Avaliação da expressão de receptores siglec-5 e -9 em neutrófilos humanos estimulados com LPS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

FLÁVIA CARDOSO AMARAL

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE RECEPTORES SIGLEC5 E -9 EM NEUTRÓFILOS HUMANOS ESTIMULADOS COM LPS

Florianópolis 2018

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE RECEPTORES SIGLEC5 E -9 EM NEUTRÓFILOS HUMANOS ESTIMULADOS COM LPS

Dissertação submetida ao Programa de Farmacologia da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Farmacologia Orientador: Prof. Dr. Fernando Spiller

Florianópolis 2018

Inicialmente, agradeço aos meus pais, Reginaldo e Valdete, por me apoiarem e me darem todo o suporte necessário para realização do mestrado. Ao meu amigo, companheiro, Luis Henrique, por todo suporte emocional e carinho. A Deus, por ser o que é na minha vida, e se manter presente sempre.

Agradeço também ao meu orientador, Prof° Fernando Spiller, pelas discussões, pela orientação na condução do trabalho e por toda ajuda frente aos problemas enfrentados.

Muito obrigada também a todo Laboratório de Imunobiologia (LiDi), em especial aos professores André Báfica e Daniel Mansur que sempre me receberam bem e colaboraram diretamente com sugestões e críticas. Além disso, expresso minha eterna gratidão aos meus amigos do LiDi que compartilharam momentos especiais e enriquecedores desde a minha iniciação científica. Muito obrigada por toda ajuda, sugestões e críticas!

Agradeço especialmente a Cristina, minha eterna mestra e amiga, por simplesmente tudo! Ao Matheus, meu amigo por me acompanhar durante esse percurso.

Obrigada também ao Prof° Fernando Cunha pela recepção em seu laboratório em Ribeirão Preto e todos os amigos que pude fazer durante esse período enriquecedor. Bem como a toda equipe do Hospital das Clínicas que ajudaram com os pacientes sépticos.

Agradeço ao Laboratório de Óxido Nítrico e ao corpo técnico do Lameb, por todo auxílio na utilização dos equipamentos.

Ao CNPq e ao Scripts pelo auxílio financeiro que permitiu o desenvolvimento deste trabalho.

A superestimulação dos neutrófilos circulantes durante a sepse contribui para o dano tecidual e falência de múltiplos órgãos. Dessa forma, a elucidação de receptores que podem estar envolvidos com a regulação do estado de ativação dos neutrófilos vem sendo alvo de estudos. Os Siglecs (Sialic acid-binding immunoglobulin super-family lectins) são receptores expressos em várias células do sistema imunológico que possuem um domínio intracelular inibitório chamado de ITIM (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs), que permite, através do recrutamento de fosfatases SHP-1 e 2, interferir em vias ativadas por outros receptores. Os Siglecs ligam-se ao ácido siálico presente na membrana plasmática da própria célula, mantendo o sítio de interação mascarado. A ativação celular ou a ação da enzima neuraminidase, que cliva o ácido siálico, liberam o sítio de ligação e permite a interação com o ácido siálico livre, presente em células adjacentes ou em patógenos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de receptores Siglec em neutrófilos humanos estimulados com LPS e identificar os mecanismos envolvidos em sua regulação. Nossos resultados mostraram que neutrófilos humanos (células CD66b+) têm alta expressão de Siglec-5 e -9, moderada expressão de Siglec-3 e -7 e não expressam Siglec-1, -2, -6, -8 ou -10. O tratamento do sangue total com LPS (1,0 μg/mL) por 3 horas aumentou significativamente a expressão de Siglec-5 e de Siglec-9 de maneira dose-dependente. Sendo que o pico de expressão desses receptores ocorreu entre 1,5 e 3 horas após o estímulo. Os neutrófilos possuem estoque intracelular de Siglec-5 e -9 que aparentemente são translocados para a membrana após a ativação com o LPS (1,0 μg/mL). Observamos ainda uma diminuição da expressão dos ligantes de Siglec-5 e -9 e de ácido siálico na conformação α-2,3 na membrana dos neutrófilos estimulados. Escherichia coli (107; 108 UFC) também induziu um aumento significativo na expressão de Siglec-5 em neutrófilos após 1,5 h de incubação, o que não foi observado com Enterococcus gallinarum (106; 107; 108 UFC) e o Pam3Cys (1,0 μg/mL). Para avaliar a atividade da neuraminidase e sua relação na expressão dos receptores, utilizamos o inibidor de neuraminidase, oseltamivir (Tamiflu). A incubação por 1,5 h do sangue total com o Tamiflu (250 μM) diminuiu a expressão de Siglec-5, mas promoveu alterações no tamanho e complexidade nos neutrófilos. Os estudos envolvendo pacientes sépticos não apresentaram diferenças quando comparado aos pacientes controles, exceto pelo tratamento com Tamiflu (10 μM) que modulou a expressão de Siglec-5,

mas não de Siglec-9. Em conjunto, nossos resultados demonstram que o LPS aumenta a expressão de Siglec-5 e -9 em neutrófilos e esse mecanismo pode ser dependente da ação da neuraminidase.

Over-stimulation of circulating neutrophils during sepsis contributes to tissue damage and multiple organ failure. Thus, identify and understand receptors that may be involved in the regulation of the neutrophil activation state have been subject of this study. Siglecs (Sialic acid-binding immunoglobulin super-family lectins) are immune system cells receptor that have an inhibitory intracellular domain called ITIM (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs), which, through the recruitment of SHP- 1 and 2, suppress/inhibit other receptors pathway activation. Siglecs binds to sialic acid present on cells plasma membrane, keeping the site of interaction masked. Cell activation or the action of the enzyme neuraminidase, which cleaves sialic acid, releases the binding site and allows interaction with free sialic acid and sialic acid in adjacent cells or pathogens. The aim of the present study was to evaluate the expression of Siglec receptors on human neutrophils stimulated with LPS and to identify the mechanisms involved in their regulation. Our results showed that human neutrophils (CD66b+ cells) have high expression of Siglec-5 and -9, moderate expression of Siglec3 and 7 and do not express Siglec1, 2, 6, 8 or -10. The treatment of whole blood with LPS (1.0 μg/ml) for 3 hours significantly increased the expression of Siglec-5 and Siglec-9 in a dose-dependent manner. The highest expression of these receptors occurred between 1.5 and 3 hours after the stimulus. Neutrophils have intracellular reservoir of Siglec-5 and -9 that are apparently translocated to the membrane after activation with LPS (1.0 μg/mL). It was also observed that the expression of Siglec-5 and -9 ligands and sialic acid (α-2,3 conformation) on the neutrophil cell membrane decrease after stimulation. Escherichia coli (107; 108 CFU) also induced a significant increase in Siglec-5 expression in neutrophils after 1.5 h of incubation, which was not observed with Enterococcus gallinarum (106; 107; 108 CFU) and Pam3Cys (1,0 μg/mL). To evaluate the activity of neuraminidase and its relationship in receptor expression, we used the neuraminidase inhibitor, oseltamivir (Tamiflu). The incubation for 1.5 h of whole blood with Tamiflu (250 μM) decreased Siglec-5 expression, and induced changes in neutrophils size and complexity. Studies involving septic patients showed no difference in Siglecs expressions when compared to control patients, except for the treatment with Tamiflu (10 μM) that modulated the expression of Siglec-5, but not Siglec-9. Taken together, our results demonstrate that LPS increases the expression of Siglec-5 and -9 in neutrophils and this mechanism may be

dependent on the neuraminidase activation or sialic acid cleavage by neuraminidase.

Keywords: Neutrophils. Siglec-5. Siglec-9. LPS. Sepsis.

