivadas da redução parcial do oxigênio molecular ao reagirem com moléculas orgânicas, podem levar à morte celular neuronal. Quando em baixas concentrações, atuam em processos celulares de defesa contra agentes patogênicos69. Níveis mais elevados de EROs contribuem para disfunção vascular e crescimento celular anormal, incluindo hipertrofia do músculo vascular70. Entre os EROs estão o aníon superóxido (O2-), os radicais peróxidos (ROOH), peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (OH-), 71. Entre os ERNs encontra-se o peroxinitrito (ONOO-) e o óxido nítrico (NO)72.
Alguns tipos de espécies reativas são produzidos por neutrófilos e macrófagos ativados com intuito de inativar microrganismos invasores, no entanto, sua produção excessiva pode danificar os tecidos hospedeiros. Esta produção pode levar a danos celulares irreversíveis em lipídios e proteínas, causando disfunção mitocondrial e falência orgânica73. Além disso, os efeitos pró-inflamatórios dos EROs e ERNs incluem danos endoteliais, aumento de liberação de citocinas e comprometimento mitocondrial74, contribuindo para a sobrecarga de radicais livres e o desequilíbrio entre
oxidantes e antioxidantes75.
Em condições normais, a produção de espécies reativas é balanceada pelo sistema de defesa antioxidante no organismo. Alguns dos mecanismos moleculares postulados da progressão da sepse estão ligados ao desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e sua degradação por substâncias antioxidantes. Quando a produção destas espécies é maior do que a resposta antioxidante do organismo, ocorre o estresse oxidativo, causando danos e até a morte celular74,76.
Entre os mecanismos de defesa contra o excesso de radicais livres estão a atividade de enzimas antioxidantes como as enzimas superóxido dismutase (SOD), a glutationa peroxidase (GPx) e a catalase (CAT)77. A SOD é um componente da defesa antioxidante endógena que se opõe aos efeitos do anion superóxido, enquanto a CAT e a GPx agem impedindo a formação do radical OH- a partir de H2O278.
O SNC é vulnerável aos efeitos do estresse oxidativo, pois ele possui ácidos graxos poli-insaturados, que podem ser alvos das EROs, e por possuir uma baixa concentração das defesas antioxidantes52,77. Nesse sentido, a disfunção cerebral na sepse pode estar relacionada aos efeitos dos mediadores inflamatórios, às alterações metabólicas na circulação cerebral, e às alterações celulares decorrentes da produção de EROs e ERNs79.
Há evidências de estresse oxidativo nas horas iniciais após a sepse experimen-tal (6, 24 e 48h), podendo contribuir para o aparecimento da disfunção neurológica aguda e em longo prazo80. Adicionalmente, tratamentos com abordagem antioxidante estão sendo testados em estudos pré-clínicos e apontam para o uso promissor de derivados de selênio para minimizar o dano oxidativo e mitocondrial encefálico na sepse81. Ainda, o tratamento com a associação de N-acetilcisteína (NAC) e deferoxa-mina (DFX)82 ou guanosina foram eficazes em atenuar o dano oxidativo agudo, resul-tando em melhoria de funções cognitivas em longo prazo83.
1.1.6 Possibilidades antioxidantes na disfunção cerebral na sepse
As terapias antioxidantes podem ser eficazes contra danos na sepse por redu-zirem os danos mitocondriais84, restaurar antioxidantes endógenos e diminuir o estresse oxidativo85. Algumas estratégias antioxidantes são capazes de melhorar a disfunção cerebral na sepse a longo prazo82.
Com base nos efeitos antioxidantes da NAC, como “scavenger” de radicais livres e como substrato para a formação da enzima GPx, Toklu e colaboradores86, avaliaram os danos oxidativos e inflamatórios em pulmões e tecidos cerebrais após sepse. Observaram que a substância estudada melhorou a capacidade antioxidante total, diminuiu a peroxidação lipídica e a inflamação nos órgãos estudados.
