UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA Centro de Ciências Biológicas/CCB
Departamento de Ciências Fisiológicas/CFS Laboratório de Investigação de Doenças Crônicas/ LIDoC
Robson Barth
O HNF4α É CRUCIAL NO AUMENTO DA ÁREA
INSULINA
+INDUZIDA POR DEXAMETASONA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA Centro de Ciências Biológicas/CCB
Departamento de Ciências Fisiológicas/CFS Laboratório de Investigação de Doenças Crônicas/ LIDoC
Robson Barth
O HNF4α É CRUCIAL NO AUMENTO DA ÁREA
INSULINA
+INDUZIDA POR DEXAMETASONA
Trabalho de Conclusão do Curso apresentado como requisito para cumprimento da disciplina TCC II (BIO7016) do currículo do Curso de Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina.
Orientadora: Drª Fernanda Barbosa Lima
AGRADECIMENTOS
Agradeço em especial a minha mãe pelo apoio e incentivo em todos os momento e por sempre acreditar em mim.
A minha orientadora Drª Fernanda Barbosa Lima pela confiança para a realização deste trabalho.
A todos os colegas do Laboratório de Investigação de Doenças Crônicas (LIDoC) e um agradecimento especial às mestrandas Francieli Caroline de Ramos e Liana Conrado França pelos conselhos e apoio nos momentos difíceis.
Ao CNPq e também a FAPESC pelo auxílio financeiro e por fomentar a pesquisa. Ao professor Dr Gustavo Jorge dos Santos pelos ensinamentos e contribuições durante este período.
E a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização deste projeto.
‘’
Desejos podem se tornar realidade. Mas não se você esperar por milagres. Milagres são coisas que fazemos por nós mesmos. Aqui e agora!’’RESUMO
O diabetes mellitus é uma doença metabólica de etiologia múltipla decorrente da falta de insulina e/ou da incapacidade deste hormônio em exercer adequadamente seus efeitos. Sendo alvo de estudos há muitos anos, a cura para o diabetes tem como foco a regeneração da massa de células β ou a regulação da via de apoptose destas células. A dexametasona (DEXA) é um glicocorticóide sintético utilizado no tratamento de inflamações e outras patologias, entretanto, se utilizado de maneira crônica pode acarretar danos, como a resistência periférica à insulina. Tendo em vista que (1) o hepatocyte nuclear factor alpha (HNF4α) é crucial para a proliferação de célula β em cenários de maior demanda por insulina, (2) resistência a insulina (RI) induzida por DEXA promove aumento de massa de célula β e, (3) estudar processos que induzem proliferação de célula β pode ser um alvo terapêutico importante para o DM, neste trabalho nós investigamos se a proliferação de células β pancreáticas induzidas por DEXA é dependente do HNF4α. Para isso, utilizamos animais transgênicos knockout (KO) tecido-específico e induzível para o fator de transcrição HNF4α, tratados ou não com DEXA. Nos animais avaliamos o metabolismo glicêmico através do teste de tolerância tanto de glicose (ipGTT) e a sensibilidade à Insulina (ipITT). Avaliamos também a morfometria do pâncreas, com ênfase na área positiva para Insulina e glucagon. Observamos que, os animais HNF4αloxP/loxP;Ins.Cre+apresentam glicemia de jejum reduzida e que a DEXA induziu RI em
todos os animais, independente do genótipo. Respondendo à nossa pergunta, diferente dos animais WildType (WT), os animais com genótipo HNF4α loxP/loxP;Ins.Cre+ não apresentaram
aumento da área Insulina+ induzida pela DEXA. Com isso, concluímos que, o fator de
transcrição (FT) HNF4α é essencial para expansão de célula β em modelos de RI. Esses dados nos permite apontar o HNF4α como possível alvo terapêutico na tentativa de desenvolver novas fontes de célula β para um possível transplante em pacientes diabéticos.
Palavras-chave: HNF4α, Resistência à Insulina, Célula β, dexametasona
As is well known, diabetes mellitus is a metabolic disease of etiology caused by lack of insulin and / or inability of this hormone to exert side effects. Being the subject of studies for many years, the cure for diabetes focuses on the regeneration of β cell mass or a change in the apoptosis pathway of these cells. Dexamethasone (DEXA) is known to be a synthetic glucocorticoid used to treat inflammation and other conditions, however, chronic use can cause collateral damage such as peripheral insulin resistance. Given that (1) HNF4α is crucial for β-cell proliferation in cases of increased insulin demand, (2) dexamethasone-induced IR promotes β-cell mass increase, and (3) studies that induce β cell proliferation may be an important therapeutic target for DM. In this work we investigated the proliferation of dexamethasone-induced and HNF4α-dependent pancreatic β cells. For this, it uses transgenic animals KO tissue specific and inducible for transcription factor HNF4α, open or not with dexamethasone. After model construction, glycemic metabolism is tested by the glucose tolerance test (ipGTT) and insulin sensitivity (ipITT). A pancreas morphometry is also available, with an emphasis on the positive Insulin and glucagon area. Note that as expected for HNF4αloxP/loxP;Ins.Cre+animals presented reduced fasting glucose and that Dexamethasone
induced IR in all animals, regardless of genotype. Answering our question, different types of
WildType( WT ) animals, animals with genotype HNF4αloxP/loxP;Ins.Cre+ had no increase in
Dexamethasone-induced positive insulin and glucagon area. Thus, we conclude that, finding our initial hypothesis, FT HNF4α is essential for β cell expansion in IR models. These data allow us to point out or HNF4α as a possible therapeutic target in an attempt to develop new β cell sources for a possible transplant in diabetic patients.
