Síntese de novos híbridos derivados de tacrina, lofina, pirimidina e carboidratos, compostos com potencial aplicação no tratamento da doença de Alzheimer

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

SÍNTESE DE NOVOS HÍBRIDOS DERIVADOS DE TACRINA, LOFINA,

PIRIMIDINA E CARBOIDRATOS, COMPOSTOS COM POTENCIAL

APLICAÇÃO NO TRATAMENTO DA DOENÇA DE ALZHEIMER

Tese de Doutorado

JOÃO PAULO BIZARRO LOPES

Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Ceschi

II UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

JOÃO PAULO BIZARRO LOPES

SÍNTESE DE NOVOS HÍBRIDOS DERIVADOS DE TACRINA, LOFINA,

PIRIMIDINA E CARBOIDRATOS, COMPOSTOS COM POTENCIAL

APLICAÇÃO NO TRATAMENTO DA DOENÇA DE ALZHEIMER

Tese apresentada como requisito parcial para a obtenção do grau de doutor em Química

Prof. Dr. Marco Antonio Ceschi Orientador

IV "O heroísmo não consiste em não ter medo, mas sim em superá-lo!"

(Roberto Gómez Bolaños - criador e intérprete do Chapolin Colorado)

Dedico este trabalho aos meus pais, José Marcio Pereira Lopes (in memoriam) e Denise Bizarro Lopes.

V

AGRADECIMENTOS

À minha mãe, professora Denise Bizarro Lopes, pela minha educação, pelo carinho, por me guiar sempre pelo caminho da honestidade e por me ensinar a respeitar. Por ter compreendido e apoiado a minha escolha de seguir numa carreira que exige muito estudo e dedicação, mas que ainda é pouco valorizada em nosso país. Por ser um exemplo de profissional. Por ser a minha mãe.

Aos meus irmãos João Marcos e Maria Laura, pelo amor e companheirismo que a distância não diminui. Pelos momentos que compartilhamos e fazemos questão de estar juntos. Pela compreensão da minha ausência.

À minha avó, Ceneida Bizarro, pelo carinho e amor incondicionais aos seus netos. Pela compreensão da minha ausência. Pela festa que sempre faz quando vou lhe visitar.

Ao meu orientador, professor doutor Marco Antonio Ceschi, pela excelente orientação. Pela convivência muito próxima que tivemos nesses anos com a qual pude aprender mais do que química, mas como ser um bom e sério cientista. Pela liberdade a mim conferida de tomar decisões com relação ao trabalho, tanto no experimental quanto na escrita, o que creio ser fundamental no processo de formação de um cientista.

Aos professores Diogo Seibert Lüdtke, Leandra Franciscato Campo, Dennis Russowsky e Fabiano Severo Rodembusch, pelo apoio a mim prestados em variadas situações em diversos momentos do meu doutorado.

Ao doutor Laurent Emmanuel Dardenne e à doutora Isabella Alvim Guedes, pelo esforço para realizar os estudos de modelagem molecular e a discussão dos resultados a tempo de incluí-los nas patentes, no artigo e nesta tese de doutorado. Por terem sido atenciosos e prestativos em diversos momentos do meu doutorado e pelo conhecimento transmitido.

Aos professores e ex-colegas de laboratório Jessie Sobieski da Costa e Douglas Gamba, pelo companheirismo e pelo apoio prestados em diversos momentos.

Ao meu colega, doutorando Viktor Saraiva Câmara, pela divertida e produtiva convivência no laboratório. Pela troca de experiências, pela paciência e pelo exemplo de profissional. Pela amizade adquirida.

Aos colegas Gabriela, Brunella, Franciela, Ana Júlia, Renan, Patrick e Rafael, com os quais tive o prazer de trabalhar junto durante o meu doutorado.

VI Aos demais colegas, atuais e ex-integrantes do laboratório K-215, pelos divertidos momentos que tornaram o ambiente de trabalho agradável.

Aos meus amigos da Parsa, pela amizade que se mantém desde a graduação. Pelos momentos de descontração e diversão sem os quais é impossível manter uma mente sadia.

Aos meus sogros, Edite e José Gonzaga, por todo carinho e apoio que recebo. Pela compreensão nos momentos de ausência.

À minha companheira canina, Lola, que é um exemplo de amor incondicional e companheirismo.

À minha melhor companheira, melhor amiga, meu amor, minha namorada, Luana Silva. Por todo o amor que sei que sente por mim e que me permite sentir o mesmo. Por me tornar uma pessoa melhor. Por me fazer me sentir mais completo. Por todo carinho que me transmite. Por me permitir contemplar a experiência única que é ver o brilho do seus olhos (os quais não há mais bonitos) e sentir que sou amado. Por toda a paciência e compreensão que sei que foi muito necessária nessa reta final do meu doutorado. Por fazer parte dessa conquista junto comigo. Pela ajuda na tese. Pelo fornecimento dos tosilatos dos carboidratos (a colaboração foi estabelecida pelos orientadores antes do namoro, a colaboração com a namorada foi uma mera e feliz coincidência).

A todos, muito obrigado! João Paulo

VII

SUMÁRIO

3.1.2. Características Patológicas e Hipóteses ... 11

3.2. Hipótese Colinérgica e Enzimas Colinesterases ... 14

3.2.1. Mecanismo de transmissão colinérgica ... 14

3.2.2. Acetilcolinesterase ... 16

3.2.3. Butirilcolinesterase ... 25

3.3. Inibidores de Colinesterases ... 30

3.3.1. Híbridos multialvo baseados em tacrina ... 32

3.4. Núcleo Lofina e Derivados Imidazólicos ... 41

3.5. Núcleo Pirimidina Derivado da Reação de Biginelli ... 44

3.6. Carboidratos e Derivados ... 49

3.5.1. Interações CH/π entre carboidratos e anéis aromáticos ... 50

3.5.2. Derivados de carboidratos com atividade anti-beta amilóide (anti-Aβ) ... 52

3.5.3. Derivados de carboidratos com atividade anticolinesterase ... 53

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 59

4.1. Metodologia ... 59

4.2. Síntese dos Derivados da Tacrina ... 60

4.2.1. Síntese da 9-cloro-1,2,3,4-tetraidroacridina (5) ... 60

4.2.2. Obtenção das 9-aminoalquil-1,2,3,4-tetraidroacridinas (1a-e) ... 62

4.3. Síntese dos Derivados da Lofina ... 65

4.4. Síntese da Pirimidina Derivada da Reação de Biginelli ... 71

4.4.1. Reação de Biginelli para obtenção da 6-metil-2-oxo-4-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidina-5-carboxilato de etila (7) ... 71

4.4.2. Oxidação seletiva da DHPM 7 ... 75

4.4.3. Cloração com POCl3 ... 79

4.5. Híbridos Tacrina-pirimidina e Lofina-pirimidina ... 81

4.5.1. Síntesedos Híbridos Tacrina-Pirimidina e Lofina-Pirimidina ... 81

4.5.2. Caracterização Espectroscópica dos híbridos tacrina-pirimidina e lofina-pirimidina ... 83

VIII

4.6.1. Tosilato da D-xilose ... 93

4.6.2. Tosilato da D-ribose ... 94

4.6.3. Tosilato da D-galactose ... 95

4.7. Híbridos Derivados de Carboidratos ...95

4.7.1. Síntese dos Híbridos Tacrina-carboidratos e Lofina-carboidratos ...95

4.7.2. Caracterização espectroscópica dos híbridos derivados de carboidratos ...104

4.7.3. Tentativa de desproteção dos carboidratos ...114

4.8. Atividade Anticolinesterase dos Compostos Sintetizados ...115

4.8.1. Híbridos tacrina-pirimidina e lofina-pirimidina ...115

4.8.2. Híbridos derivados de carboidratos ... 117

4.9. Estudos de Modelagem Molecular ...123

4.9.1. Híbridos tacrina-carboidratos ... 124

4.9.2. Híbridos lofina-carboidratos ... 130

4.9.3. Predição do perfil farmacocinético dos híbridos tacrina-carboidratos ... 132

5. CONCLUSÕES ...135

6. PARTE EXPERIMENTAL ...137

6.1. Materiais e Métodos ...137

6.2. Procedimentos de Síntese ...138

6.2.1. Procedimento para a síntese da 9-cloro-1,2,3,4-tetraidroacridina (5) ...138

6.2.2. Procedimento geral para a síntese das 9-aminoalquil-1,2,3,4-tetraidroacridinas (1a-e).138 6.2.3. Procedimento geral para a proteção seletiva das 1,n-alcanodiaminas e obtenção das aminas protegidas 20a-e ...141