Figura 2. Processo de formação de NETs. ... 26 Figura 3. Estrutura dos Siglecs expressos em humanos. ... 36 Figura 4. Interação cis ou trans entre o ácido siálico e os receptores Siglec. ... 38 Figura 5. Estratégia de análise para os dados obtidos por Citometria de Fluxo. ... 57 Figura 6. Expressão e frequência de Siglecs homólogos ao CD33 em células CD66b+. ... 60 Figura 7. Tamanho e complexidade das células estimuladas com LPS.. ... 63 Figura 8. Estimulação in vitro de sangue total com LPS aumenta a expressão de Siglec-5 e -9 de forma dose-dependente.. ... 63 Figura 9. Expressão de Siglec-5 e -9 durante diferentes tempos de estimulação com o LPS in vitro.. ... 66 Figura 10. Neutrófilos humanos estimulados com LPS aumentam expressão de Siglec-5, -7 e -9.. ... 68 Figura 11. Gráficos de contorno dos leucócitos totais estimulados com E. coli e E. gallinarum... 70 Figura 12. Neutrófilos humanos estimulados com E. coli aumentam a expressão de Siglec-5.. ... 72 Figura 13. Tamanho e complexidade das células estimuladas com PAM3Cys.. ... 73 Figura 14. Expressão de Siglec-5 em neutrófilos humanos estimulados com Pam3Cys. ... 74 Figura 15. Comparação nas mudanças no tamanho e complexidade das células permeabilizadas em relação as não permeabilizadas. ... 76 Figura 16. Identificação de Siglec-5 e -9 intracelular em neutrófilos humanos. ... 78 Figura 17. Inibição in vitro da enzima neuraminidase pelo Tamiflu. .... 80 Figura 18. Tamanho e complexidade das células tratadas com Tamiflu. ... 82 Figura 19. Expressão de Siglec-5 e -9 em neutrófilos após o tratamento com o Tamiflu. ... 83 Figura 20. LPS diminui o ácido siálico na conformação α-2-3 presente na membrana de neutrófilos e hemácias. ... 86 Figura 21. LPS diminui os ligantes de Siglec-5 e -9 em neutrófilos humanos. ... 88 Figura 22. Tamanho e complexidade das células estimuladas com PMA. ... 89

Figura 23. Produção de EROs e expressão de Siglec-5 em neutrófilos estimulados com LPS e PMA. ... 91 Figura 24. Comparação da expressão de Siglec-5 e -9, seus ligantes e conformações do ácido siálico em pacientes sépticos e doadores saudáveis. . ... 93 Figura 25. Comparação da expressão de Siglec-5 e -9, seus ligantes e conformação do ácido siálico em pacientes sépticos e doadores saudáveis após o tratamento com Tamiflu. ... 95

1.1 NEUTRÓFILOS ... 19

1.2 SEPSE ... 28

1.3 SIGLEC – SIALIC ACID BINDING IG-LIKE LECTINS ... 34

2 OBJETIVOS ... 43

2.1 OBJETIVO GERAL ... 43

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICO ... 43

3 METODOLOGIA ... 45

3.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ... 45

3.2 AMOSTRAS DE SANGUE DE DOADORES SAÚDAVEIS 45 3.3 AMOSTRAS DE SANGUE DE PACIENTES SÉPTICOS.. 46

3.4 ESTÍMULAÇÃO IN VITRO COM LPS OU PAM3CYS ... 47

3.5 LISTA DE REAGENTES UTILIZADOS PARA CITOMETRIA DE FLUXO ... 47

3.6 OBTENÇÃO DE LEUCÓCITOS TOTAIS APÓS LISE DAS HEMÁCIAS ... 48

3.7 MARCAÇÃO DE VIABILIDADE COM FVS ... 49

3.8 MARCAÇÃO PARA CITOMETRIA DE FLUXO COM ANTICORPOS ... 50

3.9 AVALIAÇÃO DA CONFORMAÇÃO DO ÁCIDO SIÁLICO EM NEUTRÓFILOS HUMANOS ... 50

3.10 AVALIAÇÃO DE LIGANTES DE SIGLEC-5 E -9 EM NEUTRÓFILOS HUMANOS ... 51

3.11 ESTIMULAÇÃO DOS NEUTRÓFILOS COM E. coli ou E. gallinarum ... 52

3.12 GLICOSILAÇÃO DE HEMÁCIA ... 52

3.13 ENSAIO DE ATIVIDADE DA NEURAMINIDASE ... 53

3.14 TRATAMENTO COM TAMIFLU NO SANGUE TOTAL . 54 3.15 MARCAÇÃO INTRACELULAR DE SIGLEC-5 E -9 ... 54

3.16 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO EM NEUTRÓFILOS HUMANOS ... 55 3.17 EXPERIMENTOS COM PACIENTES SÉPTICOS ... 55 3.18 ESTRATÉGIA DE ANÁLISE DOS DADOS OBTIDOS POR CITOMETRIA DE FLUXO ... 56 3.19 ANÁLISE ESTÁTISTICA ... 57 4 RESULTADOS ... 59

4.1 CARACTERIZAÇÃO DA EXPRESSÃO DE RECEPTORES

SIGLECS EM CÉLULAS CD66b+ ... 59 4.2 NEUTRÓFILOS HUMANOS ESTIMULADOS COM LPS IN VITRO AUMENTAM A EXPRESSÃO DE SIGLEC-5 E -9 ... 61 4.2.1 Expressão de Siglec-5 e -9 após ensaio de concentração-resposta do LPS ... 61 4.2.2 Expressão de Siglec-5 e -9 após ensaio de tempo-resposta do LPS 64

4.2.3 Expressão de Siglec- 3, -5, -7 -9 em neutrófilos humanos estimulados com LPS 1,0 μg/mL ... 67

4.3 EXPRESSÃO DE SIGLEC-5 EM NEUTRÓFILOS

AUMENTA APÓS ESTIMULAÇÃO IN VITRO COM E. COLI, MAS NÃO APÓS O ESTÍMULO COM E. GALLINARUM... 69 4.4 O ESTÍMULO COM O PAM3CYS IN VITRO NÃO AUMENTA A EXPRESSÃO DE SIGLEC-5 EM NEUTRÓFILOS HUMANOS ... 73

4.5 NEUTRÓFILOS HUMANOS POSSUEM ESTOQUE

INTRACELULAR DE SIGLEC-5 E -9 ... 75

4.6 OSELTAMIVIR (TAMIFLU) INIBE A ENZIMA

NEURAMINIDADE SE LEUCÓCITOS HUMANOS IN VITRO ... 78 4.7 TAMIFLU DIMINUI A EXPRESSÃO DE SIGLEC-5 EM NEUTRÓFILOS ... 81 4.8 AVALIAÇÃO DA GLICOSILAÇÃO DE NEUTRÓFILOS ESTÍMULADOS COM LPS ... 84 4.8.1 O estímulo do LPS reduz a quantidade de ácido siálico na conformação α2,3 na membrana de neutrófilos e de hemácias ... 84

4.9 NEUTRÓFILOS ESTIMULADOS COM PMA

EXPRESSAM MENOS SIGLEC-5 ... 88

4.10 PACIENTES SÉPTICOS ... 92

5 DISCUSSÃO ... 97

6 CONCLUSÃO ... 107

1 INTRODUÇÃO

1.1 NEUTRÓFILOS

O sistema imune inato humano é , geralmente, a primeira linha de defesa do organismo no combate aos mais diversos tipos de patógenos – vírus, bactérias, protozoários, fungos, helmintos – assim como xenobióticos. Sua atuação é rápida e, na maioria das vezes, eficaz, de modo que, o desenvolvimento de infecções em indivíduos saudáveis ocorre apenas ocasionalmente (KUMAR; SHARMA, 2010; MÜLLER et al., 2008; MURPHY et al., 2010). Os componentes do sistema imunológico inato são variados, e incluem, por exemplo, as células epiteliais, o sistema complemento, os mediadores solúveis, e os tipos celulares. Esses consistem em células apresentadoras de antígenos, como as células dendríticas, células NK, e células fagociticas, como os macrófagos e os neutrófilos (HATO; DAGHER, 2015; MURPHY et al., 2010).

Os neutrófilos são células do sistema imunológico classificados como leucócitos polimorfonucleares ou granulócitos. Essa classificação é decorrente, respectivamente, do formato multilobulado de seu núcleo, que favorece a passagem dessas células entre as células epiteliais durante sua migração, e por seu citoplasma ser repleto de grânulos contendo diversas enzimas que atuam no combate ao patógeno (CARVALHO et al., 2015; HOFFMANN et al., 2007). Os neutrófilos são as células do sistema imune presentes em maior quantidade no sangue de humanos saudáveis, compondo cerca de 60% dos leucócitos totais (KOBAYASHI; MALACHOWA; DELEO, 2017). Essas células

possuem uma meia vida curta em torno de sete a dez horas em humanos (VON VIETINGHOFF; LEY, 2008). Por conta disso, a produção de neutrófilos, em um adulto saudável, é por volta de 5x1010 a 1010 células por dia e ocorre na medula óssea através de um processo denominado de granulopoiese (HOFFMANN et al., 2007; PRUCHNIAK; ARAZNA; DEMKOW, 2013). O fator estimulante de colônias granulocíticas (G-CSF, do inglês granulocyte colony stimulating factor) é o principal regulador fisiológico da produção de neutrófilos. Este atua através do receptor G-CSF, o qual promove a mobilização das células progenitoras, o aumento da proliferação dos precursores de granulócitos e a liberação de células maduras para o sangue (NATHAN, 2006; SUMMERS et al., 2010).

