Análise de genes homeólogos da família frigida-like e do receptor de etileno EIN4 durante o desenvolvimento reprodutivo em Coffea arabica : Homeologous genes analysis of frigida-like family and ethylene receptor EIN4 throughout reproductive development in

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Instituto de Biologia

NATALIA GOMES VIEIRA VAN DEN BROEK

ANÁLISE DE GENES HOMEÓLOGOS DA FAMÍLIA FRIGIDA-LIKE E DO RECEPTOR DE ETILENO EIN4 DURANTE O DESENVOLVIMENTO

REPRODUTIVO EM COFFEA ARABICA

HOMEOLOGOUS GENES ANALYSIS OF FRIGIDA-LIKE FAMILY AND ETHYLENE RECEPTOR EIN4 THROUGHOUT REPRODUCTIVE

DEVELOPMENT IN COFFEA ARABICA

CAMPINAS - SP

2018

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NATALIA GOMES VIEIRA VAN DEN BROEK

ANÁLISE DE GENES HOMEÓLOGOS DA FAMÍLIA FRIGIDA-LIKE E DO RECEPTOR DE ETILENO EIN4 DURANTE O DESENVOLVIMENTO

REPRODUTIVO EM COFFEA ARABICA

HOMEOLOGOUS GENES ANALYSIS OF FRIGIDA-LIKE FAMILY AND ETHYLENE RECEPTOR EIN4 THROUGHOUT REPRODUCTIVE

DEVELOPMENT IN COFFEA ARABICA

Orientador: JORGE MAURÍCIO COSTA MONDEGO

CAMPINAS

2018

Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do titulo de Doutora em Genética e Biologia Molecular na área de Genética Vegetal e Melhoramento.

Thesis presented to the Biology Institute of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in Genetics and Molecular Biology in the area of plant genetics and breeding.

ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR NATALIA GOMES VIEIRA E ORIENTADA PELO PROF. DR. JORGE MAURÍCIO COSTA MONDEGO.

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COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Jorge Maurício Costa Mondego

Prof. Dr. Douglas Silva Domingues

Prof. Dr. Luiz Filipe Potasio Pereira

Prof. Dra. Maria Helena de Souza Goldman

Prof. Dr. Renato Vicentini dos Santos

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

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Aos amantes da ciência, que assim como eu se fascinam pelo exuberante mundo da pesquisa molecular.

Ao meu filho Benício, pela importância incondicional que tem na minha vida.

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, que ilumina meus passos, me ama pelo que sou e me fortalece diante das adversidades.

A minha família, em especial meus pais; Antônio Carlos e Iara, que sempre abdicam de suas próprias vontades para que meus sonhos e objetivos se realizem! Sem vocês não seria possível concretizar esse trabalho!

Ao meu marido Kollien, pelo amor, carinho, paciência, cumplicidade e compreensão. Sem o seu apoio a minha vida não seria a mesma!

Aos amigos, que conheci no IAC, pelos momentos de descontração e amizade, Cema, Fernanda, Cissa, Suellen, Carol, Ruth, Juliana Veloso, Lisandra. Em especial agradeço aos que trabalharam diretamente comigo; Juliana, Ilse, Renata, Elaine e Marcus por todos os momentos de descontração, amizade e conhecimentos compartilhados. Vocês são demais!

Ao Dr. Carlos Colombo por todo suporte de equipamentos, estrutura e apoio à minha pesquisa. Obrigada!

Ao Dr. Jorge Mondego, pelos ensinamentos e orientação. Sempre disponível para me receber, ouvir, questionar e auxiliar. Ofereceu-me a oportunidade de ter mais autonomia na ciência, me ajudando a crescer pessoalmente e contribuindo de forma significativa para minha capacitação profissional. Sem a sua compreensão e ajuda não seria possível conquistar essa etapa. Muito obrigada!

Aos professores do curso de Genética e Biologia Molecular da Unicamp, pelos valiosos ensinamentos.

Aos membros da banca examinadora, Dr. Jorge Mondego, Dr. Renato Vicentini, Dra. Maria Helena Goldman, Dr. Douglas Domingues e Dr. Luiz Filipe Pereira por aceitarem o convite para fazer parte da banca e contribuir construtivamente com o meu trabalho.

A FAPESP, agência financiadora do meu projeto de doutorado 2013/17544-3 pelo suporte financeiro.

Enfim, a todos que de alguma forma, direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho.

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“...And now that you don’t have to be perfect, you can be good.”

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RESUMO

O café é uma das commodities agrícolas mais importantes no mundo. Por ser um alotetraplóide, o genoma de Coffea arabica é a junção dos genomas de seus ancestrais diplóides (Coffea canephora e Coffea eugenioides) que passaram a ser subgenomas nessa espécie. Dessa forma, os transcritos expressos por C. arabica são uma combinação de genes homeólogos desses dois subgenomas. A regulação destes genes modula a expressão nos tecidos e condições biológicas diferentes, o que poderia explicar a maior plasticidade ambiental de C. arabica e de outros poliploides com relação a plantas diplóides. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar os genes homeólogos da família Frigida-like (FRL) e do receptor de etileno EIN4, observando as diferenças nas sequências gênicas e promotoras, além de investigar a expressão diferencial de genes homeólogos (EDH) no desenvolvimento reprodutivo e embriogênese somática direta de C. arabica. Os RNAs de folhas, flores, frutos e embriões em diferentes estádios de desenvolvimento foram extraídos e ensaios de qPCR foram realizados utilizando o método Taq-MAMA para discriminar as sequências homeólogas. Nosso trabalho é um dos pioneiros a utilizar os dados do genoma completo de C.

canephora e C. arabica e dados do transcriptoma de C. eugenioides para o estudo dos genes

homeólogos e pela primeira vez os ortólogos dos genes Frigida-like foram identificados e caracterizados em Coffea. Surpreendentemente, além de confirmar a expressão dos genes

FRLs durante a embriogênese zigótica, detectamos a expressão de FRLs durante a

embriogênese somática direta. Quanto ao gene EIN4, este foi mais expresso no embrião do que em outros tecidos do fruto e houve um aumento da expressão nos estádios finais de desenvolvimento no endosperma e pericarpo. Além disso, os homéologos de FRLs e EIN4 foram diferencialmente expressos. Avaliamos também se a metilação ou a presença/ausência de elementos cis nos promotores homeólogos poderiam explicar a regulação na EDH. Consideramos nosso trabalho um importante passo para a elucidação da regulação na EDH em C. arabica, dando suporte a estratégias alternativas para o melhoramento e seleção guiada.

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ABSTRACT

Coffee is one of the most important agricultural commodities in the world. As an alotetraploid, Coffea arabica genome is the merger of its diploid ancestors’ genome (Coffea

canephora and Coffea eugenioides) which became subgenomes in this species. Therefore,

transcripts expressed by C. arabica are a combination of homelogous genes of these two subgenomes. The regulation of these genes modulates expression in different tissues and biological conditions, which could explain the greater environmental plasticity of C. arabica and others polyploids comparing to diploid plants. Thus, the aim of our study was to evaluate Frigida-like family (FRLs) and ethylene receptor EIN4 gene, observing the differences in gene sequences and promoters, as well as investigating homeolog differential expression (HDE) throughout reproductive development and somatic embryogenesis in C. arabica. RNA from leaves, flowers, fruits and embryos at different stages of development was extracted and qPCR assays were performed using Taq-MAMA method to discriminate homeolog sequences. Our work is one of pioneers to use C. canephora and C. arabica complete genome data and C. eugenioides transcriptome data to study homeolog genes and for the first time Frigida-like orthologs were identified and characterized in Coffea. Surprisingly, in addition to confirming FRL gene expression during zygote embryogenesis, we detected FRL expression during direct somatic embryogenesis. Regarding EIN4, it was more expressed in embryo than others tissues on fruit and there was an increase in expression in the final stages of development in the endosperm and pericarp. In addition, FRLs and EIN4 homeologous were differentially expressed. We also evaluated whether methylation or the presence/absence of cis elements in homeologous promoters could explain HDE regulation. We considered our work an important step for elucidate HDE regulation of C. arabica, supporting alternative strategies for breeding and guided selection.