6.2.4.Procedimento geral para a síntese tetracomponente das (n-(2,4,5-trifenil-1H-imidazol-1- il)alquil)carbamato de terc-butila (21a-e) ...143

6.2.5. Procedimento geral para a desproteção de 21a-e e obtenção das n-(2,4,5-triphenil-1H- imidazol-1-il)alcanaminas 9a-e ... 146

6.2.6. Procedimento para a síntese da 6-metil-2-oxo-4-fenil-1,2,3,4-tetraidropirimidina-5- carboxilato de etila (7) (Reação de Biginelli) ...150

6.2.7. Procedimento para a obtenção da 2-cloro-4-metil-6-fenil-pirimidina-5-carboxilato de etila (6) ... 151

6.2.8. Procedimento geral para a síntese dos híbridos tacrina(n)-pirimidinas (43a-c) e lofina(n)- pirimidinas (44a-c) ... 152

6.2.9. Síntese dos tosilatos derivados de carboidratos ...156

6.2.10. Procedimento geral para a síntese dos híbridos tacrina(n)-carboidratos e lofina(n)- carboidratos ... 159

IX

6.4. Estudos de Modelagem Molecular ...173

APÊNDICE ...175

Apêndice A: Estruturas dos Aminoácidos ...175

Apêndice B: Modelagem Molecular ...176

Apêndice C: Espectros de RMN dos Compostos Sintetizados ...180

Apêndice D: Espectros de IV dos Compostos Inéditos ...257

X

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Fármacos aprovados para o tratamento da doença de Alzheimer. ...3 Figura 2. Ação do bis-tacrina nos dois sítios da enzima acetilcolinesterase. ...4 Figura 3. Compostos sintetizados pelo nosso grupo com atividade anticolinesterase. ...5 Figura 4. a) clivagem da proteína APP gerando o peptídeo Aβ; b) comparação da proteína tau associada aos microtúbulos (acima) e hiperfosforilada (abaixo). Créditos da imagem: Shutterstock®. ... 12 Figura 5. Estrutura do neurotransmissor acetilcolina (à esquerda) e representação esquemática da sinapse química entre dois neurônios (à direita). Figura extraída do livro Princípios de Bioquímica de Lehninger, 6ª ed., pg. 466. ... 15 Figura 6. a) Estrutura do monômero da MmAChE com destaque para o sítio ativo (azul claro) e o domínio WAT em hélice α; b) Vista de cima da estrutura tetramérica da MmAChE, com cada monômero representado por uma cor, o sítio ativo em azul claro, a Ser203 da tríade catalítica em verde e os domínios WAT ao centro, circundando o PRAD; c) e d) Representação esquemática da ancoragem da AChE em células neuronais via PRiMA (c) e em lâmina basal via ColQ (d). ... 18 Figura 7. a) Cavidade do sítio ativo da AChE, onde a linha pontilhada representa o espaço disponível, mais estreito na entrada; b) Representação do complexo ES antes de reagir: interação cátion-π com Trp84 e LH com Gly118-119. ... 20 Figura 8. a) Visão geral do sítio ativo da AChE destacando as portas alternativas com os caminhos de saída indicados por flecha, indicando a saída de tiocolina. Figura obtida a partir de fotos instantâneas da tiocolina obtidas na dinâmica molecular do trabalho de Xu et al.; b) Posições do Trp84, Trp432, Tyr442 e da TCh obtidas partir da conformação nativa (verde) e a instantâneos obtidos a partir da dinâmica molecular em 4,2 ns (azul) e17,1 ns (violeta) ... 24 Figura 9. Ésteres hidrolisados pela enzima butirilcolinesterase (BuChE). ... 26 Figura 10. Superposição das estruturas da TcAChE (PDB ID 2CKM, azul claro) e hBuChE (PDB ID 4BDS, verde) com o substrato acetilcolina, obtidas do docking pela equipe colaboradora do LNCC. ... 27 Figura 11. Derivados da tacrina (a) e da 7-metóxi-tacrina, 7-MEOTA (b). ... 32 Figura 12. Comparação da conformação nativa (azul claro), com a da enzima inibida (violeta) pelo bis(7)-tacrina (verde, à esquerda) e o bis(5)-tacrina (verde, à direita)... 33

XI Figura 13. a) Híbridos tacrina-tianeptina; b) Representação da estrutura inibidor-enzima (acima) e os modos de ligação do enantiômero híbrido (n = 3, X = Cl) com os aminoácidos (abaixo), obtidos in silico... 40 Figura 14. Derivados imidazólicos: a) lofina e fármacos comercializados; b) testados como inibidores de colinesterase. ... 42 Figura 15. a) derivados de Hantzsch; b) derivados de Biginelli. ... 46 Figura 16. Interações do composto AAP1 na TcAChE: a) representação 2D; b) adaptada da figura do docking do trabalho de Ahmad et al. ... 47 Figura 17. Interações do composto AAP2 na TcAChE: a) representação 2D; b) adaptada da figura do docking do trabalho de Ahmad et al. ... 48 Figura 18. Representação esquemática das interações CH/π da β-D-galactose (esquerda) e α-D-galactose (direita) com o anel indólico. As ligações C-H axiais estão destacadas em azul. 51 Figura 19. Relação entre a superfície de potencial eletrostático (ESP) da D-galactose e a formação de interações CH/π: A) estrutura tridimensional; B) ESP, onde as regiões em azul são as áreas com menor densidade eletrônica; C) representação das interações com anéis aromáticos. ... 51 Figura 20. Produtos naturais derivados de carboidratos com atividade anti-Aβ. ... 53 Figura 21. Produtos naturais derivados de carboidratos com atividade anticolinesterase... 54 Figura 22. Derivados de carboidratos contendo selênio: a) selenoureidoiminoaçúcares inibidores da AChE; b) selenocarboidratos sintetizados pelo grupo de Lüdtke. ... 56 Figura 23. Iminoaçúcares de Decrooq et al.a) inibidores da AChE e da BuChE; b) inibidores seletivos da BuChE... 57 Figura 24. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) da 9-cloro-1,2,3,4-tetraidroacridina (5), com ampliação entre 7,40 e 8,15 ppm (acima e à esquerda). ... 62 Figura 25. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) da amina 1a, com ampliação entre 7,3 e 8,0 ppm (acima e à esquerda) e entre 1,4 e 1,8 ppm (acima e à direita). ... 64 Figura 26. Espectro de RMN de 1H (DMSO-d6, 300 MHz) do composto 21c, com ampliação entre 6,6 e 8,2 ppm (acima e à esquerda)... 70 Figura 27. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) do composto 9c, com ampliação entre 7,0 e 7,8 ppm (acima e à esquerda). ... 70 Figura 28. Espectro de RMN de 1H (DMSO-d6, 300 MHz) da DHPM 7. ... 73 Figura 29. Rotas possíveis para o mecanismo da reação de Biginelli: a) rota do íon imínio; b) rota da enamina; c) rota Knoevenagel.. ... 74

XII Figura 30. Comparação dos espectros de RMN de 1H da DHPM 7, acima em verde (DMSO-d6, 300 MHz), com o do produto de oxidação 26, abaixo em vermelho (CDCl3, 300 MHz). . 79 Figura 31. Comparação dos espectros de RMN de 1H da DHPM 7, acima em verde (DMSO-d6, 300 MHz), com o do produto de oxidação 26, no meio em vermelho (CDCl3, 300 MHz) e do produto de cloração, a pirimidina 6, abaixo em azul (CDCl3, 300 MHz)... 80 Figura 32. Comparação dos espectros de RMN de 13C (APT) da DHPM 7, acima em verde (DMSO-d6, 75 MHz), com a da pirimidina 6, abaixo em azul (CDCl3, 75 MHz). ... 81 Figura 33. a) Estrutura do híbrido 43a com carbonos numerados; b) ampliação do espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) de 43a entre 7,2 e 8,0 ppm e c) entre 1,0 e 5,4 ppm. ... 84 Figura 34. a) Estrutura do híbrido 43a com carbonos numerados; b) Espectro de RMN de 13C (APT, CDCl3, 75 MHz) do híbrido 43a, ampliação entre 115 e 170 ppm e c) 10 e 70 ppm. ... 86 Figura 35. a) Ampliação do RMN bidimensional 1H-13C HSQC do híbrido 43a na região dos aromáticos e comparação com o APT da amina 1a (à direita) para identificação dos carbonos; b) Ampliação do HSQC do híbrido 43a na região dos alifáticos. ... 87 Figura 36. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) do híbrido 43a (acima) e 44a (abaixo). Em negrito estão destacados os hidrogênios do núcleo pirimidina. ... 88 Figura 37. Espectro de RMN de 13C (APT, CDCl3, 75 MHz) do híbrido 43a (acima) e 44a (abaixo). Em negrito estão destacados os carbonos do núcleo pirimidina. ... 89 Figura 38. Espectro HMQC do híbrido lofina(6)-pirimidina 44a, ampliação na região dos a) aromáticos e b) alifáticos. Em negrito estão destacados os C e H do núcleo pirimidina. ... 90 Figura 39. Espectros de IV (pastilha de KBr) dos híbridos tacrina(6)-pirmidina (43a, acima) e lofina(6)-pirimidina (44a, abaixo). ... 91 Figura 40. Carboidratos naturais precursores dos tosilatos utilizados neste trabalho. ... 92 Figura 41. Panorama geral dos rendimentos obtidos para os híbridos sintetizados. ... 100 Figura 42. Proposta de formação de uma ligação de hidrogênio no estado de transição da SN2 no anel da a) D-galactose e b) D-xilose. Essa interação é observada no produto (à direita). .. 103 Figura 43. a) Estrutura do híbrido tacrina(6)-D-xilose (54c); b) Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) de 54c, destacando ampliações; e c) Ampliação entre 2,3 e 4,6 ppm. .... 106 Figura 44. Espectro de RMN bidimensional homonuclear 1H-1H-COSY (CDCl3, 300 MHz) do híbrido tacrina(6)-D-xilose (54c), ampliação entre 1,0 e 6,0 ppm. ... 107 Figura 45. Comparação dos espectros de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) dos híbridos tacrina-(n = 6)carboidratos, D-xilose (54c, acima), D-ribose (55a, meio) e D-galactose (56a, abaixo). Ampliações entre 1,2 e 6,4 ppm. ... 109

