FIGURA 13. Distribuição dos pacientes com adenocarcinoma gástrico por faixa etária.
A Tabela 5 mostra as variáveis morfológicas dos tumores gástricos analisados.
Tabela 5. Variáveis morfológicas dos adenocarcinomas gástricos.
Parâmetros morfológicos N (%)
Tamanho ≤ 3 cm 21 (24,1) > 3 cm 66 (75,9) Tipo histológico
(Classificação de Lauren) Difuso 28 (32,2) Intestinal 59 (67,8) Localização Cárdia 29 (33,3) Antro 38 (43,7) Corpo
Infiltrado inflamatório Leve Moderado Intenso 20 (23,0) 5 (5,7 ) 73 (84,0) 9 (10,3) N = números de casos
DISTRIBUIÇÃO POR IDADE
0 0 1 2 15 16 29 19 0 5 10 15 20 25 30 35 N 0 a 10 11 a 20 21 a 30 31 a 40 41 a 50 51 a 60 61 a 70 71 a 80 81 a 90 91 a 100
Segundo a classificação de Lauren, os adenocarcinomas gástricos foram classificados nos tipos intestinal e difuso. A Figura 14A mostra um adenocarcinoma de tipo intestinal e a Figura 14B um adenocarcinoma de tipo difuso.
Figura 14: Adenocarcinoma gástrico segundo a Classificação de Lauren. A: adenocarcinoma de tipo intestinal. H-E 400x
B: adenocarcinoma de tipo difuso (células em anel de sinete). H-E 400x
4.2 Interpretação Imuno-histoquímica
O padrão de positividade para os anticorpos primários da família Bcl-2 foi o aparecimento de coloração marrom-acastanhada às vezes finamente granular no citoplasma das células nos adenocarcinomas e na mucosa gástrica não tumoral. (52,53)
A imuno-expressão nuclear da proteína p53 e da proteína Ki-67 foi considerada positiva nos adenocarcinomas e na mucosa gástrica não tumoral.
A imuno-expressão da proteína caspase 3 foi considerada positiva no citoplasma das células e corpos apoptóticos marcados nos adenocarcinomas e na mucosa gástrica não tumoral.
As microfotografias a seguir mostram exemplos de expressão das proteínas Bak, Bad, Bax, Bcl-xl, Bcl-2, p53, Ki-67 e caspase 3 clivada em adenocarcinomas gástricos e em mucosa gástrica não tumoral.
Figura 15: Fotomicrografia demonstrando
a expressão positiva citoplasmática da proteína Bak em adenocarcinoma gástrico. 400x
Fotomicrografia demonstrando a expressão positiva citoplasmática da proteína Bak em mucosa gástrica não
tumoral. 400x
410x
Figura 16: Fotomicrografia demonstrando a expressão positiva citoplasmática da proteína Bad em adenocarcinoma gástrico. 400x
Fotomicrografia demonstrando a expressão positiva citoplasmática da proteína Bad em mucosa gástrica não
tumoral. 400x
Figura 17: Imuno-expressão positiva
citoplasmática da proteína Bax em
adenocarcinoma gástrico.
400x
Figura 18: Imuno-expressão positiva citoplasmática da proteína Bcl-xl em
adenocarcinoma gástrico.
400x
Figura 19 Imuno-expressão positiva citoplasmática da proteína Bcl-2 em
adenocarcinoma gástrico. 400x
Imuno-expressão positiva citoplasmática da proteína Bax em mucosa gástrica não
tumoral. 400x
Imuno-expressão positiva citoplasmática da proteína Bcl-xl em mucosa gástrica não
tumoral. 400x
Imuno-expressão positiva citoplasmática da proteína Bcl-2 em mucosa gástrica não
Figura 20: Imuno-expressão positiva nuclear
da proteína p53em adenocarcinoma
gástrico. 400x
Figura 20: Imuno-expressão positiva nuclear da proteína Ki-67 em adenocarcinoma gástrico. 400x
Imuno-expressão positiva nuclear da proteína
p53 em mucosa gástrica não tumoral. 400x
Imuno-expressão positiva nuclear da proteína
Ki-67 em mucosa gástrica não tumoral.
Figura 22 A: Imuno-expressão positiva da proteína 22 B: Imuno-expressão positiva da proteína
caspase 3 clivada em adenocarcinoma gástrico. Caspase 3 clivada em mucosa gástrica não
400x tumoral. 400x
Figura 23: Caspase 3 clivada: Fotomicrografias com exemplos de digitalização da imagem, para contagem das células imuno-expressas (apoptóticas).
Durante o processo de construção do TMA e durante os cortes histológicos para a realização da técnica imuno-histoquímica, ocorreram perdas e esgotamento de tecidos da mucosa e do tumor.
Ocorreram perdas de tecido tumoral para as proteínas Bad (1 caso), Bak (2 casos), Bax (1 caso), Bcl-2 (1 caso), Bcl-xl (1 caso), Ki-67 (1 caso), Caspase 3 (1 caso). Não houve perda de tecido para a proteína p53.
Ocorreram perdas de tecido de mucosa gástrica para as proteínas: Bad (3 casos), Bak (2casos), Bax (2 casos), Bcl-2 (2casos), Bcl-xl (2 casos), Ki-67 (2 casos), p53 (2 casos), Caspase 3 (2 casos)
A Tabela 6 mostra os resultados imuno-histoquímicos no adenocarcinoma e na mucosa gástrica não tumoral.
Tabela 6 Resultados imuno-histoquímicos no adenocarcinoma gástrico e
mucosa gástrica não tumoral.
Proteínas N Negativo N (%) Positivo N (%)
Tumor Bcl-2 84 81 (95,2) 3 (4,8 ) Bcl-xl 84 10 (11,9) 74 (88,1) Bax 84 18 (21,4) 66 (78,6) Bak 83 64 (77,1) 19 (22,9) Bad 83 36 (43,3) 47 (56,7) P53 Ki-67 Caspase 3 clivada 86 84 84 49 (56,9) 19 (22,6) 17 (20,2) 37 (43,1) 65 (77,4) 67 (79,8) Mucosa Bcl-2 84 83 (98,8) 1 ( 1,2 ) Bcl-xl 84 21 (25,0) 63 (75,0) Bax 84 25 (29,7) 59 (70,3) Bak 83 21 (25,3) 62 (74,7) Bad 83 8 ( 9,6) 75 (90,4) P53 Ki-67 Caspase 3 clivada 86 84 84 84 (97,6) 32 (38,1) 53 (63,1) 2 ( 2,4) 52 (61,9) 31 (36,9)
As Tabelas 7 e 8 e os anexos 21 a 32 mostram os resultados da análise estatística das correlações da expressão das proteínas Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bad, Bak, p53, Ki-67 e caspase 3 clivada no tumor e na mucosa gástrica não tumoral,segundo a idade, sexo, tamanho do tumor, infiltrado inflamatório, tipo histológico (classificação de Lauren), grau de invasão, metástases para linfonodos e estádio TNM. O anexo 33 mostra o gráfico de correlação entre o índice apoptótico e o índice mitótico.
Tabela 7: Resultados da associação das proteínas estudadas no adenocarcinoma com
as variáveis clínicas e patológicas.