Keywords: HNF4α, insulin resistance, β cell, dexamethasone
1 INTRODUÇÃO ………..10 2. OBJETIVOS ………..13 2.2. Objetivos Gerais ………...………...…...13 2.2. Objetivos Específicos ………...………...13 3. JUSTIFICATIVA/HIPÓTESE …………...……….14 4. METODOLOGIA ………...………...14 4.1 Animais ……….14 4.2. Genotipagem ………...15
4.3. Teste intraperitoneal de tolerância à glicose (ipGTT) ………...……….15
4.4. Teste intraperitoneal de tolerância à insulina (ipITT) ………....15
4.5 Eutanásia e Fixação do pâncreas ……….………..15
4.6. Imunohistoquímica ……….16
4.7. Morfometria ………....16
4.8. Análise estatística………..………..17
5. RESULTADOS ………...……….………….….17
6. DISCUSSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS ………...21
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Metabolismo glicêmico dos animais KO e WT
………...……..21
Figura 02: ipITT e kITT dos animais WT e KO tratados ou não com Dexametasona....…....22
Figura 03: Análise de arquitetura da ilhota dos animais WT e KO tratados ou não com Dexametasona ………….………24
1. INTRODUÇÃO
1.1. Controle hormonal da glicemia
O nosso organismo está constantemente sujeito a inúmeras variações tanto no meio externo como no meio interno. Para isso, é necessário que mesmo diante dessas variações, o nosso corpo possa lidar com essas mudanças no intuito de manter seu meio interno dentro de uma faixa ou intervalo de valores. Esse conceito é conhecido como homeostase e, para fins didáticos, ele geralmente é desmembrado e classificado em diferentes tipos, como a homeostase térmica, a homeostase osmótica e até mesmo homeostase glicêmica. Especificamente para atingir a homeostase glicêmica, é necessário o envolvimento de diversos tecidos bem como a secreção e atuação de diversos hormônios.
O pâncreas é um órgão situado no abdômen e é constituído por uma parte exócrina e uma parte endócrina (CARPINELLI et al., 2018) (Benitezet al., 2012). A sua parte exócrina, que é responsável pela secreção de enzimas digestivas na luz do duodeno corresponde a mais de 95% da massa do órgão em adultos. Já a parte endócrina responsável pela liberação de hormônios importantes para a regulação da glicemia, é constituída por um micro órgão denominado ilhotas pancreáticas (ou ilhotas de Langerhans) as quais estão distribuídas ao longo do corpo do pâncreas e correspondem a somente 1 a 3 % da massa total do órgão adulto(CARPINELLI et al., 2018) . As ilhotas são compostas por diferentes proporções e tipos celulares, a saber: células alfa, que secretam glucagon, células delta que secretam somatostatina, células PP responsáveis por secretar polipeptídio pancreático, células épsilon secretam grelina e as células β que compõem cerca de três quartos da ilhota e secretam amilina e insulina (Benitezet al., 2012)(Gupta et al., 2007).
A insulina é o único hormônio peptídico hipoglicemiante produzido pelo organismo a fim de controlar a quantidade de glicose na corrente sanguínea. Sua síntese ocorre no retículo endoplasmático rugoso e como a maioria dos hormônios, existe a produção de um pré hormônio, que neste caso é a pré-proinsulina que dá origem a proinsulina. Essa molécula de pró insulina durante o seu transporte pelo complexo de Golgi, é clivada e dá origem a insulina e também ao peptídeo C responsável pela ligação das cadeias A e B. A insulina e o peptídeo C então são armazenados dentro de grânulos e secretados frente a um estímulo. O principal efetor para a secreção da Insulina é a glicose ( ARAKI, Eiichi et al 1994)(Benitezet al., 2012).
A insulina liberada em resposta a um aumento da glicemia (taxa de glicose no sangue) e atua principalmente no fígado, tecido muscular e tecido adiposo(Chen et al., 2018). A glicose é internalizada na células β através do transportador GLUT2. Devido ao seu alto Km e baixa afinidade para com a glicose, o GLUT2 só promove entrada de glicose quando a glicemia está elevada. Uma vez no interior da células β, a glicose é transformada em glicose-6-fosfato pela enzima Glicoquinase, e então segue para a via de produção de adenosina trifosfato (ATP) . Com a metabolização da glicose e consequente aumento do ATP, observa-se um aumento no coeficiente entre ATP/ADP, esse aumento na razão ATP/ADP promove o fechamento de canais de potássio sensíveis ao ATP o que impede que o potássio seja retirado do interior da célula, promovendo a despolarização das células. Devido à despolarização ocorre a abertura dos Canais de cálcio dependentes de voltagem. Uma vez abertos, o canais promovem um grande influxo de cálcio e com o aumento das concentrações intracelulares desta molecula, ocorre a ativação de vias de sinalização que culminam no movimento, fusão e liberação dos grânulos de insulina. Problemas na secreção deste hormônio, quantidades de célula insular insuficiente, bem como uma insensibilidade periférica à insulina afetam forma importante a homeostase glicêmica, possibilitando o aparecimento de patologias como o Diabetes Mellitus (DM) (CARPINELLI et al., 2018)(Chen et al., 2018).
1.2. O Diabetes Mellitus
O DM é uma doença metabólica de etiologia múltipla, decorrente da falta de insulina e/ou da incapacidade deste hormônio em exercer adequadamente seus efeitos(Chen et al., 2018). Caracteriza-se por hiperglicemia crônica que pode ser consequência tanto da deficiência absoluta (DM1) (Cnop, et al, 2005) (Rojas et al., 2018), quanto da deficiência relativa da insulina, devido a problemas na secreção ou na sensibilidade ao hormônio (DM2) (Sandovici, et al, 2013). De acordo com Sociedade Americana de Diabetes (ADA), no ano de 2019, 464 milhões de casos de diabetes foram confirmados, e estima-se que no ano de 2045 haja aproximadamente 700 milhões de casos no mundo . Além desses tipos clássicos de DM, foi relatada a existência do Diabetes do Jovem no Início da Maturidade (MODY), um tipo especial de DM2, caracterizado por uma transmissão genética autossômica, que tem como característica a deficiência na secreção de insulina estimulada pela glicose (GSIS). O MODY resulta de uma mutação de ao menos 6 diferentes genes, entre eles o HNF4α, responsável
pelo Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY 1) (Gupta, et al, 2004; Gupta, et al, 2007) e alvo deste trabalho.
