PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
LUCAS ALVES SARMENTO PIRES
ANÁLISE MORFOMÉTRICA DO CRESCIMENTO DO CRÂNIO DE RATOS SUBMETIDOS A DESNUTRIÇÃO NO PERÍODO DE LACTAÇÃO
Niterói, RJ 2019
ANÁLISE MORFOMÉTRICA DO CRESCIMENTO DO CRÂNIO DE RATOS SUBMETIDOS A DESNUTRIÇÃO NO PERÍODO DE LACTAÇÃO
Dissertação submetida ao Programa de Pós Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciências Médicas.
ORIENTADOR: PROF. DR. MARCIO ANTONIO BABINSKI COORIENTADOR: PROF. DR. VINICIUS SCHOTT GAMEIRO
Niterói, RJ 2019
ANÁLISE MORFOMÉTRICA DO CRESCIMENTO DO CRÂNIO DE RATOS SUBMETIDOS A DESNUTRIÇÃO NO PERÍODO DE LACTAÇÃO
Dissertação submetida ao Programa de Pós Graduação em Ciências Médicas da Universidade Federal Fluminense como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre. Área de Concentração: Ciências Médicas.
Aprovado em 30 de janeiro de 2019.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________________________________ Prof. Dr. Alair Augusto Sarmet Moreira Damas dos Santos
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE - UFF
____________________________________________________________________ Prof. Dr.Marcelo Abidu-Figueiredo
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO - UFRRJ
____________________________________________________________________ Prof. Dr.Renato Luiz Silveira
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE - UFF
Niterói 2019
Dedico este trabalho a Deus por me dar força e esperança nessa jornada.
O primeiro agradecimento irá para Deus, pois essa trajetória inteira jamais teria acontecido sem que Ele me guiasse para tal.
Gostaria de agradecer a minha família, em especial, meus pais - Valdinete e Paulo Roberto - por nunca me desmotivarem, por mais difíceis que as coisas tenham ficado com o passar dos anos.
Agradeço ao meu orientador, conselheiro e amigo Marcio Babinski por nunca ter duvidado da minha capacidade e sempre ter me incentivado.
Agradeço também aos professores Carlos Chagas, Jorge Manaia e Vinícius Schott pela força e ajuda. Em especial, agradeço ao professor Albino Fonseca por ter auxiliado na técnica histológica.
Agradeço ao staff inteiro da Pós Graduação em Ciências Médicas por terem me dado a oportunidade de realizar e concluir este trabalho e a CAPES/CNPQ pelo incentivo financeiro dado. Devo agradecer, também, aos colegas da Radiologia do Hospital Universitário Antônio Pedro, por terem cedido espaço para a realização de parte desta dissertação.
Por fim, gostaria de agradecer a todos aqueles que deram apoio direta ou indiretamente. Espero que saibam o quão foram importantes para a conclusão deste trabalho.
“Dê-me, Senhor, agudeza para entender, capacidade para reter, método e faculdade para aprender, sutileza para interpretar, graça e abundância para falar. Dê-me, Senhor, acerto ao começar, direção ao progredir e perfeição ao concluir”.
A desnutrição é um problema de saúde pública mundial. Dados da Organização Mundial de Saúde relatam que aproximadamente um quarto das crianças menores que 5 anos possuem alguma forma de retardo em seu crescimento. Estudos experimentais demonstram alterações estruturais, metabólicas e funcionais em diversos sistemas causadas pela desnutrição materna durante o período gestacional e durante o período de aleitamento. No entanto, há escassez na literatura a respeito dos efeitos crônicos da desnutrição durante o período de lactação no tecido ósseo. O objetivo deste trabalho é verificar as alterações morfométricas do crânio de ratos Wistar adultos cujas progenitoras foram desnutridas durante a lactação. Trinta e seis ratos recém-nascidos foram divididos em três grupos: grupo controle, no qual a mãe recebeu dieta comercial regular contendo 23% de proteína em quantidades ilimitadas; grupo restrição proteico-calórica, no qual a mãe recebeu uma dieta comercial contendo 8% de proteína em quantidades ilimitadas; o grupo com restrição calórica, no qual a mãe recebeu uma dieta comercial contendo 23% de proteína em quantidades limitadas. Essas dietas foram administradas somente durante o período de amamentação. Após o desmame, todos os ratos receberam a mesma dieta que o grupo controle até os 180 dias de idade. Em seguida, os ratos foram eutanasiados, seus crânios foram excisados e mensurados através de imagens radiográficas e paquímetro digital. Posteriormente, seus crânios foram descalcificados com ácido nítrico (5%) e amostras histológicas foram obtidas. A espessura do crânio, o número de lacunas vazias e o tamanho destas lacunas foram verificados. Foi realizado o teste ANOVA seguido pelo teste de Newman-Keuls para fins de comparação. Observou-se que o crânio dos grupos restrição de proteíco-calórica e restrição calórica foi menor em relação ao grupo controle, assim como a análise histológica demonstrou menor espessura do násion e bregma do grupo restrição proteíco-calórica quando comparados com o grupo controle. Em resumo, a desnutrição materna durante o período de lactação causou efeitos em longo prazo na morfologia craniana de ratos Wistar. Estes efeitos não puderam ser revertidos após a regulação da dieta.
Malnutrition is a global public health problem. Data from the World Health Organization report that approximately one quarter of children under the age of 5 have some form of retardation in their growth. Experimental studies demonstrate structural, metabolic and functional changes in several tissues caused by maternal malnutrition during the gestational period and during the lactation period. However, there is a lack in the literature regarding the chronic effects of malnutrition during the lactation period in bone tissue. Thirty-six newborn Wistar rats were divided into three groups: control group, in which the mother received a regular commercial diet containing 23% of protein in unlimited amounts; protein-energy restriction group, in which the dam received a commercial diet containing 8% of protein in unlimited amounts; the energy restricted group, in which the dam received a commercial diet containing 23% of protein in limited amounts. After weaning, all rats received the same diet as the control group until 180 days of age. Then, the rats were euthanized; their skulls were excised and measured by radiographic images and digital caliper. Subsequently, their skulls were decalcified with nitric acid (5%) and histological samples were obtained. The thickness of the skull, the number of empty lacunae and the size of these lacunae were verified. The ANOVA test was performed, followed by the Newman-Keuls test for comparison purposes. It was observed that the cranium of the protein-calorie restriction and caloric restriction groups was smaller in relation to the control group. The histological analysis also demonstrated a reduced thickness of the nasion and bregma from the protein-calorie restriction group when compared with the control group. In summary, maternal malnutrition during the lactation period had long-term effects on the cranial morphology of Wistar rats. These effects could not be reversed after dietary regulation.