XIII Figura 46. Comparação dos espectros de RMN de 13C (CDCl3, 75 MHz) dos híbridos tacrina-(n = 6)carboidratos, D-xilose (54c, acima), D-ribose (55a, meio) e D-galactose (56a, abaixo). Ampliações entre 60 e 165 ppm. ... 110 Figura 47. Ampliações na região dos alifáticos dos espectros bidimensionais 1H-13C-HMQC dos híbridos de tacrina e a) xilose (54c); b) ribose (55a); e c) galactose (56a). ... 111 Figura 48. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 300 MHz) do híbrido tacrina(6)-D-xilose (54c, acima) e lofina(6)-D-xilose (57c, abaixo)... 112 Figura 49. Espectros de IV (pastilha de KBr) dos híbridos xilose (54c), tacrina(6)-ribose (55a), lofina(6)-xilose (57c) e tacrina(6)-galactose (56a). ... 113 Figura 50. Estrutura do híbrido tacrina(6)-pirimidina (43a) nas formas a) bidimensional e b) tridimensional. Os átomos de H não são mostrados na Figura 3D. ... 116 Figura 51. Comparação das estruturas 2D (à esquerda) e 3D (à direita) do núcleo pirimidina (a) e di-hidropirimidinona (DHPM, b). Os átomos de H não são mostrados na Figura 3D. .. 117 Figura 52. Sobreposição dos resultados de docking dos híbridos tacrina(6)-D-xilose (54c, rosa), tacrina(6)-D-ribose (55a, amarelo) e tacrina(6)-D-galactose (56a, verde) na TcAChE: A) Modos de ligação previstos na cavidade do sítio ativo da AChE; B) Interação do núcleo carboidrato no PAS; C) Sobreposição dos híbridos 55a e 56a com o inibidor co-cristalizado com a TcAChE (PDB ID 1ZGC).. ... 126 Figura 53. Representação das ligações CH/π previstas, em linhas tracejadas em rosa, para os núcleos carboidratos dos híbridos com espaçador hexametilênico (54c, 55a e 56a). ... 127 Figura 54. Resultados de docking dos híbridos tacrina(n)-D-xilose (54a, n = 4, roxo), (54b, n = 5, azul-claro), (54c, n = 6, rosa), (54d, n = 7, verde-escuro) e (54e, n = 8, cinza) na TcAChE. ... 128 Figura 55. Resultado de docking do híbrido tacrina(6)-D-galactose (56a) na TcAChE (A) e na hBuChE (B).. ... 129 Figura 56. Resultado de docking do composto lofina(5)-D-xilose (57b) na TcAChE (A) e na hBuChE (B)... 130 Figura 57. Interação entre o núcleo lofina do inibidor 57b com o Trp231 (no CAS) e a ponte salina entre o NH protonado ligado ao núcleo D-xilose e o Asp70 na enzima hBuChE. ... 131 Figura 58. Resultado de docking do composto lofina(6)-D-galactose (59a) na enzima hBuChE: (A) visão de cima da cavidade do sítio ativo; (B) interação do inibidor 59a com resíduos de aminoácidos na entrada da cavidade da hBuChE. ... 132

XIV

ÍNDICE DE ESQUEMAS

Esquema 1. Síntese dos dímeros bis(n)-tacrina por Pang e colaboradores. ...4

Esquema 2. Mecanismo de hidrólise da ACh pela enzima TcAChE: a) acilação e b) desacilação. ... 22

Esquema 3. Mecanismo de hidrólise da heroína pela enzima hBuChE. ... 28

Esquema 4. Hidrólise da cocaína pela enzima BuChE. ... 29

Esquema 5. Síntese da tacrina via reação de Friedländer. ... 30

Esquema 6. Destino metabólico da tacrina na mitocôndria das células hepáticas. ... 31

Esquema 7. a) Reação de Radziszewski para a síntese da lofina; b) Síntese dos híbridos tacrina-lofina pelo nosso grupo de pesquisa. ... 43

Esquema 8. Síntese dos dímeros bis(n)-lofina. ... 44

Esquema 9. Esquema genérico da reação de Biginelli. ... 44

Esquema 10. Síntese dos organosselênios derivados de Biginelli com atividade anti-AChE, obtidos pelo grupo de A. L. Braga. ... 49

Esquema 11. Nucleosídeos de purina sintetizados por Schwarz e colaboradores. ... 55

Esquema 12. Análise retrossintética para a obtenção dos híbridos baseados em tacrina. ... 59

Esquema 13. Análise retrossintética para a obtenção dos híbridos baseados em lofina. ... 60

Esquema 14. Reação de Niementowski para obtenção da 9-cloro-1,2,3,4-tetraidroacridina (5). ... 60

Esquema 15. Proposta de mecanismo para a síntese da 9-cloro-1,2,3,4-tetraidroacridina (5). ... 61

Esquema 16. Síntese dos intermediários 9-aminoalquil-1,2,3,4-tetraidroacridinas (1a-e). .... 63

Esquema 17. Mecanismo de formação das 9-aminoalquil-1,2,3,4-tetraidroacridinas (1a-e). . 63

Esquema 18. Tentativa de obtenção das aminas de interesse via one-pot. ... 65

Esquema 19. Proteção seletiva das 1,n-alcanodiaminas. ... 66

Esquema 20. Reação tetracomponente para síntese das aminas 21a-e. ... 66

Esquema 21. Proposta de mecanismo da reação tetracomponente. ... 67

Esquema 22. Remoção do grupo Boc e obtenção das aminas 9a-e. ... 68

Esquema 23. Rota sintética para obtenção de 2-aminopirimidinas proposta por Singh et al. . 71

Esquema 24. Reação de Biginelli para obtenção da DHPM 7. ... 72

Esquema 25. Proposta de mecanismo da reação de Biginelli para obtenção da DHPM 7. ... 75

XV Esquema 27. Proposta de mecanismo da oxidação da DHPM via radicalar, de acordo com

Memarian e Farhadi. ... 78

Esquema 28. Síntese da 2-cloro-6-metil-4-fenilpirimidina-5-carboxilato de etila (6). ... 79

Esquema 29. Proposta de mecanismo via SNAr para a formação de 2-aminopirimidinas 27. 82 Esquema 30. Síntese dos híbridos de interesse contendo a) tacrina (43a-c) e b) lofina (44a-c). ... 82

Esquema 31. Proteção das hidroxilas da D-xilose. ... 93

Esquema 32. Proposta mecanística para formação do bis-acetonídeo 51 a partir da D-xilose. ... 94

Esquema 33. Hidrólise do bis-acetonídeo 49 seguida da tosilação da hidroxila primária e obtenção do tosilato da D-xilose (45). ... 94

Esquema 34. Obtenção do tosilato da D-ribose (46). ... 95

Esquema 35. Obtenção do tosilato da D-galactose (47). ... 95

Esquema 36. Primeira tentativa de síntese do híbrido tacrina(6)-xilose (54c). ... 96