Cassol e colaboradores87 realizaram pesquisa para verificar os efeitos de uma combinação de NAC e DFX, um quelante de ferro, no cérebro de ratos após modelo de sepse por ligação e perfuração cecal (CLP). Demonstraram que a combinação dessas substâncias pode reverter as alterações na cadeia respiratória mitocondrial e a atividade da enzima creatina quinase (CK) que estão alteradas no cérebro de ratos sépticos.
Em outro estudo, Danielski e colaboradores15, usando um modelo animal de sepse polimicrobiana, estudaram os efeitos antioxidantes da vitamina B6 no córtex pré-frontal e o hipocampo destes animais. Comprovaram que o tratamento agudo com esta vitamina melhorou parâmetros relacionados à disfunção cerebral na sepse, como o estresse oxidativo, diminuiu a permeabilidade da BHE, a disfunção mitocondrial, e consequentemente a deficiência cognitiva de longo prazo.
Em estudo similar, Giustina e colaboradores14 investigaram se o ácido α-lipóico (AAL) teria efeito antioxidante na disfunção cerebral em ratos sépticos. Os achados demonstram que AAL atuou diminuindo o estresse oxidativo e melhorando parâmetros inflamatórios no hipocampo e córtex cerebral. Isso por meio da proteção a permeabilidade BHE, diminuição da formação de nitrito/nitrato, da atividade da MPO, do dano oxidativo para lipídios e proteínas e aumento da atividade de enzimas antioxidantes nas estruturas cerebrais. Este antioxidante também tem sido avaliado em situações de lesão cerebral secundária à sepse, pois é capaz de ultrapassar rapidamente a BHE88, otimizar sua função e atenuar o processo inflamatório, já que inibe a produção de citocinas pró-inflamatórias89. Com esses achados, verifica-se a importância e necessidade de estudos sobre substâncias antioxidantes como adjuvantes na sepse.
1.1.7 Ácido fólico
O AF (2-amino-4-hidroxi-6-metilenoaminobenzolL-glutâmico) possui a fórmula molecular C19H19N7O690. É uma vitamina hidrossolúvel do complexo B, conhecida também por B9 ou folato91,92, não sendo sintetizada pelo organismo, podendo ser consumida através da alimentação com vegetais verdes folhosos e frutas cítricas91.
Esta vitamina é essencial para inúmeras funções no organismo como a biossíntese de nucleotídeos, bem como síntese e reparo de DNA93,92, produzir hemácias e prevenir a anemia92,94. Além disso, desempenha papel crucial na síntese de norepinefrina, serotonina e dopamina92 e auxilia na neuroplasticidade e preservação da integridade do neurônio95.
O folato tem recebido atenção na literatura científica em relação ao seu papel para a saúde do cérebro. Este nutriente é conhecido por proteger a favor do desenvolvimento neurocognitivo e contra os processos de neurodegeneração96. Tem se visto que a suplementação dessa substância pode ser eficaz no reparo e recuperação do SNC de indivíduos adultos com lesão neurológica97. Algumas pesquisas associaram a deficiência de folato com depressão98,99 e comprometimento cognitivo100, já que ele está envolvido na síntese de neurotransmissores101. Além disso, o folato preserva os fosfatos de alta energia, junto com a produção reduzida de EROs, previne a lesão oxidativa das células102.
Segundo Stanger e Wonisch70 o folato pode melhorar a disfunção endotelial para uma situação de estresse, sugerindo que o AF tem efeitos antioxidantes. Assim, o aumento do estresse oxidativo também pode levar ao aumento do consumo de folato, devido ao seu papel como antioxidante durante estados prolongados de ativação imune103. Segundo Higashi-Okai e colaboradores104, o AF e derivados demonstraram atividades contra a geração de H2O2 na peroxidação de ácido linoleico.
Estudos pré-clínicos ainda mostraram que o folato reduz a formação de NO endotelial, provavelmente por suas propriedades antioxidantes105,106. Como também, inibe a peroxidação lipídica e protege as membranas celulares e o DNA dos danos causados pelos radicais livres107.
