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(1)CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ATIVIDADE DE ISOLADOS DE Bacillus thuringiensis (BERLINER) PARA AS BROCAS DA CANA-DE-AÇÚCAR Diatraea saccharalis (FABR.) E Diatraea flavipennella (BOX) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) por LILIANE MARQUES DA SILVA (Sob Orientação do Professor Herbert Álvaro Abreu de Siqueira) RESUMO A bactéria Bacillus thuringiensis (Berliner) apresenta características essenciais no controle de insetos-praga, tais como seu modo de ação, especificidade e seletividade. Dessa forma, esta pesquisa objetivou avaliar a atividade tóxica de isolados de B. thuringiensis em larvas de Diatraea saccharalis (Fabr.) e Diatraea flavipennella (Box) e caracterizar quanto à presença de gene de toxinas os isolados tóxicos. Estas pragas foram mantidas em dieta artificial. Foram utilizados 24 isolados, preservados em meio LB, glicerol a 15% e SDS a 0,02% e mantidos a -80ºC. Para caracterização molecular foram utilizados iniciadores gerais e específicos. Nos testes de patogenicidade com D. saccharalis e D. flavipennella, 16 e 18 isolados mostraram-se ativos, respectivamente. Os valores de CL50 entre os isolados para a população de D. saccharalis variaram entre 0,08 x 105 (LIIT-0105) e 4104 x 105 (LIIT-2707) esporos + cristais/mL. O isolado LIIT-0105 foi 18,59 e 4382 vezes mais tóxico que o Btk e Btt, respectivamente. Para D. flavipennella, os valores de CL50 entre os isolados variaram entre 0,40 x 105 (LIIT-2707) e 542,75 x 105 (LIIT-2109) esporos + cristais/mL. O isolado LIIT-2707 foi 11,52 e 1137 vezes mais tóxico que o Btk e Btt, respectivamente. O isolado LIIT-0105 que teve a menor CL50 para D. saccharalis apresentou os genes cry1, cry2, cry8, cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1, cry2Ab2 e cry9C e para D. flavipennella o isolado LIIT-2707 apresentou a menor CL50 amplificando para os genes. i.

(2) cry1, cry2, cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1 e cry2Ab2. Os resultados sugerem que isolados de B. thuringiensis apresentam grande potencial e variabilidade para bioprospecção desta bactéria, para o desenvolvimento de produtos ou transformação de plantas que expressem genes de Bt para o controle de D. saccharalis e D. flavipennella.. PALAVRAS-CHAVE: Bioinseticida, patogenicidade, isolados, bactéria, inseto, Lepidoptera, broca da cana-de-açúcar.. ii.

(3) ACTIVITY AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF Bacillus thuringiensis (BERLINER) ISOLATES TO THE SUGARCANE BORERS Diatraea saccharalis (FABR.) AND Diatraea flavipennella (BOX) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) by LILIANE MARQUES DA SILVA (Under the direction of Professor Herbert Álvaro Abreu de Siqueira) ABSTRACT The bacterium Bacillus thuringiensis (Berliner) presents remarkable aspects for the control of insect pests, such as its mode of action, specificity and selectivity. Thus, this study aimed to evaluate the toxic activity of B. thuringiensis isolates in larvae of Diatraea saccharalis (Fabr.) and Diatraea flavipennella (Box) and determine the toxin gene contents for the very active isolates. The insects were maintained on artificial diet. Twenty four isolates were used, which were preserved in LB medium, 15% glycerol and 0.02% SDS and kept at 80 ° C. General and specific primers were used to survey for toxin genes. In pathogenicity tests with D. saccharalis and D. flavipennella, 16 and 18 isolates showed activity toward borers, respectively. The LC50 values among isolates for the population of D. saccharalis ranged from 0.08 x 105 (LIIT-0105) and 4104 x 105 (LIIT-2707) crystals + spores/mL. The isolated LIIT-0105 was 4,382 and 18.59 times more toxic than Btk and Btt, respectively. For D. flavipennella, the LC50 values between isolates ranged from 0.40 x 105 (LIIT-2707) and 542.75 x 105 (LIIT-2109) crystals + spores/mL. The isolate LIIT-2707 was 1,137 and 11.52 times more toxic than Btk and Btt, respectively. The isolate LIIT-0105 presented the lowest LC50 for D. saccharalis that harbored the genes cry1, cry2, cry8 cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1, cry2Ab2, cry9C. For the borer D.. iii.