A saída dos neutrófilos da medula óssea ocorre por migração através do endotélio sinusoidal que separa o compartimento hematopoiético da circulação. No entanto, apenas 1 a 2% de neutrófilos maduros são encontrados na corrente sanguínea, visto que uma boa parte permanece na medula óssea enquanto o restante localiza-se em órgãos como o fígado, o baço e os pulmões. Estes reservatórios permitem o rápido recrutamento dessas células durante um processo infeccioso, o qual é orquestrado por diversas quimiocinas, incluindo a interleucina 8 (IL-8), interferon gama (IFN-,do inglês interferon gamma), proteína C5a do complemento e leucotrieno B4 (LTB4,do inglês leukotriene B4) (CHRISTOFFERSSON; PHILLIPSON, 2018; PRUCHNIAK; ARAZNA; DEMKOW, 2013; SUMMERS et al., 2010).

Os neutrófilos são a primeira linha de defesa no combate a bactérias e fungos, sendo os primeiros leucócitos recrutados para o foco infeccioso, em um processo conhecido como migração

(KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013a; SEGAL, 2007). Esse processo é decorrente de uma série de eventos sequenciais. Inicialmente, quando um patógeno atravessa o epitélio e alcança o tecido, macrófagos residentes são ativados especialmente por padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs, do inglês pathogen-associated molecular pattern) e por e por padrões moleculares associados ao dano tecidual (DAMPs, do inglês danger associated molecular patterns). Diante disso, essas células liberam citocinas e quimiocinas, dentre as quais IL-1β, IL-6, fator de necrose tumoral (TNF, do inglês tumor necrosis factor) e IL-8 que resulta na ativação de moléculas de adesão do endotélio vascular próximo a inflamação, iniciando a cascata de recrutamento de neutrófilos (LEY et al., 2007; SADIK; KIM; LUSTER, 2012). A primeira etapa desta cascata é a captura, em que células endoteliais ativadas passam a expressar as selectinas P e E, as quais interagem com ligantes glicosilados, por exemplo, como a “glicoproteína ligante de selectina 1” (PSGL1, do inglês Pselectin glycoprotein ligand 1), presente na membrana celular dos neutrófilos, permitindo assim a interação com as paredes do vaso para subsequente rolamento na superfície do endotélio (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013; MANTOVANI et al., 2011). A ligação entre as selectinas e PSGL-1 é caracterizada por ser uma interação de baixa afinidade e ocorre à medida que o neutrófilo rola sob o endotélio de forma que novas interações são formadas ao mesmo tempo em que outras são desfeitas. Esse contato entre a superfície do endotélio ativado e os neutrófilos favorece o contato destes com quimiocinas ali depositadas. Por conta disso, as células passam a expressar as integrinas LFA1 (também conhecida como α1β2; integrina β2 CD11a complexada com

CD18) e MAC1 (também conhecida como αMβ2; CD11b complexado com CD18). Estas integrinas se ligam a moléculas de adesão intercelular 1 e 2 (ICAM1 e ICAM2, do inglês intercellular adhesion molecule 1 or 2) presentes no endotélio vascular ativado formando ligações mais estáveis que resultam na interrupção do rolamento e a aderência dos neutrófilos no endotélio vascular. (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013; MURPHY et al., 2010; PRUCHNIAK; ARAZNA; DEMKOW, 2013).

A partir disso, ocorre a transmigração dos neutrófilos mediada por integrinas (LFA-1, MAC-1, VCAM1) e por uma molécula, presente nos leucócitos e nas junções intercelulares, relacionada às imunoglobulinas, chamada de “molécula de adesão celular plaquetária/endotelial 1” (PECAM1, do inglês platelet/endothelial cell adhesion molecule 1) (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013). Essas interações permitem a mudança de conformação dos neutrófilos e sua passagem entre as células endoteliais. Normalmente, as células rastejam sob o endotélio vascular a procura de um local adequado para transmigração paracelular, ou seja, entre as células epiteliais. No entanto, uma minoria pode realizar a transmigração através da via transcelular, a qual a célula epitelial envolve o neutrófilo através de projeções semelhantes à microvilosidades formando uma espécie de cúpula (LEY et al., 2007). Tais projeções são ricas em ICAM1 e VCAM1 e interagem com as integrinas LFA-1 e VLA-4 (também conhecida como integrina α4), presente nos leucócitos, permitindo a passagem da célula através da célula endotelial (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013). Depois de passar pelo revestimento endotelial, os neutrófilos ainda devem atravessar a membrana basal. Para isso, os mesmos liberam proteases, tais como a elastase, que permitem a quebra

do colágeno facilitando a migração (BORREGAARD, 2010). Por fim, os neutrófilos são direcionados ao sítio inflamatório por um gradiente de quimioatrativos como IL-8, LTB4, proteína C5a do complemento e peptídeos N-formilados (NFP, do inglês N-formylated peptides). Esses mediadores inflamatórios ativam receptores acoplados a proteína G (GPCRs, do inglês G-protein-coupled receptors) que estimulam a movimentação dos neutrófilos através da reorganização do citoesqueleto até o foco infeccioso (PHILLIPSON; KUBES, 2011).

Figura 1. Cascata de migração dos neutrófilos. Etapas envolvidas na migração dos neutrófilos para o foco infecioso. Primeiramente, ocorre à captura e o rolamento mediado por selectinas, a ativação dos neutrófilos por citocinas que resulta na adesão ao endotélio através de integrinas. Na sequência, as células rastejam sob o endotélio em busca do melhor local onde decorre a transmigração pela via paracelular ou transcelular. As principais moléculas envolvidas em cada etapa estão indicadas acima de cada processo. Imagem adaptada de Ley et al. (2007).

No local da infecção, os neutrófilos que foram parcialmente ativados durante seu processo de migração, entram em contato com PAMPs e citocinas pró-inflamatórias que resultam em uma ativação total da célula. Isso ocorre por conta do efeito conhecido como priming de neutrófilos, no qual essas células se mantêm não responsivas a um

único estímulo, mas aumenta sua capacidade de resposta de ativação após um segundo estímulo (MAYADAS; CULLERE; LOWELL, 2014). Dessa forma, em um processo inflamatório regular há certa garantia que será apenas no foco infecioso que os neutrófilos serão totalmente ativados e atuarão para destruir os patógenos. Para isso, essas células possuem diversos mecanismos de defesa como, por exemplo, a fagocitose. Esse mecanismo é um processo ativo, na qual o patógeno é circundado pela membrana fagocítica, seguido pela internalização em uma vesícula, conhecida como fagossoma. O fagossoma permite a fusão de outras vesículas que contêm grânulos de proteínas antibacterianas como, por exemplo, lisozima, defensina, lactoferrina e catepsina. Assim como os macrófagos, os neutrófilos fagocitam partículas não opsonizadas ou opsonizadas a partir dos receptores Fc (FcR), como por exemplo, os FcRIIA (CD32) e FcRIIIb (CD16) que reconhecem a porção Fc de uma imunoglobulina, e também a partir da integrina MAC1 que se liga em fragmentos C3b do complemento (PRUCHNIAK; ARAZNA; DEMKOW, 2013). Essa opsonização favorece a captação de partículas, resultando em uma fagocitose rápida, que leva menos de 20 segundos (MAYADAS; CULLERE; LOWELL, 2014; SEGAL, 2007). Além da fagocitose, os neutrófilos passam a produzir espécies reativas de oxigênio (EROs) pelo sistema NADPH-oxidase que é um complexo multiproteíco composto por ligante de membrana, o p22 phox, gp91phox, que formam o flavocitocromo b558, e quatro componentes citosólicos, o p40 phox, p47 phox, p67 phox e rac2 (PRUCHNIAK; ARAZNA; DEMKOW, 2013; SEGAL, 2007). A formação desse complexo, após a ativação dos neutrófilos, catalisa a redução do oxigênio através de um processo de transferências de elétrons. Essa reação resulta na formação de ânion

superóxido (O2•) e o peróxido de hidrogênio (H2O2) que são liberados ao compartimento intracelular como o fagossoma ou ao meio extracelular, atuando na destruição do patógeno (MAYADAS; CULLERE; LOWELL, 2014; PRUCHNIAK; ARAZNA; DEMKOW, 2013).