Bcl-2 Bcl-xl Bax Bad Bak p53 Ki-67 Cas3
Idade <=50 NS NS NS NS NS NS NS NS >50 NS NS NS 0,021 0,026 NS NS NS Sexo Masculino NS NS NS NS NS NS NS NS Femenino NS NS NS NS NS NS NS NS Tamanho <3 NS NS NS NS NS NS NS NS >3 NS NS NS NS NS 0,046 NS NS Inf.Inflamatorio Moderado NS NS NS NS NS NS 0,023 NS Intenso NS NS NS NS NS NS NS NS Leve NS NS NS NS NS NS NS NS Lauren Int NS NS 0,001 0,001 NS NS 0,002 NS Dif NS NS NS NS NS NS NS NS Estádio Precoce NS NS NS NS NS NS NS NS Avançado NS NS NS NS NS NS NS NS Linfonodos Comprometidos NS NS NS NS NS NS NS NS Não comprome NS NS NS NS NS NS NS NS TNM T1 NS NS NS NS NS NS NS NS T2 NS NS NS NS NS NS NS NS T3T4 NS NS NS NS NS NS NS NS
Tabela 8: Resultados da associação das proteínas estudadas na mucosa não tumoral
com as variáveis clínicas e patológicas.
Bcl-2 Bcl-xl Bax Bad Bak p53 Ki-67 Casp3
Idade <=50 NS NS 0,021 NS 0.026 NS NS NS >50 NS NS NS NS NS NS NS NS Sexo Masculino NS NS NS NS NS NS NS NS Femenino NS NS NS NS NS NS NS NS Inf.Inflamatorio Moderado NS NS NS NS NS NS NS NS Intenso NS NS NS NS NS NS NS NS Leve NS NS NS NS NS NS NS NS Lauren Intestinal NS NS NS NS NS NS NS NS Difuso NS NS NS NS NS NS NS NS Estádio Precoce NS NS NS NS NS NS NS NS Avançado NS NS NS NS NS NS NS NS Linfonodos Comprometidos NS 0,016 NS NS NS NS NS NS Não comprome NS NS NS NS NS NS NS NS TNM T1 NS NS NS NS NS NS NS NS T2 NS NS NS NS NS NS NS NS T3 T4 NS NS NS NS NS NS NS NS
As Tabelas 9 e 10 contêm os resultados da análise da correlação entre as proteínas Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bad, Bak, p53, ki-67 e caspase 3 no adenocarcinoma e na mucosa gástrica não tumoral dos 87 pacientes da amostra.
Tabela 9 – Correlação entre os marcadores por IHQ no adenocarcinoma
Proteínas –
Tumor Bcl-xl Bax Bad Bak p53 ki-67 Caspase-3
Bcl-2 rs = -0,04 p = 0,743 n = 84 rs = -0,17 p = 0,130 n = 84 rs = 0,13 p = 0,233 n = 84 rs = -0,01 p = 0,905 n = 83 rs = 0,14 p = 0,214 n = 85 rs = 0,02 p = 0,880 n = 84 rs = -0,09 p = 0,393 n = 84 Bcl-xl --- rs = 0,18 p = 0,093 n = 85 rs = 0,40 p < 0,001 * n = 85 rs = 0,42 p < 0,001 * n = 85 rs = 0,45 p < 0,001 * n = 86 rs = 0,23 p = 0,031 * n = 85 rs = 0,19 p = 0,081 n = 85 Bax --- --- rs = 0,21 p = 0,047 * n = 86 rs = -0,01 p = 0,928 n = 85 rs = 0,03 p = 0,751 n = 86 rs = 0,32 p = 0,002 * n = 86 rs = 0,14 p = 0,199 n = 85 Bad --- --- --- rs = 0,39 p < 0,001 * n = 85 rs = 0,07 p = 0,535 n = 86 rs = 0,22 p = 0,045 * n = 86 rs = 0,25 p = 0,020 * n = 85 Bak --- --- --- --- rs = 0,14 p = 0,206 n = 85 rs = -0,03 p = 0,802 n = 85 rs = 0,17 p = 0,125 n = 84 p53 --- --- --- --- --- rs = 0,35 p = 0,001 * n = 86 rs = 0,05 p = 0,642 n = 86 Ki-67 --- --- --- --- --- --- rs = 0,23 p = 0,234 n = 81 * Correlações estatisticamente significantes ao nível de significância 5%
Tabela 10 – Correlação entre os marcadores por IHQ na mucosa não tumoral Proteínas –
Tumor Bcl-xl Bax Bad Bak p53 ki-67 Caspase-3
BCL-2 rs = 0,08 p = 0,488 n = 85 rs = 0,04 p = 0,715 n = 85 rs = 0,01 p = 0,960 n = 84 rs = 0,06 p = 0,570 n = 85 rs = 0,21 p = 0,057 n = 86 rs = 0,04 p = 0,689 n = 85 rs = 0,09 p = 0,398 n = 85 Bcl-xl --- rs = 0,19 p = 0,083 n = 84 rs = 0,07 p = 0,526 n = 84 rs = -0,02 p = 0,880 n = 85 rs = 0,16 p = 0,143 n = 85 rs = 0,15 p = 0,169 n = 84 rs = -0,06 p = 0,598 n = 84 Bax --- --- rs = 0,33 p = 0,002 * n = 83 rs = 0,34 p = 0,002 n = 84 rs = 0,19 p = 0,086 n = 85 rs = 0,32 p = 0,003 * n = 84 rs = 0,22 p = 0,045 * n = 84 Bad --- --- --- rs = 0,54 p < 0,001 * n = 84 rs = 0,05 p = 0,647 n = 84 rs = 0,13 p = 0,258 n = 83 rs = 0,10 p = 0,362 n = 83 Bak --- --- --- --- rs = -0,06 p = 0,566 n = 85 rs = 0,03 p = 0,764 n = 84 rs = -0,00 p = 0,993 n = 84 p53 --- --- --- --- --- rs = 0,37 p < 0,001 * n = 85 rs = 0,16 p = 0,134 n = 85 Ki-67 --- --- --- --- --- --- rs = 0,20 p = 0,064 n = 84
* Correlações estatisticamente significantes ao nível de significância 5%
A Tabela 11 desenvolve os resultados da comparação da expressão das proteínas Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bad, Bak, p53, Ki-67 e caspase 3 clivada entre o adenocarcinoma e a mucosa dos 87 pacientes analisados.
Tabela 11 – Comparação da expressão dos marcadores relacionados, entre a mucosa
e o adenocarcinoma.