o diabetes mellitus apresenta duas principais formas que são conhecidas como DM1 e DM2, e mesmo esses dois tipos serem poligênicos, possuem uma diferença em sua etiologia (Rojas et al., 2018). O DM1 é decorrente da redução da massa de células b podendo ser tanto pela apoptose quanto pela diferenciação, que ocorre pelo contato com células do sistema imune e por ação de mediadores pró-inflamatórios como as citocinas (Rojas et al., 2018). A falha do reconhecimento de proteínas específicas das células β pelo sistema imune e também pelas ilhotas invadidas por neutrófilos ativados, que liberam citocinas pró-inflamatórias como Interleucina-1β (IL-1b), Fator de Necrose Tumoral-α (TNF-a), Interferon-g (IFN-g), e radicais livres, como o óxido nítrico (NO)(Rojas et al., 2018). Células β apresentam receptores dessas citocinas que por sua vez ativam vias de apoptose, de supressão de síntese proteica e também vias de expressão de FAS nas membranas que é um marcador para ligação de linfócitos T (Rojas et al., 2018). Após semanas ou meses(parâmetros humanos) (Pipeleers e Ling, 1992; Kay et al., 2000),há perda quase total das células β sem prejuízo aos demais tipos celulares que compõem a ilhota pancreática (Mandrup-Poulsen,1996; Eizirik e Mandrup-Poulsen, 2001; Cnop et al., 2005; Eizirik et al., 2009)Tanto o DM1 como DM2 são formas poligênicas do DM, todavia existem as formas monogênicas de DM, como o Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) (Firdous et al, 2018), caracterizado por uma herança genética de dominância autossômica de diagnóstico precoce, geralmente antes dos 24 anos de idade (Gupta e Kaestner, 2004). O MODY resulta de uma mutação mendeliana de ao menos 16 diferentes genes (Firdous et al, 2018), entre eles o Hepatocyte Nuclear Factor 4α (HNF4α) que é responsável pelo MODY1 (Gupta e Kaestner, 2004; Gupta et al., 2007). Nesta doença, o neonato humano pode apresentar hiperglicemia hiperinsulinêmica no pós-parto imediato (Demirbilek et al, 2017) . De modo geral, o mais comum é a presença de hiperglicemia não assintomática na criança, adolescente ou jovem antes do seu diagnóstico definitivo (Fajans,2001) em conjunto com uma secreção de insulina diminuída sem defeito na sua ação, quando não associada com a obesidade (ADA, 2018) e, ao longo dos anos, presença de anormalidades nas lipoproteínas e nas concentrações lipídicas (Dhe-Paganon, 2002). Para nortear o diagnóstico, um critério que distingue o MODY 1 dos demais DMs é ter história familiar pregressa de diabetes, em três ou mais gerações, sem a presença de obesidade ou autoimunidade das células pancreáticas (Fajans e Bell; 2011). Considerada uma doença
bastante rara, no Reino Unido e EUA o MODY representa em torno de 1 a 2% dos casos de diabetes rastreados em jovens (Unnikrishnan, 2016), porém devemos considerar que o exame genético não é algo realizado de rotina na clínica.
1.3. Resistência à insulina e massa de célula β
O estado de RI desencadeia nas ilhotas pancreáticas uma hipersecreção de insulina compensatória na tentativa de restabelecer os níveis normais da glicemia. Essas alterações podem ser funcionais (aumento da produção/secreção de insulina) e estruturais (ocorrência de hiperplasia e hipertrofia de célula β) ( Kahn, 2003; Paulsen, et al, 2010). Para elucidar os mecanismos que levam as células β a compensarem a hiperglicemia na RI diversos modelos animais são utilizados.Neste trabalho optamos utilizar o modelo com animais expostos a altas doses de glicocorticóides tendo como glicocorticoide a DEXA.
A DEXA é um glicocorticóide sintético, que pode ser usado em tratamentos clínicos devido ao sua ação antialérgica, imunossupressora e anti-inflamatória ( RAFACHO, et al, 2004). Porém a utilização crônica ou em elevadas doses deste glicocorticóide pode acarretar em efeitos adversos ao paciente, ou os quais são reproduzidos em animais ( RAFACHO et al. 2017). Alguns exemplos destes quadros danosos são a resistência periférica à insulina, diabetes e intolerância a glicose ( RAFACHO, et al , 2004). Os glicocorticóides (cortisol para humanos e corticosterona para roedores) exercem função em eventos estressores como inflamações e tendo como resposta a proliferação celular por exemplo. Mas mesmo não estando em situações de estresse, os glicocorticóides ainda possuem funções de regulação homeostática em vários tecidos, regulando, por exemplo, o metabolismo de proteínas e carboidratos e também funções cardiovasculares e respostas inflamatórias.