TABELA 1 – Composição da dieta normoproteica e hipoproteica, p. 21 TABELA 2 – Composição da mistura de vitaminas, p. 22
TABELA 3 – Composição da mistura de minerais, p. 23
TABELA 4 – Pontos de reparo para realização das mensurações macroscópicas, p. 25 TABELA 5 – Resultados morfométricos dos ratos adultos (180 dias), p. 36
Figura 1 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (L1, L2, L3, L4 e C4), p. 26 Figura 2 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (C3, C5 e C6), p. 27
Figura 3 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A1, A2, C1 e C2), p. 28 Figura 4 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A4 e A5), p. 29
Figura 5 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A3 e C7), p. 30 Figura 6 – MORFOMETRIA NA RADIOGRAFIA, p. 30
Figura 7 – PONTOS DE CORTE HISTOLÓGICO, p. 31
Figura 8 – MENSURAÇÃO DA ESPESSURA DOS OSSOS, p. 32
Gráfico 1 – PESO TOTAL DOS ANIMAIS AO TÉRMINO DO ESTUDO, p. 34 Gráfico 2 – PESO TOTAL DOS CRÂNIOS AO TÉRMINO DO ESTUDO, p. 35 Figura 9 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO CONTROLE, p. 37
Figura 10 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO RESTRIÇÃO CALÓRICA, p. 38
Figura 11 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO RESTRIÇÃO PROTEÍCO-CALÓRICA, p. 39
Gráfico 3 – ESPESSURA DO CRÂNIO NOS PONTOS ESTUDADOS DOS 3 GRUPOS, p. 41
A1 – Altura 1 A2 – Altura 2 A3 – Altura 3 A4 – Altura 4 A5 – Altura 5 C – Grupo controle C1 – Comprimento 1 C2 – Comprimento 2 C3 – Comprimento 3 C4 – Comprimento 4 C5 – Comprimento 5 C6 – Comprimento 6 C7 – Comprimento 7 L1 – Largura 1 L2 – Largura 2 L3 – Largura 3 L4 – Largura 4 MS – Ministério da Saúde
OMS – Organização Mundial de Saúde RC – Grupo restrição calórica
RPC – Grupo restrição protéico-calórica
1 JUSTIFICATIVA, p. 14
2 OBJETIVOS, p. 15
2.1 OBJETIVO GERAL, p. 15
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p. 15
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p. 16
3.1 TECIDO ÓSSEO E O CRÂNIO, p. 16 3.2 O ALEITAMENTO MATERNO, p. 17
3.3 A DESNUTRIÇÃO MATERNA E SEUS EFEITOS, p. 18
4 MATERIAIS E MÉTODOS, p. 20
4.1 CUIDADOS BIOÉTICOS, p. 20 4.2 AMOSTRA E DIETA, p. 20
4.3 EUTANÁSIA, MORFOMETRIA E PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO, p. 23 4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA, p. 32 5 RESULTADOS, p. 34 5.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA, p. 34 5.2 ANÁLISE MICROSCÓPICA, p. 37 6 DISCUSSÃO, p. 42 7 CONCLUSÕES, p. 46 8 OBRAS CITADAS, p. 47 9 ANEXOS, p. 52
9.1 APROVAÇÃO EM COMITÊ DE ÉTICA, p. 52 9.2 PROTOCOLO DE CONVÊNIO DE PESQUISA, p. 53 9.3 PROTOCOLO DE DOAÇÃO DE MATERIAIS, p. 54
9.4 E-MAIL PARA O COMITÊ DE ÉTICA E CUIDADOS EM ANIMAIS DA UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE, p. 55
9.5 RESPOSTA DO COMITÊ DE ÉTICA E CUIDADO EM ANIMAIS DA UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE, p. 56
1 JUSTIFICATIVA
Apesar das taxas de desnutrição materna terem declinado nas duas últimas décadas, essa condição ainda prevalece em países de baixa e média renda (Black et al., 2013). Dados mais recentes da Organização Mundial de Saúde (OMS) demonstram que 24.7% das crianças menores de 5 anos possuem retardo no crescimento, enquanto que 15.1% das crianças menores de 5 anos estão desnutridas. Além disso, somente 37% dos recém-nascidos são amamentados de forma exclusiva até os 6 meses de idade (World Health Organization, 2014).
Estudos prévios demonstram inúmeras alterações estruturais, metabólicas e funcionais em diversos sistemas causadas pela desnutrição materna durante o período gestacional (Confortim et al., 2017; Howie et al., 2012; Mehta et al., 2002) e durante o período de aleitamento (Babinski et al., 2016; Gautsch et al., 1999; Passos et al., 2000; Ramos et al., 2000; Schultz et al., 2017).
De modo geral, são numerosos os estudos a respeito da desnutrição materna, porém, poucos trabalhos avaliaram os efeitos da desnutrição materna durante o período de lactação. São ainda mais escassos aqueles que avaliam tais efeitos no crânio (Fernandes et al., 2008; Luna et al., 2016). Ainda, estudos realizados em ossos como o fêmur, a tíbia e a mandíbula, demonstraram a ação deletéria da desnutrição durante e após o período de lactação (Alippi et al., 1999; Alippi et al., 2002; Babinski et al., 2016; Bozzini et al., 2011; Degani Junior et al., 2011; Giglio et al., 1998; Shin et al., 2015).
Logo, a falta de informações na literatura relativas ao crescimento e desenvolvimento morfológico e estrutural do crânio sob um quadro de desnutrição, associadas ao enorme significado do estudo dos efeitos da desnutrição materna e suas consequências para o crescimento fetal motivou a realização desse estudo.