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LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO I

Figura 1 Variabilidade na frequência de genes homeólogos nos contigs. Fonte: Vidal et al.

(2010). 23

Figura 2 Estádios de floração do café. Adaptado de De Morais (2011). 27 Figura 3 Desenho esquemático mostrando as interações entre os componentes do complexo

FRIGIDA e o gene FLC. Adaptado de Choi et al. (2011). 28 Figura 4 Alterações teciduais que ocorrem durante o desenvolvimento dos frutos de café e

maturação. e: endosperma; ps: perisperma; pc: pericarpo. Fonte: Salmona et al.

(2008). 30

Figura 5 Via Biosintética do etileno e ciclo de Yang. Fonte: Wilson et al., (2015). 32

Figura 6 Estruturas de domínios dos receptores de etileno de Arabidopsis thaliana. Fonte:

Wilson et al., (2015). 33

CAPÍTULO II Artigo 1

Figure 1 Sequence alignment of Frigida domain in Coffea (Ca, Cc) and Arabdopsis (At) Frigida-like proteins. Black background, more than 90% of conservation between amino acids; Dark gray background and white letters, conservation between amino acids 89-80%; Light gray background and black letters, conservation between amino

acids 79-60%. 61

Figure 2 Phylogenetic analysis of CcFRL proteins with orthologous proteins of A. thaliana (At), S. bicolor (Sorbi), O. sativa (ORYSA), S. lycopersicum (SOLLY), S. tuberosum (SOLTU) and V. vinifera (VITVI). The percentage of replicate trees in

which the associate 62

Figure 3 Expression profiles of CaFRL homeologous genes (CaCc and CaCe) in leaves of C. arabica, C. canephora and C. eugenioides. Gray bars refer to CaCc and white bars refer to CaCe. Values of three technical replicates are presented as mean ± SD (error bars). Transcript abundances were normalized using the expression of UBQlO (ubiquitin) as reference gene. Asterisks indicate significant differences (P < 0.05)

between homeologous genes. 63

Figure 4 Anatomical view of C. arabica organs and tissues at which CaFRL gene expression was evaluated. (A) Flowers at different stages (green cluster, white cluster, white candle and anthesis). Scale: 5mm. (B) Fruits (From top to bottom: whole fruit, fruit cross section, fruit longitudinal section, embryos; from left to right: days after flowering). Perisperm (pe), embryo (eb), endosperm (end), pericarp (pe). Scale: fruits = 2mm, embryos = 1mm. (C) Foliar explants collected throughout DSE. 0 days (0d), 8 days (8d), 16 days (16d), 28 days (28d), 60 days (60d), embryo formation (Embryos). Adaxial epidermis (AD), palisade parenchyma (Pp), spongy parenchyma (Sp),vascular bundle (Vb), abaxial epidermis (AB), stomata (St); asterisk indicates intense mitosis in spongy parenchyma; Arrow indicates the beginning of cellular division at spongy parenchyma; Pró-embryonic mass (Pm);

Meristematic cells (Mc) Scale: 0d-28d = 50 µm, 60d and Embryos = 200 µm. 64

Figure 5 Gene expression analysis of CaFRL genes in C. arabica flowers. (A) Heat map visualization of CaFRL expression in flowers at different stages (see material and

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methods). Expression level is indicated with a color scale, from light green (weakly expressed) to red (strongly expressed). ‘Green cluster’ sample was used as internal calibrator. (B) Expression profiles of homeologous genes (CaCc and CaCe) of

CaFRL family in flowers at different stages (green cluster, white 1 floral bud, white

2 floral bud and anthesis). Values of three technical replicates are presented as mean ± SD (error bars). Transcript abundances were normalized using the expression of UBQlO (ubiquitin) as reference gene. Asterisks indicate significant differences (P <

0.05) between homeologous genes. 65

Figure 6 Gene expression analysis of CaFRL genes during C. arabica fruit development (A) Heat map visualization of CaFRL expression in fruits at different stages of fruit development. Expression level is indicated with a color scale, from light green (weakly expressed) to red (strongly expressed). ‘60 daf pe’ sample was used as internal calibrator (B) Expression profiles of homeologous genes (CaCc and CaCe) of CaFRL family in fruits at different tissues. Perisperm (pe), embryo (eb), endosperm (end) and pericarp (po) and stages of ripening (60-240 daf, days after flowering). Values of three technical replicates are presented as mean ± SD (error bars). Transcript abundances were normalized using the expression of UBQlO (ubiquitin) as reference gene. Asterisks indicate significant differences (P < 0.05)

Figure 7 Gene expression analysis of CaFRL genes in C. arabica direct somatic embryogenesis (A) Heat map visualization of CaFRL expression in DSE at different stages. Expression level is indicated with a color scale, from light green (weakly expressed) to red (strongly expressed). ‘0d’ sample was used as internal calibrator (B) Expression profiles of homeologous genes (CaCc and CaCe) of CaFRL family during DSE at different stages: 0 days (0d), 8 days (8d), 16 days (16d), 28 days (28d), 60 days (60d), globular embryos (gl), heart embryos (he) and torpedo embryos (to). Values of three technical replicates are presented as mean ± SD (error bars). Transcript abundances were normalized using the expression of UBQlO (ubiquitin) as reference gene. Asterisks indicate significant differences (P < 0.05)

Figure S1 N-terminal region of the Frigida-like proteins families. Conserved amino acids within each family, FRL-1, FRL-2, FRL-3, FRL-4 e FRL-5 are shaded with brown, gray, red, green and blue colors, respectively. Similar amino acids are deﬁned as acidic, basic, polar or non-polar. All alignments were generated using ClustalW and

Gene doc software. 70

Figure S2 Alignment of genome sequences (gDNA), Expressed Sequence Tag (EST) and RNA sequencing (RNAseq) of the FRL-2 gene of C. canephora (Cc), C. arabica (Ca) and

C. eugenioides (Ce). The arrows indicate homeologs CaCc and CaCe.

Polymorphisms are marked with asterisks. Box shows SNP used to design primers

for TaqMAMA methodology. 71

Figure S3 Dendogram of the Frigida-like protein sequences of C. arabica (1,

CaFRL-2, CaFRL-3, CaFRL-4 e CaFRL-5), C. canephora (CcFRL-1, CcFRL-CaFRL-2, CcFRL-3, CcFRL-4 e CcFRL-5), C. eugenioide (CeFRL-1, CeFRL-2, CeFRL-3, CeFRL-4 e CeFRL-5) and S. lycopersicum (SlFrigida-like). Homeologous genes of Notice that

each FRI homeologous of C. arabica is positioned near C. canephora (FRL-x.1) or C. eugenioides (FRL-x.2) FRI genes. The evolutionary history was inferred using the Neighbor-Joining method cotucted in MEGA7. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) is shown next to the branches. The evolutionary distances were computed using the

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Figure S4 Differential cis-acting elements found in FRL-1 coffea promoters. 72

Figure S7 Differential cis- acting elements found in FRL-5 coffea promoters. 74

Figure 1 Part of coding sequence alignment of EIN4 gene in C. canephora (Cc), C. arabica BACs (Ca) and C. eugenioides (Ce). The arrows indicate homeologs CaCc and

CaCe. Polymorphisms are marked with bold letters. 89

Figure 2 Sequence alignment of EIN4 proteins in Coffea arabica (CaCcEIN4, CaCeEIN4),

Coffea canephora (CcEIN4), Coffea eugenioides (CeEIN4), Solanum lycopersicum

(SlEIN4) and Arabdopsis thaliana (AtEIN4). Black background, 100% of conservation between amino acids; Dark gray background, conservation between amino acids 99-80%. The alignment was constructed with Clustal W2 and edited

with Gene Doc. 90

Figure 3 Expression profiles of EIN4 homeologous genes (CaCc and CaCe) in leaves of C.