Outro mecanismo de combate ao patógeno é a degranulação, em que os grânulos presente no citoplasma dos neutrófilos se fundem com o fagossoma ou com a membrana plasmática liberando seu conteúdo contendo diferentes moléculas antimicrobianas. Basicamente, os neutrófilos possuem grânulos que são formados durante o processo de diferenciação na medula óssea e são classificados como primários (azurofílicos), que contêm defensinas, mieloperoxidase, serina, elastase; os secundários (específicos), que contêm fosfatase alcalina, lactoferrina, lisozima, NADPH oxidase, colagenase; e os terciários (gelatinase), que contêm catepsina e gelatinase. Atualmente, foram descritos também outros dois tipos de grânulos. Um deles contém uma grande quantidade de ficolin-1, e outro é conhecido como vesículas secretórias e foi identificado apenas em neutrófilos maduros e aparenta ser formado a partir de endocitose e por pequenas estruturas do complexo de golgi (RØRVIG et al., 2009; SHESHACHALAM et al., 2014). Recentemente, foi descrito um novo mecanismo de atuação dos neutrófilos conhecido como armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs, do inglês neutrophil extracellular traps) (BRINKMANN et al., 2004). Os NETs são fibras extracelulares compostas principalmente por derivados de ácido desoxirribonucleico, histonas e várias proteínas, como a lactoferrina e catepsina, além de enzimas, como a elastase e a mieloperoxidade. (BRINKMANN et al., 2004; KOLACZKOWSKA;

KUBES, 2013). Esse mecanismo resulta na imobilização dos patógenos, impedindo sua disseminação, facilitando a fagocitose e promovendo sua morte por meio das histonas e proteases (BRINKMANN et al., 2004; KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013; PRUCHNIAK; ARAZNA; DEMKOW, 2013). A formação dos NETs é rápida e ocorre em minutos, de modo que alguns autores sugerem que esse processo envolve um tipo de morte celular, diferente de necrose e apoptose, denominado de NETosis (FUCHS et al., 2007; KENNEDY; DELEO, 2009).

Figura 2. Processo de formação de NETs. Neutrófilos ativados aumentam a produção de espécies reativas de oxigênio (1). Em sequência, inicia-se o processo de desintegração da membrana nuclear e a perda da integridade das vesículas que contêm os grânulos (2), o que resulta, posteriormente, na combinação dos grânulos com o material nuclear (3). Por fim, há a contração celular para liberação dos NETs no meio extracelular (4). Imagem adaptada de Brinkmann e Zychlinsky (2007).

Todos esses mecanismos de defesa realizados pelos neutrófilos são essenciais no combate a microorganismos, de forma que qualquer desordem na função dessas células está relacionada com o aumento de infecções (DINAUER, 2014). Como exemplo, é possível citar a deficiência granular específica (SGD, do inglês Neutrophil-specific granule deficiency) que é caracterizada pela ausência de grânulos secundários ocasionando infecções bacterianas e fúngicas recorrentes e de difícil tratamento (DINAUER, 2014; WADA; AKAGI, 2016). Já a

doença granulomatosa crônica é um grupo de diversas doenças genéticas que afetam o complexo NADPH-oxidase e dificulta a produção de EROs, aumentando as infecções fúngicas e bacterianas graves que podem evoluir e levar a morte do hospedeiro (SONG et al., 2011; YU et al., 2018).

No entanto, esses mecanismos de defesa não são específicos e quando ativados tornam-se fatores deletérios para o organismo do hospedeiro. Por exemplo, é possível que os grânulos venham a se fundir ao fagossoma antes de seu total englobamento, resultando na liberação de conteúdo citolítico e produtos oxidativos no meio extracelular, ocasionando dano no local (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013a; MAYADAS; CULLERE; LOWELL, 2014; SECUNDINO et al., 2016). A própria formação e liberação de NETs e de EROs inevitavelmente ocasionam dano tecidual. Contudo, em condições normais o processo inflamatório é autolimitante e os eventuais danos causados no local são reparados. Os neutrófilos possuem um papel importante no processo de reparação ao atrair e programar macrófagos para orquestrar o reparo tecidual, ao diminuir migração de outros neutrófilos para o foco infecioso, suprimir sua ativação e induzir sua morte por apoptose (KOLACZKOWSKA; KUBES, 2013b; MANTOVANI et al., 2011; NATHAN, 2006).

Dessa forma, para manter a homeostase tecidual é importante garantir que a ativação dos neutrófilos seja suficiente para controlar a infecção, causar um dano tecidual mínimo e induzir o reparo. Fatores que promovem uma ativação inadequada, uma falha na regulação da produção ou na apoptose dos neutrófilos colaboram para que os efeitos deletérios causados pelo dano sejam maior do que os causados própria

infecção (NATHAN, 2002; NATHAN; DING, 2010). Nesses casos, eventualmente o quadro evolui para complicações mais graves, como por exemplo, na sepse.

1.2 SEPSE

A sepse é uma disfunção orgânica ocasionada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção. É considerada uma das condições mais frequentes no mundo e requer o cuidado em Unidades de Terapia Intensiva (UTI). Em função disso, é uma grande preocupação de saúde pública devido ao alto valor gasto no tratamento. Nos Estado Unidos, por exemplo, em 2011, o desembolso foi de mais de 20 bilhões de dólares o que corresponde a 5,2% do total de custos hospitalares (MACHADO et al., 2017; SINGER et al., 2016). No Brasil, um estudo evidenciou a primeira análise econômica de custo direto da sepse em UTIs brasileiras, em que demonstrou que o custo do tratamento de pacientes com sepse no Brasil é alto. Esta análise ocorreu em 21 UTIs, incluindo 524 pacientes sépticos, de forma que o custo médio total de cada um destes pacientes foi em torno de R$ 28.813,00 (SOGAYAR et al., 2008).

Há poucos estudos epidemiológicos sobre sepse no Brasil. Dentre estes, o Brazilian Sepsis Epidemiological Study (BASES) realizou em 2004 um estudo de coorte observacional multicêntrico, em cinco Unidades Terapêuticas Intensivas (UTI) nos estados de São Paulo e Santa Catarina. Os resultados demonstraram que a incidência de sepse foi de 30,5 casos a cada 100 admissões nas UTIs (SILVA et al., 2004). Em 2014, a Sepsis prevalence assessment database (SPREAD) realizou uma pesquisa que abrangeu todas as regiões do Brasil e demonstrou uma

incidência de sepse de 36,3 por 1000 pacientes-dia e uma mortalidade de aproximadamente 56%. Além disso, esse estudo fez uma projeção de casos de sepse em adultos tratadas por UTI por ano no Brasil, a qual foi de 420.000 casos por ano, sendo que destes 230.000 não sobreviveriam (MACHADO et al., 2017).

Em 2016, a 3° Conferência Internacional para Definições da Sepse e Choque Séptico (do inglês, The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock) estabeleceu uma nova definição de sepse e extinguiu outros termos considerados redundantes ou excessivamente limitados, como a sepse grave e septicemia, respectivamente. Dessa forma, na definição atual, a sepse é considerada uma disfunção orgânica, com risco de vida, causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção (SINGER et al., 2016). Está resposta inclui um estado pró e anti-inflamatório juntamente com modificações em outros sistemas, como o cardiovascular, o neuronal, o metabólico e vias de coagulação (SHEN et al., 2017; SINGER et al., 2016).

Sob aspecto do sistema imunológico, diversos estudos demonstram que há uma função desregulada dos neutrófilos e que isso é um fator importante na fisiopatologia da doença, sendo diretamente correlacionada com aumento na morbidade e mortalidade dos pacientes. (DANIKAS et al., 2008; KOVACH, MELISSA A.; STANDIFORD, 2012).

Comumente pacientes sépticos apresentam elevado número de neutrófilos no sangue, tanto células maduras, quanto de células ainda imaturas, conhecidas como bastonetes (MARE et al., 2015). Um dos fatores que contribui para isso são as altas concentrações de G-CSF em

pacientes sépticos, uma vez que esse fator possui papel fundamental para a granulocitose, (TANAKA et al., 1996; WEISS et al., 2003). Além disso, sabe-se que a retenção e a liberação dos neutrófilos da medula óssea estão correlacionadas com a presença dos receptores CXCR4 e CXCR2 na membrana dos neutrófilos, que se ligam, respectivamente, ao CXCL12 e CXCL1 ou CXCL2. Basicamente, a ligação entre CXCR4 e CXCL12 mantém a célula retida, enquanto que sinais através de CXCL1 ao CXCR2 favorece sua liberação para a corrente sanguínea. Normalmente, a liberação de neutrófilos para a corrente sanguínea correlaciona-se com o fato de que à medida que há a sua maturação, os neutrófilos diminuem a expressão de CXCR4 e aumentam a de CXCR2, portanto, encontra-se quase que exclusivamente neutrófilos maduros no sangue (STRYDOM; RANKIN, 2013). No entanto, a alta presença de neutrófilos imaturos no sangue de pacientes séptico, está correlacionada com uma diminuição de CXCL12 e um aumento de CXCL1 na medula óssea, ou seja, há um menor estímulo para retenção, em decorrência de haver menos CXCL12, e um maior estímulo para liberação dos neutrófilos, por conta do aumento de CXCL1 e sua interação com o CXCR2 (WEISS et al., 2003).