O efeito do AF sobre a toxicidade embrionária induzida por arsênio, foi avaliado em estudo utilizando modelo animal, o qual concluiu que essa vitamina pode proteger
o desenvolvimento do sistema nervoso contra a toxicidade do arsênio. Isso pois, ela agiu diminuindo o estresse oxidativo e atenuando o aumento dos níveis de EROs108.
Se tratando de processo infeccioso e o desenvolvimento de estresse oxidativo cerebral, um estudo realizado por Barichello e colaboradores17, em modelo animal de meningite, demonstrou que o AF, administrado em determinadas doses, pode diminuir o estresse oxidativo e aumentar os níveis do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Este último é uma proteína endógena responsável por regular a sobrevivência neuronal e a plasticidade sináptica, prevenindo o comprometimento cognitivo17.
Portanto, para reduzir a morbimortalidade em pacientes sépticos, há uma maior necessidade de compreender melhor os mecanismos subjacentes à disfunção neurológica causada por sepse e identificar novas estratégias terapêuticas em sua prevenção. Como o estresse oxidativo está associado à encefalopatia séptica, a terapia antioxidante tem sido considerada um potencial tratamento farmacológico para esta condição, demonstrando a importância de pesquisas envolvendo o AF por suas propriedades antioxidantes.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito neuroprotetor do AF em ratos submetidos à sepse.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Verificar os efeitos do AF sobre a permeabilidade BHE no hipocampo e córtex pré-frontal em ratos submetidos ao modelo de sepse CLP após 24 horas;
-Analisar o efeito do AF sobre a infiltração de neutrófilos no hipocampo e córtex pré-frontal em ratos submetidos ao modelo de sepse por CLP após 24 horas;
-Avaliar o efeito do AF sobre a concentração de nitrito/nitrato no hipocampo e córtex pré-frontal em ratos submetidos ao modelo de sepse por CLP após 24 horas;
- Avaliar o efeito do AF sobre a peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas no hipocampo e córtex pré-frontal em ratos submetidos ao modelo de sepse por CLP após 24 horas;
- Determinar a sobrevida de ratos após a indução de sepse por CLP e tratamento com AF.
3. MÉTODOS
3.1 TIPO DE ESTUDO
Estudo experimental pré-clínico utilizando modelo animal de doença.
3.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
Os reagentes utilizados para as análises bioquímicas foram: ácido tio-barbitúrico, dinitrofenilhidrazina, hidroperoxido de tert-butila, albumina bovina, reagente de Griess e azul de evans (Sigma, St. Louis, MO), ácido tricloroacético, ácido fosfórico, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA), (Labsynth, São Paulo, Brasil). No que se refere aos equipamentos, as análises de nitrito/nitrato, dano em lipídios, proteínas, mieloperoxidase (MPO), foram avaliadas em Espectrofotômetro (U2010, Hitachi) (Laboratório de Neurobiologia de Processos Inflamatórios e Metabólicos- UNISUL), enquanto que as análises de BHE foram realizadas em leitora de microplacas Spectramax M3 – Molecular Devices (Laboratório de Neurociências – UNESC).
3.3 ANIMAIS
Foram utilizados um total de 128 ratos machos da linhagem Wistar de 60 dias de vida (250-300g) obtidos do biotério da Universidade do Vale do Itajaí. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno de dimensões adequadas, com maravalha, em ambiente climatizado (22°C ± 2°C), com ciclo claro/escuro de 12 horas, recebendo água e dieta padrão ad libitum durante todo o período de experimento.
3.4 DELINEAMENTO DO ESTUDO
3.4.1 Tratamento e grupos experimentais
Conforme ilustrado nas figuras 1 e 2, para a análise de quebra da BHE e bioquímicas os animais foram divididos em sham+água, sham+AF, CLP+água e CLP+AF, receberam em dose única AF dissolvido em água (grupos AF) ou veículo (água) (grupos veículo) por via oral com auxílio de gavagem na dose de 10mg/kg imediatamente após CLP17.
Na análise de sobrevida, os animais foram divididos nos mesmos grupos acima recebendo diariamente 10mg/kg de AF por via oral durante 10 dias consecutivos. Foram inclusos nos grupos experimentais 12 animais para os grupos sham e 18 animais para os grupos CLP.