Marcadores Tumor Mucosa Normal Comparação
Bcl-2 – n (%) n = 84 n = 84 0 72 (85,7%) 76 (90,5%) 1 3 ( 3,6%) 3 ( 3,6%) 2 2 ( 2,4%) 3 ( 3,6%) 3 4 ( 4,8%) 1 ( 1,2%) 6 3 ( 3,6%) 1 ( 1,2%) p = 0,211 Bcl-xl – n (%) n = 84 n = 84 1 0 ( 0,0%) 1 ( 1,2%) 3 10 (11,9%) 20 (23,8%) 4 0 ( 0,0%) 2 ( 2,4%) 6 31 (36,9%) 49 (58,3%) 9 43 (51,2%) 12 (14,3%) p < 0,001 * Bax – n (%) n = 84 n = 84 0 7 ( 8,3%) 4 ( 4,8%) 1 0 ( 0,0%) 2 ( 2,4%) 2 3 ( 3,6%) 5 ( 6,0%) 3 8 ( 9,5%) 14 (16,7%) 4 1 ( 1,2%) 3 ( 3,6%) 6 34 (40,5%) 43 (51,2%) 9 31 (36,9%) 13 (15,5%) p = 0,058 Bad – n (%) n = 83 n = 83 0 3 ( 3,6%) 1 ( 1,2%) 1 1 ( 1,2%) 0 ( 0,0%) 2 4 ( 4,8%) 2 ( 2,4%) 3 28 (33,7%) 5 ( 6,0%) 4 0 ( 0,0%) 7 ( 8,4%) 6 35 (42,2%) 42 (50,6%) 9 12 (14,5%) 26 (31,3%) p < 0,001 * (continua)
Tabela 11 (continuação)
Marcadores Tumor Mucosa Comparação
Bak – n (%) n = 83 n = 83 0 10 (12,0%) 1 ( 1,2%) 1 1 ( 1,2%) 0 ( 0,0%) 2 4 ( 4,8%) 5 ( 6,0%) 3 49 (59,0%) 15 (18,1%) 4 2 ( 2,4%) 6 ( 7,2%) 6 15 (18,1%) 47 (56,6%) 9 2 ( 2,4%) 9 (10,8%) p < 0,001 * p53 – n (%) n = 86 n = 86 0 36 (41,9%) 73 (84,9%) 1 4 ( 4,7%) 7 ( 8,1%) 2 8 ( 9,3%) 3 ( 3,5%) 3 1 ( 1,2%) 1 ( 1,2%) 4 7 ( 8,1%) 2 ( 2,3%) 6 9 (10,5%) 0 ( 0,0%) 9 21 (24,4%) 0 ( 0,0%) p < 0,001 * Ki-67 – n (%) n = 84 n = 84 0 19 (22,6%) 32 (38,1%) 1 7 ( 8,3%) 14 (16,7%) 2 10 (11,9%) 12 (14,3%) 3 6 ( 7,1%) 3 ( 3,6%) 4 13 (15,5%) 11 (13,1%) 6 13 (15,5%) 10 (11,9%) 9 16 (19,0%) 2 ( 2,4%) p < 0,001 * CASPASE 3 – n (%) n = 84 n = 84 0 17 (20,2%) 53 (63,1%) 1 38 (45,2%) 24 (28,6%) 2 21 (25,0%) 6 ( 7,1%) 3 8 ( 9,5%) 1 ( 1,2%) p < 0,001 *
A Figura 24 mostra a curva de sobrevida de Kaplan-Meier de 68 pacientes portadores de adenocarcinoma gástrico. Desta análise, não fizeram parte 19 pacientes perdidos no seguimento.
Observamos que a probabilidade de sobrevida após 1 ano da cirurgia, foi de aproximadamente 70% e após 5 anos da cirurgia foi de aproximadamente 45%.
Tabela 12 – Sobrevida segundo marcação das proteínas no adenocarcinoma Eventos Tempo de Sobrevida Proteína Pacientes Óbitos Censuras média IC95% Teste de Logrank (p) Bcl-2 negativo 49 18 (36,7%) 31 (63,3%) 3,3 [2,6; 4,0] Bcl-2 positivo 2 1 (50,0%) 1 (50,0%) 5,3 [3,6; 6,9] --- Bcl-xl negativo 3 1 (33,3%) 2 (66,7%) 1,2 [0,3; 2,1] Bcl-xl positivo 47 17 (36,2%) 30 (63,8%) 3,9 [2,9; 4,8] --- Bax negativo 11 2 (18,2%) 9 (81,8%) 4,4 [3,2; 5,6] Bax positivo 40 17 (42,5%) 23 (57,5%) 3,3 [2,3; 4,4] 0,101 Bad negativo 24 8 (33,3%) 16 (66,7%) 3,4 [2,3; 4,5] Bad positivo 27 11 (40,7%) 16 (59,3%) 3,7 [2,6; 4,9] 0,877 Bak negativo 39 12 (30,8%) 27 (69,2%) 4,1 [3,1; 5,1] Bak positivo 11 6 (54,5%) 5 (45,5%) 2,6 [1,3; 4,0] 0,148 p53 negativo 26 8 (30,8%) 18 (69,2%) 4,3 [3,0; 5,5] p53 positivo 25 11 (44,0%) 14 (56,0%) 2,8 [1,9; 3,8] 0,399 ki-67 negativo 23 9 (39,1%) 14 (60,9%) 2,4 [1,6; 3,1] ki-67 positivo 28 10 (35,7%) 18 (64,3%) 4,1 [2,9; 5,2] 0,439 Caspase-3 negativo 35 13 (37,1%) 22 (62,9%) 3,8 [2,7; 4,9] Caspase-3 positivo 15 6 (40,0%) 9 (60,0%) 3,3 [2,1; 4,6] 0,948
Não foram aplicados testes estatísticos para as curvas de Bcl-2 e Bcl-xl devido ao pequeno número de pacientes com marcação positiva e negativa respectivamente.
Figura 25. Curva de sobrevida segundo a marcação da proteína Bax no adenocarcinoma.
Figura 26. Curva de sobrevida segundo a marcação da proteína Bad no adenocarcinoma. 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo de seguimento (anos)
Bax Positivo Negativo p=0,101 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo de seguimento (anos)
Bad
Negativo Positivo
p=0,877
Probabilidade - Sobrevida Global
Figura 27. Curva de sobrevida segundo a marcação da proteína Bak no adenocarcinoma.
Figura 28. Curva de sobrevida segundo a marcação da proteína p53 no adenocarcinoma. 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo de seguimento (anos)
Bak Negativo Positivo p=0,148 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo de seguimento (anos)
p53
Positivo Negativo
p=0,399
Probabilidade - Sobrevida Global
Figura 29. Curva de sobrevida segundo a marcação da proteína Ki-67 no adenocarcinoma.
Figura 30. Curva de sobrevida segundo a marcação da proteína Caspase 3 no adenocarcinoma. 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo de seguimento (anos)
Ki-67 Negativo Positivo 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tempo de seguimento (anos)
Caspase-3 clivada Negativo Positivo
p=0.439
p=0,948
Probabilidade - Sobrevida Global
Tabela 13- Resumo da imuno-expressão dos marcadores estudados na mucosa não
tumoral e no tumor de pacientes com adenocarcinoma gástrico.
Marcadores Mucosa não tumoral Tumor
Bcl-2 ↓ ↑ Bcl-xl * ↓ ↑ Bax ↓ ↑ Bad* ↑ ↓ Bak * ↑ ↓ Caspase-3 clivada* ↓ ↑ Ki-67* ↓ ↑ p53* ↓ ↑
5 DISCUSSÃO
O câncer gástrico é uma das doenças mais comuns que afeta a população mundial e é uma das principais causas de morte natural, superada somente pelas doenças cardio-vasculares. No Brasil é a segunda causa de morte por câncer entre os homens e a quarta entre as mulheres. Este câncer pode ser curado através de cirurgia tradicional, quando detectado em fase precoce.
Estudos para determinar as diferenças genéticas entre tumores iniciais e avançados, assim como os de crescimento lento ou rápido, contribuíram na escolha dos tratamentos de maior ou menor agressividade. A procura de um marcador de prognóstico eficiente para os pacientes portadores de câncer gástrico tem levado inúmeros pesquisadores a estudar uma gama enorme de possíveis marcadores. Esta descoberta permitiria discriminar com maior clareza pacientes que seriam favorecidos com a cirurgia, a cirurgia associada a quimioterapia, tratamentos mais agressivos ou protocolos experimentais.