(4) flavipennella, the isolated LIIT-2707 presented the lowest LC50 and the following genes cry1, cry2, cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1 and cry2Ab2 were amplified. The results suggest that B. thuringiensis isolates present a great variability of genes for bioprospection, and thus potential for developing new products and insertion on plants to express Bt genes for the control of D. saccharalis and D. flavipennella.. KEY WORDS: Bioinsecticide, pathogenicity, isolates, bacteria, insect, Lepidoptera, sugarcane borer.. iv.

(5) CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ATIVIDADE DE ISOLADOS DE Bacillus thuringiensis (BERLINER) PARA AS BROCAS DA CANA-DE-AÇÚCAR Diatraea saccharalis (FABR.) E Diatraea flavipennella (BOX) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE). por. LILIANE MARQUES DA SILVA. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Entomologia Agrícola, da Universidade Federal Rural de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Entomologia Agrícola.. RECIFE - PE Fevereiro - 2013. v.

(6) CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ATIVIDADE DE ISOLADOS DE Bacillus thuringiensis (BERLINER) PARA AS BROCAS DA CANA-DE-AÇÚCAR Diatraea saccharalis (FABR.) E Diatraea flavipennella (BOX) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE). por. LILIANE MARQUES DA SILVA. Comitê de Orientação: Herbert Álvaro Abreu de Siqueira - UFRPE Edmilson Jacinto Marques - UFRPE. vi.

(7) CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ATIVIDADE DE ISOLADOS DE Bacillus thuringiensis (BERLINER) PARA AS BROCAS DA CANA-DE-AÇÚCAR Diatraea saccharalis (FABR.) E Diatraea flavipennella (BOX) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE). por. LILIANE MARQUES DA SILVA. Orientador: Herbert Álvaro Abreu de Siqueira - UFRPE. Examinadores: Maria Cleoneide da Silva - UEMA. Edmilson Jacinto Marques - UFRPE. Valéria Wanderley Teixeira - UFRPE. vii.

(8) DEDICATÓRIA Aos meus pais Lucinéa Maria e Everaldo Marques, que sempre se esforçaram para proporcionar a melhor formação para mim, ao meu marido Filipe Nunes, pelo amor, carinho, paciência e compreensão, as minhas irmãs, Leila Marques e Leilane Marques, a minha tia Célia Maria Correia, a minha sobrinha Maria Cecília, aos meus primos Davi Correia, Barbara Correia e Brenda Correia pelo amor, apoio e compreensão em todos os momentos da minha vida.. viii.

(9) AGRADECIMENTOS A Deus, pois sem Ele nada é possível. À Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), que contribuiu para realização deste curso. Ao CNPq pela concessão da bolsa. A Fiocruz/RJ pelo material de trabalho cedido utilizado nos experimentos. Ao professor Herbert Álvaro Abreu de Siqueira, pela orientação e por ter acreditado e abraçado essa idéia. Ao professor Edmilson Jacinto Marques pela coorientação, apoio e amizade. Ao professor José Vargas de Oliveira, pela amizade, ensinamentos e momentos de descontração. Aos demais professores do Programa de Pós-Graduação em Entomologia Agrícola da UFRPE, pela contribuição na minha formação profissional. À Professora Rosa Mariano pela confiança no uso do Laboratório de Fitopatologia Molecular (UFRPE). Ao meu amigo de graduação Josué Buarque que sempre esteve ao meu lado me dando força e apoio em todas as minhas decisões. A minha grande amiga Nicolle Ribeiro pelo companheirismo e amizade. A Suzana Maria, Rebeka Alves e Flávia Gomes pela amizade e ajuda imensurável durante a realização dos experimentos. A Maria Cleoneide da Silva pela amizade e por tudo que me ensinou. Às amigas Cinthia Matias, Ana Paula Fonseca, Eliana Passos, Ellen Valente, Jennifer Guimarães, Glaucilane Cruz, pelo apoio e momentos de descontração no laboratório.. ix.