3.4.2 Amostras
Para as análises de quebra de BHE e bioquímicas, em um tempo de 24 horas após a indução de sepse, sob supervisão de médico veterinário, os animais sofreram morte indolor assistida (MIA) por meio de overdose de tiopental (0,5g/kg) e as estruturas cerebrais (hipocampo e córtex pré- frontal) foram retiradas e armazenadas em freezer -80ºC. Foi escolhido o tempo de 24 horas, para morte e dissecação das estruturas, com base em estudo anterior, que verificou que nesse tempo houve a quebra da BHE e dano no hipocampo e córtex pré-frontal após sepse por CLP56.
Figura 1 – Experimento 1: Quebra BHE. CLP ligação e perfuração cecal; AF ácido fólico.
Figura 2 – Experimento 2: Análises bioquímicas. CLP ligação e perfuração cecal; AF ácido fólico.
3.5 MODELO DE LIGAÇÃO E PERFURAÇÃO CECAL (CLP)
Sepse intra-abdominal foi produzida usando a técnica CLP109. Os ratos foram anestesiados com cetamina (80mg/kg) e xilazina (10mg/kg), e submetidos à laparotomia com incisão mediana abdominal. O ceco foi ligado abaixo da junção íleo-cecal com fio seda 3-0 e perfurado com uma agulha número 14, gentilmente comprimido até a extrusão de conteúdo fecal. Os planos cirúrgicos foram fechados e os ratos observados por 2 horas. Todos os grupos receberam suporte básico salina 50 mL/kg imediatamente, antibióticoterapia com ceftriaxona (30mg/kg) e dipirona sódica (80mg/kg) (para analgesia pós operatória) via subcutânea (S.C.)
imediatamente e 12 horas após CLP110. Como controle, foram avaliados animais submetidos à laparotomia, sem ligação ou perfuração (sham). De acordo com estudos de validação do método de CLP, as taxas de sobrevivência após a cirurgia devem ser de 100% no grupo sham e entre 45-50% no grupo em que foi induzido sepse109, o que justifica o fato do grupo CLP ter um número maior de animais nesse estudo.
3.6 ANÁLISES
3.6.1 Determinação da permeabilidade da barreira hematoencefálica
A integridade da BHE foi determinada por meio da técnica de extravasamento de azul de Evans111. Foi injetado na veia femural 1 mL de azul de Evans (1%) em salina e permitido circular durante 60 minutos antes da dissecação do SNC. Posteri-ormente, os animais foram anestesiados com cetamina (80mg/kg) e xilazina (10mg/kg) para a realização de laparotomia e foi realizada a perfusão encefálica com aproximadamente 200mL de solução salina através do ventrículo esquerdo, na pres-são de 100 mmHg, até o momento que o fluido de perfupres-são incolor foi obtido a partir do átrio direito.
As estruturas cerebrais hipocampo e cortex pré-frontal foram retiradas para avaliação da BHE e colocadas em solução tricloroacético a 50%. Após homogeneização e centrifugação, o sobrenadante obtido foi diluído em etanol (1:3) para a determinação da intensidade de sua fluorescência (excitação em 620nm e emissão em 680nm) com um espectrofotômetro de luminescência. O teor de azul de Evans nos tecidos foi quantificado a partir de uma linha padrão linear derivada de quantidades conhecidas do corante e expressa por ng/mg/tecido.
3.6.2 Atividade da mieloperoxidase (MPO)
A atividade da MPO é um indicativo do infiltrado de neutrófilos tecidual. Neste sentido, as amostras foram homogeneizadas (50mg/ml) em 0.5% de brometo de he-xadeciltrimetilamônio e centrifugadas. A suspensão foi sonicada três vezes durante 30 segundos até a obtenção do sobrenadante. Uma alíquota do sobrenadante foi
mis-turada com uma solução de 1,6mM tetrametilbenzidina (TMB) e 1mM H2O2. A ativi-dade da MPO foi mensurada espectrofotometricamente em 650nm a 37ºC. Os resul-tados foram expressos como mU/mg proteína112.