arabica, C. canephora and C. eugenioides. Values of three technical replications are

presented as mean ± SD (bar). Transcript abundances were normalized using the expression of UBQlO (ubiquitin) as reference gene. Significant differences (P <

0.05) between homeologous were evaluated using ANOVA and Tukey tests. 91

Figure 4 Gene expression analysis of CaEIN4 gene during C. arabica fruit development (A) Heat map visualization of CaEIN4 full expression in fruits at different development stages. Expression level is indicated with a color scale, from light green (weakly expressed) to red (strongly expressed). ‘60 daf pe’ sample was used as internal calibrator (B) Expression profiles of homeologous genes (CaCc and CaCe) of

CaEIN4 gene in fruits at different tissues. Perisperm (pe), embryo (eb), endosperm

(end) and pericarp (po) and stages of ripening (60-240 daf, days after flowering). Values of three technical replicates are presented as mean ± SD (error bars). Transcript abundances were normalized using the expression of UBQlO (ubiquitin) as reference gene. Asterisks indicate significant differences (P < 0.05) between

homeologous genes. 92

Figure 5 A: PCR amplification of CaCcEIN4 and CaCeEIN4 primers at promoter region in gDNA untreated and treated with Bisulfite. B: PCR amplification attempt of CaCcEIN4 and CaCeEIN4 bissulfite primers at promoter region in gDNA untreated

and treated with Bisulfite. 93

S1 Alignment of CaEIN4 promoter sequences to design CaCc and CaCe specific primers for cloning and sequencing in CATUAI AM. Underlined regions were used

for design homeolog-specific primers. 94

S2 Alignment of predicted promoter sequences after Bissulfite treatment in three C.

arabica cultivars. Underlined regions were used for design homeolog-specific

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LISTA DE TABELAS

Table 1 FRI-related genes in coffee. Gene size (gs), CDS size (CDSs), number of íntrons (I), protein length (aa), identity (Id), similarity (S). Arabdopsis thaliana (At), base pairs

(bp) 59

Table S1 Genes and corresponding primers used for expression experiments. The primers select to expression experiments F (Forward) and R (Reverse) are indicated. The CaUBQ10F and R primer par was used for the ubiquitin (UBI) as reference gene.

(E) Efficiency = E 60

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SUMÁRIO

CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO ... 16

1-INTRODUÇÃOGERAL ... 16

1.1-OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 18

2-REFERENCIALTEÓRICO ... 19

2.1-HISTÓRICO E IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DO CAFÉ ... 19

2.2-GENÔMICA DO CAFÉ E GENES HOMEÓLOGOS ... 20

2.2.1 - Regulação da transcrição nos genes homeólogos ... 24

2.3-DESENVOLVIMENTO REPRODUTIVO DO CAFEEIRO ... 26

2.3.1 - Florescimento e desenvolvimento floral... 26

2.3.2 - Desenvolvimento do fruto ... 29

2.3.3 - Participação do etileno e seus receptores no desenvolvimento do fruto de café ... 30

2.4-REPRODUÇÃO “ARTIFICIAL” VIA EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA ... 34

3-CONSIDERAÇÕESGERAIS ... 36

CAPÍTULO II: DOCUMENTOS A PUBLICAR... 37

ARTIGO1:HOMEOLOGOUSREGULATIONOFFRIGIDA-LIKEGENES PROVIDESINSIGHTSABOUTREPRODUCTIVEDEVELOPMENTAND SOMATICEMBRYOGENESISINTHEALLOTETRAPLOIDCOFFEAARABICA ... 37

ABSTRACT ... 37

INTRODUCTION ... 38

RESULTS ... 39

FRL genes characterization in Coffea ... 39

Coffea arabica homeologous FRL assignments ... 40

Coffea arabica FRL expression during flower development ... 41

Coffea arabica FRL expression during fruit development ... 41

Coffea arabica FRL expression during direct somatic embryogenesis ... 42

DISCUSSION... 43

CaFRL homeolog sequence analysis ... 43

CaFRLs display homeologous differential expression ... 44

CaFRLs might exert functions in late flower development ... 46

CaFRLs appear to be involved in embryogenesis and endosperm development ... 47

CaFRLs are expressed during somatic embryogenesis ... 48

METHODS... 49

Biological material ... 49

(15)

Genomic data and in silico analyses ... 50

RNA extraction and real-time qPCR assays ... 51

REFERENCES ... 53

TABLES ... 59

FIGURES ... 61

ARTIGO2:EIN4ETHYLENERECEPTORHOMEOLOGOUSGENESARE EXPRESSEDDURINGCOFFEAARABICAFRUITDEVELOPMENT ... 75

ABSTRACT ... 75

INTRODUCTION ... 76

METHODS... 77

Biological material ... 77

Genomic data and in silico analyses ... 77

RNA extraction and real-time qPCR assays ... 78

gDNA extraction and EIN4 homeologs genes promoters cloning ... 78

Bisulfite sequencing ... 79

RESULTS AND DISCUSSION ... 79

Coffea arabica homeologous EIN4 assignments ... 79

Coffea arabica EIN4 expression during fruit development ... 80

Understanding HDE regulation in Coffea arabica through cis-elements mapping and DNA methylation assays ... 81

REFERENCES ... 84

TABLE ... 88

FIGURES ... 89

CAPÍTULO III: CONCLUSÃO ... 110

CAPÍTULO IV: REFERÊNCIAS ... 111

ANEXOS ... 127

ANEXOI:TERMO DE BIOÉTICA ... 127

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16

CAPÍTULO I: INTRODUÇÃO

1 - INTRODUÇÃO GERAL

O café é uma das culturas agrícolas mais importantes no mundo. Ele é distribuído e comercializado globalmente em uma indústria multimilionária, sendo o Brasil o principal país produtor e exportador dessa iguaria. Esta planta é produzida em mais de 60 países e oferece um meio de subsistência para milhões de famílias que cultivam café (ICO, 2018). Além disso, dois bilhões e meio de xícaras de café são consumidas mundialmente, o tornando a cada ano a segunda commodity mais negociada após o petróleo e a cafeína contida nele a droga psicoativa mais amplamente consumida (CONAB, 2018).

O gênero Coffea, que tem seu centro de origem na África, contém as duas espécies responsáveis por quase toda a produção dos grãos de café: Coffea arabica e Coffea

canephora. O café da espécie C. arabica é cultivado em ambientes de planalto e produz frutos

superiores em termos de qualidade de bebida do que os da espécie C. canephora devido às propriedades organolépticas do fruto; resultando em um preço de mercado mais elevado. Já a espécie C. canephora é mais bem adaptada às planícies equatoriais quentes e úmidas, sendo mais resistente a altas temperaturas e às doenças do que o Arábica, no entanto produz uma qualidade inferior na bebida com maior teor de cafeína, sendo utilizado pela indústria de café solúvel e em blends (Leroy et al., 2005).

C. arabica é um alotetraplóide, visto que o seu genoma é a junção dos genomas

ancestrais diplóides Coffea canephora e Coffea eugenioides que se tornaram subgenomas (CaCc e CaCe, respectivamente) nesta espécie (Vidal et al, 2010; Lashermes et al., 1999). Desse modo, os transcritos expressos por C. arabica são a combinação de genes homeólogos destes dois subgenomas. Foi verificado que C. arabica possui expressão diferencial de genes homeólogos (EDH) sugerindo que os subgenomas ancestrais codificam proteínas envolvidas em mecanismos fisiológicos distintos, adicionando um novo elemento de investigação na regulação da expressão gênica do cafeeiro.