Os glicocorticóides também participam da resposta ao jejum, auxiliando na disponibilização de substrato e assim podendo participar no processo de normoglicemia. Essa ajuda decorre dos processos que aumentam a glicose endógena como a gliconeogênese hepática, na diminuição da captação de glicose no músculo e da lipólise e proteólise(Patel et al., 2014). Como dito, a dexametasona é um glicocorticóide sintético, que assim como os outros glicocorticóides têm um efeito de antagonismo aos efeitos da insulina nos tecidos periféricos, caracterizando-o como anti-insulínico(Liu et al., 2013). Este efeito antagonista induz o organismo a um quadro chamado de resistência à insulina, ou seja, um indivíduo insulino resistente, acarretando assim um aumento da liberação da glicose endógena por
meio do estímulo para início da gliconeogênese hepática, captação menor de glicose muscular e lipólise (Patel et al., 2014), e com isso uma liberação de insulina para a compensação, aumentando a massa de células β( RAFACHO et al. 2017,RAFACHO, et al , 2004)
1.4. HNF4a e as células β.
O HNF4α, um fator de transcrição órfão, pertencente à superfamília de receptores hormonais nucleares (NR2A1) é expresso em diversos tecidos, como fígado, rim, intestino e pâncreas(Ihara et al., 2005). Sua estrutura é formada por diferentes domínios, entre eles um domínio de transativação N-terminal, de ligação ao DNA e uma região C-terminal que forma a interface de dimerização (Ihara, et al, 2005)(Gonzalez, 2008). Existem 9 isoformas (HNF4α1 – HNF4α9) que são geradas por splicing alternativo ou por diferentes tipos de promotor. Devido a presença do promotor P2, as isoformas expressas em células β pancreáticas são HNF4α-7, α8 e α9 (hansen, et al, 2002; Huang, et al, 2008).
Nessas células, o HNF4α controla genes relacionados com o metabolismo da glicose e genes que coordenam a expressão e secreção de insulina (Wang, et al, 2000). Animais KO para o HNF4α em células β (HNF4α loxP/loxP;Ins.Cre) são intolerantes à glicose e apresentam
hiperinsulinemia no jejum e no estado alimentado( Velasco et al., 2016; Lu e Li, 2018).. Além disso, ilhotas isoladas desses animais apresentam deficiência na secreção de insulina estimulada por glicose, devido à redução na expressão de diversos proteínas envolvidas no processo secretório, entre eles L- piruvato quinase e Kir6.2 (gupta, et al, 2005).
O HNF4α regula o aumento fisiológico de massa de célula β em resposta a estresses (e.g. prenhez). Foi demonstrado que fêmeas HNF4αloxP/loxP;Ins.Cre prenhas não apresentam
aumento na proliferação de células β (esperada durante a prenhez) (gupta, et al, 2007), e são intolerantes à glicose. Além disso, mostraram que esses efeitos se devem à redução na via Ras/ERK (3). Apesar do vasto conhecimento das funções do HNF4α na fisiologia da célula β, principalmente no metabolismo da glicose, pouco se sabe sobre seu envolvimento na proteção à morte desta célula. Nesse sentido, foi relatado que o HNF4α controla alguns genes relacionados com apoptose (Gupta, et al, 2005; Odom, et al, 2004), além de estar envolvido na proteção da morte celular, induzida por estresse de retículo, através da ativação da via HNF4α-GRP78-Anks4b.
DM reside na redução do número de células β funcionais, assim entender como funciona o mecanismo de expansão/proliferação de células β, é crucial para apontarmos alvos terapêuticos que possam ser utilizados no tratamento, impedimento e/ou remissão desta patologia. Aqui, neste trabalho, utilizando então o modelo KO para o HNF4α, iremos investigar o papel desse fator de transcrição nos processos moleculares que regem a proliferação de células β. Então, hipotetizamos que o HNF4α é essencial para o processo de proliferação de célula β em modelo de RI.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Avaliar o papel do HNF4α na plasticidade das células β em modelo de animais com RI induzida por exposição ao glicocorticoide DEXA.
2.2. Objetivos Específicos
a. Avaliar o metabolismo glicêmico (ipGTT, ipITT, Glicemia de Jejum) dos animais HNF4αloxP/loxP;Ins.Cre+;
b. Avaliar a instauração da RI induzida pela DEXA;
c. Avaliar o aumento de massa de células β induzido pela DEXA;
c. Avaliar se em animais HNF4α loxP/loxP;Ins.Cre+ a DEXA é capaz de promover aumento da
massa secretora de insulina;
3. JUSTIFICATIVA/HIPÓTESE
A ilhota pancreática é vastamente estudada por ter função na homeostase glicêmica e ter relação com o desenvolvimento do DM. Os vários tipos celulares da ilhota tem suas diferenciações controladas por diversos fatores de transcrição como ARX, que determina o destino das células β, e PAX4 o destino de células alfa (Spijker et al. , 2013). Além da diferenciação, o controle da transcrição gênica é fundamental na manutenção do fenótipo e da função de células já adultas ( Shih, et al, 2001). Em células β pancreáticas, a importância dos fatores de transcrição pode ser verificada quando se observa o desenvolvimento do MODY1 (Gupta, et al, 2007), o qual é decorrente de uma mutação do fator de transcrição HNF4α, responsável por diversas funções nestas células (hansen, et al, 2002), como metabolismo de glicose e produção/secreção de insulina. Assim, sabendo que ( I ) a DEXA induz RI, ( II ) a RI promove um aumento de massa de célula β, e ( III ) que o HNF4α é um fator de transcrição que regula o aumento da massa de célula β induzido por situações de estresse, hipotetiza-se que o HNF4α participa do processo de aumento proliferação ou trans/diferenciação da massa de célula β induzido pelo DEXA.
4. METODOLOGIA
4.1. Animais
O estudo foi aprovado pela CEUA/UFSC - número de protocolo 4359060516. Para a realização deste trabalho utilizamos animais KO tecido específico e condicional para o HNF4α (HNF4αloxP/loxP;Ins.Cre+). Os animais foram gerados a partir do cruzamento da linhagem portadora da enzima CRE Recombinase nas células β (linhagem Ins.Cre+) e da linhagem que possui o gene para o FT HNF4α flanqueado pela sequência LoxP (HNF4αloxP/loxP). Os animais foram mantidos no biotério setorial do centro de fisiologia em condições padronizadas de iluminação (ciclo claro/escuro de 12 horas) e temperatura de 22±2 °C. Durante todo o período experimental tiveram livre acesso à água e ração padrão. Para o desenvolvimento experimental, os animais foram divididos em quatro grupos experimentais:
● Controle Salina (WS): após a genotipagem, os animais que não expressavam o
gene para a enzima CRE e eram homozigotos para a sequência Lox (animais (HNF4αloxP/loxP;Ins.Cre-) foram incluídos nesse grupo. Quinze dias após a última injeção de Tamoxifeno (100 microlitros por dose) os animais desse grupo receberam 10 injeções de salina em 5 dias consecutivos (1 injeção pela manhã e uma injeção durante a tarde com um período de oito horas entre a primeira
aplicação e a segunda). Para simular o volume aplicado nos grupos DEXA, essas injeções de salina foram de volume igual ao peso do animal multiplicado por 12,5.