Esquema 37. Síntese dos híbridos derivados de carboidratos: a) tacrina-(n)-D-xilose (54a-e); b) tacrina(n)-D-ribose (55a e 55b); e c) tacrina(n)-D-galactose (56a e 56b). ... 98

Esquema 38. Síntese dos híbridos derivados de carboidratos: a) lofina-(n)-D-xilose (57a-e); b) lofina(n)-D-ribose (58a e 58b); e c) lofina(n)-D-galactose (59a e 59b). ... 99

Esquema 39. Mecanismo via SN2 para a substituição da amina no tosilato da D-galactose (47) e a representação do efeito estereoeletrônico no ET. ... 101

Esquema 40. Mecanismo via SN2 para o tosilato da a) D-ribose (46) e b) D-xilose (45). ... 102

Esquema 41. Tentativas de desproteção das hidroxilas do híbrido a) tacrina(6)-xilose (54c) e b) lofina(7)-ribose (58b). ... 115

XVI

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Principais aminoácidos da enzima acetilcolinesterase, suas funções na catálise e as

principais inteações descritas com o nucleo tacrina. ... 35

Tabela 2. Híbridos baseados em tacrina descritos na literatura. ... 36

Tabela 3. Condições testadas para a síntese dos híbridos tacrina-lofina ... 43

Tabela 4. Condições de desproteção testadas de acordo com o Esquema 22. ... 68

Tabela 5. Condições testadas de acordo com o Esquema 26. ... 76

Tabela 6. Otimização do tempo de reação dos híbridos tacrina-carboidratos. ... 97

Tabela 7. Testes com KI para obtenção dos híbridos derivados de carboidratos... 104

Tabela 8. Atividade anticolinesterase dos híbridos tacrina-carboidratos. ... 118

Tabela 9. Atividade anticolinesterase dos híbridos lofina-carboidratos. ... 121

XVII

LISTA DE ABREVIATURAS

LH - Ligação de Hidrogênio DA - Doença de Alzheimer ChE - Enzimas Colinesterases

ChEI - Inibidore(s) de Colinesterase(s) AChE - Acetilcolinesterase

BuChE - Butirilcolinesterase ACh - Acetilcolina

CAS - Sítio Catalítico Ativo PAS - Sítio Aniônico Periférico Aβ - beta-amilóide

IC50 - Concentração necessária para inibir 50% da atividade enzimática

BASE-1 - Enzima β-secretase APP - Proteína Precursora Amilóide ApoE - Alipoproteína E; ApoE4 (gene)

PSEN - Proteína Presenilina; PSEN1 e PSEN2 (genes) ES - Complexo Enzima-Substrato

RMN - Ressonância Magnética Nuclear IV - Infravermelho

TMS - Tetrametilsilano

Nota: A lista com a estrutura e as respectivas abreviaturas dos aminoácidos encontra-se disponível no Apêndice A (pág. 175).

XVIII

RESUMO

A melhora da capacidade cognitiva através da utilização de um inibidor reversível das enzimas colinesterases (ChEI) consiste atualmente na principal estratégia terapêutica para o tratamento sintomático da doença de Alzheimer (DA), para a qual ainda não existe cura. No contexto da busca por novos fármacos mais eficientes e com menos efeitos colaterais que os disponíveis no mercado, protótipos análogos aos fármacos anti-Alzheimer têm sido estudados na literatura, contendo principalmente derivados da tacrina. Compostos híbridos combinando dois núcleos bioativos conectados por uma cadeia alquílica espaçadora permitem uma dupla ação no sítio ativo das colinesterases, interagindo no sítio catalítico (CAS) e no periférico (PAS) da acetilcolinesterase (AChE) e da butirilcolinesterase (BuChE).

Neste trabalho, a síntese dos compostos de interesse envolveu a preparação prévia dos núcleos separados na forma de derivados nucleofílicos e eletrofílicos. O núcleo tacrina foi obtido através de protocolos existentes na literatura, sintetizado na forma de 9-alquilaminotacrinas. O núcleo lofina foi preparado na forma de 9-alquilaminolofinas inéditas, cuja etapa chave foi a obtenção do núcleo imidazólico através de uma reação tetracomponente. Na sequência foram obtidos os híbridos tacrina-pirimidina e lofina-pirimidina, contendo o núcleo pirimidina derivado da reação de Biginelli. Esses compostos não apresentaram a atividade esperada, provavelmente devido a uma repulsão estereoeletrônica na molécula que dificultou a interação com a enzimas AChE e BuChE. Duas séries de híbridos derivados de carboidratos foram obtidas em poucas etapas a partir dos precursores naturais D-xilose, D-ribose e D-galactose, contendo as hidroxilas protegidas pelo grupo acetonídeo. Os híbridos tacrina-carboidratos inibiram ambas as enzimas AChE e BuChE na escala nanomolar de concentração, com maior afinidade pela AChE. Já os híbridos lofina-carboidratos foram amplamente seletivos para a BuChE. Os estudos de modelagem molecular mostraram que o uso da cadeia espaçadora adequada permitiu a dupla interação enzimática, com posicionamento ótimo dos núcleos no CAS e no PAS da AChE e da BuChE. Os núcleos glicosídicos atuam no PAS da AChE via interações CH/π, ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas com as metilas do grupo acetonídeo. Considerando o baixo número de etapas para a síntese, a alta potência inibitória e a biocompatibilidade, os derivados de carboidratos sintetizados neste trabalho são potenciais candidatos à aplicação no tratamento paliativo da doença de Alzheimer.

XIX

ABSTRACT

Cholinesterases inhibitors (ChEI) remain the most effective therapeutic approach for the symptomatic treatment of Alzheimer's disease (AD) for which there is still no cure. In the quest of search for new drugs with improved efficacy and less side effects, several Alzheimer's drug analogues, especially tacrine derivatives, have been synthesized and studied in the recent years. Alkylene-linked hybrids containing two bioactive moieties provide a double interaction with both catalytic site (CAS) and peripheral site (PAS) of acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE).

In this work, the synthesis of desired hybrids required previous preparation of all nuclei as nucleophilic and electrophilic derivatives. Tacrine nucleus was obtained as 9- aminoalkyl-tacrines, according to previous literature protocols. The key step for synthesis of lophine derivatives was the four-component reaction to obtain the imidazole ring in the 9- aminoalkyl-lophines. With this in hand, the lophine-pyrimidine and tacrine-pyrimidine were syntesized, containing pyrimidine nucleus derived from Biginelli reaction. Two series of natural-based carbohydrate hybrids from D-xylose, D-ribose and D-galactose were obtained, with sugar moiety protected by acetonide group. Tacrine-carbohydrates hybrids were found to be potent inhibitors of both AChE and BuChE in the nanomolar concentration scale, with more affinity for AChE. The lophine-carbohydrate hybrids were strongly selective for BuChE. Molecular modeling studies predict that the alkylene linker enables the correct positioning of the two moieties with CAS and PAS to allow optimal interactions with the binding cavity. Moreover, the glycosyl moieties interact with PAS via CH/π, hydrogen bonds and hydrophobic interactions through their methyl groups of acetonide. Considering the short synthesis, the high inhibitory potency and the biocompatibility, the carbohydrate-based hybrids synthesized in this work are potential candidates for the treatment of Alzheimer's disease.

1

Capítulo 1

2

1. INTRODUÇÃO

O mal de Alzheimer ou doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa que causa perda progressiva e irreversível das funções cognitivas, sendo a forma mais comum de demência entre idosos. Segundo estimativas da organização internacional para a DA (ADI - Alzheimer Disease International), em 2015 cerca de 46 milhões de pessoas possuíam a doença no mundo e os casos devem ultrapassar 140 milhões até 2050.1 A DA ainda não possui cura nem um medicamento eficaz, possuindo apenas tratamentos sintomáticos e paliativos. Ainda sem causa conhecida, o principal fator de risco associado é a idade avançada. Entretanto, outros fatores como hipertensão, depressão, diabetes e pouca atividade física e cognitiva também podem contribuir para o desenvolvimento da doença.2 A importância socioeconômica do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para a DA supera os possíveis riscos e os custos de desenvolvimento. Somente nos Estados Unidos, entre 2010 e 2011, os prejuízos econômicos causados pela DA superaram os 215 bilhões de dólares. De acordo com relatórios recentes, a venda de drogas para o tratamento da doença de Alzheimer pode ter chegado a 8,3 bilhões de dólares em 2017.3