A regulação dos genes homeólogos deve modular o fenótipo da planta em diferentes tecidos e condições biológicas, o que poderia explicar a maior plasticidade ambiental de C. arabica e outros poliplóides. Devido à complexidade da regulação da EDH em C. arabica, regulações cis e trans provavelmente atuam na transcrição deste alopoliplóide. O entendimento dos mecanismos que regulam a expressão de genes do cafeeiro pode

(17)

17 INTRODUÇÃO GERAL

responder algumas questões relacionadas com as diferenças fenotípicas entre cultivares de

C.arabica, além de promover insights sobre a evolução dos genomas do café (Combes et al.,

2012).

As plantas de café apresentam um importante problema de assincronia na floração, o que faz com que o amadurecimento de frutos seja irregular e, portanto, afete a qualidade do produto (Pezzopane, 2003). Este processo não é governado por um fator importante isolado como é observado em outras angiospermas, sendo influenciado pelo fotoperíodo, a vernalização e mudanças no potencial hídrico.

O amadurecimento dos frutos é altamente coordenado, geneticamente programado, e um fenômeno irreversível envolvendo uma série de mudanças fisiológicas, bioquímicas e organolépticas (Castro e Marraccini, 2006). O hormônio gasoso etileno está diretamente relacionado ao amadurecimento dos frutos e o estudo de genes relacionados à via de sinalização desse hormônio, como por exemplo os receptores de etileno, ainda é pouco explorado em café (Schaller et al., 2011). Além disso, do ponto de vista molecular, o mecanismo envolvido na percepção destes estímulos e ativação do desenvolvimento reprodutivo em C. arabica ainda não está bem compreendido.

Em Arabidopsis thaliana, o gene Frigida (FRI) é um regulador chave que inibe a transição para floração através da ativação do LOCUS DE FLORESCIMENTO C (FLC), que é um repressor central da floração e controla a resposta de exigência a vernalização (Michaels

et al., 2004). No entanto, a vernalização não tem qualquer efeito na expressão de FRI, sendo

que a família gênica Frigida-like (FRL) é encontrada em todos os genomas sequenciados de plantas superiores, independentemente se a espécie tem uma resposta a vernalização, o que sugere que estes genes podem estar envolvidos em outros processos biológicos relacionados, como o desenvolvimento embrionário, maturação da semente, entre outros (Choi et al., 2011). Existe outro processo importante que é capaz de formar embriões sem que haja fecundação e a partir de células somáticas de plantas, este é chamado de embriogênese somática (ES). Este tem se tornado um importante método de multiplicação in vitro de plantas elite de café, em larga escala, capaz de maximizar a propagação do cafeeiro, além de ser vital em trabalhos de transformação genética de plantas (Ribas et al., 2011). Além disso, o desenvolvimento de embriões somáticos e zigóticos é muito semelhante, consequentemente, a ES fornece um modelo útil sendo uma abordagem importante para estudar o desenvolvimento, eventos moleculares e bioquímicos que ocorrem durante a embriogênese vegetal (Moraes, 2003).

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18 INTRODUÇÃO GERAL

Diante dos avanços no genoma e no sequenciamento do transcriptoma de C.

arabica, C. canephora e C. eugenioides (Denoeud et al., Yuyama et al., 2016) é possível

realizar atualmente análises in silico detalhadas em diversos âmbitos da pesquisa, oferecendo material substancial de análise. Assim, o objetivo com este trabalho foi explorar os dados de sequências gênicas e promotoras dos membros da família FRL e do receptor de etileno EIN4 a fim de estudar os genes homeólogos, e ainda avaliar a EDH no desenvolvimento reprodutivo e embriogênese somática direta de C. arabica correlacionando-os com possíveis mecanismos de regulação da transcrição dos mesmos.

1.1 - Objetivos específicos

• Caracterizar a família gênica FRL em café.

• Analisar os polimorfismos encontrados nas sequências gênicas e promotoras de C.

arabica, C. canephora e C. eugenioides dos membros da família FRL e do gene EIN4

a fim de desenhar primers homeólogos específicos.

• Avaliar a expressão gênica e homeóloga específica dos membros da família CaFRL durante o desenvolvimento floral, diferentes tecidos e ao longo do desenvolvimento do fruto e ao longo da embriogênese somática direta de C. arabica.

• Avaliar a expressão gênica e homeóloga específica do gene CaEIN4 em diferentes tecidos e ao longo do desenvolvimento do fruto de C. arabica.

• Investigar se a presença de elementos reguladores em cis e metilação do DNA nos promotores dos genes homeólogos estão atuando na regulação da EDH.

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19 REFERENCIAL TEÓRICO

2 - REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 - Histórico e importância econômica do café

O café é considerado a commodity mais comercializada no mundo e fornece emprego para cerca de vinte milhões de pessoas. A árvore é originária da Etiópia mas a história inicial de seu cultivo e o uso do café como uma bebida, como a conhecemos, está centrada na Arábia. Muito antes de seu uso como base de uma bebida, os frutos e os grãos eram mastigados e considerados estimulantes. Mais tarde, o povo da Etiópia foi descoberto usando grãos secos esmagados, misturados e enrolados com gordura, como alimento para sustentá-los em suas jornadas (Smith, 2011).

O café chegou ao Brasil em 1723 por meio de mudas oriundas da Guiana Francesa. No ano seguinte, foi introduzido no Maranhão e se propagou em pequenas plantações para os estados vizinhos, atingindo a Bahia em 1773. Em 1825, as plantações alcançaram o Vale do Paraíba e os Estados de São Paulo e Minas Gerais e a produção se estendeu para o centro-sul cujas condições ecológicas eram altamente favoráveis atingindo o norte do Rio de Janeiro (onde se fomentou a ampliação da cultura na Serra do Mar) e o Espírito Santo em 1920 (Alonso-Salces et al., 2009).

A cadeia produtiva do café brasileiro se destaca na história econômica e social do país desde a época colonial, sendo o maior gerador de riquezas e o produto mais importante da história nacional. Atualmente continua sendo um importante gerador de divisas, contribuindo com mais de 2% do valor total das exportações brasileiras, e respondendo por mais de um terço da produção mundial. A demanda interna é de 42% da produção nacional, correspondendo ao segundo maior consumo de grãos do mundo. É nesse mercado gigantesco que estão centrados os interesses da cadeia produtiva do café brasileiro, que contribuiu com mais de 30% da produção mundial nas últimas safras, gerando mais de oito milhões de empregos diretos e indiretos no país, sendo, portanto, o setor do agronegócio que mais emprega no Brasil(CONAB, 2018).

Hoje, no Brasil, estimativas para 2018 indicam uma safra de 58,0 milhões de sacas de 60 kg, correspondendo a 3,48 milhões de toneladas de café. Dessa produção, 55% são produzidos em Minas Gerais, 22% em Espírito Santo, 10% em São Paulo, Bahia, 8% e Rondônia, 4%. Na safra de 2018, 76% da safra total de café é de arábica e 23,6% de café robusta. O primeiro é produzido em Minas Gerais e o outro em Espírito Santo,

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predominantemente. As projeções mostram que a produção em 2027/2028 deve situar-se em 71 milhões de sacas e as exportações estão projetadas para 34,0 milhões de sacas, um aumento de 5,0 milhões em relação a 2018 (BRASIL, 2018).

Atualmente, o café é uma das commodities agrícolas mais importantes no mundo sendo responsável por quase metade do total das exportações de produtos tropicais além de ser o segundo maior, no mercado mundial de produtos naturais, depois do petróleo. As duas espécies do gênero Coffea que são responsáveis por quase toda a produção dos grãos de café são Coffea arabica e Coffea canephora, tem aproximadamente 65% e 35% da produção mundial. Sendo que o Brasil, o Vietnã e a Colômbia são responsáveis por mais de 50% da produção mundial e o Brasil com 33% é o maior produtor e exportador (ICO, 2018).