● Knockout Salina (KS): Após a genotipagem, os animais que expressavam o gene
para a enzima CRE e eram homozigotos para a sequência Lox (animais (HNF4αloxP/loxP;Ins.Cre+) foram incluídos nesse grupo. Quinze dias após a última injeção de Tamoxifeno (dia 17) os animais desse grupo receberam 10 injeções de salina em 5 dias consecutivos (1 injeção pela manhã e 1 injeção durante a tarde ). Para simular o volume aplicado nos grupos DEXA, essas injeções de salina foram de volume igual ao peso do animal multiplicado por 12,5.
● Controle Dexa (WD): Após a genotipagem, os animais que não expressavam o
gene para a enzima CRE e eram homozigotos para a sequência Lox (animais (HNF4αloxP/loxP;Ins.Cre-) foram incluídos nesse grupo. Quinze dias após a última injeção de tamoxifeno os animais desse grupo receberam 10 injeções de DEXA, em 5 dias consecutivos (1 injeção pela manhã e 1 injeção durante a tarde com um período de oito horas entre a primeira aplicação e a segunda). A dose diária de DEXA foi de 100 mg/Kg, dividida em 50 mg/kg pela manhã e 50 mg/kg no período da tarde.
● Knockout Dexa (KD): Após a genotipagem, os animais que expressavam o gene
para a enzima CRE e eram homozigotos para a sequência Lox (animais (HNF4αloxP/loxP;Ins.Cre+) foram incluídos nesse grupo. Quinze dias após a última injeção de Tamoxifeno (dia 17) os animais desse grupo receberam 10 injeções de Dexametasona, em 5 dias consecutivos (1 injeção pela manhã e 1 injeção durante a tarde). A dose diária de DEXA foi de 100 mg/Kg, dividida em 50 mg/kg pela manhã e 50 mg/kg no período da tarde.
4.2. Genotipagem
A genotipagem dos animais foi realizada a partir do DNA extraído da cauda dos animais. Um fragmento da cauda foi incubado a 55 ºC, overnight, com Proteinase K (Roche, USA). Para a determinação da enzima CRE recombinase foi realizado um RT-PCR para o gene CRE, conforme instrução do produtor dos animais (Jackson Laboratory, USA). Da mesma forma, para determinar se os animais eram homozigotos para a sequência Lox, foi realizado um RT-PCR conforme instruções do produtor do animal (Jackson Laboratory,
USA). Como descrito anteriormente, o animal considerado experimental é aquele que, após a genotipagem, foi positivo para o gene CRE e homozigoto para a sequência Lox (HNF4αloxP/loxP;Ins.Cre+).
4.3. Teste intraperitoneal de tolerância à glicose (ipGTT)
Os animais foram mantidos em jejum por 10 h. Após a verificação da glicemia de jejum com aparelho Accu-Check Advantage II, uma solução de glicose 50% (1 g/Kg de p.c.) foi administrada pela via intraperitoneal. A glicemia dos animais foi verificada utilizando um glicosímetro Accu-Check®. nos tempos 0, 15, 30, 60, 45, 60 e 120 min após a administração de glicose
4.4. Teste intraperitoneal de tolerância à insulina (ipITT)
Após a verificação da glicemia no estado alimentado (1,5 horas de privação de alimento), insulina (1 U/kg de massa corpórea) diluída em solução salina (0,9% de NaCl) foi administrada intraperitonealmente nos animais. A glicemia foi verificada utilizando um glicosímetro Accu-Check® nos tempos 0, 10, 15, 20, 25, 30 e 60 min após a administração de insulina. A taxa de constante de decaimento da glicose (kITT) foi calculada à partir das concentrações de glicose plasmática durante a fase de decaimento linear, utilizando a fórmula 0.693/t1/2.
4.5. Eutanásia e fixação do pâncreas.
Logo após o ipITT, foi realizado a eutanásia de todos os animais, utilizando câmara de isoflurano seguido de decapitação. Com uma incisão abdominal, o pâncreas foi retirado, pesado e em seguida foi fixado em paraformaldeído 4%. Após 24 horas os cassetes foram lavados 3 vezes por 5 minutos em solução salina (0,9% de NaCl), e mantidos em álcool 70% até o período de emblocamento.
4.6. Imunohistoquímica
Após esse período, o pâncreas foi embebido em parafina e, secções seriadas de 5 micrômetros de espessura foram realizadas com a ajuda de micrótomo. Depois da
desparafinização, as secções foram bloqueadas com solução de PBS (Phosphate Buffered Saline) (0.05% Tween 20; 5% de leite em pó desnatado) e incubadas com anticorpo primário contra proteínas-alvo (Insulina, Glucagon,) por 2h em temperatura ambiente overnight a 4º C. Após lavagem em PBS, foi utilizado anticorpo secundário específico e as imagens foram reveladas com DAB (diaminobenzidina). As seções foram então marcadas com hematoxilina e montadas para observação em microscópio.
4.7. Morfometria
As fotos das lâminas foram tiradas pelo microscópio Axio scan utilizando o software ZEN BLACK. A morfometria foi feita no software Zen blue edition, da Zeiss. Nele foi circulada área total do pâncreas, área total de ilhota pancreática, área de marcação para insulina e para glucagon.