Este estudo teve, portanto, o objetivo de contribuir para o conhecimento das alterações moleculares do adenocarcinoma gástrico que possam auxiliar na avaliação prognóstica de doentes. Para isso foram utilizados métodos de natureza morfológica e imuno-histoquímica.
Avaliamos pela técnica de imuno-histoquímica tecido neoplásico e tecido da mucosa não tumoral das margens cirúrgicas, de 87 pacientes com adenocarcinoma gástrico. Destes, 51 (58,6%) eram do sexo masculino e 36 (41,4%) do sexo feminino, demonstrando maior incidência de câncer gástrico no sexo masculino, como descrito na literatura (80, 82, 83, 84)
Tanto o tabagismo como o etilismo são fatores associados ao desenvolvimento do adenocarcinoma gástrico. (80, 81) Dados estatísticos demonstram que ambos os hábitos são mais comuns no sexo masculino, o que pode explicar a maior freqüência do câncer gástrico nesse sexo.
A idade variou de 29 a 85 anos, com a média de aproximadamente 62 anos e a mediana de 63, concordando com os resultados de outros estudos. (80, 83, 85, 123)
Encontramos 13 (14,9%) pacientes no estadiamento clínico I, 15 (17,2%) no estadiamento II, 58 (66,7%) no estadiamento III e 1 (1,2%) no estadiamento IV. Aproximadamente 85% dos doentes apresentavam tumores avançados. Ao final do
estudo, 51 (58,6%) pacientes tinham morrido pelo câncer, apenas 17 (19,5%) estavam vivos e 19 (21,8%) tinham perdido o seguimento por motivos diversos.
Oshima et al, em 1999 encontraram 22 (31,0%) pacientes no estadiamento clínico III e 14 (19,72%) no estadiamento IV, sendo que aproximadamente 50,0% dos doentes apresentavam tumores avançados. Ao final do estudo 38 (55,88%) pacientes estavam vivos e 30 (44,12%) haviam falecido por causa do câncer. (86)
Tabela 14. Quadro comparativo de estadiamento clínico de câncer gástrico em países desenvolvidos e em desenvolvimento.
Estádio IA IB II IIIA IIIB IV
País (Ref.) EUA (122) 78,0% 58,0% 34,0% 20,0% 8,0% 7,0% Corea (71) 49,7% 19,3% 23,0% 8,0% Espanha (97) 4,0% 8,0% 31,0% 18,0% 21,0% 18,0% Brasil (75) 11.5% 8,6% 24,2% 17,2% 24,3% 4,3% Brasil (121) (ignor. 9,1%) 11,3% 8,3% 12,2% 23,0% 16,1% 20,0%
Como visto na tabela 14 estes resultados demonstram que ainda nos países em desenvolvimento o câncer de estômago é muito freqüente e é diagnosticado em estádios avançados em relação aos países desenvolvidos. No mundo, observa-se declínio da incidência do câncer gástrico, porém este declínio é menos evidente em países com baixa incidência, como nos EUA, enquanto que, nos países com alta incidência como o Japão, o declínio é evidente. (2, 104)
Quanto ao tamanho dos tumores estudados, aproximadamente, 76% eram maiores que 3 cm e correspondiam aos estádios más avançados, estando de acordo com o estudo de Zheng et al, em 2003.(82)
Jun et al, em 2008, estudaram a relação entre tamanho do tumor e sobrevida, em 973 pacientes com de adenocarcinoma gástrico, e observaram que nos estádios I e II o tamanho do tumor comportou-se como fator independente do prognóstico. Houve diferença significante entre os pacientes com tumores grandes e pequenos em relação à profundidade de
invasão do tumor, número de linfonodos comprometidos e estádio. O valor de corte para grandes tumores foi de 3,5cm, medida que pode ser utilizada como o valor limite mais baixo de correlação com o prognóstico. (88)
Saito et al, em 2006 estudaram 1473 pacientes com adenocarcinoma gástrico e relataram que o tamanho do tumor estava relacionado com a profundidade de invasão, comprometimento de linfonodos e poderia ser utilizado como indicador de prognóstico de câncer gástrico. (89)
Em relação ao comprometimento de linfonodos, na nossa casuística observamos que 63 (72,4%) casos, apresentavam comprometimento neoplásico, dado semelhante ao de Isobe et al, em 2004. (83) que encontraram 86 (58%) casos com comprometimento neoplásico e ao de Ohno et al. (90) que encontraram 51 (58%) pacientes com linfonodos comprometidos.
Cheong et al, em 2008, relataram que pacientes portadores de adenocarcinoma gástrico com linfonodos comprometidos, com tamanho igual ou maior que 2 cm, estavam associados com pior prognóstico. O número de linfonodos comprometidos também é considerado um indicador prognóstico. (91) Em nosso estudo, observamos que 35% dos pacientes apresentavam de 1 a 6 linfonodos comprometidos (N1), 24% de 7 a 15 linfonodos (N2) e 11,4% mais de 15 linfonodos comprometidos (N3).
Kodera et al, em 1998 relataram que o número de linfonodos comprometidos comportava-se como importante indicador prognóstico no câncer gástrico. (92) Folli et al, em 2001 correlacionaram o comprometimento neoplásico de linfonodos no câncer gástrico precoce, observando que pacientes em estádio I não apresentaram comprometimento neoplásico. A sobrevida de 5 anos em pacientes sem comprometimento neoplásico foi de 95% N0, de 77% em N1 e 60% em N2. (93)
Em nosso estudo, encontramos comprometimento de linfonodos em 3 pacientes com estádio pT1a e 2 pacientes com estádio pT1b, demonstrando que em estádios precoces o comprometimento neoplásico é menos freqüente e que o número de linfonodos comprometidos é importante fator prognóstico.
Na presente casuística, 46% dos casos foram submetidos à gastrectomia total e 54% subtotal; em 89,7% dos casos a margem estava livre e 10,3%. Segundo a classificação histológica de Lauren, encontramos 32,2% de tumores do tipo difuso e 67,8% do tipo intestinal. Alguns estudos demonstram valores semelhantes e outros apontam ao contrario, como observado na tabela 15.
Tabela 15. Quadro comparativo de frequências de acometimento de câncer gástrico segundo a classificação de Lauren em vários estudos.
Tipo intestinal Tipo difuso Misto
Krajewska et al, 1996 (56)
52% 41% 7% Van der Woude et al, 2003. (94) 59% 41%
Zheng et al, 2003. (87) 32% 50% 18% Barressi et al, 2006. (95) 67% 20% 13%
Segundo a literatura, o tumor gástrico do tipo difuso possui maior incidência em mulheres e jovens, apresentando pior prognóstico. O tipo intestinal acomete com maior freqüência indivíduos do sexo masculino e é menos agressivo. (18) Assim, podemos justificar a maior freqüência de tumores do tipo intestinal em nosso estudo, pois 58,6% dos pacientes eram do sexo masculino.
O câncer gástrico devido a sua heterogeneidade tem sido um interessante modelo para o estudo da carcinogênese molecular.
A técnica de TMA (Arranjo em matriz de amostras teciduais) é ferramenta eficiente para a patologia investigativa aplicada, permitindo o uso de vários métodos, como a imuno-histoquímica. O TMA permite conhecer a expressão protéica em centenas de amostras de tecidos com uma única reação, facilitando a interpretação e comparação da reação entre os diferentes tecidos e células. Permite também avaliar a especificidade e sensibilidade dos anticorpos em estudo.