3.6.3 Determinação de nitrito/nitrato
Foi mensurado por meio da utilização da reação de Griess, por adição de 100μL de reagente de Griess [0,1% (w/v) naftil etilenodiaminadicloridrato em H2O e 1% (p/v) sulfanilamida em 5% (v/v) H3PO4 em volume concentrado (1:1)] para 100μL de amostra. A densidade óptica foi medida a 550nm usando um espectrofotômetro. Os resultados foram expressos como nmol/mg proteína113.
3.6.4 Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
Como índice dos efeitos do estresse oxidativo sobre os lipídeos, foi utilizada a formação de TBARS, durante uma reação ácida de aquecimento em um ensaio espectrofotométrico114. Resumidamente, as amostras foram misturadas com 1mL de ácido tricloroacético a 10% e 1mL de ácido tiobarbitúrico 0,67%, e, em seguida, aquecida em banho de água fervente a 100ºC durante 30 minutos. TBARS foram determinados pela absorbância a 535nm, utilizando 1,1,3,3-tetrametoxipropano como padrão externo. Os resultados foram expressos como equivalentes de malondialdeído por miligrama de proteína.
3.6.5 Carbonilação protéica
O efeito do estresse oxidativo em proteínas foi avaliado por meio da determinação de grupos carbonil baseado na reação com dinitrofenilhidrazina em um ensaio espectrofotométrico. Resumidamente, as proteínas foram precipitadas por adição de ácido tricloroacético a 20% e dissolvidas em dinitrofenilhidrazina, e a absorbância foi aferida em 370nm. Os resultados foram expressos como níveis de proteínas carboniladas por miligrama de proteína115.
3.6.6 Determinação de proteínas totais
Todos os resultados das análises anteriormente descritas foram normalizados com a quantidade de proteínas avaliada de acordo com o método descrito por Lowry e colaboradores118.
3.6.7 Análise de sobrevida
Na avaliação da sobrevida, os animais foram observados diariamente durante 10 dias, após indução de sepse, para verificar a taxa de mortalidade119.
3.7 PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS
Os dados foram expressos em média ± desvio padrão e intervalo interquartil e foram analisados por ANOVA e teste post hoc Tukey. A análise da sobrevida foi avaliada por Klaplan-Meier e teste log rank. Para todas as análises p<0.05 foi considerado estatisticamente significante e as análises foram executadas utilizando o programa SPSS® versão 20.0. Os gráficos foram construídos no Graphpad Prism® versão 5.
3.8 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA
O presente projeto de pesquisa foi submetido à Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade do Sul de Santa Catarina – Unisul e aprovado com o número de protocolo 15.043.4.01.IV (Anexo A).
A utilização dos animais foi de acordo com os princípios da Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais em Atividades de Ensino ou de Pesquisa Científica - DBCA-2016120.
4. RESULTADOS
A figura 1 representa a avaliação da permeabilidade da BHE, medida por meio do extravasamento do corante azul de Evans. Tanto no hipocampo (A) como no córtex pré-frontal (B) o grupo CLP+água apresentou elevação da permeabilidade da BHE, comparando com o grupo sham+água. Contudo, a administração de AF, exerceu papel protetor contra a elevação da permeabilidade da BHE, em ambas as estruturas analisadas.
Figura 1 - Avaliação da permeabilidade da BHE no hipocampo (A) e córtex pré-frontal (B) de ratos submetidos à sepse e tratados com AF (10 mg/kg). Dados expressos como média ± desvio-padrão, analisados por ANOVA de uma via com post hoc de Tukey.* p<0,05 em relação ao grupo sham+água e # p<0,05 em relação ao grupo CLP+água.
Na figura 2 expressa-se a concentração de MPO, utilizada como indicativo de infiltrado de neutrófilos no hipocampo (A) e córtex pré frontal (B). Em ambas as estruturas, os animais do grupo CLP+água apresentaram maior infiltração de neutrófilos quando comparado ao sham+água. O tratamento com AF, demostrou-se eficaz na redução do infiltrado de neutrófilos nas estruturas analisadas dos animais submetidos à sepse.