2 OBJETIVOS .
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar as alterações morfométricas do crânio da prole de ratos que sofreram desnutrição no período de aleitamento e que receberam dieta normocalórica e normoproteica após o desmame até a idade adulta.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar e comparar as alterações no crescimento ósseo do crânio de filhotes na idade adulta (180 dias) relacionando as possíveis alterações morfológicas e morfométricas.
Avaliar macroscopicamente as possíveis alterações a longo prazo causadas em filhotes de ratas desnutridas durante o período de aleitamento.
Verificar as possíveis alterações microscópicas no tecido ósseo do crânio em ratos cujas progenitoras foram submetidas à desnutrição no período de lactação.
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 TECIDO ÓSSEO E O CRÂNIO
O tecido ósseo é responsável pelo suporte e proteção dos tecidos moles, como o sistema nervoso e o conteúdo da caixa torácica. Possuem função hematopoiética e possuem papel essencial na dinâmica do movimento (Junqueira & Carneiro, 2013). Além disso, os ossos funcionam como depósitos de cálcio, fosfato e outros íons, tornando-os imprescindíveis para a manutenção da concentração desses íons no corpo humano (Junqueira & Carneiro, 2013; Tortora & Derrickson, 2014).
O tecido ósseo é composto por osteócitos, osteoblastos, osteoclastos e matriz óssea (formada essencialmente por íons de cálcio e fosfato). Esta última é responsável pela rigidez do osso (Junqueira & Carneiro, 2013).
O surgimento do tecido ósseo se dá por meio de duas distintas formas: através da ossificação intramembranosa, que ocorre no interior de uma membrana conjuntiva ou através da ossificação endocondral, que parte de um molde de cartilagem hialina. A ossificação intramembranosa ocorre nos ossos que compõem o neurocrânio, e a ossificação endocondral ocorre em alguns ossos que compõem o víscerocrânio e em ossos curtos e longos que compõem o esqueleto apendicular (Junqueira & Carneiro, 2013; Pires et al., 2016; Testut & Latarjet, 1958)
O desenvolvimento dos ossos é dependente de uma relação harmoniosa entre processos de criação e destruição tecidual. Esse processo é influenciado por diversos fatores, dentre eles o estímulo hormonal, hábitos de vida e hábitos alimentares (Testut & Latarjet, 1958; Tritos & Klibanski, 2016; Weaver, 2017).
O crânio humano é formado por um conjunto de 26 ossos, e é dividido em neurocrânio (8 ossos) e víscerocrânio (14 ossos). O crânio se articula com a primeira vértebra cervical da coluna vertebral através da articulação atlanto-occipital. Todos os ossos do crânio, com excessão da mandíbula, articulam-se entre si através de articulações fibrosas, bastante resistentes e pouco móveis (Testut & Jacob, 1952; Testut & Latarjet, 1958).
Em ratos Wistar, o crânio se demonstra similar ao de humanos no que se refere ao número de ossos e nomenclatura, porém, este possui diferenças como a presença de um osso pre-esfenóide e um basiesfenóide, ao invés do osso esfenoide, que se deve a ausência de união de pontos de ossificação, como ocorre em humanos (Greene, 1935; Testut & Latarjet, 1958).
Outras diferenças podem ser encontradas no osso temporal, que é formado por peças ósseas que se ossificam isoladamente, criando um “complexo” temporal, além da presença de um osso supranumerário: o interparietal (Greene, 1935; Testut & Latarjet, 1958; Wysocki, 2008) (Greene, 1935; Testut e Latarjet, 1958; Wysocki, 2008).
Ainda, muitas estruturas podem aparecer em crânios humanos como variações anatômicas vestigiais, por exemplo, o processo paramastóideo e o osso interparietal (os
inca) (Greene, 1935; Testut & Latarjet, 1958; Tubbs et al., 2016).
3.2 O ALEITAMENTO MATERNO
De acordo com o Ministério da Saúde (MS), o aleitamento é um processo que implica em um relacionamento sadio entre mãe e filho que por sua vez influencia não somente o estado nutricional da criança, como também outros sistemas de seu organismo (Brasil, 2009; World Health Organization, 2000).
A OMS e o MS preconizam o aleitamento materno exclusivo até os 6 meses de idade, e este aleitamento pode se tornar complementar a outro tipo de dieta até os 2 ou 3 anos de idade (Brasil, 2009; World Health Organization, 2000; World Health Organization, 2002).
O período de lactação é essencial para o desenvolvimento geral da criança, e, é imprescindível para evitar diarréias, infecções e alergias, além de diminuir o risco de diabetes, hipertensão, hipercolesterolemia e obesidade. Ainda, o período de aleitamento exclusivo previne mortes infantis (Jeong et al., 2017; Kavle et al., 2018; Victora et al., 2016)
Sabe-se que a dieta da lactante influencia diretamente na quantidade e na qualidade do leite oferecido, portanto, é necessário a maior ingestão de calorias e
proteínas e o consumo de uma dieta variada de modo a manter a oferta de leite de qualidade para o filho (Ares Segura et al., 2016; Plecas et al., 2014).
Em ratos, o período de aleitamento é de 21 dias, o que torna este animal propício para experimentos relacionados à esse momento, além de fácil acesso e manuseio do modelo experimental (Quinn, 2005; Vandamme, 2014).
3.3 A DESNUTRIÇÃO MATERNA E SEUS EFEITOS
A desnutrição é caracterizada com uma ingesta pobre de nutrientes essenciais e necessários para a manutenção da saúde. Pode ser causada tanto pela ausência de alimento, em países subdesenvolvidos, ou por hábitos alimentares inadequados, em países desenvolvidos, em especial, devido ao advento das “fast-foods”, pois são de fácil acesso e não requerem esforço da parte do consumidor (Ahsan et al., 2017; Kavle et al., 2018).
A desnutrição é uma das principais causas de morte entre crianças e ainda persiste nos dias atuais. Esse fato é preocupante, pois o estado nutricional é de extrema importância para a saúde de um indivíduo, seja adulto ou criança (Ahsan et al., 2017; Black et al., 2013; Kavle et al., 2018).
Inúmeras deficiências nutricionais durante a gestação e lactação, como por exemplo, a anemia e a desnutrição, implicam em uma diminuição no peso total do feto, assim como diminuição na sua capacidade de desenvolvimento, com subsequente alteração no binônimo materno-fetal (Francisqueti et al., 2012; Haileslassie et al., 2013; Rodriguez et al., 1991).