Muitos países produtores de café são altamente dependentes da exportação dessa mercadoria, e lugares como Burundi, Etiópia e Ruanda, são responsáveis por mais da metade de suas exportações totais (Smith, 2011). O consumo de café tem aumentado nos últimos 50 anos, e esse aumento é devido, pelo menos em parte, às mudanças no simbolismo ligado ao café, já que este não é mais visto simplesmente como uma bebida, mas como um estilo de vida. Para satisfazer as demandas de consumo altamente diversificadas, os fornecedores vêm oferecendo uma grande variedade de produtos de café, diferenciados métodos de fabricação e moagem, origem, aromatizantes e embalagens (Ponte, 2002).

2.2 - Genômica do café e genes homeólogos

O cafeeiro é uma planta perene, pertencente à família Rubiaceae, subfamília Ixoroideae, tribo Coffeeae, que é composta pelo gênero Coffea L. com aproximadamente 124 espécies (Davis et al., 2011). Este gênero, que tem seu centro de origem na África, contém as duas espécies responsáveis pela produção dos grãos de café, como mencionado; Coffea

arabica, também conhecido como café Arábica e Coffea canephora, o chamado Robusta

(ICO, 2018).

O café Arábica, que é cultivado em ambientes de planalto, é considerado superior em termos de qualidade de bebida ao Robusta devido às suas propriedades organolépticas, e portanto, possui um preço de mercado mais elevado. O café Robusta é mais bem adaptado às planícies equatoriais quentes e úmidas e é uma das principais fontes de genes de resistência à doenças para os programas de melhoramento de Arábica, no entanto produz uma qualidade

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inferior na bebida com maior teor de cafeína, sendo utilizado pela indústria de café solúvel e em blends com o Arábica (Leroy et al, 2005).

C. arabica é a única espécie do gênero Coffea que é poliplóide, mais

especificamente um alotetraplóide (2n = 4x = 44), sendo fruto de um cruzamento espontâneo entre as duas espécies ancestrais diplóides, Coffea canephora e Coffea eugenioides, ou ecotipos relacionados a estas duas espécies (Lashermes et al., 1999). Estima-se que esse evento recente tenha ocorrido entre 10000– 50000 anos atrás na Etiópia (Cenci et al., 2012).

C. eugenioides cresce em planaltos e perto das bordas da floresta na África Central e Oriental

e não é produzido em escala comercial devido à sua baixa produção de frutos. Esta espécie tem sido incluída em programas de melhoramento genético para reduzir os níveis de cafeína e melhorar a qualidade de copa, pois produz pequenos frutos com baixo teor de cafeína, em comparação com Arabica e Robusta (Mazzafera e Carvalho, 1991).

Por se tratar de uma cultura perene e de período juvenil longo, o melhoramento genético do cafeeiro é lento. A introdução de uma nova característica em uma variedade elite por meio de técnicas de melhoramento convencional é um processo demorado (Anthony et

al., 2002; Bertrand et al., 2003) podendo levar no mínimo 20 anos. Para os cultivares Obatã e

Catuaí, por exemplo, o programa de melhoramento estendeu-se de 1968 a 2000 e de 1950 a 1992, respectivamente (Carvalho et al., 2008).

A diversidade genética de cultivares de C. arabica L. é relativamente pequena e a sua ampliação torna-se importante para o futuro do melhoramento do cafeeiro, visto que, trata-se de uma espécie nobre e que produz café de boa qualidade. Tal diversidade se dá pelos seguintes fatores: (i) as duas espécies parentais (C. canephora e C. eugenioides) apresentam baixa divergência de sequência entre si, (ii) C. arabica é uma planta autógama (apresenta auto-fecundação) e (iii) os cultivares de C. arabica mais plantados (Catuaí, Caturra, Mundo Novo) e que serviram como principais genitores para diversos outros cultivares, foram selecionados por apenas duas populações base: Typica e Bourbon (Anthony et al., 2002). Apesar desta baixa diversidade genética, os diferentes cultivares de C. arabica apresentam características fenológicas bastante diferenciadas como porte, resistência a patógenos, formato de frutos, etc (Fazuoli et al., 2008).

O genoma de C. arabica é a junção dos genomas de seus ancestrais que passaram a ser subgenomas nessa espécie: C. canephora (subgenoma CaCc ou Ca) e C. eugenioides (subgenoma CaCe ou Ea). Portanto, os transcritos expressos por C. arabica são uma combinação de genes desses dois subgenomas. Os genes homólogos entre os subgenomas de

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um alopoliplóide são chamados de homeólogos (Mochida et al., 2003). A alopoliploidia é considerada um dos principais fatores que contribuem para a especiação, diversificação e adaptação ecológica em plantas (Adams et al., 2003; Osborn et al., 2003; Adams, 2007; Jackson e Chen, 2010), incluindo muitas culturas agronômicas importantes como trigo (Triticum aestivum), algodão (Gossypium hirsutum), cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) e café (C. arabica) (Chen e Ni, 2006; Jackson e Chen, 2010). Alopoliplóides apresentam novos fenótipos que não estão presentes ou que superam àqueles presentes em seus ancestrais diplóides (Vidal et al., 2010). Possivelmente, a presença de fenótipos diferentes de seus ancestrais é devido à expressão diferencial dos genes homeólogos (EDH) nos alopoliplóides, o que reflete na plasticidade genômica e função dos genes em genomas duplicados (Jackson e Chen, 2010).

Quando dois ou mais genomas diferentes são combinados dentro de uma única célula, eles devem responder às consequências da duplicação do genoma, especialmente com relação às cópias duplicadas de genes com função similar ou funções redundantes. Existem algumas possibilidades evolutivas de regulação para os genes homeólogos em poliplóides: retenção da função original ou similar para os homeólogos, diversificação funcional e silenciamento gênico de um destes (Wendel, 2018). No entanto, os genes homeólogos podem apresentar também padrões de expressão desigual (ou seja, níveis de dominância ancestral; Grover et al., 2012), podendo variar a expressão entre os órgãos (Adams et al., 2003; Mochida et al., 2003; Adams et al., 2004; Nomura et al., 2005; Chaudhary et al., 2009; Flagel

et al., 2009; Buggs et al., 2010), e de acordo com diferentes tipos de estresse (Liu e Adams,

2007; Stamati et al., 2009; Dong e Adams, 2011; Combes et al., 2012; De Carvalho et al., 2014).

Nos últimos anos, o estudo da EDH em café se aprofundou. Uma análise baseada em análise de SNPs (“Single Nucleotide Polymorphisms”) em etiquetas de sequências expressas (“Expressed Sequence Tags” - EST) indicou tanto expressão igual quanto tendenciosa entre genes homeólogos (fig.1, Vidal et al. 2010). Foram analisados 2069 contigs que continham no mínimo quatro ESTs de um dos subgenomas; a maioria destes (1613; 78%) tem um número balanceado de ESTs de cada origem subgenômica. Os outros contigs têm mais que duas vezes a quantidade de ESTs de um ancestral do que do outro. Aproximadamente, 10% dos contigs tinham mais ESTs de CaCc do que de CaCe (6% com somente CaCc), e aproximadamente 12% tinham mais ESTs de CaCe do que de CaCc (9% com somente CaCe). Desse modo, sugeriu-se que C. arabica apresenta expressão diferencial

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dos homeólogos (Vidal et al, 2010). Para a validação experimental foi realizada a detecção específica dos homeólogos, através da técnica conhecida como TaqMama (Li et al., 2004) que confirmaram a expressão diferencial de alguns homeólogos em C. arabica.

Figura 1. Variabilidade na frequência de genes homeólogos nos contigs. Fonte: Vidal et al.

(2010).

Yuyama et al. (2016) utilizaram o RNA-seq para gerar o transcriptoma de referência para o parental diplóide C. eugenioides, a fim de obter uma visão global de genes transcricionalmente ativos nesta espécie, explorando ainda a expressão de genes específicos altamente expressos nas folhas e frutos. Em trabalhos mais específicos, Marracini et al., (2011) buscaram evidências da expressão diferencial de homeólogos do gene que codifica a pequena subunidade da proteína do fotossistema Rubisco (RBCS). Usando iniciadores específicos para cada homeólogo, estudos de expressão revelaram que o homeólogo CaCe foi expresso em C. arabica, enquanto que o homeólogo CaCc foi quase completamente silenciado.