Figura 2- Infiltrado de neutrófilos através da análise da atividade da MPO no hipocampo (A) e córtex pré-frontal (B) de ratos submetidos à sepse e tratados com AF (10 mg/kg). Dados expressos como média ± desvio-padrão, analisados por ANOVA de uma via com post hoc de Tukey.* p<0,05 em relação ao grupo sham+água e # p<0,05 em relação ao grupo CLP+água.
Em relação às concentrações de nitrito e nitrato no hipocampo (A) e córtex pré-frontal (B) em 24 horas após a indução de sepse, o AF não demonstrou diferenças estatisticamente significativas entre os animais com sepse que receberam ou não AF, como verificado na figura 3.
Figura 3- Concentração de nitrito/nitrato no hipocampo (A) e córtex pré-frontal (B) de ratos submetidos à sepse e tratados com AF (10 mg/kg). Dados expressos como média ± desvio-padrão, analisados por ANOVA de uma via com post hoc de Tukey.
No que refere-se ao dano oxidativo, analisou-se a peroxidação lipídica pela formação de TBARS. Como representado na figura 4, pode-se confirmar que houve um aumento da oxidação de lípidios no hipocampo (A) e cortex pre-frontal (B) dos ratos em sepse em comparação aos sham. E no hipocampo (A), a administração do AF propiciou uma menor peroxidação lipídica dos animais sépticos comparado aos que receberam água.
Figura 4- Peroxidação lipídica no hipocampo (A) e córtex pré-frontal (B) e de ratos submetidos à sepse e tratados com AF (10 mg/kg). Dados expressos como média ± desvio-padrão, analisados por ANOVA de uma via com post hoc de Tukey.* p<0,05 em relação ao grupo sham+água e # p<0,05 em relação ao grupo CLP+água.
Avaliou-se marcadores de dano oxidativo em proteínas após administração de AF, conforme a figura 5. Constatou-se que nos tecidos estudados, os animais que sofreram a indução da sepse, tiveram um maior dano oxidativo comparado ao grupos sham. Entretanto o tratamento com AF não foi eficaz na diminuição do dano oxidativo em proteínas.
Figura 5- Carbonilação proteica no hipocampo (A) e córtex pré-frontal (B) de ratos submetidos à sepse e tratados com AF (10 mg/kg). Dados expressos como média ± desvio-padrão, analisados por ANOVA de uma via com post hoc de Tukey.* p<0,05 em relação ao grupo sham+água e # p<0,05 em relação ao grupo CLP+água.
A figura 6 apresenta os dados referentes à análise de sobrevida durante os 10 dias de acompanhamento após indução da sepse. O animais do grupo sham+água tiveram 100% de sobrevida e sham+AF tiveram a sobrevida de 92%. Os ratos do grupo CLP+água apresentaram a menor sobrevida, de 35%, seguido do grupo CLP+ AF que apresentou sobrevida de 59% ao final de 10 dias de observação após a sepse.
Verificou-se portanto que houve uma diminuição significativa da sobrevida quando comparado o grupo CLP+água com sham+água e um aumento significativo quando comparado CLP+AF com CLP+água.
Figura 6- Curva de sobrevida de animais submetidos sepse e tratados com AF, seguimento de 10 dias. Dados analisados por long-rank. *p<0,05 em relação ao grupo sham+água e # p<0.05 em ralação ao grupo CLP+água. D ia s S o b r e v id a % 0 5 1 0 1 5 0 5 0 1 0 0 s h a m + H 2 O C L P + H 2 O s h a m + A F C L P + A F * #
5. DISCUSSÃO
O presente estudo contribui para o entendimento do papel neuroprotetor do AF, avaliado por meio de parâmetros bioquímicos, quebra da BHE e análise da sobrevida, em um modelo de animal de sepse polimicrobiana. Especificamente, demonstrou-se que o AF atuou nas estrututuras cerebrais estudadas, protegendo contra a permeabilidade da BHE, diminuindo a neuroinflamação, o dano oxidativo a lipídios e como consequencia, no aumento da sobrevida.