Além disso, estudos em animais mostraram que a diminuição da massa corporal do grupo estudado em relação ao grupo controle permanece até a idade adulta, mesmo que os animais submetidos à desnutrição proteica materna durante o aleitamento consumissem dieta normal após o desmame. Ao atingirem a idade adulta, a massa corporal média dos animais em estudo era cerca de 10% menor que o grupo controle (Passos et al., 2000).
O estado nutricional também influencia no tempo de hospitalização e risco de óbito no intra e pós-operatório. Estudos mostram que os pacientes que possuem um
déficit nutricional apresentam recuperação cirúrgica retardada, o que gera oneração maior às instituições hospitalares (Kyle & Coss-Bu, 2010; Mamun et al., 2011). Esse dado é de extrema relevância, pois, no Brasil, o número de cirurgias de cesarianas varia de 35% a 65%, de acordo com a região (Ramires de Jesus et al., 2015).
A desnutrição materna durante o período de aleitamento pode causar inúmeras alterações em diversos sistemas na prole de animais, a saber: diminuição da secreção de insulina (Barbosa et al., 2002), comportamento depressivo e de ansiedade (Belluscio et al., 2014), alterações no desenvolvimento do sistema nervoso e da mielinização das fibras dos axônios (Belluscio et al., 2014; Noback & Eisenman, 1981; Plagemann et al., 2000), retardo no desenvolvimento de reflexos neurológicos (Belluscio et al., 2014), diminuição de fibras musculares no músculo estriado esquelético (Confortim et al., 2017), disfunções no sistema reprodutor (Brasil et al., 2005; Howie et al., 2012; Ramos et al., 2010), déficit no crescimento do tecido hepático (Lee et al., 2016)) e desregulação da glândula tireóide (Ramos et al., 1997; Ramos et al., 2000).
No tecido ósseo, estudos demonstraram que a desnutrição crônica em ratos que estão na idade de crescimento afeta de forma negativa o crescimento (densidade óssea) e a força da mandíbula (Bozzini et al., 2011) e a espessura de vértebras (Hengsberger et al., 2005).
Estudos em que a restrição proteico-calórica foi realizada nas parturientes durante o período de lactação são escassos, porém, trabalhos que avaliaram o crescimento da mandíbula (Alippi et al., 1999; Degani Junior et al., 2011), tíbia (Fernandes et al., 2007), crânio (Fernandes et al., 2008; Luna et al., 2016) e fêmur (Babinski et al., 2016; Schultz et al., 2017) demonstraram os efeitos prejudiciais e irreversíveis em muitos dos casos, porém, vale ressaltar que muitos destes estudos foram realizados à curto prazo, portanto, não observaram alterações em ratos adultos.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CUIDADOS BIOÉTICOS
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética para o cuidado e uso de animais experimentais do Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes da Universidade do Estado do Rio de Janeiro sob o nº CEUA/036/2010 (Anexo 1) e compõe o protocolo de colaboração científica entre a Universidade do Estado do Rio de Janeiro e Universidade Federal Fluminense (Anexos 2 e 3). Não foi necessária nova aprovação em comitê de ética conforme parecer do Coordenador do Comitê de Ética em Animal da Universidade Federal Fluminense (Anexos 4 e 5).
O manejo dos animais ocorreu de acordo com os princípios descritos em “The
guide for the care and use of laboratory animals” (Bayne, 1996), “CIOMS Ethical code for animal experimentation” (Howard-Jones, 1985) e “Use of animals in experimental surgery” (Schanaider & Silva, 2004).
4.2 AMOSTRA E DIETA
Seis ratas Wistar fêmeas, nulíparas, foram mantidas em biotério com temperatura padronizada (25°C com variabilidade de 10°C para mais ou para menos) e ciclo claro-escuro (7:00-19:00). Aos três meses de idade (90 dias) estes animais acasalaram na proporção de duas fêmeas para um macho, recebendo ração comercial (23% de proteína) até o nascimento dos filhotes, quando então, foram divididas em 3 grupos de estudo:
• Grupo controle (C): com livre acesso à água e à dieta normal (ração comercial com 23% de proteína);
• Grupo restrição proteico-calórica (RPC): com livre acesso à água e à dieta hipoproteica (8% de proteína);
• Grupo restrição calórica (RC): com livre acesso à água, porém submetido à dieta normal (ração comercial com 23% de proteína) restrita às mesmas quantidades ingeridas no dia anterior pelo grupo RPC.
Dessa maneira, os três grupos foram compostos por 12 filhotes machos cada, associados à uma progenitora na proporção de um pra seis, pois, alguns autores afirmam que esse número confere maior potencial lactotrófico (Fishbeck & Rasmussen, 1987).
A dieta hipoproteica foi preparada manualmente e administrada no dia do nascimento dos filhotes. Sua composição pode ser verificada na Tabela 1. A fonte proteica (8%) desta dieta foi ração comercial macerada (Labina® - Purina Nutrimentos LTDA) e as calorias foram compensadas através de acréscimo de amido de milho, a fim de se obter uma dieta hipoproteica e isocalórica. Para avaliar a eficácia das dietas, os animais foram pesados em intervalos de 4 dias durante o estudo.
As vitaminas e os minerais foram suplementados de maneira a se obter a mesma composição da ração comercial, mostrada nas Tabelas 2 e 3, que é baseada nas recomendações do National Research Council e National Institute of Health - USA (Reeves et al., 1993).