No que concerne ao processo de migração dos neutrófilos, este se encontra prejudicado, de modo que o número dessas células que chegam ao foco infecioso pode ser insuficiente, resultando no não controle da infecção e favorecendo, dessa forma, a disseminação sistêmica do patógeno (SÔNEGO et al., 2016). Na sepse, há alterações em toda a cascata de migração dos neutrófilos. Em decorrência dos estímulos pró-inflamatórios como o TNF, IL-1β e a presença de PAMPs na corrente sanguínea, como o lipopolissacarídeo (LPS), os neutrófilos perdem

L-selectina (conhecido também como CD62L) e aumentam a expressão de β-integrinas, favorecendo a forte interação com as moléculas de adesão ICAM-1 e VCAM-1 do endotélio. Dessa forma, os neutrófilos ficam mais firmemente aderidos ao endotélio vascular, o que diminui seu rolamento e favorece a retenção dessas células nos vasos. Essa retenção pode ocasionar uma oclusão capilar e promover a isquemia nos tecidos, contribuindo para a disfunção orgânica (BROWN et al., 2006; LERMAN; KIM, 2015). Outro fator que colabora com a falência na migração dos neutrófilos é a redução da expressão do receptor CXCR2 nessas células. Já foi demonstrado que ocorre a redução desse receptor tanto em camundongos submetidos ao modelo de sepse induzido pela ligação e perfuração do ceco (CLP, do inglês cecal ligation and puncture), quando em pacientes sépticos (CHISHTI et al., 2004; RIOS-SANTOS et al., 2007). Alguns mecanismos que ocasionam essa diminuição do CXCR2 já foram elucidados. Sucintamente, a ativação prolongada de receptores acoplados à proteína G resulta no recrutamento de quinases GRKs (ou GPCRKs, do inglês G-protein coupled receptors kinases) que fosforilam esses receptores ocasionando sua dessensibilização e internalização (ARRAES et al., 2006; LEFKOWITZ, 2005). Isso é observado, em camundongos sépticos, através da ativação de dos receptores TLR2, 4, 9 pelos seus ligantes que resulta no aumento da expressão da GRK2 promovendo a internalização do receptor CXCR2 (ALVES-FILHO et al., 2009; TREVELIN et al., 2012). Além dos receptores TLR, outros estudos demonstram que tanto o TNF-α quanto o óxido nítrico podem estar associados com a dessensibilização do receptor CXCR2, colaborando para a falha na

migração dos neutrófilos (PAULA-NETO et al., 2011; SECHER et al., 2009).

Outro receptor que possui sua expressão alterada na sepse é o CCR2. Normalmente, os neutrófilos possuem expressão ínfima desse receptor em sua membrana, sendo o CCR2 comumente encontrado em monócitos (ALI et al., 2014; BONECCHI et al., 1999). Entretanto, estudos demonstram que neutrófilos de camundongos submetidos à CLP possuem a expressão do receptor CCR2 aumentada, e que este aumento é decorrente da ativação da via de TLR2 e TLR4. Sendo que, animais nocautes para o CCR2 quando submetidos à CLP apresentaram um menor acúmulo de neutrófilos em órgão como pulmão, rins e coração. Além disso, neutrófilos de pacientes sépticos não sobreviventes expressavam mais o receptor CCR2 quanto comparado aos pacientes sobreviventes. Tais fatos foram correlacionados com o aumento da migração randômica dessas células para órgãos distantes do foco infecioso (SOUTO et al., 2011).

Além do processo migratório desregulado, os neutrófilos também podem causar o dano tecidual direto através dos seus mecanismos de produção de EROs, NETs e a partir da exocitose de seus grânulos. Estudos demonstram que neutrófilos e macrófagos de pacientes sépticos produzem mais EROs quando comparado as mesmas células de pacientes saudáveis (SANTOS et al., 2012). A formação excessiva de NETs durante a sepse é correlacionado com o desenvolvimento do dano tecidual. Estudos demonstram que neutrófilos de doadores saudáveis expostos ao plasma de pacientes sépticos interagem com as plaquetas através de um mecanismo dependente de TLR4, o que resulta na produção e liberação de NETs. Isso não ocorre quando os neutrófilos

foram incubados com plasma de doadores saudáveis (CLARK et al., 2007). Além disso, estudos também demonstram que os NETs podem estar correlacionados com os distúrbios na coagulação, favorecendo o desenvolvimento de trombose (DELABRANCHE et al., 2017; VON BRÜHL et al., 2012).

Os neutrófilos são células que possuem uma meia vida curta, porém quando ativados tendem a aumentar sua sobrevida. Durante a sepse, isso também ocorre, portanto, além da medula óssea produzir e liberar mais neutrófilos para corrente sanguínea, a apoptose dessas células também é tardia (LUAN et al., 2015).

A sepse é um exemplo de doença onde o sistema imunológico, que tem um papel voltado para proteção, acaba causando danos graves ao hospedeiro por conta da infecção. De forma que, muitas das complicações que possam vir a ocorrer sejam decorrentes da resposta do organismo e não do patógeno. Os neutrófilos, conforme já explicado, colaboram diretamente para a isso, pois devido à ativação excessiva e desregulada dessas células ocorre uma falha em sua migração, resultando em uma diminuição de neutrófilos no foco infecioso e sua migração randômica pra outros órgãos, além do acúmulo deletério no endotélio capilar e o dano via seus mecanismos de defesa. Dessa forma, tendo em vista esse importante papel dos neutrófilos na fisiopatologia da sepse, entender os mecanismos de regulação dessas células, a fim de evitar esse dano tecidual excessivo, pode colaborar no desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento da sepse. E uma possibilidade para isso pode ser através de receptores inibitórios.

1.3 SIGLEC – SIALIC ACID BINDING IG-LIKE LECTINS

A resposta imune mediada por neutrófilos deve ser regulada de modo a facilitar a eliminação de patógenos sem induzir inflamação prejudicial e dano tecidual. Dessa forma, os neutrófilos expressam vários receptores inibitórios que controlam especificamente suas funções (AZCUTIA; PARKOS; BRAZIL, 2017; FAVIER, 2016). Alguns desses receptores inibitórios apresentam em sua cauda citoplasmática um imunorreceptor inibitório chamado de ITIMs (do inglês Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs), que pode modular funções celulares, como a ativação, proliferação e apoptose, através do recrutamento de fosfatases SHP-1 e 2 (do inglês Src homology 2 domain containing protein tyrosine). Dentre os receptores que atuam através desse mecanismo há o SIRPα (do inglês signal regulatory protein α), o PIR (do inglês paired-immunoglobulin-like receptor), o LILRB2 e LILRB3 (do inglês leukocyte immunoglobulin-like receptor B2 or B3) e os Siglecs (do inglês Sialic acid binding Ig-immunoglobulin-like lectins) (FAVIER, 2016).

Os Siglec são a mais recente família de lectinas descrita em humanos (MACAULEY; CROCKER; PAULSON, 2014). As lectinas são um grupo especializado de proteínas que reconhecem carboidratos e estão envolvidas em diversas funções biológicas, como na interação célula-célula, no tráfego de proteínas e no sistema imunológico através do reconhecimento de patógenos, processamento de antígenos, ativação imunológica e imunossupressão (LECKBAND, 2011; MARTH; GREWAL, 2008; VAN KOOYK; RABINOVICH, 2008). Todas as lectinas são caraterizadas por possuírem um ou mais domínios específicos responsáveis pelo reconhecimento e ligação a um

carboidrato/glicanos. Os Siglecs, por exemplo, são receptores que reconhecem principalmente cadeias de carboidratos que possuem um ácido siálico em sua porção terminal (SCHNAAR, 2016). O ácido siálico é um monossacarídeo de nove carbonos com carga negativa que se ligam ao carboidrato subjacente através de ligações glicosídicas α2,3; α2,6 e α2,8, as quais determinam sua conformação (ZHOU et al., 2018). A interação entre os Siglecs e o ácido siálico ocorre através do domínio amino-terminal V-set immunoglobulin do receptor. Atualmente, são conhecidos 16 tipos de Siglecs em humanos, os quais são subdividos em dois subtipos com base na sua sequência e sua conservação evolutiva. Um primeiro grupo mantem sua estrutura conservada e inclui os Siglecs -1, -2, -4, -15, enquanto que um segundo grupo apresenta sua estrutura em constante evolução, sendo chamados de homólogos ao CD33 (CD33-related Siglecs), e inclui, dentre outros, os Siglecs -3 (também conhecido como CD33), -5, -7, -8, -9, -10, -14 (CROCKER; PAULSON; VARKI, 2007). No que tange aos roedores, são descritos, até o momento, 9 tipos de Siglec, dentre estes 5 homólogos ao CD33. No entanto, devido à dificuldade de atribuir quais Siglecs homólogos ao CD33 seriam ortólogos entre humanos e camundongos utiliza-se a nomenclatura por letras (Siglec-E, -F, -H, -G) (CROCKER; PAULSON; VARKI, 2007; ZHOU et al., 2018). Além do domínio V-set, os Siglecs possuem um domínio C-set immunoglobulin, que varia em número entre os receptores, uma porção transmembranar e, na grande maioria, o domínio citosólico inibitório ITIM e moléculas ITIM-like. A ativação destes resulta na fosforilação que inicia o recrutamento de SHP1 e SHP2. A ligação dessas moléculas ao receptor é passível de inibir vias quinase-dependente (GOLDAMMER et al., 2018). Alguns Siglecs ainda

possuem na sua porção citoplasmática um resíduo positivamente carregado que se associa com a molécula DAP12, a qual possui o um domínio intracelular ITAM (do inglês Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) (REDELINGHUYS et al., 2011) (PILLAI et al., 2012).