Sabe-se que a inflamação sistêmica ocasionada pela sepse pode levar a alte-rações neurológicas121, e o desenvolvimento dessas alterações é uma condição que contribui para a sua elevada taxa de mortalidade48. Níveis circulantes de citocinas pró-inflamatórias aumentam consideravelmente na sepse, e como consequencia, podem sinalizar celulas do SNC, com a permeabilidade da BHE, acentuando o estresse oxidativo cerebral121, 122.
O desenvolvimento de um insulto estressante, como na sepse, leva a uma deterioração do estado vitamínico123. O efeito prejudicial sobre o sistema de defesa antioxidante é mais pronunciado em animais com deficiência isolada de vitaminas C, complexo B, A, E. A adição de vitaminas restaura o desempenho do sistema antioxidante. Assim, o papel das vitaminas na prevenção de estressores é evidente124. O AF ou Vitamina B9, em contrapartida, pode eliminar os radicais livres oxidantes125, além de auxiliar na preservação da integridade neuronal95, com isso sua suplementação pode otimizar reparo no SNC adulto97.
Sabe-se que o aumento do aminoácido homocisteina na circulação sanguínea pode estar associado a uma maior produção de EROs, devido a sua capacidade de gerar ânions superóxidos126 e possivelmente à redução das defesas antioxidantes127, favorecendo assim o aumento do estresse oxidativo. O AF está envolvido na redução dos níveis de homocisteína, visto que atua como co-fator no seu metabolismo126.
Em estudo desenvolvido por Pravenec e colaboradores128 que analisou a deficiência de folato na patogênese da síndrome metabólica e estresse oxidativo em ratos, concluiu que a deficiência de AF causou hiper-homocisteinemia e dano oxidativo no fígado, rins e coração. Também que a dieta deficiente em AF induziu a diminuição dos níveis de atividade das enzimas antioxidantes CAT, SOD e glutationa
e aumento da taxa de peroxidação lipidica, o que poderia estar contribuindo ainda mais para a patogênese do estresse oxidativo.
A BHE é uma estrutura com a finalidade de regular a passagem de substâncias do sangue para o SNC63,129. As toxinas bacterianas não conseguem atravessar facilmente a barreira, porém isso ocorre quando há alteração da sua permeabilidade. Essas alterações podem ser explicadas pela disfunção de seus componentes. Quando há disfunção das células endoteliais, afetando as proteínas constituintes das junções apertadas, há diminuição da integridade da BHE129, o que pode levar a expo-sição dos tecidos cerebrais a substâncias nocivas63.
Nesta pesquisa, observou-se que os ratos apresentaram um aumento na permeabilidade da BHE tanto no hipocampo, como no córtex pré-frontal. Estruturas em que se verifica o aumento da permeabilidade da barreira em 24 horas após a indução da sepse, por possuirem maior número de receptores para citocinas59. Esses resultados corrobaram com os resultados encontrados em estudo realizado por Danielski e colaboradores15 e Della Giustina e colaboradores14, em que houve aumento da permeabilidade da BHE nos tecidos do córtex pré-frontal e no hipocampo após indução da sepse. Em nosso estudo, o AF atuou diminuindo a permeabilidade da barreira, diminuindo assim a entrada de substâncias tóxicas no cérebro e a resposta inflamatória local, possivelmente pela diminuição do estresse oxidativo frente às células que compõem a barreira.
Em decorrência do aumento da permeabilidade da BHE, ocorre a entrada de substâncias neurotóxicas para o parênquima cerebral, com infiltração de leucócitos e ativação posterior da microglia, promovendo um aumento excessivo de mediadores inflamatórios e de EROs e consequentemente, dano neuronal129. No presente estudo observou-se que em 24 horas após a indução da sepse, houve aumento da atividade da MPO nas estruturas estudadas, corroborando estudos prévios14,15,130.