A melhora da capacidade cognitiva através da utilização de inibidores reversíveis das enzimas colinesterases (ChEI) consiste atualmente na principal estratégia terapêutica para o tratamento sintomático da DA. As enzimas colinesterases, acetilcolinesterase (AChE) e butirilcolinesterase (BuChE), são responsáveis por catalisar a hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ACh) nas sinapses colinérgicas do sistema nervoso central e nas junções neuromusculares. A utilização de ChEI permite a estimulação dos receptores de ACh prolongando a disponibilidade do neurotransmissor na fenda sináptica e melhorando os sintomas associados a DA.4 Atualmente, três dos quatro fármacos disponíveis no mercado para o tratamento da doença de Alzheimer são do tipo ChEI: Donepezil (Aricept®), (S)-Rivastigmina (Exelon®) e Galantamina (Razadyne®), Figura 1.5 Outro fármaco, a Memantina (Namenda XR®), é do tipo antagonista dos receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA), que impede a ativação desses receptores pelo glutamato, evitando o influxo livre de Ca+2 e a consequente excitotoxicidade.6, 7 Entretanto, esse fármacos apresentam efeitos colaterais, tais comonáusea, diarreia, perda de peso, tontura, dor de cabeça e cansaço.5

A tacrina (9-amino-1,2,3,4-tetraidroacridina, Figura 1) foi o primeiro fármaco aprovado nos Estados Unidos pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento

3 sintomático da DA, em 1993. Apesar de ser um potente inibidor de ambas as enzimas AChE e BuChE, seu uso foi descontinuado devido aos efeitos colaterais, principalmente a hepatotoxicidade.

Figura 1. Fármacos aprovados para o tratamento da doença de Alzheimer.

No contexto da busca por novos fármacos mais eficientes e com menos efeitos colaterais que os disponíveis no mercado atualmente, protótipos análogos aos fármacos anti-Alzheimer têm sido sintetizados na literatura, contendo principalmente derivados da tacrina.8 Por sua facilidade de síntese e sua elevada afinidade com o sítio ativo da AChE, a tacrina é uma estrutura de referência, ainda amplamente empregada como núcleo na construção de novas moléculas com o objetivo de encontrar fármacos mais potentes e mais seguros.9 Após a obtenção da estrutura de raios-X da enzima AChE em 1991, confirmou-se que o sítio ativo consiste em uma profunda cavidade, incluindo dois sítios de ligação: o sítio catalítico ativo (CAS), no fundo da cavidade, e o sítio aniônico periférico (PAS), na entrada.10 Com base nisso, em 1996 Pang e colaboradores realizaram a síntese de compostos do tipo bis(n)-tacrina, moléculas com duas unidades do núcleo tacrina ligadas por uma cadeia espaçadora de carbonos metilênicos (Esquema 1). Eles propuseram que esses compostos seriam capazes de interagir em ambos os sítios da AChE e consequentemente seriam inibidores mais eficientes (Figura 2). De fato, as análises in vitro mostraram que os dímeros de tacrina são potentes inibidores da AChE, sendo que o bis(7)-tacrina foi mil vezes mais ativo que a tacrina.11 Estudos conformacionais dos dímeros bis-tacrina indicaram que o espaçamento de sete carbonos metilênicos permite uma distância de 18 Å entre os átomos de nitrogênio de cada molécula de tacrina, bem próximo do valor de 16 Å entre o CAS e o PAS, determinado em

4 estudos computacionais.12 O estudo feito por Pang com os dímeros bis(n)-tacrina também mostrou que o aumento da cadeia provoca diminuição da atividade biológica de inibição da AChE, observação que também foi feita com heterodímeros quinolina e tacrina(n)-piridina.13

Esquema 1. Síntese dos dímeros bis(n)-tacrina por Pang e colaboradores.

Figura 2. Ação do bis-tacrina nos dois sítios da enzima acetilcolinesterase. Adaptado do trabalho de Pang et al.11

Devido à complexidade da doença de Alzheimer, por seu caráter multifatorial, há grande interesse da comunidade científica no design de moléculas multialvo, que possam interagir simultaneamente com diferentes fatores da doença, de maneira a impedir o seu progresso mais do que apenas mitigar seus sintomas.14 Híbridos contendo o núcleo tacrina conectado por uma cadeia metilênica a um outro núcleo bioativo têm sido estudados e têm se mostrado promissores como moléculas multialvo para o tratamento sintomático da DA.15 Recentemente nosso grupo de pesquisa obteve novos híbridos tianeptina e tacrina-lofina, além de dímeros quirais do tipo bis-tacrina (Figura 3). Esses compostos mostraram-se potentes inibidores das enzimas AChE e BuChE, com IC50 na escala nanomolar.16, 17, 18

5 Figura 3. Compostos sintetizados pelo nosso grupo com atividade anticolinesterase.

6

Capítulo 2

7

2. OBJETIVOS

Considerando a crescente busca por novos fármacos multialvo para o tratamento da doença de Alzheimer, este trabalho teve como objetivo principal a obtenção de novos híbridos inibidores de colinesterases. Pretendeu-se realizar a síntese de compostos baseados em tacrina e lofina, conectados por uma cadeia metilênica espaçadora aos núcleos: pirimidina, obtidos a partir da reação de Biginelli; e derivados dos carboidratos D-xilose, D-ribose e D-galactose.

Os objetivos específicos foram: (i) a utilização de uma metodologia tetracomponente, previamente desenvolvida no grupo para a obtenção dos intermediários contendo o núcleo lofina; (ii) o emprego da reação multicomponente de Biginelli para a síntese dos intermediários pirimidínicos; (iii) a preparação de intermediários contendo os núcleos tacrina e carboidratos, através de protocolos existentes na literatura; (iv) a síntese e a caracterização dos híbridos de interesse; (v) o envio das amostras dos produtos finais para a realização dos ensaios de inibição das enzimas AChE e BuChE; (vi) o envio das estruturas para estudos de modelagem molecular.

8

Capítulo 3

9

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. A DOENÇA DE ALZHEIMER 3.1.1. Aspectos Gerais

A doença de Alzheimer (DA) foi descrita pela primeira vez em 1907 pelo médico psiquiatra e neuropatologista alemão Alois Alzheimer (1864-1915), que definiu em sua publicação como "uma desordem peculiar do córtex cerebral." Em 1901 a alemã Auguste Deter foi internada aos 51 anos em uma clínica psiquiátrica, apresentando os sintomas que hoje são associados a DA, tais como prejuízos crescentes de memória, alterações repentinas de humor, agressividade e perda das funções cognitivas. Auguste foi atendida por Alzheimer, que acompanhou a regressão mental da paciente até o óbito após quatro anos e meio. Após a morte da paciente, Alzheimer examinou amostras de seu encéfalo sob o microscópio e observou alterações nas neurofibrilas que servem de sustentação ao citoesqueleto celular e, em muitos lugares onde deveriam haver neurônios, haviam apenas feixes de fibrilas. Ele observou também o acúmulo entre as células de um produto patológico do metabolismo dos neurônios, o qual chamou de placa senil. Atualmente sabe-se que essas fibrilas observadas por Alzheimer são emaranhados neurofibrilares de uma proteína chamada tau, hiperfosforilada no interior das células, enquanto que as placas senis são agregados insolúveis de um peptídeo chamado beta-amilóide (Aβ).

Atualmente, existem dois tipos reconhecidos para a DA: a familiar ou de início precoce (FAD - Familial Alzheimer's Disease) e a de início tardio ou esporádica (LOAD - Late Onset Alzheimer's Disease), sendo a primeira mais rara e representante dentre 1% e 6% dos casos.5 Na FAD os sintomas manifestam-se antes dos 60 anos e a doença possui um forte componente genético, associado a mutações e polimorfismos nos genes APP, PSEN1 e PSEN2, localizados nos cromossomos 21, 14 e 1, respectivamente, transmitidos de forma autossômica dominante.19, 20 Embora controverso na literatura, em 2013 um estudo envolvendo a extração do DNA do tecido cerebral de Auguste apontou para uma mutação no gene PSEN1, o que caracterizaria a DA familiar correspondente com idade na qual a paciente apresentou os sintomas.21, 22 A DA esporádica é a forma mais comum da doença, tendo como principal fator de risco a idade avançada. Nos últimos anos tem se fortalecido a teoria de que o gene ApoE4 seja o principal fator genético de risco ao desenvolvimento da DA, tanto a

10 familiar quanto a esporádica. A alipoproteína E (ApoE) é uma proteína plasmática produzida pelos astrócitos e é capaz de se ligar a lipídeos, sendo responsável pelo transporte de triglicerídeos, colesterol e fosfolipídios, os quais possuem vital importância para as sinapses.5, 23