Tabela 1 – Composição da dieta normoproteica e hipoproteica
Nutriente Dieta (kg)
Normoproteica Hipoproteica
Energia total (kcal) 4070,4 4070,4
Proteína (%) 23,0 8,0 Hidratos de Carbono (%) 66,0 81,0 Lipídeos (%) 11,0 11,0 Proteína (g) 230,0 80,0 Hidratos de Carbono (g) 676,0 826,0 Lipídeos (g) 50,0 50,0 Mistura de Vitaminas (g) 4,0 4,0
Tabela 2 – Composição da mistura de vitaminas Vitaminas g/kg de mistura Ácido Nicotínico 3,000 Ácido Pantotênico 1,600 Piridoxina - B6 0,700 Tiamina - B1 0,600 Riboflavina 0,600 Ácido Fólico 0,200 Biotina 0,020 Cianocobalamina - B12 2,500 Vitamina E (500 UI/g) 15,00 Vitamina A (500,000 UI/g) 0,800 Vitamina D (400,000 UI/g) 0,250 Vitamina K 0,075
Tabela 3 – Composição da mistura de minerais
Minerais g/kg de mistura
Carbonato de cálcio, 40,04% Ca 357,00 Fosfato de Potássio, 22,76% P; 28,73% K 196,00 Citrato de Potássio, 36,16% K 70,78 Cloreto de Sódio, 39,34% Na; 60,66% Cl 74,00 Sulfato de Potássio, 44,87% K; 18,39% S 46,60 Óxido de Magnésio, 60,32% Mg 24,00 Citrato de Ferro, 16,5% Fé 6,06 Carbonato de Zinco, 52,14% Zn 1,65 Carbonato de Manganês, 47,79% Mn 0,63 Carbonato de Cobre, 57,47% Cu 0,30 Iodeto de Potássio, 59,3% I 0,01 Selenato de Sódio, 41,79% Se 0,010 Paramolibidato de Amônio, 54,34% Mo 0,008
Fonte: Reeves et al. (1993).
4.3 EUTANÁSIA, MORFOMETRIA E PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO
Ao final da lactação, os filhotes de todos os grupos foram desmamados e passaram a receber a mesma ração normoproteica do grupo controle (23% de proteína), sendo acompanhados até 180 dias de idade, quando foram eutanasiados com pentobarbital (0,15 ml/100g/peso corporal). A escolha do tempo de duração do estudo foi baseada no trabalho de Quinn (2005), que sugeriu que um rato de 180 dias de idade é equivalente a um jovem adulto de 18 anos.
O crânio de cada animal foi excisado e fixado em formol a 10% e posteriormente macerado com o propósito de obter crânios secos. Em seguida, os parâmetros morfométricos presentes na Tabela 4 e ilustrados nas Figuras 1, 2, 3, 4 e 5 foram mensurados com o auxílio de um paquímetro digital (Mitutoyo Sul Americana Ltda®, São Paulo, Brasil) e através de radiografias (Philips®, Digital Diagnost® -
ELEVA® 2.1) em duas incidências: perfil e superior, ambas representadas na Figura 6. Para as radiografias, foram utilizados foco fino, 5 miliampere/s e 10 quilovolts.
Tabela 4 – Pontos de reparo para realização das mensurações macroscópicas.
Parâmetro Definição
Altura 1 (A1) Distância entre a ponta superior da crista occipital externa e o nível do forame magno (altura máxima do neurocrânio, nível occipital da caixa craniana);
Altura 2 (A2) Distância entre a borda ântero-medial da bula timpânica direita e a superfície mais dorsoventral do crânio (altura máxima do neurocrânio, nivel parietal da caixa craniana);
Altura 3 (A3) Distância entre as paredes superior e inferior direita da órbita - nível da fissura infraorbitária (altura máxima da cavidade orbital);
Altura 4 (A4) Distância entre a espinha nasal posterior e o bregma (altura máxima do neurocrânio, nível frontoparietal do caixa craniana);
Altura 5 (A5) Distância entre a espinha nasal posterior e o lambda (altura máxima do neurocrânio, nível parieto-occipital da caixa craniana);
Comprimento 1 (C1)
Distância entre a protuberância occipital externa e a margem alveolar do osso incisivo (comprimento retangular máximo do neurocrânio);
Comprimento 2 (C2)
Distância entre a protuberância occipital externa e a margem alveolar do osso incisivo (comprimento dorsoventral máximo do neurocrânio); Comprimento 3
(C3)
Distância entre o aspecto mais ventral do forame magno e da margem do osso alveolar incisivo no plano mediano (comprimento máximo do neurocrânio basal);
Comprimento 4 (C4)
Distância da ponta mais ventral do osso nasal até a sutura frontonasal (comprimento máximo do osso nasal);
Comprimento 5 (C5)
Distância entre a espinha nasal posterior e a margem alveolar do osso incisivo (comprimento máximo do osso palatino);
Comprimento 6 (C6)
Distância entre o aspecto mais ventral do forame magno e a espinha nasal posterior (comprimento máximo do osso esfenoide);
Comprimento 7 (C7)
Distância entre o aspecto mais ventral da margem infraorbital e supraorbital do lado direito (comprimento máximo da cavidade orbital);
Largura 1 (L1) Distância entre a margem direita e esquerda da sutura nasomaxilar no nível da borda infraorbital medial (largura nasal);
Largura 2 (L2) Distância entre a face lateral da borda infraorbital pré-maxilar direita e esquerda (largura do pré-maxilar);
Largura 3 (L3) Distância entre a região mais estreita (linha temporal, nível da sutura processo zigomático-malar) à direita e à esquerda do osso frontal (largura frontal);
Largura 4 (L4) Distância entre borda ântero-medial da bula timpânica direita e a borda ântero-medial da bula timpânica esquerda.
Figura 1 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (L1, L2, L3, L4 e C4)
Fotografia representando alguns dos parâmetros morfométricos analisados no presente trabalho. Fonte: Dados do estudo.
Figura 2 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (C3, C5 e C6)
Fotografia representando alguns dos parâmetros morfométricos analisados no presente trabalho. Fonte: Dados do estudo.
Figura 3 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A1, A2, C1 e C2)
Fotografia representando alguns dos parâmetros morfométricos analisados no presente trabalho. Fonte: Dados do estudo.
Figura 4 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A4 e A5)
Fotografia representando alguns dos parâmetros morfométricos analisados no presente trabalho. Fonte: Dados do estudo.
Figura 5 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS (A3 e C7)
Fotografia representando alguns dos parâmetros morfométricos analisados no presente trabalho. Fonte: Dados do estudo.
Figura 6 – MORFOMETRIA NA RADIOGRAFIA
Exemplificação das mensurações realizadas através da radiografia. Fonte: Dados do estudo.