Cabe ressaltar que a atividade da MPO é um indicativo do infiltrado de neutrófilos nos tecidos lesionados, e que ela tem papel fundamental na produção de EROs130 e, portanto, o AF se mostrou efetivo na diminuição da atividade da enzima novamente, via ação frente a tais espécies. Essa diminuição vem ao encontro do trabalho de Barichello e colaboradores17, que verificaram que a MPO teve uma redução da sua atividade no hipocampo, em animais submetidos a meningite que receberam tratamento com AF, em relação ao grupo que recebeu solução salina.
A fisiopatologia da sepse envolve uma produção maciça de NO, e o aumento considerável do nitrito/nitrato é um indicador de degradação dessa substância e formador de ERNs131. Analisando as concentrações de nitrito/nitrato nos tecidos estudados em 24 horas após a indução de sepse, não houveram diferenças estatisticamente significativas entre os animais com sepse e os controles, como também o AF não demostrou redução nos níveis dessas substâncias, possivelmente pela resposta ser exclusiva de EROs e não de ERNs.
O SNC é especialmente vulnerável aos efeitos deletérios do estresse oxidativo, devido à presença de ácidos graxos poli-insaturados, constituintes das membranas neuronais, que podem ser alvos das EROs77. Nossos resultados demonstraram que os radicais livres gerados durante a sepse induziram a um aumento do nivel de peroxidação lipídica e oxidação de proteínas nas estruturas cerebrais estudadas. O que corroba com estudo realizado por Della Giustina e colaboradores14 e Danielski15 que também encontraram uma maior taxa de oxidação dessas moléculas 24 horas após indução da sepse. Entretanto, nesse estudo apenas no hipocampo a administração do AF propiciou um menor dano oxidativo a lipídios.
Em pesquisa que analisou a ação do AF sobre o dano oxidativo no hipocampo e no córtex frontal 10 dias após a indução da meningite pneumocócica, constatou que os níveis de oxidação de lípidios diminuiu no hipocampo dos animais infectados que receberam tratamento adjuvante de AF, em comparação com o grupo que recebeu solução salina17. Adicionalmente, Joshi e colaboradores125 concluíram que o AF pode proteger os bioconstituintes das moléculas dos danos causados pelos radicais livres, atuando, entre outros fatores, na inibição da peroxidação lipídica.
Todos os parâmetros discutidos ate o momento participam do desenvolvimento da encefalopatia séptica, clinicamente caracterizada por mudanças no status mental e que pode estar presente em mais de 70% dos pacientes132. Mesmo que apresentação dos sintomas da encefalopatia séptica seja precoce, esse evento pode contribuir para a ocorrência de déficit cognitivo prolongado133. Evidências tem demonstrado envolvimento na degeneração neuronal na encefalopatia séptica, e estes pacientes apresentam uma elevada taxa de mortalidade134. Verificamos, portanto, que o efeito protetor de AF sobre a permeabilidade da BHE, atividade da MPO e dano em lipídios nas estruturas cerebrais pode ter contribuido para um aumento da sobrevida nos animais submetidos à sepse.
6. CONCLUSÃO
A sepse causou aumento da permeabilidade da BHE, elevação dos níveis da atividade da enzima MPO e da oxidação de lipídios e proteínas no hipocampo e córtex pré-frontal de ratos com diminuição da sobrevida nesses animais. A administração do AF foi eficaz na preservação da quebra da BHE, diminuição da neuroinflamação, consequentemente houve diminuição do estresse oxidativo nos tecidos estudados com aumento da sobrevida dos animais. Visto que, o ácido fólico demonstrou efeito protetor de forma a diminuir a permeabilidade da BHE, diminuindo, com isso, a entrada de neutrófilos no parênquima cerebral.
6.1 PERSPECTIVAS FUTURAS
Com a realização dessa pesquisa concluiu-se que a administração do AF foi eficaz na diminuição da neuroinflamação, e assim do estresse oxidativo nos tecidos cerebrais estudados. Entretanto, estudos utilizando o AF no combate ao estresse oxidativo ainda são escassos. Sugere-se, para futuras pesquisas, verificar a proteção do AF contra o estresse oxidativo em órgãos periféricos.
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