Um dos objetivos da presente pesquisa foi introduzir esta técnica para avaliar a expressão protéica de algumas proteínas da família Bcl-2 e validar o método para futuras pesquisas.
De acordo com a literatura, o bloco gerado pela técnica é útil enquanto as perdas das amostras forem menores que 20% e considerado excelente quando apresentam mais de 95% de aproveitamento. (77) Neste estudo, foi observada perda ou escassa representação de 13% de tecidos de mucosa não tumoral e 9,1% de tecido tumoral, estando, portanto, a porcentagem de perda dentro dos limites considerados aceitáveis para sua utilização. Após a construção do bloco complementar constituído pelos casos com escassa ou nenhuma representação de material, foi
observado apenas a perda de 2% de tecido de mucosa não tumoral e 1% de tecido tumoral, demonstrando uma porcentagem excelente de aproveitamento do material proveniente dos blocos doadores.
Estes resultados validam está técnica para sua utilização em trabalhos científicos com grandes casuísticas, pois permite;
i). A representatividade eficiente de diferentes áreas do tumor sem danos no bloco doador; ii) Repetir o procedimento sem aumento excessivo do custo e do tempo empregado; iii) Uniformizar as reações;
Para caracterizar o comportamento das proteínas reguladoras do mecanismo de apoptose pertencentes à família Bcl-2 no câncer gástrico foram estudadas proteínas que induzem a morte celular por apoptose como a proteína Bax, Bak e Bad, e proteínas que inibem a apoptose, como a proteína Bcl-2 e Bcl-xl.
A análise estatística correlacionando a expressão de Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bak, Bad, p53, Ki-67 e caspase 3 nos adenocarcinomas gástricos com as variáveis clínicas revelaram associação da hiperexpressão da proteína Bad e Bak nos adenocarcinomas de pacientes maiores de 50 anos. Não foi encontrada relação da expressão destas proteínas com o sexo dos pacientes.
Em relação ao tamanho do tumor, foi observada associação entre os adenocarcinomas gástricos que expressaram a proteína p53 e o tamanho do tumor (> 3 cm). Kyu et al, em 2003 e Sanz-Ortega et al em 2000, também observaram associação entre o aumento do tamanho dos adenocarcinomas gástricos e hiperexpressão da proteína p53. (96,97) Como a proteína p53 mutada não tem controle sobre as alterações genéticas que ocorrem durante a carcinogênese gástrica, o mecanismo de apoptose mediado por esta via provavelmente está desativado, portanto as células neoplásicas crescem descontroladamente aumentando o tamanho tumoral.
Foi observada associação entre a intensidade de inflamação no tecido tumoral e o aumento do índice mitótico. Como descrito por Pelayo Correa, em 1992, a continua agressão externa que ocorre no trato gastro-intestinal principalmente de microrganismos, provoca resposta inflamatória crônica. Esta resposta inflamatória está fortemente associada com aparecimento de câncer.
Estudos histopatológicos dos carcinomas gástricos distais ou não cárdicos, principalmente do tipo intestinal, indicam que a infecção crônica por Helicobacter pylori progride durante décadas através de vários estágios como gastrite superficial, gastrite atrófica, metaplasia intestinal, displasia e eventualmente câncer. O
desenvolvimento do câncer é atribuído às alterações no DNA causado pela interação entre a inflamação crônica, alteração do equilíbrio da proliferação celular e a apoptose, em ambiente de atrofia e acloridia, com colonização de bactérias que facilitam a formação de nitrosamidas carcinogênicas. A infecção pelo Helicobacter pylori induz inflamação por vários mecanismos, entre eles a liberação de citocinas como IL-1 considerada importante fator de iniciação e amplificação da resposta inflamatória. A IL-8, mediante a ativação de neutrófilos, gera espécies reativas de oxigênio e/ ou de nitrogênio, que podem induzir direta ou indiretamente danos no DNA, além de alterar a expressão de proto-oncogenes. As espécies reativas de nitrogênio são derivadas da síntese de óxido nítrico e induzidas por citocinas liberadas pelas células mononucleares da inflamação. (98,99)
O óxido nítrico pode favorecer o acúmulo de mutações potencialmente oncogênicas por mecanismos como a inibição das enzimas do sistema de reparo. O óxido nítrico leva à inativação do processo de apoptose pela nitrosilação de proteínas pró-apoptóticas, tais como p53 e caspases, permitindo desta forma a sobrevivência de células com danos no DNA. (100)
Estas observações são forte evidência da importância da interação do hospedeiro, infecção pelo Helicobacter pylori e resposta inflamatória no desenvolvimento da gastrite atrófica e câncer gástrico.
Comparando a expressão das proteínas estudadas em relação ao tipo histológico, segundo a classificação de Laurén, observou-se marcado aumento da imunoexpressão de todas as proteínas no adenocarcinoma de tipo intestinal. Detectuo-se diferença estatisticamente significativa das proteínas Bax (89,3% de positividade) e Bad (71,4% de positividade) em relação ao adenocarcinoma do tipo difuso. Este achado sugere que estes dois tipos histológicos de carcinomas gástricos têm comportamento molecular diferente e provavelmente vias carcinogênicas diferentes.
Isto coincide com o estudo de Krajewska et al em 1996, que estudaram o perfil imuno-histoquímico de proteínas envolvidas na apoptose, como Bcl-2, Bax, Bcl-Xl e mcl-1, em adenocarcinomas gástricos, e relacionaram a imuno-expressão com o tipo histológico e estádio clínico Observaram imuno-imuno-expressão de Bcl-xl em 85% dos casos, que quando comparado com o tipo histológico do tumor revelou diferença estatisticamente significante para Bax, Bcl-xl e mcl-1, que foram mais freqüentemente imuno-expressos em tumores do tipo intestinal de Laurén. À semelhança de nosso estudo, Bcl-xl foi significativamente mais alto nas células
tumorais do tipo intestinal. A intensidade de marcação das proteínas Bcl-2 Bcl-xl e mcl-1 foi mais forte em células tumorais quando comparado com as células foveolares normais.(61)
Van der Woude et al em 2003, observaram diferença de expressão da proteína Fas e da proteína Bcl-xl entre os tipos histológicos intestinal e difuso (94) assim como Simões et al, em 2008, que observaram aumento de expressão da proteína FasL no adenocarcinoma de tipo intestinal em comparação com o tipo difuso. (101)
Estes achados sugerem que as proteínas da família Bcl-2 controlam o mecanismo de apoptose no adenocarcinoma do tipo intestinal, enquanto que no adenocarcinoma de tipo difuso a morte celular por apoptose está inibida, existindo outros mecanismos e outras proteínas envolvidas neste tipo de adenocarcinoma.