Em seres humanos há três isoformas da ApoE: ApoE2, ApoE3, e ApoE4, que afetam de forma diferente a agregação do peptídeo beta-amilóide (Aβ).24 Experimentos mostraram que a ApoE4 promove a fibrilogênese in vivo e in vitro do peptídeo Aβ.25 De fato, tem sido observado que indivíduos com a variante ApoE4 tem predisposição para o acúmulo de placas, sendo que a posse de uma cópia do gene triplica o risco de desenvolver a DA, já um indivíduo que herdou duas cópias do gene tem 90% de risco de desenvolver a doença. A proeminência do gene ApoE4 na população varia entre 15 e 20%, sendo o ApoE3 o mais comum.23 Entretanto, a herança do gene ApoE4 não é necessária nem suficiente para causar DA, ela apenas aumenta o risco, que é maior se associado a doença vascular periférica e diabetes tipo 2.26

A dificuldade atual em se obter um diagnóstico preciso de Alzheimer em sua fase inicial, onde os sintomas ainda são inconclusivos e facilmente confundidos com sintomas naturais do envelhecimento, faz com que os tratamentos comecem sempre quando a doença já está em estágio de moderado a avançado. Além disso, o início da manifestação dos sintomas varia muito de pessoa para pessoa. Em pacientes que já manifestam os sintomas, principalmente problemas de memória, o diagnóstico diferencial é bastante amplo, podendo ser confundido com tipos de demência senil, disfunção vascular cognitiva, infecções, neuroinflamação e alterações metabólicas.27 Atualmente, uma técnica utilizada para o diagnóstico da DA é a PET (Tomografia Computadorizada por Emissão de Pósitrons), onde um composto marcado com radioisótopo se liga às placas de Aβ, marcando-as e tornando possível identificar a quantidade e a área de deposição.28 Três radioisótopos de flúor-18 (18F) foram aprovados pela FDA para uso no diagnóstico de Alzheimer com a PET: florbetapir, flutemetamol e florbetaben. Outro exame bastante utilizado é análise do líquido cefalorraquidiano, cuja composição na DA é diferente de outros tipos de demência, contendo altos níveis da proteína tau hiperfosforilada e baixos níveis da forma Aβ1-42 (discutido mais adiante), o que também pode indicar que o paciente é propenso a desenvolver a DA.27 Um estudo de um grupo de pesquisa da Suécia, envolvendo um grupo de 146 pessoas saudáveis e 46 pessoas com comprometimento cognitivo leve (MIC - mild cognitive impairment) devido à doença de Alzheimer, mostrou que as duas técnicas podem detectar a DA em fase leve com alta precisão e que não há diferenças significativas nos resultados.29

11 3.1.2. Características Patológicas e Hipóteses

Com base nas características patológicas observadas em cérebros de pacientes afetados pela doença de Alzheimer, as quais são comuns nos dois tipos da doença (familiar e tardia), diferentes hipóteses têm sido propostas com objetivo de direcionar a busca por um tratamento terapêutico eficaz. A presença de agregados do peptídeo Aβ e de emaranhados fibrilares da proteína tau são as principais características observadas, sendo que os níveis totais de Aβ observados aumentam em seis vezes no cérebro de pacientes comparado com o de pessoas saudáveis.30, 31 Os peptídeos Aβ são sintetizados nas células a partir da clivagem da proteína precursora amilóide (APP) em duas reações sequenciais, catalisadas pelas enzimas β-secretase (BASE-1) e γ-secretase (Figura 4a).32 Os agregados Aβ são formados por dois tipos de fragmentos: com 40 e 42 resíduos de aminoácidos, Aβ1-40 e Aβ1-42 respectivamente. Apesar do fragmento Aβ1-40 ser o mais comum, o Aβ1-42 é mais hidrofóbico e possui um maior potencial amiloidogênico, embora ambos sejam capazes de se agregar em oligômeros solúveis e em placas senis insolúveis.5 A hipótese da cascata amilóide originalmente descreve que a disfunção observada na DA é causada pelo acúmulo das placas senis Aβ. Contudo, pesquisas mais recentes têm confirmado que os oligômeros solúveis Aβ são os principais responsáveis em conduzir à interrupção das sinapses, com consequente morte dos neurônios e perda de memória.33 Apesar dos efeitos nocivos da Aβ, estudos têm mostrado que tanto os peptídeos Aβ quanto a APP parecem possuir uma função fisiológica importante para a neuroplasticidade, promovendo a proliferação, a diferenciação e a transmissão sináptica de várias células.5, 33 A outra característica patogênica observada por Alois Alzheimer foi a presença de emaranhados neurofibrilares no lugar de onde deveriam haver neurônios, o que hoje se sabe serem da proteína tau, dando origem à hipótese da proteína tau. A tau é uma proteína responsável por promover a montagem e a estabilidade dos microtúbulos, essenciais para a manutenção do citoesqueleto celular (Figura 4b). Porém, em cérebros acometidos pela DA essa proteína sofre hiperfosforilação e consequente mudança de sua conformação nativa, o que leva ao seu desenrolamento dos microtúbulos e à morte do neurônio.33, 34

12 Figura 4. a) clivagem da proteína APP gerando o peptídeo Aβ. Adaptado do trabalho de Patterson et al.32; b) comparação da proteína tau associada aos microtúbulos (acima) e hiperfosforilada (abaixo). Créditos da imagem: Shutterstock®.

Nos últimos anos, a imunoterapia com base nas hipóteses da proteína tau e da cascata amilóide tem despertado a atenção da comunidade científica devido aos bons resultados in vitro. Anticorpos, tais como o bapineuzumab e o solanezumab foram capazes de atravessar a barreira hematoencefálica e promover a limpeza das placas amilóides pelos astrócitos.35 Entretanto, o solanezumab não apresentou melhora nos sintomas em pacientes e falhou na fase 3 dos testes clínicos.36 O bapineuzumab é um anticorpo monoclonal que se liga a peptídeos amilóides tóxicos no cérebro, contribuindo para a sua remoção. Além disso, foi capaz de reduzir a concentração da proteína tau no líquido cefalorraquidiano, porém, essa ação não se traduziu em melhora clínica nos pacientes.37 Além do mais, outras dificuldades têm afetado a busca por um protótipo promissor que atue diretamente na tau ou na Aβ, tais como a heterogeneidade dos agregados Aβ, a existência de outras proteínas envolvidas na patogênese da DA e a indisponibilidade de estruturas de alta resolução dos oligômeros de Aβ ou tau e suas interações na célula.38 Compostos que inibem a enzima β-secretase (BASE-1), responsável por catalisar a clivagem da APP, apresentaram bons resultados em fases pré-clínicas, porém foram abandonados em fases clínicas II ou III.39, 40

A hipótese dos metais propõe que o desequilíbrio dos mecanismos homeostáticos que compartimentalizam e regulam metais endógenos, como Cu+2 e Zn+2, pode favorecer a formação de agregados Aβ através da atração e interação com resíduos de histidina dos mesmos, contribuindo para o desenvolvimento e o avanço da DA.41 Diversos estudos tem

13 revelado que o Cu+2 e Zn+2 competem pelos mesmos resíduos na Aβ, sendo que o Zn+2 possui uma contribuição maior para a agregação, enquanto que o Cu+2 promove mudanças conformacionais no peptídeo.5 Além disso, esses biometais possuem a capacidade de produzir espécies reativas de oxigênio (ERO) e de nitrogênio (ERN), contribuindo para o estresse oxidativo. Além do mais, é descrito na literatura o aumento na concentração de cobre, zinco e ferro em cérebros de pacientes com DA.42

Além dos metais fisiológicos, a exposição prolongada a metais tóxicos tais como alumínio e mercúrio também contribui na patogênese da DA. O mercúrio é um metal tóxico bioacumulativo, que provoca danos ao sistema nervoso central. Há vários relatos na literatura associando a exposição ao mercúrio ao desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, tais como Parkinson e Alzheimer.43, 44 Por exemplo, observou-se que ratos expostos a mercúrio tiveram dificuldades na formação dos microtúbulos do citoesqueleto neuronal. O mercúrio promoveu nos cérebros das cobaias a inibição do trifosfato de guanosina (GTP), impedindo a polimerização da tubulina, proteína que forma os microtúbulos.45 Alguns estudos apontam para a exposição prolongada ao amálgama usado em próteses dentárias, que contém mercúrio na composição, o que poderia acelerar o processo de desenvolvimento da DA.44, 46 Vários estudos tem evidenciado que o alumínio induz o acúmulo de placas Aβ, além de promover disfunção mitocondrial, levando à apoptose neuronal, observada tanto em testes in vitro quanto em testes in vivo.47 De uma forma geral, os metais exibem efeito tóxico no organismo pela ligação a proteínas transportadoras de Ca+2, principal sinalizador bioquímico, impedindo e interferindo nos processos celulares.44

A principal estratégia terapêutica baseada na hipótese dos metais é o sequestro desses metais através da utilização de agentes quelantes. O clioquinol, um derivado da 8-hidroxiquinolina que possui propriedades quelantes para metais como zinco, ferro e cobre, mostrou-se efetivo na inibição da formação de oligômeros Aβ em ratos após tratamento oral por nove semanas. Contudo, além de alguns efeitos colaterais, complicações na produção em grande escala tem desmotivado pesquisas adicionais para seu uso no tratamento da DA.41 A maioria dos estudos envolvendo a hipótese dos metais é fundamentada em compostos cujo alvo é a hipótese colinérgica, isto é, inibidores de colinesterase cuja estrutura foi desenhada ou modificada para agir como quelante.

