TÍTULO: EFEITO DO TRATAMENTO DE (-)-CUBEBINA E (-)-HINOQUININA NO PROCESSO INFLAMATÓRIO DA DOENÇA DE CHAGAS EXPERIMENTAL
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: FARMÁCIA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): ANA LUIZA FERREIRA CARVALHO
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): VIVIANE RODRIGUES ESPERANDIM
ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): ANA CAROLINA BOVO, MÁRCIO LUIS ANDRADE SILVA, MARIANA CINTRA PAGOTTI
1. INTRODUÇÃO
A doença de Chagas (DC) é uma doença parasitária resultante da infecção pelo protozoário parasito homoflagelado Trypanossoma cruzi podendo acometer o homem, animais domésticos e selvagens (MEIRA et al, 2012). Informações do Ministério da Saúde indicam que de 2005 a 2009 foram notificados 455 casos de DC no Brasil, dos quais 389 (85,5%) ocorreram na região norte do país, sendo 310 (68,1%) no Pará e 29 (6,3%) casos no estado do Amazonas. (SOUZA, 2012)
O ciclo evolutivo do T. cruzi apresenta três formas diferentes – tripomastigotas, amastigotas e epimastigotas – identificadas com base no seu formato celular e na posição do cinetoplasto em relação ao núcleo. Além da via de transmissão vetorial, a doença de Chagas pode ser transmitida por vias não vetoriais, como transfusões sanguíneas, transmissão congênita, transplantes de órgãos e por via oral, por meio de ingestão de alimentos contaminados dentre outros. (CUNHA-FILHO, 2013).
A patogênese da cardiomiopatia chagásica ainda não é completamente compreendida, mas se acredita que, dentre os mecanismos fisiopatológicos a persistência do parasito provavelmente constitui o principal mecanismo de injúria ao miocárdio. A presença do vetor no coração causa um gradual processo inflamatório e injúria autoimune nos tecidos cardíacos. Portanto, acredita-se que eliminando o parasito, ou ao menos reduzindo sua quantidade, pode se impactar favoravelmente na história natural da DC, melhorando a eficácia da resposta imune e reduzindo a progressão da doença. (PEDRA et al, 2011).
A DC pode ser classificada evolutivamente em duas fases: a aguda e a crônica. A fase aguda pode ser devida à infecção primária ou a reativação de fase crônica. Após a infecção inicial, a fase aguda da DC dura de 6-8 semanas. O quadro clínico abrange manifestações sistêmicas de febre, taquicardia desproporcional, esplenomegalia e edema. Podem ser observadas arritmias ventriculares, fibrilação atrial, situações que indicam pior prognóstico.
Quando a doença é transmitida de forma congênita, pode ser associada à hepatoesplenomegalia, icterícia, hemorragia cutânea e sinais neurológicos, especialmente em neonatos prematuros.
Na fase crônica, considerada 120 dias após o contato do hospedeiro com o vetor, quatro situações clínicas podem evoluir: a forma indeterminada, a forma cardíaca, a forma digestiva e a forma mista (acometimento cardíaco e digestivo no mesmo paciente). (ANDRADE et al, 2011). A cardiopatia chagásica se desenvolve em forma de miocardite crônica progressiva e fibrosante com alterações degenerativas necróticas das células cardíacas. As fibras que não sofrem esse processo degenerativo-necróticos se hipertrofiam e a longo do prazo evoluem para uma cardiomegalia e como consequência, insuficiência cardíaca. Além disso, a DC afeta o tubo digestivo e altera secreção, motilidade, absorção e causa uma destruição neuronal do sistema nervoso autonomo intramural que na progressão da doença ocorre dilatações permanentes e difusas dando o caráter de megacólon chagásico.(DIAS; COURA, 1997)
Os tratamentos clínicos empregados foram realizados com o uso de benzonidazol e nifurtimox. Esses únicos fármacos disponíveis para o tratamento da doença apresenta índice de cura de 70-80% na fase aguda, e 10-20% na fase crônica. Com elevado custo no tratamento e escassez de terapias efetivas para a resolução do quadro patológico, a doença de Chagas se torna um problema social, econômico e político que afeta mais indivíduos economicamente desfavorecidos e requer um enfrentamento integral, multiprofissional, com ações intersetoriais.( BALLESTER-GIL et al, 2008)
Dessa forma, produtos naturais são uma fonte potencial de novos fármacos, os quais podem, no futuro, substituir muitos medicamentos atuais que apresentam baixa eficácia e efeitos colaterais.
Em alguns compostos derivados da (-)-cubebina, produto natural extraído de uma espécie de pimenta indiana, a Piper cubeba, foram constatadas a atividade tripanocida com interferência no processo de trans-splicing de RNA dos parasitos. Os derivados semi-sintéticos mais ativos contra a forma amastigota do T. cruzi foram a(-)-hinoquinina, (-)-O-benzilcubebinae (-)-(N,N-dimetilaminoetil) cubebina.(SOUZA, 2012).