4.8 Análise Estatística
Os resultados estão expressos como média ± erro padrão da média (SEM). As comparações entre os animais WT e KO foram realizadas pelo teste T (t student test). Já as comparações feitas entre os grupos CS, CD, KS E KD foram realizadas por ANOVA de duas vias, seguido do pós-teste de Turkey. Foi considerado estatisticamente diferente quando p>0.05.
5. RESULTADOS
5.1. Caracterização do modelo de deleção do gene HNF4α
Para caracterizar o modelo, analisamos a glicemias de jejum dos animais do grupo WildType e Knockout 15 dias apos a ultima aplicação de tamoxifen. Como é possível observar na Figura 1A, os animais do grupo WildType apresentaram uma glicemia de jejum maior quando comparada ao animais do grupo KO e estes valores apresentaram uma diferença estatística significante e um intervalo de confiança de 95%.
Passados 15 dias da última aplicação de tamoxifeno, realizamos o teste intraperitoneal de tolerância à glicose (ipGTT) nos dois grupos de animais. Nesse teste, é verificada a glicemia do tempo Zero (glicemia basal) e após a aplicação pela via intraperitoneal (ip) de 1g/kg de peso do animal, são aferidas as glicemias após 10, 15, 20, 25, 30 e 60 minutos. Como é possível perceber na Figura 1B, durante todos os tempos analisados, a glicemia dos animais do grupo WildType foi maior desde a primeira verificação (glicemia basal) até o término do teste. Entretanto a área abaixo da curva não foi estatisticamente diferente.
5.2. Confirmação da RI
A fim de confirmar o efeito da DEXA na indução da RI, realizamos o ipITT nos 4 grupos experimentais: WildType com aplicação de salina (WS), Knockout com aplicação de salina (KS), WildType com aplicação de dexametasona (WD) e Knockout com aplicação de dexametasona (KD). No ipITT é verificada a glicemia no tempo 0 (basal) e após a aplicação de 1 U de insulina por quilograma de peso do animal a glicemia é avaliada novamente após 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos do início do teste.
Na Figura 2A, podemos observar a variação da glicemia induzida pela insulina em relação ao basal. Como é possível notar, os animais do grupo WD apresentaram um menor percentual de queda glicêmica e ao final do experimento, ou seja, após 30 minutos, este percentual não atingiu 20% de queda da glicemia. Os animais KS e KD apresentaram uma queda percentual glicêmica semelhante (de aproximadamente 40 %) e o grupo que teve a queda mais acentuada foi o grupo WS, representando (mais de 50 %) de diminuição da glicose sanguínea em relação ao seu basal.
Ainda em relação ao ipITT, é possível calcular a taxa constante de decaimento da glicemia por minuto aplicando-se a fórmula kITT = 0.693/t(½). Na Figura 2B, observa-se que o grupo KD apresentou uma kITT maior que o grupo WD e que este resultado foi estatisticamente significante com um intervalo de confiança de 95%.
5.3. Avaliação da área de insulina e glucagon
A fim de investigar os efeitos da DEXA na quantidade de célula β, bem como do papel do HNF4α em um possível aumento deste tipo celular nos avaliamos a área de células β e α nos animais WT com aplicação de salina (WS), Knockout com aplicação de salina (KS), WT com aplicação de DEXA (WD) e Knockout com aplicação de DEXA (KD). Após a eutanásia e todo o processo histológico e de imunohistoquímica, foi avaliado a partir da morfometria, a quantidade de área positiva para insulina e glucagon dentro das ilhotas. Como se pode ver na Figura 3A/B a quantidade de imunomarcação para insulina no grupo WT tratados com DEXA é maior quando comparado comparado com o grupo WS e estes valores apresentaram uma diferença estatística significante e um intervalo de confiança de 95%, corroborando que o modelo DEXA aumenta a proliferação de células β devido a indução periferia de resistência à insulina. Não há diferença estatística entre o grupo KD e KS.
Na Figura 3A/C 6 temos a morfometria realizada para verificar a quantidade de marcação positiva para o hormônio do glucagon nas ilhotas. Nos grupos tratados com DEXA, temos um aumento de marcação de glucagon de 0,2% para 0,3% entre WS e WD. Já os grupos KO mesmo não tendo um aumento entre o KS e o KD, ainda é possível notar um pequeno aumento no grupo KD. Os valores apresentaram uma diferença estatística significante e um intervalo de confiança de 95% entre WD e KD, e um intervalo de confiança de 99% entre KS e WD.
6. DISCUSSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS
O DM é uma patologia principalmente caracterizada por hiperglicemia crônica derivada de uma perda da função e/ou do número de célula β das ilhotas pancreática( Cnop, et al, 2005). A patologia é instaurada quando produção/secreção de insulina não é capaz de suprir a demanda fisiológica dos tecidos periféricos. (Oliver-Krasinski e Stoffers, 2008). Assim, independente do tipo (DM1, DM2 ou outros) a fisiopatologia do DM reside na redução do número e/ou na eficiência da célula β. Por isso, observamos hoje um grande esforço da comunidade científica em desenvolver novas fontes de células produtoras de insulina para terapias de reposição/regeneração celular (Afelik e Rovira, 2017).
O tecido pancreático apresenta uma elevada capacidade de se adaptar a desafios metabólicos, aumentando a massa de célula β por replicação, hipertrofia e/ou neogênese (Bonner-Weir, 2000). Por exemplo, durante a prenhez existe uma RI fisiológica e passageira acompanhada por um aumento na massa secretora de insulina. Na Obesidade também se observa este feito. A obesidade pode levar a um quadro de aumento da necessidade de insulina e o pâncreas se adapta a esta condição promovendo um aumento no número e na função das células β (Spijker et al. , 2013). Uma vez que qualquer forma de DM se beneficiaria com o surgimento de novas células β, se faz extremamente importante estudar os mecanismo que orquestram a proliferação desse tipo celular.