Lee et al em 2003, estudaram a imuno-expressão das proteínas Bcl-2, Bcl-xl, Bax e p53 em adenomas (n=41) e adenocarcinomas gástricos (n=100), correlacionando-as com grau de displasia, tipo histológico, profundidade de invasão, metástases em linfonodos e estádio clínico. Observaram maior expressão de Bcl-2 em adenomas de alto grau, em comparação com a expressão em adenocarcinomas. As proteínas Bcl-xl, Bax e p53 apresentaram maior expressão nos adenocarcinomas em comparação com os adenomas. O estudo sugeriu que a expressão aumentada da proteína Bcl-2 está relacionada com o desenvolvimento de adenomas gástricos de alto grau, emquanto que as proteínas Bcl-xl e p53 estão envolvidas no desenvolvimento do adenocarcinoma gástrico nos estádios iniciais, mas não com a progressão tumoral. (102)
Bir et al em 2007, compararam a imuno-expressão de proteínas da apoptose nos dois tipos histológicos de adenocarcinoma gástricos e nas lesões pré-neoplásicas, observando aumento da proteína Bax em adenocarcinomas e em lesões pre-neoplásicas como a metaplasia intestinal, em comparação com a mucosa normal. Sugeriram que esta proteína pode estar envolvida na carcinogênese gástrica principalmente na transformação de metaplasia intestinal para carcinoma de tipo intestinal. (62)
As análises estatísticas correlacionando expressão de Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bak, Bad, p53, Ki-67 e caspase 3 na mucosa gástrica não tumoral com as variáveis clínicas mostrou associação das proteínas Bax e Bak em pacientes com a idade maior que 50 anos. Foi observada associação entre as proteínas Bad e Bax; entre Bak e Bad, Bax com Ki-67 e caspase 3 e Ki-67 e p53.
Quando comparamos a relação da expressão entre todas as proteínas no adenocarcinoma, observamos correlação das proteínas Bad e Bax e Bad e Bak. A proteína Bcl-xl apresentou correlação com as proteínas Bad e Bak. Houve correlação entre Ki-67 e Bcl-xl, Bax, Bad e p53 e caspase 3, e correlação entre Bad e caspase 3.
Analisando estes resultados podemos confirmar que as proteínas pró-apoptóticas Bak, Bax e Bad estão intimamente relacionadas entre si e que a expressão das mesmas está associada aos mecanismos regulatórios de apoptose no câncer gástrico e na mucosa normal.
A hiperexpressão da proteína anti-apoptótica Bcl-xl nos adenocarcinomas e sua correlação com as proteínas pró-apoptóticas foi achado esperado, pois como descrito por Holinger et al, em 1999. (106) e Hinds et AL em 2007 (47)
as proteínas Bak e Bad formam heterodímeros com a proteína Bcl-xl, para inibir seu efeito apoptótico. A quantidade de heterodímeros formados provavelmente não é suficiente para inibir a quantidade de Bcl-xl presente no tumor, facilitando a proliferação celular neoplásica. Este desequilíbrio entre apoptose e proliferação celular pode ser também explicado pela redução de expressão das proteínas Bak e Bad observados nos adenocarcinomas, assim como também pela associação com a hiperexpressão da proteína Ki-67.
Os resultados observados na mucosa gástrica não tumoral corroboram também esses achados, pois não foi observada correlação da proteína Bcl-xl com as proteínas Bad, Bax e Bad, confirmando que na mucosa gástrica adjacente predominam estas proteínas em relação à proteína Bcl-xl o que mantêm o equilíbrio entre a proliferação celular e a apoptose.
Na tentativa de entender a carcinogênese gástrica, vários estudos foram realizados pesquisando a expressão anômala da proteína Bcl-2 na mucosa normal e lesões pré-neoplásicas. Forones et al em 2005, observaram aumento da expressão da proteína Bcl-2 em mucosa com metaplasia intestinal (68%) em comparação com a expressão nos adenocarcinomas (45%). Nos carcinomas foi mais freqüente no tipo precoce que no tipo avançado, sugerindo o envolvimento desta proteína na carcinogênese gástrica. (70)
Usando a técnica de TMA, Sum et al em 2005, estudaram várias proteínas envolvidas em lesões consideradas pré-neoplásicas como metaplasia do tipo incompleta, displasias de baixo e de alto grau e nos adenocarcinomas, observando
maior expressão de Bcl-2 em mucosa com metaplasia intestinal incompleta (81%), em comparação com a mucosa displásica (69,4%) e com os adenocarcinomas (22,9%), sugerindo a importância do Bcl-2 na carcinogênese gástrica, principalmente nos estádios iniciais. (107) Lee et al, em 2005, demonstrou a hiperexpressão desta proteína nos adenomas (34,2%) e displasias de alto grau (52,4%), em comparação com os adenocarcinomas (2%). (71)
Muller et al em 1998, estudou a expressão da proteína Bcl-2 em 413 carcinomas gástricos e obteve expressão positiva de Bcl-2 em 11,4% dos tumores; encontrou ainda associação com o tipo de tumor, segundo a classificação de Lauren, sendo que 95% dos tumores Bcl-2 positivos foram do tipo intestinal enquanto que os tipos difusos e em anel de sinete foram Bcl-2 negativos. Observou também que os tumores sem metástases para linfonodos foram Bcl-2 negativos e os tumores com metástases para linfonodos foram Bcl-2 positivos. Em relação ao prognóstico ou estádio clínico não encontrou relação significante. (108)
Lee et al, em 2003, estudou a expressão de Bcl-2 e p53 em 308 adenocarcinomas gástricos e obteve positividade de Bcl-2 em 12,7% dos casos, e 34,1% de positividade para p53. Observou correlação negativa significante em relação à profundidade de invasão e metástases em linfonodos. Pacientes com Bcl-2 positivo tiveram sobrevida melhor em cinco anos comparada com os pacientes com Bcl-2 negativo. Observou que pacientes com tumores que revelaram a combinação de expressão p53(+)-Bcl-2(-), apresentavam sobrevida pior em comparação com o grupo com expressão p53(+)-Bcl-2 (+). (102)
Zhang etal, em 2004 observaram hipoexpressão de reguladores da apoptose da família Bcl-2 como o Bid, Bax ( pro-apoptóticos) induzidos por H. pylori, assim como a expressão aumentada do Bcl-2 (anti-apoptótico), revelando a importância da infecção por H. pylori na inibição da apoptose e posterior desenvolvimento do câncer gástrico.(109)
No nosso estudo, a imunoexpressão positiva da proteína Bcl-2 foi observada em apenas 3 adenocarcinomas (4,8%), incluindo todos os estádios. Como descrito na literatura, a proteína Bcl-2 está frequentemente hiperexpressa em lesões como metaplasia intestinal, displasias, adenomas e adenocarcinomas precoces, enquanto que nos carcinomas avançados sua expressão está reduzida. Nossa casuística foi constituída principalmente por carcinomas em estádios avançados (n=73)
e poucos casos de adenocarcinomas precoces (n=12), sendo esta provavelmente a causa da baixa porcentagem de expressão da proteína Bcl-2. A baixa expressão pode ser explicada também pelo sistema de escore adotado, pois foram considerados positivos somente os casos com mais de 10% de células neoplásicas com moderada e intensa marcação. Não foi observada diferença de expressão desta proteína entre o tecido tumoral e a mucosa não tumoral. Não foram aplicados testes estatísticos para as curvas de sobrevida de Bcl-2 devido ao pequeno número de pacientes com marcação positiva.
No estômago, a imunoexpressão da proteína Bcl-x é observada em diferentes células da mucosa como as células foveolares, parietais e principais. A isoforma Bcl-xl demonstrou ser a que mais se expressa no trato gastro-intestinal. Em nosso estudo, 74 (88,1%) dos adenocarcinomas e 63 (75%) das mucosas não tumorais expressaram a proteína Bcl-xl. Comparando a expressão desta proteína no tumor e na mucosa não tumoral, foi observado aumento de expressão no tumor em relação à expressão na mucosa não tumoral. Observo-se também associação desta proteína com as proteínas Bak e Bad nos adenocarcinomas. Essa associação foi descrita por Holinger et al. (106) e Hinds et al, em 2007 (47) onde foi sugerido que a proteína Bak e Bad aparentemente heteromerizam-se com a proteína anti-apoptótica Bcl-xl, o que faria com que qualquer mutação da Bak eliminasse a heterodimerização do Bcl-xl, inibindo o efeito apoptótico da Bak. Esta observação sugere que a Bak aumenta a apoptose através da ligação com a Bcl-xl e inibe o seu efeito anti-apoptótico.