(10) Aos Amigos de turma Auridete Oliveira, Mauricéia Fidelis, Cynara Moura, Paulo Roberto, Wagner Melo, Débora Lima, Itíllio Pontes, Jefferson Elias, Wellington Marques, Mariana Oliveira, Douglas Barbosa, Mateus Campos, Cleiton Araújo. Aos Amigos Martin Duarte, Agna Rita, Eduardo Barros, Felipe Colares, Alice Maria, Alberto Belo, Tadeu Martins, Flávia Born, Mário Jorge, Lucas Souza, Maurício Silva, Andresa Cristina, Lílian Ribeiro, Solange Maria, Aline Nascimento, Sérgio Alves, Carlos Henrique. A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.. x.

(11) SUMÁRIO Página AGRADECIMENTOS ..................................................................................................................ix CAPÍTULOS 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 01 1.1 Características gerais de Bacillus thuringiensis ................................................ 02 1.2 Modo de ação das proteínas Cry de Bacillus thuringiensis a insetos................ 04 1.3 A utilização de Bacillus thuringiensis na agricultura........................................ 08 1.4 Cultura de cana-de-açúcar ................................................................................. 09 1.5 Diatraea saccharalis (Fabr.) e Diatraea flavipennella (Box)........................... 11 1.6 Manejo das brocas comuns da cana-de-açúcar ................................................. 13 LITERATURA CITADA ........................................................................................... 15. 2. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ATIVIDADE DE ISOLADOS DE Bacillus thuringiensis (BERLINER) PARA AS BROCAS DA CANA-DEAÇÚCAR Diatraea saccharalis (FABR.) E Diatraea flavipennella (BOX) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE) ......................................................................... 23 RESUMO ................................................................................................................ 24 ABSTRACT ............................................................................................................ 25 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 26 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 28 RESULTADOS ....................................................................................................... 33 DISCUSSÃO ........................................................................................................... 37 AGRADECIMENTOS ............................................................................................ 41 LITERATURA CITADA ........................................................................................ 41. xi.

(12) CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO A utilização da bactéria Bacillus thuringiensis (Berliner) como bioinseticida e a transgenia com suas toxinas tem sido uma alternativa viável e econômica para o controle de insetos na agricultura, este bioinseticida é facilmente obtido em larga escala e de fabricação menos onerosa que a dos inseticidas químicos tradicionais (Schnepf et al. 1998). Essa bactéria B. thuringiensis apresenta características essenciais no controle de insetos-praga, tais como seu modo de ação, especificidade e seletividade (Glare & O’Callaghan 2000, Karim et al. 2000, Bobrowski et al. 2003, Polanczyk & Alves 2003, Bravo et al. 2007). Entretanto, assim como os inseticidas convencionais, que comumente são aplicados de maneira inadequada propiciando a ocorrência de resistência dos insetos, os bioinseticidas a base de B. thuringiensis e as plantas geneticamente modificadas com essa bactéria, devem ser manejados corretamente para evitar a ocorrência de novos casos de resistência e efeitos indesejáveis aos inimigos naturais (Gould et al. 2002, Tabashnik et al. 2008). O controle de pragas na agricultura é um fator limitante e resulta no aumento do custo de produção, trazendo problemas tanto para o produtor quanto para o consumidor e o ambiente (de Maagd et al. 2001). O custo para o desenvolvimento de inseticidas químicos é alto e tem aumentado ao longo dos anos devido à necessidade de novas moléculas e formulações mais adequadas, o que tem feito crescer o interesse por inseticidas alternativos, como os bioinseticidas que são mais baratos no desenvolvimento, mais específicos e menos poluentes (Almeida & Batista Filho 2001).. 1.