Em outra análise da expressão gênica, agora usando um microarranjo de café de 15K (Privat et al. 2011), C. arabica foi comparado com seus parentais relacionados (C.

eugenioides e C. canephora) a fim de verificar a extensão de uma possível dominância de um

dos sub-genomas no transcriptoma de C. arabica (Bardil et al., 2011). Foi inferido que C.

arabica possui maior homeostase, devido a menor variação da expressão, dependendo das

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esse resultado (baixa flutuação de expressão em C. arabica) pode ter sido influenciado pela incapacidade de distinguir os homeólogos nos microarranjos.

Combes et al. (2012) realizaram outro estudo utilizando o transcriptoma de folhas de C. arabica cultivado em diferentes temperaturas de crescimento adequadas para cada um de seus ancestrais (30°C - 26°C para C. canephora, 23°C - 19°C para C. eugenioides), só que agora utilizando a técnica derivada de sequenciamento de nova geração conhecida como RNAseq. Quaisquer que fossem as condições de crescimento, 65% dos genes estudados demonstraram nível equivalente de expressão de homeólogos e 35% demonstraram expressão tendendo para um dos subgenomas. Além disso, não foi possível observar expressão gênica de homeólogos direcionada para CaCc em condições mais quentes ou em direção a CaCe em condições mais frias (Combes et al., 2012). De modo intrigante, para a maioria dos genes, não houve uma relação que aparentemente ligasse à variação da expressão gênica nas condições analisadas com a variação da expressão gênica relativa dos homeólogos.

Em outra pesquisa, investigando a homeologia, Yu et al. (2011) isolaram BACS (“Bacterial artificial chromosomes”) de C. arabica que representam regiões homeólogas dessa espécie. Dentro desses BACs foram anotados 16 genes em cada um, mas não houve nenhuma avaliação de expressão diferencial dos homeólogos.

2.2.1 - Regulação da transcrição nos genes homeólogos

Diferenças na expressão gênica entre alelos parentais e homeólogos podem ser resultantes de mudanças na regulação cis e/ou trans. Mudanças em elementos cis-regulatórios nos promotores e regiões transcritas afetam a transcrição e a estabilidade do mRNA (Witkopp

et al., 2008; Tirosh et al., 2009). Efeitos do tipo trans podem resultar da divergência funcional

de fatores de transcrição e reguladores da cromatina ou de outros componentes que transmitem sinais ambientais em alterações na expressão gênica (Shi et al., 2012). Recentemente, evidências indicam que a estabilidade da expressão gênica é mantida pela coordenação entre atividades regulatórias cis e trans (Weirauch e Hughes, 2010).

Buscando inferências sobre os mecanismos regulatórios da expressão dos homeólogos em C. arabica, Combes et al., (2012) usaram as premissas de caracterização de regulação cis e/ou trans em híbridos de Drosophila formuladas por Wittkopp et al., (2004) e expandidas para híbridos e alopoliploides vegetais em outros trabalhos (Stupar e Springer, 2006; Chaudhary et al., 2009; Shi et al., 2012). Trinta e dois (32%) dos genes de C. arabica

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foram inequivocamente caracterizados por apresentarem exclusivamente regulação diferencial por mecanismos cis. Os 68% restantes apresentaram ou regulação em trans (14%), ou combinação entre regulação em cis e regulação em trans (31%) ou um mecanismo difícil de definir entre regulação cis ou trans (33%). Esse dado indica certa complexidade da expressão gênica em C. arabica, já que em outros alopoliplóides, como algodão e Arabidopsis suecica, a regulação em cis prevalece (Chaudary et al., 2009; Shi et al., 2012).

Trabalhos recentes têm mostrado que as modificações epigenéticas têm papel crucial na regulação da expressão dos genes homeólogos em plantas alopoliplóides (Chen, 2007; Gaeta et al., 2007; Shitsukawa et al., 2007; Chen et al., 2011; Hu et al., 2013). A metilação do DNA é um mecanismo relatado como comum e importante no controle da expressão gênica em plantas, sendo o processo mais estudado. A metilação do DNA nas citosinas é uma modificação epigenética que afeta tanto o empacotamento da cromatina como também a transcrição (Takuno e Gaut, 2012). Em plantas, o estado da cromatina pode ser modificado de forma reversível pela acetilação e metilação da porção N-terminal de histonas para o remodelamento em eucromatina ou heterocromatina (Boyko e Kovalchuk, 2008; Peng e Zhang, 2009), o que influencia diretamente na expressão gênica.

Em vegetais, a metilação do DNA ocorre em três contextos de sequencias – CG (também conhecida como sequências CpG), CHG e CHH (onde H = A, C ou T). A função da metilação do DNA varia com relação às características genômicas. Dentro de regiões repetitivas, a metilação é capaz de silenciar a transcrição, agindo como um mecanismo de defesa contra os elementos transponíveis (Lisch, 2009). Além disso, a metilação pode bloquear a expressão de um gene por evitar a ligação de um fator de transcrição numa região promotora (Vanyushin e Ashapkin, 2011); estes genes são frequentemente associados a promotores tecido-específicos (Zhang et al., 2006). Por outro lado, a função da metilação em regiões codantes (conhecido como “gene body methylation”) não é clara. A metilação intragênica pode reduzir, ou, paradoxalmente, aumentar a expressão gênica. Uma hipótese para tal fenômeno é que há a supressão de promotores crípticos dentro das regiões codantes, prevenindo uma expressão inócua e funcionalmente custosa (Maunakea et al., 2010). Outra hipótese indica que o “gene body methylation” aumenta a acurácia do mecanismo de processamento de RNA (Lorincz et al., 2004) e uma última hipótese sugere que tal fenômeno é um subproduto da transcrição não tendo significância funcional (Teixeira e Colot, 2009).

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2.3 - Desenvolvimento Reprodutivo do cafeeiro 2.3.1 - Florescimento e desenvolvimento floral

A fase reprodutiva do cafeeiro começa com a capacidade em produção de flores, que leva aproximadamente 3 anos para se desenvolver a partir da germinação de sementes até a primeira floração e produção de frutos. Há a indução de gemas que se desenvolvem nas axilas foliares dos ramos plagiotrópicos e, em raras ocasiões, em ortotrópicos. (De Oliveira et

al., 2014) O desenvolvimento floral do cafeeiro segue etapas de indução, iniciação,

diferenciação, crescimento/desenvolvimento, latência e antese (Pezzopane, 2003, Camargo e Camargo, 2001). Essas etapas são controladas por hormônios, como giberelinas e ácido abscísico (Bowning, 1973) que são ativados principalmente por fotoperiodismo (mudanças na duração do dia) e por uma queda na temperatura (estação fria) (Wormer e Gituanja, 1970).

De Oliveira et al. (2014) mostraram as principais alterações morfológicas durante o desenvolvimento floral em C. arabica por meio de microscopia de luz e eletrônica de varredura. Inicialmente, os botões são encontrados nas axilas das folhas dos ramos e cobertos pelas estípulas interpeliolares. Cada uma dessas gemas é composta de um par de brácteas protegendo o meristema vegetativo (MV). O primeiro estágio é caracterizado pela conversão do MV em meristema de inflorescência (MI). Nesse estágio, os brotos crescem rapidamente, o segundo par de brácteas se desenvolve e uma secreção de mucilagem é iniciada pelos coléteres. O estágio 2 começa com a produção dos meristemas florais (MF) pelo MI de cada botão. Após a formação dos MFs, o estágio seguinte é caracterizado pela diferenciação dos órgãos florais. O desenvolvimento da flor é terminado com a formação do ovário bilocular inferior e seguido por uma fase de alongamento, que perturba a barreira da mucilagem e permite que a floração ocorra.