A hipótese colinérgica foi a primeira teoria proposta para a terapia da DA e postula que a perda das funções colinérgicas associada a morte neuronal contribui significativamente para o declínio cognitivo associado a idade avançada e aos sintomas da doença.48, 49

14 Atualmente, três dos quatro fármacos disponíveis no mercado para o tratamento da doença de Alzheimer baseiam-se nessa hipótese, ou seja, são inibidores das enzimas colinesterase (Figura 1, pág. 3). Além disso, os melhores resultados obtidos até o momento envolvem compostos cuja estratégia inicial baseia-se na síntese de uma série de inibidores de colinesterases, seguida por modificações na estrutura dos compostos mais potentes com vias de atingir as características das outras hipóteses. Como tratou-se da base para o desenvolvimento deste trabalho, a hipótese colinérgica e será abordada em mais detalhes nas seções seguintes.

Existem ainda outras várias características observadas que não serão abordadas neste texto, tais como disfunções mitocondriais associadas ao estresse oxidativo, problemas no metabolsimo do colesterol, associação entre a DA e o diabetes, entre outras.5, 33 A memantina, único fármaco aprovado até o momento que não age via inibição das colinesterases, atua como antagonista dos receptores NMDA (N-metil-D-aspartato), baseada na hipótese glutamatérgica. Ao se ligar aos receptores NMDA (NMDAr), a memantina impede a ligação do glutamato, seu agonista natural, o qual promove superestimulação dos NMDAr provocando a excitotoxicidade devido ao influxo excessivo de Ca+2 no meio intracelular.6, 7

3.2. HIPÓTESE COLINÉRGICA E ENZIMAS COLINESTERASES 3.2.1. Mecanismo de transmissão colinérgica

A sinapse ocorre na região chamada fenda sináptica, um pequeno espaço entre o axônio de um neurônio pré-sináptico e um neurônio ou miócito pós-sináptico (Figura 5). Um potencial de ação gera uma despolarização na membrana celular, que se propaga através de abertura e fechamento de canais iônicos de sódio e potássio ao longo da membrana do axônio. Esse processo é conhecido como impulso nervoso, que ao atingir a região próxima à fenda sináptica promove a abertura de canais de cálcio, permitindo o influxo de íons Ca+2. O aumento da concentração de Ca+2 na zona ativa induz a liberação da ACh na fenda sináptica. Uma vez liberada, a ACh liga-se a receptores específicos localizados na membrana da célula pós-sináptica, permitindo a passagem de íons Na+ e K+, gerando um novo potencial de ação e propagando a transmissão da mensagem intercelular.50

15 Figura 5. Estrutura do neurotransmissor acetilcolina (à esquerda) e representação esquemática da sinapse química entre dois neurônios (à direita). Figura extraída do livro Princípios de Bioquímica de Lehninger, 6ª ed., pg. 466.50

As enzimas acetilcolinesterase (AChE, E.C.* 3.1.1.7) e butirilcolinesterase (BuChE, E.C. 3.1.1.8) são serino hidrolases que catalisam a reação de hidrólise de ésteres derivados de colina ou similares. A AChE atua seletivamente em acetilésteres e sua função fisiológica é a hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ACh) nas sinapses colinérgicas. Esse é um processo natural importante para evitar a dessensibilização, onde a superestimulação do receptor de ACh mantém o canal fechado apesar da contínua presença de ACh e esse estado

*

O Número EC (Enzyme Commission) é uma classificação das enzimas de acordo com a reação catalisada, determinada pela União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB), podendo ser conferida no site: http://www.sbcs.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/.

16 pode persistir por muitos segundos mesmo após a remoção da ACh, podendo levar a falhas fatais nos processos cognitivos e paralisia cerebral.51 A intoxicação por inibidores irreversíveis da AChE, tais como os agentes de guerra organofosforados, promove esse processo ao impedir a hidrólise e a reciclagem da ACh.52 Entretanto, a utilização de inibidores reversíveis da AChE tem se demonstrado a estratégia terapêutica mais eficaz para o tratamento paliativo da doença de Alzheimer.40

3.2.2. Acetilcolinesterase

A AChE é encontrada principalmente em junções neuromusculares, sistemas nervosos central e periférico, fibras colinérgicas e não colinérgicas e hemácias, sendo que sua atividade é maior nos neurônios motores e sensoriais.53 Nas sinapses, encontra-se principalmente na forma tetramérica ancorada na membrana celular. A estrutura monomérica da AChE humana constitui-se em 543 aminoácidos arranjados em 12 folhas β centrais envolvidas por 14 hélices α, sendo classificada como um sanduíche α/β.54, 55

A estrutura da AChE tende a ser bem conservada entre as diferentes espécies, por exemplo a humana (Homo sapiens, hAChE) e a do camundongo (Mus musculus, MmAChE), possuem 88% de identidade e 97% de homologia na sequência de aminoácidos.55, 56 Em 1991, Sussman e colaboradores publicaram a primeira elucidação da estrutura tridimensional da AChE, através da cristalização do homodímero da enzima obtida da arraia elétrica do pacífico (Torpedo californica, TcAChE), utilizando análise de raios-X.10 A partir deste trabalho, aliados a novas estruturas cristalinas da AChE de várias espécies cristalizadas com inibidores, inúmeros estudos computacionais foram desenvolvidos e têm auxiliado o entendimento da estrutura detalhada da enzima, especialmente no sítio ativo, o que é fundamental para o planejamento racional de novos fármacos.57, 58 A TcAChE e a hAChE são as espécies mais estudadas da enzima do ponto de vista computacional e suas sequências de aminoácidos possuem 86% de homologia, com as posições de aminoácidos no sítio ativo quase idênticas. As diferenças entre as AChE de diferentes espécies são mostradas na Tabela 1, página 35.

A AChE tem sido purificada e isolada nas suas formas monomérica, dimérica e tetramérica, entretanto a forma tetramérica é a mais importante para a atividade catalítica em condições fisiológicas, sendo predominante em cérebros de mamíferos.59, 60 A estrutura

17 tetramérica da AChE é mantida por um domínio do monômero rico em triptofano,† chamado domínio de tetramerização anfifílico (WAT - tryptophan amphiphilic tetramerization), composto por 40 resíduos de aminoácidos e a extremidade C-terminal da proteína (Figura 6a). A interação entre cada domínio WAT de cada monômero estabiliza a estrutura quaternária (Figura 6b).61 Por sua vez, o tetrâmero da AChE é ancorado na membrana celular através de duas estruturas essenciais: o domínio de ligação rico em prolina (PRAD - proline-rich attachment domain) e a proteína de ancoramento à membrana (PRiMA - proline-rich membrane-anchoring protein) (Figura 6b e Figura 6c). A PriMA é a proteína de ancoramento nas sinapses neuronais, enquanto que na sinapses onde há lâmina basal, como nas junções neuromusculares, a enzima é ancorada pela subunidade Q tipo colágeno (ColQ- collagen-like Q subunit) (Figura 6d).62 Estudos de cristalografia e cálculos computacionais mostraram que interações hidrofóbicas do tipo stacking entre o WAT e o PRAD, formando um complexo [(WAT)4PRAD], estabilizam o ancoramento na membrana do tetrâmero da AChE do camundongo (Figura 6c-d).62, 63

†

As estruturas dos 20 aminoácidos mais comuns em proteínas estão disponíveis, junto com seus respectivos nomes e códigos, no Apêndice A (pág. 175).

18 Figura 6. a) Estrutura do monômero da MmAChE com destaque para o sítio ativo (azul claro) e o domínio WAT em hélice α; b) Vista de cima da estrutura tetramérica da MmAChE, com cada monômero representado por uma cor, o sítio ativo em azul claro, a Ser203 da tríade catalítica em verde e os domínios WAT ao centro, circundando o PRAD;62 c) e d) Representação esquemática da ancoragem da AChE em células neuronais via PRiMA (c) e em lâmina basal via ColQ (d).63 Figuras adaptadas das referências citadas.