Em nosso estudo, houve maior expressão da proteína Bak e Bad na mucosa não tumoral em relação à proteína Bcl-xl, e baixa expressão de Bak e Bad no adenocarcinoma em comparação com o Bcl-xl. Krajewska et al em 1996, encontraram expressão similar das proteínas Bcl-xl e Bak no câncer de cólon. (111) Este achado justifica o desequilíbrio entre proliferação celular e apoptose, confirmado também pelo aumento de expressão da proteína Ki-67 no tumor em relação à mucosa não tumoral. A associação da expressão da proteína Bcl-xl com a proteína Bad pode ser explicado, pois ela regula as proteínas pró-apoptóticas Bax e Bak, permitindo seu transporte até a membrana mitocondrial e assim facilitando sua heterodimerização com as proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 e Bcl-xl.
A hiperexpressão de Bcl-xl em relação à proliferação celular pode ser explicada em base aos achados de Smith et al em 2007, (106) que sugeriram que a proteína Bcl-xl no câncer humano modula a resposta celular frente ao dano do DNA,
mediante: i) a regulação da permeabilidade da membrana mitocondrial no mecanismo da apoptose; ii) a estabilização dos pontos de checagem do dano de DNA ao nível do G2/M do ciclo celular, mediante a inibição da cdk1(quinasse dependente da ciclina ) evitando a apoptose de células com DNA lesado. iii) retardando o efeito apoptótico da quimioterapia em células tumorais. O aumento de expressão de Bak em células tumorais sensibiliza estas células para o tratamento de baixas doses de 5FU e cisplatina frequentemente utilizados no tratamento do câncer gástrico. Sugerem que seria interessante avaliar a resposta à quimioterapia pós-operatória nos pacientes que apresentaram baixa expressão de Bak e hiperexpressão de Bcl-xl. (111)
Não foram aplicados testes estatísticos para as curvas de sobrevida da proteína Bcl-xl devido ao pequeno número de pacientes com marcação negativa.
A expressão reduzida da proteína Bax parece ser um fator prognóstico negativo em pacientes com câncer de mama, ovário, cólon, esôfago e pâncreas, e a perda de expressão de Bax em leucemia linfoblástica aguda em crianças está associada com quimioresistência e ativação inadequada da cascada de caspases. Anagnostopoulus et al em 2005, compararam a expressão da proteína Bax com a expressão da proteína Bcl-2 em gastrite crônica, gastrite atrófica, metaplasia intestinal e displasia de alto e baixo grau, observando 100% de expressão de Bax na gastrite crônica, 74% na gastrite atrófica, 50 % na metaplasia intestinal e 12% nas displasias. O Bcl-2 não foi expresso na gastrite crônica, porém houve expressão de 48% na gastrite atrófica, 41% na metaplasia intestinal e 99% nas displasias. Os autores sugeriram que a supressão da proteína Bax e a expressão aumentada da proteína Bcl-2 são eventos iniciais da carcinogênese gástrica, observados antes da transformação maligna. (82)
Os autores em estudo mais recente, estudaram a expressão da proteína Bax em carcinomas gástricos e correlacionaram com parâmetros clínico-patológicos e com o prognóstico. Observaram 42,4% de positividade e correlação entre os tumores que não expressaram Bax com o comprometimento de linfonodos e com a desdiferenciação do tumor. Os tumores que expressaram Bax tiveram correlação com estádios mais avançados e com a profundidade da invasão tumoral. (103)
Em nosso estudo, foi observada expressão positiva de Bax em 78,6% dos adenocarcinomas e em 70,3% na mucosa não tumoral, não existindo diferença de expressão significativa. Houve diferença de expressão entre os tipos histológicos intestinal e difuso, podendo ser utilizado como marcador de comportamento biológico.
Em nosso estudo, a curva de sobrevida de Kaplan-Meier dos pacientes com adenocarcinoma gástrico em relação à expressão da proteína Bax mostrou que pacientes com tumores Bax positivos tiveram probabilidade de sobrevida menor do que aqueles com tumores Bax negativos. No entanto, estas diferenças não foram estatisticamente significantes, indicando que a expressão da proteína Bax não influencia o prognóstico dos pacientes.
Em relação à expressão das proteínas Bad e Bak, as curvas de sobrevida de Kaplan-Meier dos pacientes com adenocarcinoma gástrico mostraram que pacientes com tumores Bad e Bak positivos tiveram a probabilidade de sobrevida menor do que aqueles com tumores Bad e Bak negativos. No entanto, estas diferenças não foram estatisticamente significantes, indicando que a expressão destas proteínas não interferiu na sobrevida dos pacientes.
No nosso estudo, observamos também maior proliferação celular nas amostras tumorais quando comparadas à mucosa não tumoral, demonstrando que a proliferação celular e a apoptose estão aumentadas nestes tumores. Apesar da aparente incongruência, a taxa de apoptose está aumentada nos tumores e sua intensidade correlaciona-se com a velocidade de crescimento tumoral. As células apoptóticas são geralmente mais numerosas em tumores malignos do que em tecidos adultos normais. Em tumores clinicamente agressivos, tanto o índice mitótico quanto o apoptótico encontram-se aumentados (113 114).
Isobe et al em 2004, avaliaram a expressão da caspase 3 e da caspase 3 ativada em 151 pacientes com adenocarcinoma gástrico. Avaliaram o índice de expressão de caspase 3 (C3EI) pela técnica de imuno-histoquímica e o IA pela técnica de TUNEL. Utilizaram a média do C3EI para subdividir aos pacientes em grupos com alto e baixo C3EI, observando que o grupo com baixo C3EI teve melhor prognóstico que o grupo com alto C3EI. Observaram correlação do C3EI com o comprometimento de linfonodos e sobrevida pós-operatória. Houve baixa expressão imuno-histoquímica da caspase 3 ativada revelando que em células neoplásicas a maior parte da caspase 3 está inativada, confirmado também pelo número de células apoptóticas pela técnica de TUNEL. (83)
Estrov et al, em 1998, reportaram que altos níveis de caspase não clivada estão associados com baixa sobrevida em leucemia mielóide aguda e que altos níveis de caspase 3 clivada estão associados com melhor sobrevida. (116)
Em nosso estudo, a curva de sobrevida de Kaplan-Meier dos pacientes com adenocarcinoma gástrico em relação a expressão da proteína caspase 3 clivada mostrou que pacientes com tumores com maior número de células apoptóticas tiveram a probabilidade de sobrevida semelhante aos pacientes com tumores com menor número de células apoptóticas, indicando que a expressão desta proteína não interferiu no prognóstico dos pacientes.
Nosso estudo mostrou expressão aumentada da proteína p53 nos adenocarcinomas (43,1%) apresentando diferença de expressão em relação à mucosa não tumoral (2,4%). Houve correlação da expressão da proteína p53 com o tamanho do tumor, mais expresso no tipo histológico intestinal e com a imuno-expressão da proteína Ki-67. Este achado demonstra a ineficácia da proteína p53 provavelmente mutada, permitindo o crescimento descontrolado das células com alterações genéticas.