(13) 1.1 Características gerais de Bacillus thuringiensis A bactéria Bacillus thuringiensis foi descoberta no início do século XX e a partir da década de 20 começou a ser produzida em grandes quantidades visando o controle de insetos (Federici 2005). B. thuringiensis é uma bactéria gram-positiva, aeróbica facultativa, mesófila e quimioheterotrófica (Arantes et al. 2002). Esta possui forma de bastonete de aproximadamente 1,1 µm de largura por 4,0 µm de comprimento, sendo capaz de se movimentar devido à presença de flagelos peritríquios (Habib & Andrade 1998, Bobrowski et al. 2003). A distribuição dessa bactéria é bem ampla, ocorrendo em locais como solo, produtos estocados, plantas, alguns lugares mais raros como pássaros, morcegos e lagos (Bernhard et al. 1997), insetos mortos e vivos (Villas-Bôas et al. 1998, Suzuki et al. 2004). Durante seu desenvolvimento, B. thuringiensis passa por duas fases, a fase vegetativa e a estacionária, semelhantes ao desenvolvimento de Bacillus subtilis. A primeira fase caracterizase pelo crescimento exponencial das células de B. thuringiensis, momento em que há grande disponibilidade de nutrientes no meio, já a fase estacionária ocorre quando o meio se torna hostil e a bactéria adapta-se à diminuição de nutrientes através de mecanismos genéticos. A expressão dos genes cry de B. thuringiensis geralmente ocorre na fase estacionária da célula, acumulando seu produto na célula mãe, a qual é liberada no meio ao final da esporulação (Lereclus et al. 2000). Simultaneamente ao processo de esporulação, ocorre a produção de uma inclusão cristalina, também chamada de cristal protéico, constituído de proteínas Cry, “mnemônico” do inglês “Crystal”. Esta inclusão pode representar cerca de 25% do peso seco de células já esporuladas (Agaisse & Lereclus 1995). Esses autores relataram que apesar da expressão dos genes cry estarem estreitamente relacionada ao evento da esporulação, existem genes cry que são expressos independentemente da esporulação (Pinto et al. 2009).. 2.

(14) Estes polipeptídios são denominados de δ-endotoxina e característicos de cada variedade de B. thuringiensis, que podem apresentar peso molecular entre 40 e 140 kDa. Silva et al. (2012) analisaram o perfil protéico de vinte isolados de B. thuringiensis ativos contra Plutella xylostella (L.) e Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) e a maioria dos isolados (85%) apresentou bandas próxima a 130 kDa similar aos padrões Bt var. kurstaki e Bt var. aizawai, observando ainda em 50% dos isolados bandas entre 65 e 70 kDa. Além das toxinas “Cry”, que apresentam toxicidade a fase jovem de coleóptera, díptera, lepidóptera, ortóptera, nematóides, ácaros e protozoários (Feitelson et al. 1992, Souza et al. 1999, de Maagd et al. 2003), outras toxinas como as VIP (Vegetative Insecticidal Proteins) que são secretadas para o meio durante a fase vegetativa de crescimento (Estruch et al. 1996) e Cyt (citolíticas) também apresentam atividades a insetos da ordem Lepidoptera e Diptera, respectivamente (Höfte & Whitheley 1989, de Maagd et al. 2003, Kurtz et al. 2007). As proteínas Cyt podem interagir com as proteínas Cry para sinergizar os seus efeitos, contra determinadas espécies de mosquitos e borrachudos (Butko 2003, Soberón et al. 2007, Federici et al. 2010). Mais de 700 genes de proteínas Cry foram sequenciados e as proteínas Cry classificadas em 72 grupos (cry 1-cry 72), a partir de diferentes cepas de B. thuringiensis (Crickmore et al. 2013). Esse entomopatógeno também produz outros fatores de virulência, como as βexotoxinas, α-exotoxinas, hemolisinas, enterotoxinas, quitinases e fosfolipases (Habib & Andrade 1998, Hansen & Salamitou 2000, Liu et al. 2002, Arora et al. 2003). Estudos detalhados sobre estas proteínas e modo de ação permitiram identificar que cada uma pode apresentar atividade contra uma determinada ordem de insetos (Crickmore et al. 1998, Silva-Werneck et. al. 2000). As proteínas tóxicas para lepidópteros em geral pertencem ao grupo Cry1, Cry2 e Cry9, as proteínas ativas a coleópteros são Cry3, Cry7 e Cry8, assim. 3.