Para a análise histomorfométrica, as amostras foram descalcificadas em uma solução de ácido nítrico a 5%. Após isso, foram realizadas secções frontais de 5µm de espessura de quatro regiões da díploe do neurocrânio (násion, bregma, vértex e ínion, Figura 7) e estes fragmentossofreram preparação histológica de rotina e posterior inclusão em parafina (Behmer et al., 1975).
Figura 7 – PONTOS DE CORTE HISTOLÓGICO
Regiões de cortes coronais para análise histológica. Legenda: 1: násion; 2: bregma; 3: vertex; 4: ínion. Adaptado de Greene (1935).
Após este processamento e subsequente corte, os fragmentos foram corados com hematoxilina & eosina (H&E) (Bancroft & Stevens, 1996) e levadas ao microscópio de luz para observação e captura de imagens para serem analisadas pelo software ImageJ® (versão 1.52, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA).
Cinco mensurações aleatórias foram realizadas em cinco campos aleatórios de cada lâmina (aumento de 40X), conforme exemplifica a Figura 8. Estes dados foram expressos em milímetros (mm).
Figura 8 – MENSURAÇÃO DA ESPESSURA DO OSSO
Exemplificação de como a espessura do crânio nos quatro pontos (ínion, bregma, vértex e násion) foi obtida. Aumento de 40X. Hematoxilina & Eosina. Fonte: Dados do estudo.
As lacunas foram analisadas em cinco campos aleatórios do osso cortical (aumento de 100X), seu tamanho foi expresso em micrômetros (µm) e a quantidade de lacunas vazias (proporção entre lacunas preenchidas e lacunas vazias) foi expressa em percentual. Estes parâmetros histomorfométricos foram baseados no artigo de Vidal et al. (2012).
As imagens para análise foram obtidas em microscópio óptico Olympus acoplado a uma câmera de vídeo Sony CCD, sendo a imagem dos campos microscópicos transferida para um monitor.
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada com auxílio do programa estatístico IBM SPSS (versão 21, Armonk, New York, USA). Os dados apresentados neste trabalho estão sob o formato de média e desvio padrão (média±desvio padrão ou percentual±desvio padrão). O teste estatístico de ANOVA (análise de variância) seguido pelo teste de Newman-Keuls foi utilizado para comparar as médias entre os três grupos estudados.
O teste qui-quadrado foi utilizado para comparar o percentual de lacunas vazias entre os grupos. O teste de Bland-Altman foi utilizado para comparar os dados morfométricos coletados via mensuração com paquímetro e via mensuração através de radiografias.
Para todas as análises estatísticas, o valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA
O peso médio em grama dos animais ao término do estudo foi de 483,2 ±47,6, 415,7± 39,8 e 402,7±42,87 para os grupos C, RC e RPC, respectivamente (Gráfico 1). Quando o grupo C foi comparado com os grupos RC e RPC houve diferença significativa (p < 0,05), porém, quando o grupo RC foi comparado com o grupo RPC, não houve (p > 0,05).
Gráfico 1 – PESO TOTAL DOS ANIMAIS AO TÉRMINO DO ESTUDO
Peso total dos ratos no último dia de estudo (em gramas). As diferenças entre o grupo C e os grupos RC e RPC foram significativas. Já as diferenças entre o grupo RC e o grupo RPC não foram estatisticamente significativas. Fonte: Dados da pesquisa.
A média do peso dos crânios foi de 9,17±1,87 g, 8.96±3,55 g e 7,98±2,13 g para os grupos C, RC e RPC, respectivamente. Esses valores não tiveram diferenças estatisticamente significativas (p > 0,05). O peso dos animais e o peso do crânio pode ser conferido no Gráfico 2.
Gráfico 2 – PESO TOTAL DOS CRÂNIOS AO TÉRMINO DO ESTUDO
Peso total dos crânios nos três grupos (em gramas). Não houve diferença significativa. Fonte: Dados do estudo.
Em relação às medidas de altura, foi observado que houve uma redução estatisticamente significativa (p < 0,05) entre o grupo C e o grupo RPC em todas as mensurações realizadas. Quando o grupo C foi comparado com o grupo RC, somente a medida A3 foi estatisticamente significativa (p < 0,05). Quando o grupo RC foi comparado com o grupo RPC, as mensurações A1 e A1 foram estatisticamente significativas (p < 0,05).
Em relação ao comprimento, foi observada redução estatisticamente significativa nas medidas C3, C5 e C6 quando o grupo C foi comparado com o grupo RC (P < 0,05). Quando o grupo C foi comparado com o grupo RPC, as medidas C3, C4, C5 e C6 tiveram diferenças significativas (p < 0,05). Porém, quando o grupo RC foi comparado com o grupo RPC, nenhuma mensuração teve diferença significativa (p > 0,05).
Ao compararmos a largura do crânio dos grupos C e RC, somente a largura do pré-maxilar (L2) teve alterações estatisticamente significativas (p < 0,05). Quando o grupo C foi comparado com o grupo RPC, as medidas L1, L2 e L3 tiveram diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05). Ao compararmos o grupo RC com o grupo RPC, não houve diferença significativa (p > 0,05) em nenhuma mensuração.
A média e a análise estatística para cada mensuração pode ser conferida na Tabela 5.
Tabela 5 – Resultados morfométricos (em milímetros) dos ratos adultos (180 dias) Grupos Valor de p Parâmetro C RC RPC C vs RC C vs RPC RC vs RPC Altura 1 12,49±0,42 12,17±0,29 11,29±0,38 > 0,05 < 0,05 < 0,05 Altura 2 14,93±0,59 14,70±0,28 14,29±0,87 > 0,05 < 0,05 < 0,05 Altura 3 4,97±0,32 4,58±0,22 4,49±0,25 < 0,05 < 0,05 > 0,05 Altura 4 13,49±0,37 13,29±0,34 13,02±0,60 > 0,05 < 0,05 > 0,05 Altura 5 18,03±0,58 17,70±0,40 17,10±0,70 > 0,05 < 0,05 > 0,05 Comprimento 1 48,06±1,37 47,52±1,05 47,43±0,99 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Comprimento 2 47,81±1,45 47,17±1,00 47,14±0,95 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Comprimento 3 45,79±1,37 44,91±1,03 44,74±1,06 < 0,05 < 0,05 > 0,05 Comprimento 4 19,64±0,71 19,04±0,83 18,83±0,46 > 0,05 < 0,05 > 0,05 Comprimento 5 26,92±0,79 26,59±0,61 26,47±0,52 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Comprimento 6 27,04±0,81 26,72±0,59 26,73±0,54 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Comprimento 7 6,25±0,31 5,85±0,35 5,59±0,22 < 0,05 < 0,05 > 0,05 Largura 1 4,48±0,19 4,38±0,22 4,17±0,22 > 0,05 < 0,05 > 0,05 Largura 2 8,03±0,23 7,69±0,16 7,61±0,13 < 0,05 < 0,05 > 0,05 Largura 3 7,40±0,19 7,25±0,21 7,09±0,22 > 0,05 < 0,05 > 0,05 Largura 4 17,06±0,41 17,16±0,25 17,00±0,34 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Resultados expressos em milímetros através de média±desvio padrão (12 animais por grupo). Legenda: C: grupo controle; RC: grupo restrição calórica; RPC: grupo restrição protéico-calórica Fonte: Dados da pesquisa.