Figura 3. Estrutura dos Siglecs expressos em humanos. Os receptores Siglecs (Sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins) são proteínas transmembranares que contêm um domínio extracelular V-set immunglobulin que reconhece o ácido siálico, seguido do número variável do domínio C-set immunoglobulin. Intracelular, a grande maioria possui o domínio ITIM, enquanto outros possuem um resíduo positivamente carregado que permite se acoplar ao DAP12, o qual carrega o domínio ITAM. Como exceção há o Siglec-4, que possui um domínio com sítio de fosforilação Fyn kinase. Os Siglecs são divididos em dois grupos de acordo com a similaridade de sequência e conservação durante a evolução. O menor grupo é comum a todos os mamíferos e apresentam menor similaridade na sequência, enquanto o grupo maior, os homólogos ao CD33 são mais conservados e com maior similaridade em suas sequências. Imagem adaptada de Zhou et al. (2018).

Os Siglecs reconhecem estruturas sialiladas comumente encontradas nas células de mamíferos, podendo, então, se ligar aos ácidos siálicos presentes na superfície da própria célula, através de uma ligação do tipo cis, ou na superfície de outras células, tecidos e até

mesmo de patógenos, através de uma ligação do tipo trans. Quando ocorre a interação do tipo cis, o sítio de ligação do Siglec encontra-se encoberto, impedindo a interação com outros ligantes glicanos. Dessa forma, para que ocorra a ligação entre os receptores Siglecs com ligantes trans é necessária à quebra da ligação cis. Isso ocorre pela ação de enzimas sialidases/neuraminidases que clivam o ácido siálico ou devido à ativação celular por algum estímulo específico que altere o padrão de glicosilação das glicoproteínas e glicolipídeos presente na membrana plasmática. Essa ligação também pode ocorrer pelo deslocamento da ligação cis que ocorre em decorrência da presença de células adjacentes com alta densidade de ligantes trans (CROCKER; PAULSON; VARKI, 2007). Alguns patógenos utilizam-se dessa interação trans para modular negativamente a resposta imunológica. Por exemplo, em neutrófilos, a ligação do tipo trans entre o Siglec-9 e resíduos do ácido siálico NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc presente na cápsula polissacarídica de Streptococcus do grupo B, resulta na supressão da função microbicida, diminuindo a produção de NETs e espécies reativas de oxigênio, favorecendo assim a sobrevivência dessas bactérias (CARLIN et al., 2009).

Figura 4. Interação cis ou trans entre o ácido siálico e os receptores Siglec. Os Siglecs interagem com o ácido siálico presenta na mesma membrana em que são expressos em uma ligação conhecida como cis (A). Essa interação mantem o domínio V-set immunoglobulin dos receptores encobertos, o que impossibilita a interação com outros ácidos siálicos em células adjacentes. No entanto, se haver a ação de sialidades, as quais podem clivar o ácido siálico que bloqueia o sítio de ligação, ou devido à ativação celular em que pode ocorrer a reestruturação de glicoproteínas ou glicolípideos na membrana, o sítio de ligação pode ficar descoberto, permitindo novas interações. Outra maneira de ligação é conhecida como trans, a qual o ácido siálico que se liga ao Siglec encontra-se em células adjacentes ou mesmo em patógenos (B). Imagem adaptada de Crocker, Paulson e Varki (2007).

A expressão dos Siglecs ocorre principalmente em células do sistema imunológico. De forma que alguns Siglecs possuem sua expressão quase que restrita a determinados tipo celulares, como o Siglec-8 encontrado predominantemente em eosinófilos, enquanto que outros são amplamente distribuídos, como o Siglec-9 que está presente em monócitos, neutrófilos, células dendríticas, células B e células natural killer (BOCHNER, 2009; VARKI; ANGATA, 2006; VON GUNTEN; BOCHNER, 2008). Além disso, vários tipos de Siglecs

podem estar expressos ao mesmo tempo em um tipo celular, como por exemplo, os neutrófilos que expressam Siglec-5, -9. Ademais, estudos demonstram que cada tipo de Siglec possui uma maior ou menor afinidade pelo ácido siálico dependendo da sua conformação, o que sugere que cada receptor pode ter uma função específica nas células do sistema imunológico (LEHMANN; TIRALONGO; TIRALONGO, 2006).

Alterações na expressão de Siglecs na superfície celular podem representar uma forma de regulação do sinal promovido por esses receptores. Por exemplo, a expressão de Siglecs -5, -7, -8, -9 e -11 não foi alterada em macrófagos, quando tratados com LPS, apenas foi evidenciado um ligeiro aumento de Siglec-10 nos macrófagos que foram derivados do fator estimulante de colônias de macrófagos (M-CSF, do inglês macrophage-colony stimulating factor). Em contrapartida, células dendríticas, após o estímulo com LPS, diminuíram a expressão dos Siglecs-7 e -9, e isto foi correlacionado com um aumento da atividade dessas células (LOCK et al., 2004). Em camundongos, macrófagos derivados de medula estimulados com LPS aumentaram a expressão de Siglec-E, ortólogo ao Siglec-9 em humanos, após 12 e 24 horas de estimulação (BOYD et al., 2009a; NAGALA et al., 2018). O aumento da expressão de Siglec-E também foi observado após o tratamento com agonistas de TLR2, TLR7 e TLR9, mas não com o agonista de TLR3 (BOYD et al., 2009a). Já em neutrófilos isolados de sangue humano e estimulados com IL-1β, IL-3, IL-4 e IFN- não foram observadas mudanças na expressão de Siglec-5. No entanto, quando o tratamento foi realizado com TNF e fMLP (N-formyl-methionyl-leucylphenylalanine) foi observado um aumento considerável na

expressão de receptor, sugerindo que a modulação de Siglec-5 pode ser específica (ERICKSON-MILLER et al., 2003). O estímulo de neutrófilos com o LPS promoveu o aumento da expressão de RNA mensageiro de Siglec-5 (ALI et al., 2014). De forma semelhante, neutrófilos humanos estimulados com LPS aumentaram a expressão de Siglec-9 de maneira concentração-dependente após 12 horas de incubação. Isso também ocorreu após a incubação dessas células com TNF-α e IL-8. Curiosamente, este receptor também possui sua expressão aumentada em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica, e in vitro, neutrófilos de doadores saudáveis tratados com extrato de fumaça de cigarro também apresentaram um aumento da expressão de Siglec-9 (ZENG et al., 2017).

Esses resultados demonstram que estudos sobre a modulação da expressão de Siglecs induzidas por diferentes estímulos inflamatórios podem ajudar na compreensão do papel desses receptores durante o processo inflamatório, visto que a forma como os Siglecs atuam ainda vem sendo elucidada (PILLAI et al., 2012).