Em vista da necessidade de novas substâncias com atividade biológica sobre o T. cruzi, o interesse pela pesquisa vem crescendo com o intuito de se obter compostos capazes de atuarem sobre o parasita de baixo custo e desprovidos de graves efeitos colaterais. Estudos envolvendo as lignanas e neolignanas, como a (-)-cubebina e a (-)-hinoquinina (Figura 1) tem demonstrado a importante atividade desses compostos sobre diferentes formas do parasita. A continuidade desses estudos pode contribuir para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da Doença de Chagas. (SOUZA, 2012).
2. OBJETIVO
Diante da importância no desenvolvimento de novos alternativas medicamentosas no tratamento da doença de Chagas, esse estudo foi realizado com o objetivo analisar os efeitos do tratamento das substâncias cubebina e (-)-hinoquinina na doença de Chagas experimental na fase crônica através na quantificação de óxido nítrico, demonstrando a atividade inflamatória da doença com essas substancias em comparação com o tratamento já existente.
3. METODOLOGIA
Foram avaliadas as substâncias (-)-cubebina e seu derivado, a (-)-hinoquinina, as quais anteriormente já demonstraram atividade antichagásica. As sementes de Piper cubeba utilizadas nesse estudo foram importadas da Floral Seed Company, Dehradun, Índia.
Todos os animais foram mantidos nas mesmas condições, em sala com temperatura e luminosidade controlada, recebendo água e ração ad libitum.
Os animais serão mortos por superdosagem de tiopental sódico (250mg/kg, diluído em solução fisiológica em uma concentração final a 5%) por via intraperitoneal. Após a morte dos animais, será coletado o coração e estes utilizados para a confecção de lâminas.
Foi utilizada a cepa Y de Trypanosoma cruzi, constituídas por formas tripomastigotas delgadas (NUSSENZWEIG, 1953). Esta cepa se manteve no Biotério da Universidade de Franca, através de repiques sucessivos em camundongos Swiss, por punção cardíaca no dia do pico parasitêmico (7º dia da infecção). Os animais dos grupos infectados foram inoculados intraperitonealmente com 1x106 formas tripomastigotas sanguíneas.
Para estes animais referentes à fase crônica, após a infecção os mesmos foram reservados 120 dias para a cronificação.
Após esse período, o tratamento foi realizado utilizando-se camundongos albinos, machos, linhagem BALB/C, sendo divididos em grupos: controle negativo – 5 animais foram inoculados com 1 x 106 parasitas e tratados com o solvente utilizado na preparação das soluções (DMSO 5%) durante 20 dias; tratamento (-)-cubebina - após 48h da inoculação intraperitoneal dos parasitas (1 x 106 parasitas), 5 animais foram tratados intraperitonealmente com a (-)-cubebina na concentração de 20 mg/kg durante 20 dias; tratamento (-)-hinoquinina - após 48h da inoculação intraperitoneal dos parasitas (1 x 106 parasitas), 5 animais foram tratados intraperitonealmente com a (-)-hinoquinina na concentração de 20 mg/kg durante 20 dias.
Todos os procedimentos foram realizados segundo os preceitos do Comitê de Ética da Universidade de Franca sob aprovação do Protocolo número 009/14.
4. DESENVOLVIMENTO
O experimento para a fase crônica se iniciou no 120°dia após o inóculo infectante com 20 dias de tratamento das substancias em cada um dos grupos e posteriormente foi realizada a quantificação de óxido nítrico.
Quantificação de óxido nítrico
Os ensaios de produção de óxido nítrico foram realizados com células do lavado peritoneal. Os ratos tiveram a cavidade peritoneal lavada com 10 mL de RPMI, centrifugado por 10 minutos a 1500 rpm e seu sobrenadante desprezado. O “pellet” foi ressuspendido com 1 mL de RPMI contendo 10% de soro bovino fetal e antibiótico. Desta suspensão foi determinada a quantidade de células viáveis e a concentração acertada para 5 x 105cel/mL. 100 µL desta suspensão foram distribuídas em placa de 96 poços, adicionado de 100 µg/mL poço de LPS e levado a estufa contendo 5% de CO2 durante 24 horas a 37°C. Após este período a placa foi submetida à centrifugação a 1500 rpm durante 4 minutos e recolhidos 100µL do sobrenadante para outra placa onde foi adicionado igual volume de reagente de Griess permitindo a revelação da reação por meio de leitor de microplacas utilizando filtro de 540nm (SALTZMAN, 1954).
5. RESULTADOS
Nas duas últimas décadas, o NO tem sido alvo de uma infinidade de estudos e está constantemente surpreendendo a comunidade científica, dada à quantidade de processos biológicos em que está envolvido (DUSSE et al., 2013).