3.2.2.1. Mecanismo Catalítico da Acetilcolinesterase

O sítio ativo de cada unidade monomérica de AChE consiste em uma estreita e profunda cavidade de cerca de 20 Å de profundidade e possui dois sítios de ligação: sítio ativo catalítico (CAS - catalytic active site), no fundo da cavidade, e sítio aniônico periférico (PAS - peripheral anionic site), na entrada (Figura 7a).55, 64, 65 O mecanismo de hidrólise da acetilcolina pela AChE tem sido estudado antes mesmo da primeira cristalização e elucidação da estrutura tridimensional. Com base em evidências experimentais, em 1987 Daniel M. Quinn propôs que o mecanismo de hidrólise pode ser dividido em duas partes: acilação (ligação da acetilcolina na enzima e liberação da colina) e desacilação (liberação do de ácido acético e restabelecimento do sítio ativo).66 A elucidação da estrutura tridimensional da TcAChE confirmou que a tríade catalítica é composta por Ser200, His440 e Glu327, similar à tríade de várias outras serino hidrolases, onde a serina é o nucleófilo.10, 67 Com a ampliação da

19 biblioteca‡ de estruturas de AChE de diferentes espécies, cristalizadas com diferentes substratos e inibidores, aliado ao avanço da química computacional, diversos estudos de mecânica quântica e mecânica molecular têm possibilitado a melhor compreensão do mecanismo catalítico e da estrutura detalhada do sítio ativo.68 Além dos três aminoácidos responsáveis diretamente pela atividade catalítica, o CAS possui aminoácidos estritamente posicionados para conferir alta seletividade para acetilésteres, restringindo o espaço para a hidrólise de ésteres volumosos no chamado bolso acila, composto por três fenilalaninas (Phe288, Phe290 e Phe331). A cavidade do oxiânion, composta por duas glicinas (Gly118 e Gly119) e uma alanina (Ala201), todas posicionadas próximas ao nucleófilo (Ser200), doam ligação de hidrogênio (LH) a partir do NH da cadeia peptídica para os oxigênios do grupo acetil, tornando o carbono carboxílico mais suscetível ao ataque nucleofílico, como mostrado esquematicamente na Figura 7b.55 Além disso, essas LH são fundamentais para manter a estabilidade dos intermediários tetraédricos formados em ambas as etapas, como mostrado mais adiante no Esquema 2. A acetilcolina é atraída para dentro da cavidade do sítio ativo através de atração eletrostática do grupo colina positivamente carregado pelo Asp72, um aminoácido negativamente carregado (Figura 7a, D72).69 Vários resíduos de aminoácidos aromáticos, tais como Trp279, Tyr70, Tyr334, Tyr121 e Phe330 ajudam a "empurrar" a ACh para o fundo da cavidade, onde está o CAS. Um resíduo fundamental para concluir esse processo é o Trp84, localizado adjacente à tríade catalítica e responsável por atrair e acomodar o grupo colina via interação cátion-π, enquanto a tríade catalítica se encarrega de iniciar a reação. Essa região é conhecida como subsítio aniônico, pois o nome foi dado quando se acreditava que era um aminoácido negativamente carregado o responsável por essa função.55, 64

A enzima AChE segue a cinética de Michaellis-Menten e seu mecanismo pode ser descrito dessa forma, onde inicialmente ocorre a formação do complexo enzima-substrato (ES), como mostrado a seguir na Figura 7b.

‡

Todas as enzimas cristalizadas com ou sem substrato ou inibidor estão catalogadas no banco de dados PDB (Protein Data Bank), com um determinado código específico. Para mais detalhes: http://www.rcsb.org/pdb.

20 Figura 7. a) Cavidade do sítio ativo da AChE, onde a linha pontilhada representa o espaço disponível, mais estreito na entrada. Adaptado do trabalho de Lushington et al.55; b) Representação do complexo ES antes de reagir: interação cátion-π com Trp84 e LH com Gly118-119.

No Esquema 2 é mostrada a proposta mais consistente para mecanismo da AChE. Após a formação do complexo ES (I), o ataque nucleofílico da Ser200 leva a formação do intermediário tetraédrico representado por IIa e IIb. A teoria do estado de transição prevê que uma enzima tende a estabelecer interações favoráveis com o estado de transição da reação de modo a estabilizá-lo e baixar a energia de ativação da reação, atuando assim como um catalisador.50 De fato, vários estudos têm mostrado que a energia do estado de transição na AChE, representado pelas estruturas IIa e IIb, possuem energia menor quando comparado com o complexo enzima-substrato (I).70, 71 Além disso, uma terceira LH, entre o H da ligação peptídica da Ala201 e o oxiânion do substrato surge em II que não é observada no complexo ES, aumentando o componente estabilizador. Por fim, cálculos prevêem a formação de LH do H da His440 tanto com o O da Ser200 (IIa) quanto o O do éster de colina (IIb) no estado de transição. Posteriormente, ocorre a desprotonação da His440 pelo oxigênio da ACh, levando ao rompimento da ligação C-O na ACh. Esse rompimento é favorecido pela neutralização do sistema (representado pelo estado III) e a liberação de colina, que é recapturada pela célula para nova síntese de ACh.

21 Na etapa de desacilação, mostrada no Esquema 2b, uma molécula de água, altamente conservada e posicionada pela enzima (discutido mais adiante) é desprotonada pela His440, promovendo a substituição nucleofílica na acetil-Ser200 (enzima acetilada, III), formando o segundo intermediário tetraédrico, representado por IV, que conduz à liberação de ácido acético e à regeneração do sítio ativo enzima (V).72

22 a)

b)

23 Várias informações experimentais baseadas em estudos computacionais têm evidenciado alguns detalhes do mecanismo da AChE. Por exemplo, assim como observado em várias outras enzimas, na AChE a histidina (His440) age via catálise geral ácido-básica, sendo observado experimentalmente um aumento do caráter básico do seu anel imidazólico no intermediário tetraédrico em relação à estrutura I.67 Vários estudos têm demonstrado a importância do terceiro resíduo da tríade catalítica (Glu327) na estabilização dos estados de transição II e IV. Experimentos com a enzima hAChE mutante trocando o glutamato por aspartato e glutamina na posição 334 (327 na TcAChE) mostraram inatividade da enzima sem o glutamato na tríade catalítica.67, 73 Alguns estudos apontam para uma interação eletrostática do Glu327 com o anel imidazólico protonado da His440.74 Por outro lado, a maior parte dos cálculos tem indicado que a formação de LH entre um oxigênio do carboxilato do Glu327 e o NH da His447 é a principal forma de contribuição do Glu327 para a estabilização do anel imidazólico protonado.68, 75, 76 Outro aminoácido importante para a atividade catalítica é o Glu199, que atua através de ligações de hidrogênio principalmente posicionando a molécula de H2O conservada no CAS na orientação correta para promover o ataque nucleofílico na acetil-Ser200 em III (Esquema 2b).76 Além disso, estudos envolvendo a AChE de inseto (DmAChE) e a humana (hAChE) apontaram que na formação do complexo ES o Glu199 (237-DmAChE e 202-hAChE) atua estabilizando o grupo colina no subsítio aniônico através de uma LH com um dos grupos metila do grupo amônio, dando suporte ao Trp84.75, 77 Todas as enzimas possuem aminoácidos posicionados para estabilizar o estado de transição e promover a catálise, porém essa grande versatilidade de interações e a quantidade de resíduos de aminoácidos envolvidos no sítio ativo da AChE não é tão comum, o que ajuda a explicar a sua alta eficiência catalítica (kcat/KM ∼108 M-1s-1).50

Outra propriedade observada na AChE é a existência de portas alternativas, tais como a porta dos fundos (backdoor), localizada na região do subsítio aniônico no CAS, e a porta lateral (side-door), aproximadamente perpendicular ao PAS (Figura 8a). As evidências experimentais da existência dessas portas cresceram fortemente na década de 90, após a obtenção do raio-X da TcAChE e com o avanço dos estudos de dinâmica molecular.55, 78, 79 Constatou-se que a ACh e outros ligantes com amônio quaternário são largos demais para entrar e sair simultaneamente através da longa cavidade do sítio ativo, único caminho possível observado na estrutura de raios-X.80 Além disso, a evidência da existência de um Ω-loop (ver Figura 7a) através de quebra e formação de uma ponte dissulfeto entre os resíduos Cys67 e Cys94 (Cys69 e Cys96 na hAChE), tornou fácil relacioná-lo com o controle de abertura e