Alguns estudos demonstram que Siglecs podem exibir uma função inibitória, embora pouco compreendida, sobre receptores TLR. A expressão ectópica de Siglec-9 em linhagem de macrófagos, por exemplo, resulta na inibição da produção de TNF e aumento da produção de IL-10 em resposta ao LPS. Sendo que esta inibição é dependente da via de sinalização promovida pelo ITIM, visto que a mesma resposta não ocorre em linhagens que possuem Siglec-9 deficiente de ITIM (ANDO et al., 2008). De modo semelhante, macrófagos de camundongos C57/BL6 estimulados com LPS recrutam SHP-1 e SHP-2 por Siglec-E, sugerindo a ativação do domínio ITIM,

que resulta uma diminuição da indução de citocinas antivirais como interferon beta (IFN-β) (BOYD et al., 2009a). Tais respostas podem ser decorrentes da interação que ocorre entre os receptores, visto que pode haver interação entre o ácido siálico presente no receptor TLR e os Siglecs (FENG et al., 2012). Através do ensaio de ELISA sanduiche, já foi demonstrado que tanto Siglec-5 quanto Siglec-9 apresentaram alguma interação com todos os TLR testados, e o mesmo ocorreu para os Siglecs-E; -F; -H de murinos. Curiosamente, a ativação do receptor TLR4 por LPS em células dendríticas (DC) de camundongos resulta na diminuição da interação entre Siglec-E e o TLR4 (CHEN et al., 2014). Tal fato foi associado com a atuação da enzima neuraminidase endógena Neu1 expressa nessa linhagem celular, pois é sabido que a ativação do TLR4 com o LPS, bem como TLR2 e TLR3 por seus agonistas, promove a translocação da Neu1 em macrófagos derivados de medula e células dendríticas de camundongos (AMITH et al., 2009). Essa relação entre a interação TLR-4-Siglec-E e a atividade da neuraminidase é ainda mais evidenciada, pois, camundongos nocaute para Neu1 apresentam maior sobrevida após doses de LPS (100 e 200 μg/animal) e menor produção de citocinas como IL-6 e TNF-α, o que sugere uma menor ativação da via do TLR4 (CHEN et al., 2014). Estudos demonstram que a formação do complexo MyD88/TLR4 e a ativação do NFκB promovida pelo LPS é dependente da remoção do ácido siálico. A remoção, do ácido siálico na posição α2-3 presente no receptor TLR4 de macrófagos e células dendríticas, ocorre em função da ativação de Neu1. Além disso, o tratamento de células HEK293 com Tamiflu, um inibidor de neuraminidase, e com a lectina Maackia amurensis, que reconhece o ácido siálico na conformação α2-3, mas não a lectina Sambucus nigra,

que reconhece na conformação α2-6, diminuem a ativação da via NFκB (ABDULKHALEK; SZEWCZUK, 2013; AMITH et al., 2010a). Indicando, dessa forma, que a associação entre estes receptores pode estar envolvida na manutenção do estado quiescente das células.

Tendo em vista o exposto, este trabalho visou avaliar a expressão de Siglec na membrana dos neutrófilos após a ativação com LPS. A hipótese desse trabalho é de neutrófilos estimulados com LPS aumentam a expressão de receptores inibitórios Siglec-5 e -9 para atenuar a ativação da via mediada pelo TLR4.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar os mecanismos envolvidos na expressão de Siglec em neutrófilos após o estímulo com o LPS no sangue total humano.

1. Caracterizar a frequência e expressão de Siglec-3; -5; -7; -8; -9; -10 em células CD66b+;

2. Avaliar a expressão de Siglec-5 e -9 e do ácido siálico nas conformações α-2,3 e α-2,6 na membrana de neutrófilos estimulados com LPS;

3. Avaliar a expressão de ligantes de Siglec-5 e -9 na membrana de neutrófilos após a estimulação com o LPS;

4. Avaliar a expressão de Siglec-5 em neutrófilos estimulados com Escherichia coli e Enterococcus gallinarum;

6. Estudar os efeitos do tratamento com Tamiflu na expressão de Siglec-5 e -9 em neutrófilos ativados com LPS;

7. Avaliar a expressão de Siglec-5 e -9 e de seus ligantes, as conformações α-2,3 e α-2,6 do ácido siálico e os efeitos do tratamento com o Tamiflusob esses parâmetros em pacientes sépticos.

3 METODOLOGIA

3.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

Este estudo foi apreciado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade Federal de Santa Catarina (CAAE: 82815718.2.0000.0121). Os voluntários saudáveis recrutados para doação de sangue foram alunos do Programa de Pós Graduação em Farmacologia. Após esclarecimentos quanto aos objetivos do estudo, metodologia utilizada e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, foi realizada a coleta de 4 mL de sangue para desenvolvimento da pesquisa.

A coleta de sangue de pacientes sépticos foi realizada no período de 04/04/2018 a 27/04/2018 no Hospital das Clínicas - Unidade de Emergência - de Ribeirão Preto (HCFMRP-USP). Os voluntários, ou seus representantes legais em caso de incapacidade do paciente, receberam orientação sobre o estudo, o procedimento e riscos envolvidos. Após a assinatura do termo de consentimento, foi realizada a coleta de 2 tubos de sangue para o desenvolvimento da pesquisa. O Comitê de Ética em Pesquisa do HCFMRP-USP aprovou o estudo (CAAE 30459114.6.0000.5440).

3.2 AMOSTRAS DE SANGUE DE DOADORES SAÚDAVEIS Para o desenvolvimento da pesquisa foi utilizado amostras de sangue de doadores saudáveis entre 18 e 60 anos, os quais não apresentavam sintomas de doenças crônicas, não declaram situação de estresse e que não tenham ingerido bebida alcóolica nas últimas 24 horas pré-coleta.

As amostras de sangue foram coletadas em tubo a vácuo contendo K3EDTA (Labor Import, Brasil), homogeneizadas lentamente e transportadas adequadamente para o fluxo laminar. Neste, alíquotas de 100 μL de sangue foram coletadas em tudo eppendorf de 0,6 mL para análise no contador hematológico ABX Micro 60 (Horiba ABX SAS, França).

Os resultados de hemograma e leucograma obtidos foram avaliados para determinar se as amostras estavam em conformidade para realização dos experimentos. Amostras que apresentaram valores alterados nos resultados não foram utilizadas.

3.3 AMOSTRAS DE SANGUE DE PACIENTES SÉPTICOS Os pacientes deste estudo foram selecionados com base nos dados clínicos de admissão. As coletas de sangue foram realizadas no dia da admissão, e quando disponíveis, no segundo e sétimo dia após a entrada no hospital. Para o grupo de doadores saudáveis, o sangue foi coletado de profissionais da saúde presente na Unidade de Emergência do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto no mesmo dia da coleta do sangue do paciente séptico. Em ambos os casos o sangue foi coletado em dois tubos a vácuo contendo K3EDTA (Labor Import, Brasil). Posteriormente, as amostras foram acondicionadas para transporte e encaminhadas ao Laboratório de Inflamação e Dor na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP) para a realização dos experimentos.

3.4 ESTÍMULAÇÃO IN VITRO COM LPS OU PAM3CYS

O LPS cepa E.coli 0127:b8 (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) foi utilizado para estimular os leucócitos em sangue total. Para isso, alíquotas de LPS foram previamente sonicadas em banho ultrassônico (Cole-Parmer, Nilles, Illinois, EUA) por 20 minutos. Em seguida, foi realizada a adição de LPS nas concentrações de 0,01; 0,1 ou 1,0 μg/mL, dependendo do experimento realizado, em tubos do tipo falcon de 15 mL contendo o sangue total. As concentrações de LPS utilizadas foram previamente descritas como indutoras da ativação de neutrófilos (BÖHMER; TRINKLE; STANECK, 1992). Por fim, as amostras foram incubadas em estufa a 37°C em ambiente enriquecido com 5% de CO2 por 30 minutos, 1 hora e meia, 3 ou 6 horas.

Além do LPS, o sangue total também foi estimulado com 1,0 μg/mL de Pam3Cys (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA) em tubo falcon de 15 mL por 1 hora e meia ou 3 horas. Posteriomente, após homogeneização, foi realizada a incubação nas mesmas condições descritas para o LPS, ou seja, em estufa a 37°C com ± 5% de CO2. 3.5 LISTA DE REAGENTES UTILIZADOS PARA CITOMETRIA

DE FLUXO

Lista de anticorpos, lectinas ou corantes utilizados nos experimentos de Citometria de Fluxo. Informações sobre a diluição utilizada, o clone ou a especificidade, além da marca dos reagentes utilizados.

3.6 OBTENÇÃO DE LEUCÓCITOS TOTAIS APÓS LISE DAS HEMÁCIAS

Após a estimulação, para obtenção dos leucócitos totais foi realizado a lise das hemácias. Para isso, 10 mL de tampão de lise (NH4Cl 0.15 M; EDTA 0.1 mM; Na2HCO3 12 mM) gelado foram adicionados nos tubos falcons contendo o sangue, estes foram homogeneizados e deixados em repouso por 7 minutos. Em seguida, foi realizada a centrifugação (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) a uma velocidade de rotação de 270 x g por 7 minutos com aceleração e desaceleração de 2 a uma temperatura de 22°C. Ao fim da centrifugação, foi retirado o sobrenadante e foi repetido o processo de lise mais uma vez. Por fim, as células foram lavadas com PBS + 2 mM de EDTA nas mesmas condições de centrifugação, exceto pela

temperatura que foi de 4°C para diminuir a atividade celular. Após a centrifugação foi obtido os leucócitos totais.