Não houve diferenças significativas entre as mensurações realizadas com auxílio do paquímetro digital e as mensurações feitas através de radiografias (p > 0,05).
5.2 ANÁLISE MICROSCÓPICA
Foi observado nas imagens histológicas que os grupos RC e RPC tiveram uma proporção maior de lacunas vazias no osso cortical do que o grupo C (Figuras 9, 10 e 11). As proporções de lacunas vazias para os grupos C, RC e RPC foram: 7,65%±2,23, 8,36%±3,67, e 10,41%±2.91, respectivamente. Essa diferença não foi estatisticamente significativa (p > 0,05).
Figura 9 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO CONTROLE
Há uma pouca proporção de lacunas vazias (seta preta) no grupo controle. Aumento de 100X. Hematoxilina & Eosina. Fonte: Dados do estudo.
Figura 10 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO RESTRIÇÃO CALÓRICA
Há uma proporção de lacunas vazias (setas pretas) ligeiramente maior que o grupo controle. Aumento de 100X. Hematoxilina & Eosina. Fonte: Dados do estudo.
Figura 11 – ASPECTO HISTOLÓGICO DO CRÂNIO DO GRUPO RESTRIÇÃO PROTEÍCO-CALÓRICA
Observe o número abundante de lacunas vazias (setas pretas) no crânio dos ratos do grupo RPC. Aumento de 100X. Hematoxilina & Eosina. Fonte: Dados do estudo.
Já a análise histomorfométrica do tamanho das lacunas revelou uma área média de 6,72±3,23 µm, 8,13±2,81 µm e 9,54±3,77 µm para os grupos C, RC e RPC, respectivamente, sem alterações estatisticamente significativas (p > 0,05).
Em relação à espessura, houve diferença significativa entre o vertex nos três grupos (p < 0,05). Ainda, houve diferença significativa (p < 0,05) entre o grupo C e o grupo RPC no que tange a análise do bregma e násion. A média detalhada de todas as mensurações pode ser conferida na Tabela 6 e no Gráfico 3.
Tabela 6 – Espessura do crânio nos três grupos. Grupos Valor de p Região C RC RPC C vs RC C vs RPC RC vs RPC Bregma 0,30±0,03 0,29±0,04 0,27±0,02 > 0,05 < 0,05 < 0,05 Ínion 0,37±0,01 0,37±0,04 0,35±0,04 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Násion 0,34±0,04 0,32±0,03 0,32±0,01 < 0,05 < 0,05 > 0,05 Vertex 0,26±0,03 0,24±0,02 0,21±0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 Resultados expressos em média±desvio padrão (12 animais por grupo). Legenda: C: grupo controle; RC: grupo restrição calórica; RPC: grupo restrição protéico-calórica Fonte: Dados da pesquisa.
Gráfico 3 – ESPESSURA DO CRÂNIO NOS PONTOS ESTUDADOS DOS 3 GRUPOS
Gráfico representando a espessura média de cada grupo nas regiões estudadas. Fonte: Dados da pesquisa.
6 DISCUSSÃO
O período de amamentação é essencial para o correto desenvolvimento do recém-nascido, uma vez que beneficia múltiplos sistemas do organismo. Sabe-se que a dieta da mãe afeta diretamente a qualidade e a quantidade do leite produzido. Apesar disso, há taxas significativas de desnutrição materna em países desenvolvidos e em desenvolvimento (Ahsan et al., 2017; Ares Segura et al., 2016; Haileslassie et al., 2013; Jeong et al., 2017; Kavle et al., 2018; Rajendram et al., 2017).
Os efeitos da desnutrição materna durante a gravidez têm sido amplamente estudados na literatura. Esses estudos comprovaram a teoria do “metabolic imprinting” (ou programação fetal), na qual os efeitos causados durante a vida intrauterina podem induzir distúrbios metabólicos em períodos tardios (Barker, 2000; Barker, 2012; Hyde et al., 2017; Kumar et al., 2017; Lee et al., 2016; Rajendram et al., 2017).
No entanto, estudos mostraram que o período de lactação também é um momento crítico para induzir alterações de desenvolvimento em diversos tecidos. Dessa maneira, o “metabolic imprinting” pode ocorrer até o final do período de amamentação (Babinski et al., 2016; Confortim et al., 2017; Fernandes et al., 2008; Fernandes et al., 2007; Luna et al., 2016; Natt et al., 2017; Qasem et al., 2016; Schultz et al., 2017; Victora et al., 2016).
O presente estudo mostrou que o crânio no grupo RPC foi significativamente menor do que nos grupos C ou RC, em especial, no que tange a altura. Além disso, a espessura média do crânio foi significativamente menor no grupo RPC em duas regiões, das quatro analisadas. Portanto, foi observado um impacto negativo no crescimento do crânio causado pela restrição proteico-calórica materna durante o período de lactação, o que corrobora para a extensão do período de programação fetal até o fim da amamentação.
O estudo realizado por Ramirez Rozzi et al. (2005) demonstrou mudanças relacionadas ao tamanho, e não à forma, do crânio do macaco-esquilo submetido à uma dieta pobre em proteína. O que vai de acordo com nossos resultados, visto que não foram observadas mudanças na forma do crânio de ratos Wistar.