Apesar do grande progresso que se têm observado nos últimos anos, muitas vias intracelulares que controlam a proliferação de células β ainda permanecem desconhecidas. Neste cenário, objetivamos neste trabalho desvendar o papel do FT HNF4α no processo de proliferação de célula β (Gupta et al., 2007).
O HNF4α é um FT importante para células β. Sabe-se que este FT controla aproximadamente 11% dos genes da célula β, incluindo o gene da Insulina (Gupta et al., 2004) (Gupta et al., 2007). Já foi reportado que o HNF4α participa de processos de aumento de massa secretora de insulina durante a prenhez, uma vez que ao contrário de fêmeas knockout para o HNF4α em células β, fêmeas wildtype apresentam expansão de massa de célula β induzida pela prenhez (Gupta et al. , 2007). Assim, concluímos que esse FT parece ser crucial para processos que envolvam proliferação de célula β, em cenários de aumento de demanda por este hormônio.
A RI, independente de sua etiologia (obesidade, prenhez ou glicocorticóides) é um estado onde se observa aumento pela demanda da insulina. Como dito anteriormente, este aumento pela demanda da insulina desencadeia nas células β alterações na função (aumento da produção/secreção de insulina) e alterações estruturais (hiperplasia/hipertrofia de célula β) (Kahn, 2003; Paulsen et al. , 2010). Neste cenário, modelos de animais resistente à insulina são excelentes para se estudar vias que estimulam a expansão das células β. Neste trabalho, a fim de responder à nossa hipótese, utilizamos animais KO para o HNF4α, tratados ou não com DEXA.
Como já reportado pelo nosso grupo na Dissertação de mestrado da pós-graduanda Carolina Ruoso, animais KOt apresentam em torno de 50% de redução na expressão gênica do HNF4α . Também neste documento mostramos que esses animais são mais tolerantes à1 glicose e apresentam glicemia de jejum reduzida, em comparação com o controle . Nos 2 animais deste trabalho não avaliamos a expressão gênica do HNF4α e avaliamos o fenótipo induzido pelo KO avaliando a glicemia de jejum. Como esperado, animais do grupo KO apresentaram glicemia de jejum reduzida e comparação com os animais do grupo WT (Figura 1A). Com aparente tolerância à glicose aumentada (Figura 1B/C).
Depois de caracterizado o modelo de deleção do gene HNF4α, prosseguimos com a investigação do papel do HNF4α na expansão de massa de célula β induzida por RI. Para a indução de RI utilizamos a DEXA, pois essa ação diabetogênica da já é algo bem descrita na literatura (Rafacho et al. , 2008; Protzek et al., 2014). Para comprovar que realmente a RI foi instaurada analisamos qual a sensibilidade dos animais a este hormônio através do ipITT e da taxa de decaimento da glicemia frente à insulina (kITT). Como esperado, o tratamento com DEXA induziu RI tanto nos animais WT como nos animais KO (Figura 2A/B).
Sabendo que RI é um estado que induz expansão de célula β (Kahn, 2003; Paulsen et al. , 2010) e, após saber que o tratamento com DEXA utilizado neste trabalho realmente promoveu a instauração da RI, fomos analisar a arquitetura da ilhota. Avaliamos então a imuno-marcação para Insulina e Glucagon nos diferentes grupos.
Como podemos observar na Figura 3A,o tratamento com DEXA promoveu um aumento na imunorreatividade para a Insulina e uma possível hipertrofia das ilhotas pancreáticas nos animais WT. Quando transformamos essa constatação visual em números
1 Anexo 01. Figura 2 da Dissertação de mestrado da pós-graduanda Carolina Ruoso.
encontramos que a área do pâncreas ocupado por células β foi aumentado pelo DEXA apenas nos animais WT (Figura 3B). Assim, podemos inferir que o DEXA, mesmo induzindo RI, não foi capaz de promover proliferação de célula β quando o HNF4α não estava presente. Essa observação vai ao encontro de nossa hipótese e nos indica que o FT HNF4α é essencial para a expansão de célula β induzida por RI.
Quando olhamos para a marcação de Glucagon observamos que quando comparado com animais WD, os animais KD apresentam menor área de células α (Figura 3A/C), indicando que animais KO não sofreram efeito do DEXA também no tocante às células α. Esses achados podem nos indicar que além da proliferação, o HNF4α pode atuar em processos de plasticidade pancreática. Entretanto mais experimentos precisam ser realizados para discutirmos este assunto.
Esses dados corroboram os dados apresentados na Dissertação de mestrado da pós-graduanda Carolina Ruoso, onde também mostramos que a marcação para o Ki67 estava aumentado. Isso nos indica que o tratamento com DEXA promoveu aumento da área ocupada por células β e que, provavelmente, este processo depende da presença do HNF4α. ( RUOSO, C, 2018)
7. Conclusão
Neste trabalho, podemos então concluir que o modelo de RI induzido por DEXA é efetivo para avaliar o impacto do FT HNF4α na proliferação massa de células β, e subsequente a área positiva para insulina. Concluímos também que o FT HNF4α, como mostrado em outros estudos de Gupta e colaboradores (Gupta et al. , 2007), é crucial para a proliferação de massa de células β, aumentando a área positiva para insulina. Esperamos que após o fim da morfometria e das análises estatísticas possamos avaliar também a desdiferenciação de células da ilhota pancreática. A partir dos nossos resultados , não tivemos a confirmação da instauração da RI nos modelos KD e KS. Esperamos que os próximos lotes possam melhorar os números a fim de afunilar os resultados das análises estatísticas.
8. REFERÊNCIAS
AFELIK, S.; ROVIRA, M. Pancreatic β-cell regeneration:Facultative or dedicated progenitors? Mol
Cell Endocrinol, v.445, p. 85-94, 04 2017. ISSN 1872-8057.
ARAKI, Eiichi et al. Alternative pathway of insulin signalling in mice with targeted disruption of the IRS-1 gene. Nature, v. 372, n. 6502, p. 186, 1994.