Lee et al, em 2003 obtiveram expressão positiva em 43,2% dos carcinomas gástricos. A expressão positiva teve associação com idade mais avançada, sexo masculino, tamanhos maiores, melhor diferenciação histológica, com o tipo intestinal da classificação de Laurén, PCNA e estádio mais avançados. Observaram associação com pior prognóstico em analises univariadas. Sobrevida de 5 anos no grupo p53 positivo foi de 64.8%, significativamente mais baixa que o grupo p53 negativo com 70,4%. (118) Danesi et al, em 2000, em estudo por citometria de fluxo detectaram 48,9 % de positividade de p53, porém não encontraram relação com a sobrevida. (119)
Sot et al em 2007, demonstraram que existe alta afinidade da proteína p53 pela proteína Bcl-xl e Bak, e que quando existe igual concentração de proteínas pró-apoptóticas e anti-apoptóticas ou com mais alta concentração das últimas, a proteína p53 preferencialmente une-se ao Bcl-xl para inibir seu efeito apoptótico. A interação com Bak ocorreria em um segundo tempo se houver excesso de moléculas de p53, a qual ativaria estas proteínas para oligomerizar com as proteínas anti-apoptóticas. (112)
Em nosso estudo, a curva de sobrevida de Kaplan-Meier dos pacientes com adenocarcinoma gástrico em relação a expressão da proteína p53 mostra que pacientes com tumores p53 positivos tiveram probabilidade de sobrevida menor do que aqueles com tumores p53 negativos. No entanto, estas diferenças não foram estatisticamente significantes, indicando que a expressão da proteína p53 não
influenciou no prognóstico dos pacientes. Achados similares foram observados por Oshima et al, em 1999. (86)
O crescimento tumoral é determinado pelo balanço entre a proliferação e a perda das células tumorais. Esta proliferação é função das células em divisão pelo tempo de duração do ciclo celular. A medida da atividade proliferativa, utilizando método imuno-histoquímico, pode ser feita através de anticorpos contra antígenos associados à proliferação, como Ki-67 e PCNA. A proteína Ki-67 é considerada como fator prognóstico importante nos tumores malignos. (92)
Pacientes portadores de tumores com alta atividade proliferativa apresentam pior prognóstico que aqueles com baixa atividade. (92)
Em nosso estudo, foi observada associação entre o índice de proliferação celular avaliado pela proteína Ki-67 e o adenocarcinoma de tipo intestinal. Forones et al, em 2005, observaram aumento da expressão da proteína Ki-67 no adenocarcinoma em comparação com a metaplasia intestinal. (70) Oshima et al, em 1999 observaram maior expressão de Ki-67 em adenocarcinomas de tipo intestinal do que em adenocarcinomas difusos. (86)
Kyu et al, em 2003, estudaram a índice de proliferação celular, usando a proteína PCNA em adenocarcinomas gástricos, e observaram correlação entre idade, sexo masculino, tamanho do tumor, tipos histológicos bem diferenciados e o índice de PCNA. O adenocarcinoma tipo intestinal apresentou maior índice de PCNA em relação ao tipo difuso. Observaram também relação com a proteína p53. (96) Oshima et al, em 2008, estudaram o índice de proliferação celular (Ki-67) em carcinomas gástricos e de cólon, observando ampla variação de porcentagem e intensidade de expressão de Ki-67, sendo maior nos carcinomas gástricos. (105)
Casasola et al, em 2004, estudaram a expressão de ciclina D1, D3, Cdk4 e Ki-67 em 74 pacientes com adenocarcinoma gástrico, em relação ao índice de proliferação celular e observaram 97% de positividade de Ki-67 que se correlacionou com a sobrevida, sugerindo que o índice de proliferação elevada é indicador de pior prognóstico. (73) Estudos da expressão imuno-histoquímica de Ki-67 e citometria de fluxo para avaliar a ploidia do DNA em carcinomas gástricos demonstraram que a expressão elevada do Ki-67 e o padrão de anaploidia do DNA estão relacionados com alto potencial de comprometimento de linfonodos à distância. (74)
Em nosso estudo, a curva de sobrevida de Kaplan-Meier dos pacientes com adenocarcinoma gástrico em relação à expressão da proteína Ki-67
mostrou que pacientes com tumores Ki-67 negativos tiveram sobrevida menor do que aqueles com tumores Ki-67 positivos. No entanto, estas diferenças não foram estatisticamente significantes, indicando que a expressão da proteína Ki-67 não influenciou o prognóstico dos pacientes.
Como o crescimento tumoral é determinado pelo balanço entre a proliferação e a perda das células tumorais, nosso resultado sugere que nos adenocarcinomas gástricos estudados existe mutação do gene TP53 que codifica a proteína p53 anômala incapaz de corrigir o DNA alterado. Esta alteração gênica estaria evitando o mecanismo de apoptose mediado pela proteína p53, permitindo a proliferação de células com DNA danificado. Somado a este mecanismo, a desregulação das proteínas da família Bcl-2 caracterizada pela hiperexpressão da proteína Bcl-xl nos adenocarcinomas e pela hipoexpressão de proteínas pró-apoptóticas, Bak e Bad no tumor, favorecem a redução da apoptose, desencadeando a proliferação descontrolada de células tumorais.
SUMÁRIO
1- Houve associação da imuno-expressão da proteína Bad com pacientes com idade maior de 50 anos nos tecidos de mucosa gástrica não tumoral. .
2- Houve associação da proteína p53 com o tamanho do tumor (>3 cm). 3- Houve associação da proteína Ki-67 com a intensidade de inflamação. 4- Houve associação da expressão das proteínas Bax, Bad e Ki-67 com o adenocarcinoma de tipo intestinal.
5- As proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2 mostraram correlação positiva entre si, tanto no tumor quanto na mucosa não tumoral.
6- Houve correlação positiva das proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2 com a proteína anti-apoptótica Bcl-xl nos adenocarcinomas.
7- As proteínas Bcl-xl, Bak, Bad, p53 e ki-67 apresentaram diferenças estatisticamente significantes entre a imunoexpressão no tumor e na mucosa não tumoral;
8. Nos adenocarcinomas as proteínas Bcl-xl, Bax, Bad e p53 correlacionaram-se positivamente com a expressão de Ki-67.
9. Os adenocarcinomas exibiram maior imuno-expressão da proteína Ki-67 e de caspase 3 clivada.
6 CONCLUSÕES
1- No câncer gástrico a expressão das proteínas da família Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Bak e Bad) e da proteína p53 está desregulada, favorecendo o desequilíbrio entre proliferação celular e apoptose, permitindo o crescimento descontrolado de células neoplásicas.
2- A expressão destas proteínas não está influenciando a sobrevida dos pacientes com adenocarcinoma gástrico.
7 PERSPECTIVAS
1- Avaliar a expressão protéica e quantificar os níveis de mRNA dos genes da família bcl-2 e das caspases por meio da técnica de Western-Blot e pela técnica de PCR-RT respectivamente, em material congelado do mesmo grupo de pacientes estudado, para correlacionar com os achados imuno-histoquímicos observados neste estudo.
2- Correlacionar os achados imuno-histoquímicos observados nos adenocarcinomas
com a resposta dos pacientes à quimioterapia, para verificar a influência da hiperexpressão da proteína Bcl-xl, que facilita a resistência a este tipo de tratamento, assim como verificar a influência da hipoexpressão da proteína Bak nos adenocarcinomas, conhecida por sensibilizar as células neoplásicas ao tratamento quimioterápico. (111)
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