O óxido nítrico (NO) constitui uma das menores e mais simples moléculas biossintetizadas (Morris; Billiar, 1994). O NO é um radical livre, gasoso, inorgânico, incolor, que possui sete elétrons do nitrogênio e oito do oxigênio, tendo um elétron desemparelhado (BECKMAN; KOPPENOL, 1996).
A grande maioria das doenças causadas por agentes patológicos leva a um desequilíbrio da resposta imune, onde um estado de imunossupressão normalmente se instala, de modo a proporcionar ao parasita, condições de evasão da resposta imune do hospedeiro.
Os resultados obtidos apontam a (-)-cubebina e (-)-hinoquinina, como imunomoduladores da resposta imune, aumentando a produção de óxido nítrico por parte dos animais infectados e submetidos ao tratamento com estas substâncias.
1 0 5 10 15 CN ITC ITH Grupos experimentais Óx id o n ít ri co
Figura 2. Produção de óxido nítrico expressos em µM em camundongos infectados com 20.000 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Y de Trypanosoma cruzi referentes à fase crônica. Grupo CN (Animais infectados e tratados com DMSO), Grupo ITC (Animais infectados e tratados com (-)-cubebina), Grupo ITH (Animais infectados e tratados com (-)-hinoquinina).
Para a substância (-)-hinoquinina, observa-se uma elevação maior da produção de óxido nítrico em comparação ao grupo de animais tratados com a (-)-cubebina para os animais infectados, portanto esse substancia apresentou uma maior resistência à infecção por Trypanosoma cruzi em relação à (-)-cubebina e ao controle negativo (Figura 2).
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
De acordo com as informações apresentadas neste presente estudo, é possível considerarmos que há uma elevada eficácia no tratamento com a substância (-)-hinoquinina para a fase crônica da doença de Chagas, confirmado pelo aumento da produção de óxido nítrico no grupo de animais tratados com a mesma, de acordo com sua modulação na resposta imune nos camundongos do grupo infectado (controle negativo). Dessa forma, podemos concluir que a substância (-)- hinoquinina poderia ser considerada promissora para a produção de novos fármacos para o tratamento da fase crônica na Doença de Chagas.
7. FONTES CONSULTADAS
ANDRADE J.P., NETO J.A.M., PAOLA A.A.V., VILAS-BOAS F., OLIVEIRA G.M.M, BACAL F., BOCCHI E.A., ALMEIDA D.R.,FILHO A.A.F., MOREIRA M.C.V., XAVIER S.S., JUNIOR W.A.O., DIAS J.C.P. e cols. I Diretriz Latino Americana para Diagnóstico e Tratamento da cardiopatia chagásica. Resumo executivo. Arq Bras Cardiol. Rio de Janeiro. v.96. 2011.
BALLESTER-GIL, L. M. et al. O saber do paciente chagásico sobre a sua doença: construção compartilhada de um instrumento para a pesquisa e teste de sua aplicabilidade. Ciência & Saúde Coletiva, v.13, p.2199-2214, 2008.
BASTOS, J. K.; ALBUQUERQE, S.; SILVA, M. L.; Evaluation of the Trypanocidal Activity of Lignans isolated from the leaves of Zanthoxylum naranjillo; Planta Med., v.65, p.541, 1999.
BECKMAN, J.S.; KOPPENOL, W.H. Nitric oxide, superoxide, and peroxinitrite: the good, the bad, and the ugly. American Journal of Physiology, v. 271, p.1424-37, 1996.
CUNHA-FILHO, M.; SÁ-BARRERO L.; LEONARDI, D.; LAMAS, M. C.; SALOMÓN, C.; Recentes Avanços no Tratamento de Chagas, Associação Médica de Brasília, Brasília, 2013.
DIAS, J. C. P.,COURA, J. R. Clínica e terapêutica da doença de Chagas: uma abordagem prática para o clínico geral. Fiocruz. Rio de Janeiro,1997.p. 71-79.
DUSSE, L. M.S.; VIEIRA, L. M.; CARVALHO, M. G.alho. Revisão sobre óxido nítrico. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, v. 39, n. 4, p. 343-350, 2003.
MEIRA N.D., MORENO A.M.H., BARBOSA D.P., MAGALE E.Z., MENDES S.Q., BARBOSA G.M.S. Aspectos epidemiológicos da Doença de Chagas (DCH) em relação aos pacientes atendidos de 1986 a 2010 no Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas- IPEC- Fiocruz/RJ/Brasil. Revista de Ciência e Tecnologia. v.12, p. 25-31. 2012.
MORRIS, S. M.; BILLIAR, T. R. New insights into regulation of inducible nitric oxide synthesis. American Journal of Physiology, v. 266, p.829-39, 1996.
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