Bonner-Weir, S. Islet growth and development in the adult. J Mol Endocrinol, v. 24, n. 3, p.297-302, Jun 2000. ISSN 0952-5041.
CARPINELLI, Angelo Rafael et al. Pâncreas Endócrino. In: AIRES, Margarida de Mello et al.
Fisiologia. 5. ed. Florianópolis: Guanabara Koogan, 2018. Cap. 70. p. 1158-1169.
Cnop M, Welsh N, Jonas J, Jörns A, Lenzen S, Eizirik D: Mechanisms of pancreatic beta-cell death in type 1 and type 2 diabetes: many differences, few similarities. Diabetes 2005;54 Suppl 2:S97-107 FAJANS, S. S.; BELL, G. I. MODY: history, genetics, pathophysiology, and clinical decision making. Diabetes Care, v.34, n. 8, p. 1878-84, Aug 2011. ISSN 1935-5548.
Gupta RK, Gao N, Gorski RK, White P, Hardy OT, Rafiq K, Brestelli JE, Chen G, Stoeckert CJ, Kaestner KH: Expansion of adult beta-cell mass in response to increased metabolic demand is dependent on HNF-4alpha. Genes Dev 2007;21:756-769
Gupta RK, Kaestner KH: HNF-4alpha: from MODY to late-onset type 2 diabetes. Trends Mol Med 2004;10:521-524
Gupta RK, Vatamaniuk MZ, Lee CS, Flaschen RC, Fulmer JT, Matschinsky FM, Duncan SA, Kaestner KH: The MODY1 gene HNF-4alpha regulates selected genes involved in insulin secretion. J
Clin Invest 2005;115:1006-1015
Hansen SK, Párrizas M, Jensen ML, Pruhova S, Ek J, Boj SF, Johansen A, Maestro MA, Rivera F, Eiberg H, Andel M, Lebl J, Pedersen O, Ferrer J, Hansen T: Genetic evidence that
HNF-1alpha-dependent transcriptional control of HNF-4alpha is essential for human pancreatic beta cell function. J Clin Invest 2002;110:827-833
Huang J, Karakucuk V, Levitsky LL, Rhoads DB: Expression of HNF4alpha variants in pancreatic islets and Ins-1 beta cells. Diabetes Metab Res Rev 2008;24:533-543
Ihara A, Yamagata K, Nammo T, Miura A, Yuan M, Tanaka T, Sladek FM, Matsuzawa Y, Miyagawa J, Shimomura I: Functional characterization of the HNF4alpha isoform (HNF4alpha8) expressed in pancreatic beta-cells. Biochem Biophys Res Commun 2005;329:984-990
pathophysiology of Type 2 diabetes. Diabetologia 2003;46:3-19
Oliver K,, J. M.; STOFFERS, D. A. On the origin of the beta cell. Genes Dev, v. 22, n.15, p. 1998-2021, Aug 2008. ISSN 0890-9369.
Odom DT, Zizlsperger N, Gordon DB, Bell GW, Rinaldi NJ, Murray HL, Volkert TL, Schreiber J, Rolfe PA, Gifford DK, Fraenkel E, Bell GI, Young RA: Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors. Science 2004;303:1378-1381
Paulsen SJ, Jelsing J, Madsen AN, Hansen G, Lykkegaard K, Larsen LK, Larsen PJ, Levin BE, Vrang N: Characterization of beta-cell mass and insulin resistance in diet-induced obese and diet-resistant rats. Obesity (Silver Spring) 2010;18:266-273
RAFACHO, A. et al. Functional alterations in endocrine pancreas of rats with different degrees of dexamethasone-induced insulin resistance. Pancreas, v. 36, n. 3, p. 284-93, Apr 2008. ISSN 1536-4828.
RAFACHO, Alex et al. Glucocorticoid treatment and endocrine pancreas function: implications for glucose homeostasis, insulin resistance and diabetes. 2017.
RUOSO, C. . O papel do HNF4α na expansão da massa de célula β induzida por dexametasona 2018. Sandovici I, Hammerle CM, Ozanne SE, Constância M: Developmental and environmental
epigenetic programming of the endocrine pancreas: consequences for type 2 diabetes. Cell Mol Life
Sci 2013;70:1575-1595
Santos GJ, Oliveira CA, Boschero AC, Rezende LF: CNTF protects MIN6 cells against apoptosis induced by Alloxan and IL-1β through downregulation of the AMPK pathway. Cell Signal 2011;23:1669-1676
Shih DQ, Screenan S, Munoz KN, Philipson L, Pontoglio M, Yaniv M, Polonsky KS, Stoffel M: Loss of HNF-1alpha function in mice leads to abnormal expression of genes involved in pancreatic islet development and metabolism. Diabetes 2001;50:2472-2480
Spijker HS, Ravelli RB, Mommaas-Kienhuis AM, van Apeldoorn AA, Engelse MA, Zaldumbide A, Bonner-Weir S, Rabelink TJ, Hoeben RC, Clevers H, Mummery CL, Carlotti F, de Koning EJ: Conversion of mature human β-cells into glucagon-producing α-cells. Diabetes
2013;62:2471-2480
SPIJKER, H. S. et al. Conversion of mature human β-cells intoglucagon-producing α-cells. Diabetes, v. 62, n. 7, p. 2471-80, Jul 2013. ISSN 1939-327X.
Steil GM, Trivedi N, Jonas JC, Hasenkamp WM, Sharma A, Bonner-Weir S, Weir GC: Adaptation of beta-cell mass to substrate oversupply: enhanced function with normal gene expression. Am J Physiol
Wang H, Maechler P, Antinozzi PA, Hagenfeldt KA, Wollheim CB: Hepatocyte nuclear factor 4alpha regulates the expression of pancreatic beta -cell genes implicated in glucose metabolism and nutrient-induced insulin secretion. J Biol Chem 2000;275:35953-35959
ANEXO 01 3
ANEXO 02 4