Os botões florais podem crescer até um comprimento de 4-6 mm e entrar em uma fase dormente até ser estimulada a floração (2-3 meses) (fig. 2). Ao entrarem em dormência, as células dos botões estão se desenvolvendo plenamente mas sem ocorrer a divisão meiótica. A conexão vascular no pedicelo do botão resume-se quase que exclusivamente ao floema, sendo que o xilema bastante reduzido possui vasos com paredes espessas, por isso ocorre um expressivo déficit hídrico nos botões florais. Além disso, os botões não atingem uma umidade crítica graças à presença da secreção gomosa que encobre o botão floral, o que reduz a evapotranspiração. Altas temperaturas favorecem os botões florais a entrarem em dormência. (Browning, 1973)

(27)

A dormência geralmente é interrompida de repente, com a chegada da chuva e interrupção do estresse hídrico (reidratação) nos brotos e/ou uma queda drástica da temperatura. No campo, esses estímulos frequentemente ocorrem simultaneamente com a chegada da chuva (com pelo menos 10mm de precipitação) e o fim de uma estação seca, que quanto mais severa, mais intensa é a floração. Em climas equatoriais onde a estação seca não é claramente definida, os cafeeiros florescem durante o ano inteiro produzindo 25-50 períodos de floração. Irrigação de qualquer tipo, mesmo névoas, pode quebrar o período de dormência. A floração geralmente se inicia de 5-12 dias após o estímulo ativador ocorrer. (Camargo, 1985)

Figura 2. Estádios de floração do café. Adaptado de De Morais (2011).

Uma inflorescência normal consiste em quatro botões florais em um talo curto que cresce no tronco principal, conhecido como glomérulo. Na maioria dos casos, o glomérulo apresenta quatro flores. A flor de café consiste em uma corola com cinco lóbulos brancos, um cálice, cinco estames e o pistilo. O ovário está na base da corola e contém dois óvulos que, se devidamente fertilizados, produzem dois grãos de café. Flores abrem no início da manhã e permanecem abertas durante todo o dia. Na tarde do mesmo dia, uma vez que a fertilização tenha ocorrido, as anteras ficam marrons. Dois dias depois a corola branca murcha e as partes florais caem deixando o ovário se desenvolver. Se a fertilização falhou, os estigmas e a corola permanecem ligados ao ovário. (Camayo e Arcila, 1996) A maturação das anteras pode coincidir com a antese ou ocorrer alguns dias antes. Na espécie C. arabica a polinização realiza-se antes da abertura completa das flores, proporcionando um elevado grau de auto-fecundação (acima de 94%). Diferente da espécie C. canephora que apresenta autoincompatibilidade gametofítica, e portanto, a polinização ocorre após a abertura das flores através do vento e de agentes polinizadores. (De Melo e Sousa, 2011)

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O fotoperíodo, a vernalização e principalmente as mudanças no potencial hídrico da planta são fatores chaves que controlam o intrigante processo de floração no café. Este processo não é governado por um fator importante isolado como é observado em outras angiospermas (Majerovicz e Söndahl, 2005). Do ponto de vista molecular, o mecanismo envolvido na percepção destes estímulos e ativação do desenvolvimento reprodutivo em

Coffea ainda não está bem compreendido.

Em Arabidopsis thaliana, FRIGIDA (FRI) é uma proteína chave que regula a transição de floração pela ativação do LOCUS DE FLORESCIMENTO C (FLC), que é um repressor central da floração e controla a resposta da planta à vernalização (Lee e Amasino 1995; Michaels et al., 1999; Johanson et al., 2000; Wang et al., 2006). FRI atua como uma proteína scaffold interagindo com outros fatores que atuam formando um complexo, que se liga na região promotora do gene FLC desencadeando a sua expressão e, consequentemente, inibindo a floração (fig. 3, Choi et al., 2011). Por outro lado, a vernalização não tem qualquer efeito na expressão de FRI. A vernalização inibe a expressão de FLC e cria um meristema que é competente para submeter-se a transição floral, assim ela torna FLC insensível aos efeitos da ativação por FRI (Michaels et al., 2004).

Figura 3. Desenho esquemático mostrando as interações entre os componentes do complexo

FRIGIDA e o gene FLC. Adaptado de Choi et al. (2011).

Análises prévias do proteoma de Arabidopsis revelaram uma família de genes FRI de sete membros que se agruparam em dois clados (Michaels et al. 2004). Esforços recentes de sequenciamento resultaram na deposição de várias sequências semelhantes a FRI de diferentes plantas. No entanto, não é claro se estas proteínas previstas são ortólogas de FRI ou proteínas semelhantes a FRI. Por outro lado, Risk et al., (2010) identificaram 5 famílias FRI por meio da análise de resíduos nas posições N- e C-terminal. As FRLs são encontradas em todos os genomas de plantas superiores independente de as espécies exibirem um processo de vernalização. Embora o gene FRI esteja ligado à regulação do florescimento, os membros dessa família gênica também estão associados a outros processos biológicos relacionados à

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reprodução como o desenvolvimento embrionário (Choi et al., 2009) e a maturação de sementes (Risk et al., 2010).

2.3.2 - Desenvolvimento do fruto

No café o desenvolvimento dos frutos é um processo longo caracterizado por mudanças e evoluções nos tecidos. Logo após a fecundação, o ovário que contém os dois óvulos fertilizados começa a se desenvolver. Durante as primeiras 6-10 semanas, no entanto, o ovário cresce muito lentamente, mas se torna visível em um estágio de cabeça de alfinete dormente. É a chamada fase chumbinho, onde no fruto está ocorrendo uma intensa divisão celular sem, contudo, ocorrer aumento de volume.

Os frutos no estádio de chumbinho não estão em dormência fisiológica, já que estudos mostram que neste período há uma intensa absorção de oxigênio demonstrando alto metabolismo no fruto (Cannell, 1971a). Nesta fase inicial o fruto é principalmente constituído pelo pericarpo e perisperma. Em seguida, o endosperma lentamente substitui o perisperma que é forçado a voltar para a periferia do óvulo e dará origem a película prateada no fruto maduro. O endosperma por sua vez, endurece durante a fase de maturação devido ao acúmulo gradual de proteínas de reserva, sacarose e polissacarídeos complexos, representando as principais reservas da semente. No endosperma que enche o grão inteiro, o embrião zigótico evoluiu para o estágio de "dois cotilédones" (Castro e Marraccini, 2006).

Durante os últimos meses de maturação, o fruto completa seu crescimento e, dependendo na variedade, adquire cor vermelha e amarela. Cada fruto contém dois "grãos" revestidos em mucilagem. Na maturação ocorre desidratação do endosperma e alteração da cor do pericarpo. O pericarpo é composto por vários tecidos como exocarpo, mesocarpo e endocarpo. O exocarpo é responsável pela expressão da coloração do fruto do café durante o desenvolvimento. O mesocarpo é rico em açúcar e água, sendo formado de células do parênquima com paredes celulares compactas e densas em frutos verdes, que durante a maturação se tornam mais finas provavelmente devido a modificações de pectina. O endosperma é localizado na parte mais interna do pericarpo (Castro e Marraccini, 2006).

As sementes, após o endurecimento do endocarpo, não podem mais crescer em tamanho em virtude da constrição mecânica imposta pelo endocarpo duro. Sendo que o tamanho do fruto é altamente influenciado pela quantidade de chuva. Portanto durante este período os frutos são sensíveis à deficiência hídrica. A presença de frutos estimula uma maior

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taxa fotossintética pelas folhas, os próprios frutos quando ainda verdes apresentam uma mínima taxa de fotossíntese. (Da Matta et al., 2007)

Segundo Salmona et al. (2008) os frutos de café Arábica possuem os seguintes estádios de desenvolvimento (fig. 4): Estádio 1 (00-60 DAF, dias após a floração): sementes principalmente formada por perisperma aquoso (frutos pequenos com peso de 0.5 g); Estádio 2 (60-90 DAF): muito semelhante ao estádio 1, exceto que o peso do fruto é superior a 0.5 g. A semente é formada principalmente de perisperma aquoso em torno de um endosperma líquido muito pequeno; Estádio 3 (90-120 DAF): tecido de endosperma aquoso crescente e progressivamente substituindo o perisperma no lóculo; Estádio 4 (120-150 DAF): endosperma leitoso macio; Estádio 5 (150-210 DAF): endosperma duro branco, enquanto que o perisperma restante se assemelha a uma película fina verde envolvendo o endosperma; Estádio 6 (210-240 DAF): amadurecimento, frutos cereja com pericarpo tendendo para o amarelo; Estádio 7 (240 DAF): frutos maduros vermelhos cereja (dependendo da variedade) com pericarpo transformando-se em roxo.