3.7 MARCAÇÃO DE VIABILIDADE COM FVS

Para determinar a viabilidade celular foi utilizado o corante BD HorizonTM Fixable Viability Stain 450 (FVS450) (BD Biosciences, USA). Este corante permite descriminar por citometria de fluxo as células de mamíferos viáveis das não viáveis de acordo com a intensidade de fluorescência das mesmas. Isso ocorre porque o FVS450 interage com aminas presentes na superfície celular e intracelular. Uma vez que células mortas possuem maior permeabilidade na membrana, há maior interação entre as aminas intracelulares e o corante, resultando em uma maior intensidade de fluorescência nas células inviáveis (entre 10 a 20 vezes) quando comparadas com as células menos permeáveis, ou seja, viáveis.

Dessa forma, as após a lavagem das células com PBS + 2 mM de EDTA, as células foram ressuspendidas neste mesmo tampão contendo FVS (1 μL de FVS para 1000 μL de tampão). Em seguida, o tubo falcon foi passado no agitador (Vision Scientific, Daejeon-Si, Coréia do Sul) rapidamente e incubado no escuro em temperatura ambiente por 10 minutos. Por fim, foi adicionado 1 mL de tampão FACS (PBS + 2mM EDTA + 1% de albumina bovina) para interromper a interação, seguido da centrifugação conforme descrito anteriormente. Então, o sobrenadante foi descartado e as células ressuspendidas em tampão FACS.

3.8 MARCAÇÃO PARA CITOMETRIA DE FLUXO COM ANTICORPOS

Para realizar a marcação com anticorpos para a citometria de fluxo, as células foram dispostas em placa de 96 fundo em U, de forma que cada poço continha 1 x 106 células totais. A placa, então, foi centrifugada nas mesmas condições anteriores, seguido do descarte do sobrenadante. Após, as células foram ressuspendidas em 25 μL de tampão FACS contendo os anticorpos, em suas respectivas concentrações, dependendo do objetivo do experimento (Vide 3.5). Além disso, sempre foi adicionado Fc Block (1:100; Human TruStain FcX™, Biolegend), para bloquear ligações inespecíficas devido aos receptores Fc presente nos neutrófilos. Logo, foi realizada a incubação por 40 minutos a 4°C. Após, foram adicionados 160 μL de tampão FACS em cada poço, seguido da homogeneização com a pipeta. Por fim, a placa foi novamente centrifugada, o sobrenadante descartado e as células foram ressuspendidas em 200 μL de tampão FACS contendo 2% de paraformaldeído (PFA). Então, as células foram analisadas por citômetro de fluxo BD FACSVerseTM (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA).

3.9 AVALIAÇÃO DA CONFORMAÇÃO DO ÁCIDO SIÁLICO EM NEUTRÓFILOS HUMANOS

Para avaliar a conformação do ácido siálico na membrana de neutrófilos humanos foram utilizados as lectinas Sambucus nigra (SNA) e Maakia amurensis (MAL II). A SNA reconhece o ácido siálico, preferencialmente, na posição α-2,6, enquanto a MAL II reconhece o ácido siálico na posição α-2,3.

Nesses experimentos, as células foram lavadas e ressuspendidas apenas com solução de Hanks sem fenol (HBSS; Gibco, Invitrogen, Grand Island, NY, EUA) contendo cálcio e magnésio, pois a presença de cálcio é importante para manutenção da estrutura da MAL II (HORTON, 2008).

Para incubação, as células na placa de 96 em fundo U foram ressuspendidas em Hanks contendo SNA FITC (1:2000; Vector Lab, USA) e MAL II biotinilada (1:1000; Vector Lab, USA) juntamente com os anticorpos desejados por 40 minutos a 4°C. Após, a lavagem foi adicionado estreptavidina PE (Biolegend, USA) em 25 μL de Hanks por 15 minutos a 4°C. Por fim, as células foram novamente lavadas e ressuspendidas em Hanks contendo 2% de PFA, seguido da análise no citômetro BD FACSVerseTM.

3.10 AVALIAÇÃO DE LIGANTES DE SIGLEC-5 E -9 EM NEUTRÓFILOS HUMANOS

A avaliação de ligantes de Siglec-5 e -9 foi realizada utilizando quimeras, Siglec-5-FC; Siglec-9-FC, estas contêm a porção extracelular dos receptores ligada a uma porção Fc de IgG humano.

Para isso, 3,0 μg/mL de Siglec-5-FC ou Siglec-9-FC foram previamente incubados com 0,5 μg/mL de anti-IgG humano Alexa Fluor 488, por 10 minutos no gelo.

Na placa, os leucócitos totais foram ressuspendidas em 25 μL de PBS 1x contendo uma das quimeras juntamente com o anti-IgG Alexa Fluor488 e os anticorpos de interesse. Em seguida, a placa foi incubada a 4°C por 40 minutos, seguido da lavagem com PBS 1x. Por fim, as células foram ressuspendidas em 200 μL de PBS 1x contendo 2% PFA para posterior análise em citômetro de fluxo BD FACSVerseTM.

3.11 ESTIMULAÇÃO DOS NEUTRÓFILOS COM E. coli ou E. gallinarum

Para os experimentos realizados com as bactérias gram-negativa, Escherichia coli, e gram-positiva, Enterococcus gallinarum, inicialmente foi feita o crescimento das mesmas em meio BHI (do inglês, brain heart infunsion) por 18 horas. Posteriormente, as bactérias foram lavadas com PBS, centrifugadas e ressuspendidas em 1 mL de PBS para ajuste conforme a escala de 0,5 de MacFarland. A partir disso, foram feitas diluições para que ao adicionar no sangue a concentração final fosse de 106, 107 ou 108 UFC. Após homogeneização do sangue contendo a bactéria, este foi incubado por 1 hora e meia em estufa a 37°C ± 5% de CO2. Ao fim, as hemácias foram lisadas, os leucócitos totais lavados, para então marcação com anticorpos, conforme descrito anteriormente.

3.12 GLICOSILAÇÃO DE HEMÁCIA

A avaliação da conformação do ácido siálico presente nas hemácias foi realizada com a lectina MAL II. Dessa forma, após 3 horas de estímulo com LPS 1,0 μg/mL, foi coletado 1 μL de sangue total. Este foi ressuspendido em 25 μL de PBS contendo MAL II e anticorpos anti-CD16 PerCP Cy5.5 e anti-CD235a APC por 40 minutos, no escuro, a 4°C. O anticorpo CD16 foi utilizado para excluir a possibilidade de haver algum neutrófilo, monócito visto que a marcação foi realizada no sangue total, e o CD235a por ser uma glicoforina A presente na membrana dos eritrócitos. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS, e em seguida ressuspendidas em 200 μL de PBS para análise por citometria de fluxo.

3.13 ENSAIO DE ATIVIDADE DA NEURAMINIDASE

A atividade da neuraminidase foi detectada utilizando o reagente 4-MUNANA (2′-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid sodium; Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, EUA). Esse reagente é clivado pela enzima neuraminidase liberando um composto que emite fluorescência que pode ser detectada na excitação de 365 nm e emissão de 450 nm.

A enzima neuraminidase de Clostridium perfringens (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi utilizada nos experimentos como controle positivo. Para isso, 0,012 unidades internacionais da enzima em HBSS foram adicionadas em placa escura de 96 poços, fundo plano e transparente (Life Sciences, Corning, NY, EUA) juntamente com 1 μL de 4-MUNANA (0,025 mM). Também foi adicionado em alguns poços Tamiflu (Oseltamivir; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) 300 ou 500 μM para inibição da enzima. Estes procedimentos foram realizados em um volume final de 200 μL e com a placa no gelo para inibição da enzima neuraminidase. Na sequência, foi realizada a leitura no aparelho SpectraMax® Paradigm® (Molecular Devices, San José, CA, EUA) em temperatura de 37°C por 15 minutos.

Para os experimentos de cinética com células, após lise das hemácias, 0,5 x 106 de leucócitos totais foram ressuspendidos em HBSS e adicionados em placa escura de 96 poços, fundo plano e transparente. Em seguida, foi adicionado 1 μL de 4-MUNANA (0,025 mM) em todos os poços, Tamiflu 300 μM e LPS 1,0 μg/mL nos poços adequados. Posteriomente, o volume foi completado até 200 μL com HBSS, seguido da leitura no aparelho Spectramax® Paradigm® por 15 ou 60 minutos a 37°C.