Luna et al. (2016), em um estudo realizado com ratos Wistar, demonstrou também que houve diminuição significativa de diversos parâmetros anatômicos no que tange o tamanho do crânio desses animais. Apesar disso, os autores associaram a desnutrição durante o período de gravidez, lactação e à intervenção cirúrgica de fechamento das artérias uterinas. Este estudo é bastante interessante e permite certa comparação com o presente trabalho devido ao fato de que foi realizado à longo prazo (210 dias), e o método de mensuração também foi o mesmo: a radiografia.
Ambos os estudos supracitados demonstram que apesar das diferenças metodológicas, os efeitos causados pela desnutrição materna no período de aleitamento são similares, em especial, à longo prazo, um tema pouco explorado na literatura.
O “catch-up growth” é considerado como o crescimento compensatório durante a janela de recuperação após uma determinada restrição de crescimento. Pode ser completo (tipo A) quando o animal atinge o tamanho adulto normal ou incompleto (tipo B), quando este não consegue atingir a curva de crescimento normal. O conceito de
“catch-up growth” foi bem explicado por Boersma & Wit (1997) e está diretamente
relacionado com o conceito de programação fetal.
Muito se sabe sobre o “catch-up growth”, no entanto, há incerteza se esta retomada no crescimento (tipo A) é possível ou não, pois há um mosaico de resultados diferentes na literatura, especialmente quando ambos os períodos (gravidez e amamentação) são considerados separadamente (Alippi et al., 1999; Babinski et al., 2016; Qasem et al., 2016; Schultz et al., 2017).
Quando utilizamos este termo no presente estudo, o conceito de “catch-up
growth” é considerado como o período em que o crescimento do crânio dos ratos dos
grupos RC e RPC levaria para atingir o crescimento do crânio dos animais do grupo C. Um estudo anterior realizado por Fernandes et al. (2008) observou resultados semelhantes aos nossos, embora em ratos jovens (21 dias). Quando seus resultados são comparados com os apresentados neste estudo, fica claro que o “catch-up growth” não foi possível, uma vez que essas mudanças no crescimento do crânio se perpetuaram mesmo após a ingestão de dieta regular dos ratos adultos após o aleitamento.
O estudo das lacunas que circundam o osteócito é usado para medir as alterações patológicas no tecido ósseo causadas pela osteoporose, por exemplo. Portanto, pode ser
um indicador de anormalidades no osso (Bai et al., 2016; van Oers et al., 2015). Uma porcentagem ligeiramente maior de lacunas vazias pôde ser observada nos grupos RC e RPC. Embora não tenham sido estatisticamente significantes, esses resultados podem indicar que houve de fato uma lesão no tecido ósseo causada pela desnutrição materna durante o período de lactação.
Além disso, alguns autores propuseram o estudo do tamanho das lacunas. O estudo realizado por Babinski et al. (2018), em ratos desnutridos durante a amamentação, evidenciou um aumento significativo do tamanho das lacunas na porção cortical do fêmur dos animais em restrição proteico-calórica, assim como o fêmur dos animais em restrição calórica, quando comparados com o grupo controle. Neste estudo, os autores propuseram uma possível relação entre a lacuna e a osteoporose, ou, seu início.
Da mesma maneira, foram encontradas lacunas de tamanho maior no grupo RPC em comparação com o grupo RC e o grupo C. Apesar disso, nossos resultados não necessariamente corroboram que tenha ocorrido o mesmo tipo de degeneração óssea, visto que o fêmur se trata de um osso longo e sujeito a carga e turnover celular intenso (Babinski et al., 2018), enquanto que os ossos do crânio são ossos planos e que não recebem cargas contínuas (Testut & Latarjet, 1958).
Lacunas maiores podem ser indicadores de degradação de tecido ósseo, como por exemplo, uma hipomineralização do osso e reabsorção óssea, demonstrado por alguns estudos experimentais (Bonivtch et al., 2007). Porém, ainda há divergências sobre esse fato na literatura, e ainda é motivo de pesquisas inovadoras com o propósito de elucidar o real significado da histomorfometria das lacunas dos osteócitos (Dong et al., 2014; Mader et al., 2013).
Outro ponto importante de se conhecer os efeitos gerados pela desnutrição durante a lactação é a relação direta que o crânio possui com o desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Dessa maneira, sabe-se que algumas condições ósseas podem levar a má formação nervosa, como por exemplo, a sinostose prematura, que, em alguns casos, pode causar distúrbios cognitivos, visuais, de audição e linguagem, assim como aumento da pressão intracraniana (Ghizoni et al., 2016).
Esta relação fica evidente quando observamos o exemplo contrário: o desenvolvimento anormal do SNC pode ser encontrado na doença Zika, que por sua vez, origina a microcefalia (Nunes et al., 2016).
O presente trabalho não nos permite realizar esse tipo de discussão, mas, sabe-se que esses fatores estão intimamente relacionados devido a uma provável causa genética, porém, não existe ainda resposta concreta a respeito dessa relação ontogênica (Ghizoni et al., 2016).
Podemos explorar esse fato a partir da comparação dos achados presentes nesse estudo com os trabalhos realizados por Belluscio et al. (2014) e Natt et al. (2017), que observaram comportamentos depressivos e de ansiedade, assim como diminuição de reflexos e raciocínio em ratos cujas progenitoras foram desnutridas durante o período perinatal.
7 CONCLUSÕES
Em suma, o presente trabalho observou que a desnutrição durante o período de aleitamento causou mudanças macro e microscópicas no crânio da prole. Houve uma redução sensível no tamanho do crânio, em especial nas medidas relacionadas à altura, assim como a redução na espessura do bregma e násion, evidenciadas pela análise histológica.
O presente trabalho observou também que tais alterações não foram recuperadas na idade adulta mesmo após a normalização da dieta, o que corrobora negativamente para a teoria de “catch-up growth”.
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9 ANEXOS
9.4 E-MAIL PARA O COMITÊ DE ÉTICA E CUIDADOS EM ANIMAIS DA UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
9.5 RESPOSTA DO COMITÊ DE ÉTICA E CUIDADO EM ANIMAIS ANIMAL DA UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