Figura 4. Alterações teciduais que ocorrem durante o desenvolvimento dos frutos de café e

maturação. e: endosperma; ps: perisperma; pc: pericarpo. Fonte: Salmona et al. (2008).

2.3.3 - Participação do etileno e seus receptores no desenvolvimento do fruto de café

O etileno é um hormônio gasoso sintetizado pelas plantas que produz muitos efeitos em eventos de crescimento, desenvolvimento e nas respostas aos estresses bióticos e abióticos, sendo que a ampla diversidade desses processos é maior do que para muitos outros fito-hormônios (Abeles et al., 1992).

(31)

Em termos de crescimento, o etileno é mais comumente associado à regulação do tamanho das células, particularmente como inibidor do alongamento celular. Também se descobriu que o etileno regula o crescimento através do controle da divisão celular em alguns casos. No entanto, ele também pode servir como um sinal para promover a expansão celular, uma importante resposta ao estresse de submersão em algumas espécies (Jackson 2008). Em termos de desenvolvimento, o etileno é mais comumente associado ao "envelhecimento", particularmente por sua capacidade de acelerar processos como a senescência, o amadurecimento e a abscisão (Stepanova e Alonso, 2009; Schaller, 2012). Além disso, o etileno serve como um modulador chave da resposta da planta a estresses bióticos ou abióticos (Yang e Hoffman, 1984; Kende, 1993; Wang et al., 2005).

O amadurecimento de frutos é altamente coordenado, geneticamente programado, e um fenômeno irreversível envolvendo uma série de mudanças fisiológicas, bioquímicas e organolépticas. Baseado na produção de etileno e taxas de respiração os frutos podem ser classificados como climatéricos e não climatéricos. Frutos climatéricas, como tomate, abacate, banana, pêssegos, ameixas e maçãs, são caracterizados por um aumento rápido na biossíntese de etileno associado a um aumento na taxa de respiração. No início do amadurecimento, o processo que culmina com a maturação dos frutos. Este recurso permite que os frutos climatéricos completem sua maturação após a colheita, enquanto que frutos não climatéricos, como morango, uva e frutas cítricas, não mostram nenhum aumento na produção de etileno e taxas de respiração e devem completar o amadurecimento na planta (Mcmurchie

et al,. 1972; Lelievre et al., 1997).

Crucial para as funções do etileno é a regulação rigorosa de sua biossíntese. Além disso, ao contrário da auxina ou de outros hormônios vegetais, o etileno não precisa ser ativamente transportado ou degradado nas células vegetais, fazendo com que a biossíntese do etileno seja o único ponto regulador importante para as plantas controlarem os seus níveis (Burstenbinder e Sauter, 2012). A biossíntese se dá primeiramente a partir do precursor inicial Met (Metionina) que é convertida em SAM (ou Adomet, S-adenosil-L-metionina) via SAM sintase, após, SAM é convertido a ACC (1-aminociclopropano-1-carboxilato) pela enzima ACS que gera um subproduto MTA (5'-metiltioadenosina) e este subproduto é reciclado para Met por uma via conhecida como ciclo da metionina ou ciclo de Yang. O ACC sofre clivagem oxidativa para formar etileno, um processo catalisado pela ACO. Além disso, o ACC pode ser conjugado com ácido malônico ou glutationa para formar MACC (malonil-ACC) ou GACC (1- γ-L-glutamilamino ACC). (fig. 5)

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Figura 5. Via Biosintética do etileno e ciclo de Yang. Fonte: Wen et al., 2015.

O etileno é percebido através de sua ligação a receptores, que estão localizados no retículo endoplasmático (ER) e Golgi e que funcionam como reguladores negativos da resposta ao etileno. Os receptores de etileno existem como famílias de múltiplos membros em plantas, que podem ser divididas em duas subfamílias (fig. 6). Os membros dessas subfamílias contêm três domínios transmembranares conservados perto do N-terminal. A região transmembranar também abrange o sítio de ligação ao etileno e este evento de ligação requer um cofator de cobre (O'malley et al., 2005). Esta região é seguida por um domínio GAF, que pode mediar as interações proteína-proteína (Xie et al., 2006; Gao et al., 2008; Grefen et al., 2008). Então, na porção C-terminal há domínios relacionados a histidina (His) quinases e domínios receptores, os chamados elementos de sinalização 'de dois componentes' comuns à transdução de sinal procariótica (Schaller et al., 2011).

No entanto, existem diferenças entre os membros individuais das subfamílias, por exemplo, na subfamília 1 de Arabidopsis o receptor ETR1 contém um domínio receptor mas o ERS1 não. Similarmente, os receptores ETR2 e EIN4 da subfamília 2 têm domínios receptores mas o ERS2 não. Além disso, apesar de todos os receptores da subfamília 2 divergirem nos domínios de His-quinase, onde essas divergências ocorrem variam entre os receptores. Em particular, o EIN4 reteve o His conservado para a fosforilação, enquanto os outros membros da subfamília 2 não, sendo este receptor um dos focos de nossa pesquisa. As diferenças de sequência e domínio entre os receptores sugerem que estes podem exercer diferentes funções, desempenhando papéis mais individualistas na transdução do sinal de etileno (Shakeel et al., 2013).

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Figura 6. As estruturas dos domínios dos receptores de etileno de Arabidopsis thaliana.

Fonte: Wen et al., 2015.

Resumidamente, na ausência de etileno os receptores ativam CTR1, uma Ser/Thr-quinase que fosforila EIN2, uma proteína ligada ao RE com similaridade aos transportadores de íon metálico Nramp (Alonso et al., 1999). Esta é mantida em um estado inativo quando fosforilada por CTR1. Na ligação do etileno os receptores inativam o CTR1 aliviando assim a supressão nos elementos de sinalização a jusante. Como resultado, o EIN2 é processado proteoliticamente de forma que seu domínio C-terminal seja liberado para migrar para o núcleo. No núcleo, o EIN2 ativa direta ou indiretamente os fatores de transcrição EIN3 e EIN3 like1 (EIL1) para iniciar a resposta transcricional ao etileno.

O etileno coordena vários processos durante o amadurecimento em frutos climatéricos desencadeando modificações na cor do fruto, promovendo a degradação da clorofila e carotenóides e biossíntese de flavonoides; na textura dos frutos, via alteração de células de turgor e/ou metabolismo da parede celular; e sabor do fruto, aroma e qualidade nutricional, modificando açúcares de frutas, ácidos e perfis voláteis (Giovannoni, 2004).

Sagio et al. (2013) mostraram que a taxa de etileno e a expressão do gene CaACO aumentou nos estádios finais de desenvolvimento do fruto no Cultivar Catucaí, sugerindo a participação desde hormônio também no amadurecimento do fruto de café. Em outro trabalho, foi realizada uma análise de expressão ao longo do desenvolvimento do fruto em C. arabica de genes que codificam proteínas relacionadas a biossíntese e sinalização de etileno (Sagio et

al., 2014). Entre eles os putativos receptores de etileno CaETR1 (AtETR1) e CaETR4

(AtETR2) foram avaliados. CaETR1, que pertence a subfamília 1 apresentou apenas pequenas alterações na expressão durante o amadurecimento dos frutos, no entanto CaETR4, que