(15) como Cry1B e Cry1I, a qual tem dupla atividade. As proteínas Cry5, Cry12, Cry13 e Cry14 possuem atividade nematicida e as proteínas Cry2, Cry4, Cry10, Cry11, Cry16, Cry17, Cry19 e Cyt são tóxicas para dípteros (Crickmore et al. 2013). Essa caracterização foi baseada em bioensaios contra diferentes larvas de insetos (Bravo et al. 1998).. 1.2 Modo de ação das proteínas Cry de Bacillus thuringiensis a insetos A grande atividade inseticida de B. thuringiensis deve-se às δ-endotoxinas, situadas em corpos paraesporais (cristais), essas proteínas tornam-se tóxicas a insetos, após sua ingestão e solubilização, no intestino médio das larvas (Bravo 1997). Eles são produzidos no segundo estágio de esporulação, durante a formação de esporos. Após a ingestão por insetos suscetíveis, os cristais são dissolvidos em meio levemente ácido (coleópteros) ou alcalino (lepidópteros e dípteros) do intestino médio do inseto e as protoxinas são liberadas. As proteases do intestino desdobram as protoxinas, produzindo uma proteína ativada de tamanho menor. A principal protease digestiva de lepidópteros e dípteros é a serino-protease, enquanto nos coleópteros ocorre principalmente cisteíno-protease e aspartato-proteases (de Maagd et al. 2001). Após ativação pelas proteases, a toxina usualmente atravessa a matriz peritrófica e ligase a receptores específicos presentes nas microvilosidades apicais das células epiteliais do intestino médio (Schnepf et al. 1998). Após a ligação com o receptor, a toxina forma poros que interferem no transporte de íons pela membrana das células, causando a lise do epitélio do intestino médio. Isto, consequentemente, interrompe a osmoregularidade das células, levando o pH do lúmen até a neutralidade, favorecendo a germinação dos esporos que acarretará em septicemia e morte do inseto (Schnepf et al. 1998). A inibição da alimentação pode ocorrer logo após a ingestão do esporo e da toxina de B. thuringiensis, levando ao desencadeamento. 4.

(16) mais rápido do processo de intoxicação do inseto (Schnepf et al. 1998, Monnerat & Bravo 2000, de Maagd et al. 2003). Perda do apetite, abandono do alimento, paralisia do intestino, vômito, diarréia, paralisia total e, finalmente, a morte (Aronson et al. 1986) são sintomas observados a partir do momento em que insetos suscetíveis ingerem os cristais e esporos de B. thuringiensis. Perdem sua agilidade e o tegumento adquire tonalidade de cor marrom-escura. Após a morte, o tegumento apresenta cor negra, característica das infecções provocadas por este microrganismo (Habib & Andrade 1998, Monnerat & Bravo 2000). Em geral, as endotoxinas possuem alto grau de similaridade e apresentam três domínios: I, II e III, sugerindo similar modo de ação. O domínio I (terminal-N) é constituído por um feixe de sete α-hélices, em que a α-hélice 5 é hidrofóbica e circundada por 6 hélices anfipáticas. O domínio II é formado por três folhas β-antiparalelas e o domínio III (terminal-C) consiste de duas folhas β-antiparalelas formando um β-sanduíche. O domínio I está envolvido na inserção da proteína na membrana e na formação do poro, enquanto que os domínios II e III estão envolvidos no reconhecimento e ligação ao receptor (de Maagd et al. 2001, Bravo et al. 2007). Acredita-se que o domínio III esteja também fortemente envolvido na formação de poros (Schnepf et al. 1998). Até o final do século passado, a sequência de eventos que leva à morte do inseto a partir da ingestão de toxinas Cry pareceu relativamente simples e bem compreendida, pelo menos em termos gerais (Rajamohan et al. 1998, Schnepf et al. 1998). A presença de tais poros na membrana plasmática interfere com a fisiologia da célula por eliminar gradientes iônicos transmembranares e pode conduzir a lise das células devido ao influxo massivo de solutos a partir do lúmen do intestino médio (Knowles & Ellar 1987). Segundo Vachon et al. (2012), muitos detalhes deste esquema, o que pode ser considerado como o modelo ''clássico'' de modo de ação de Bt, no entanto, permanecem sem. 5.

(17) solução. Por exemplo, a estrutura dos poros formados pelas toxinas e os mecanismos pelos quais eles se agregam na membrana não foram completamente elucidados. A pesquisa sobre o modo de ação de toxinas Cry tem sido dominado nos últimos anos por dois modelos, o modelo sequencial de ligação, que propõe uma sequência complexa de eventos que envolvem receptores múltiplos, numa tentativa de explicar o mecanismo de formação de poros (Gómez et al. 2002, Bravo et al. 2004, Pacheco et al. 2009) e o modelo via de sinalização, sugerindo que a formação de poros não desempenha um papel essencial (Zhang et al. 2005, 2006). Segundo a versão inicial do modelo sequencial de ligação, uma vez ativado por proteases intestinais, a toxina se liga ao receptor caderina. Isto provoca uma alteração conformacional que favorece uma clivagem proteolítica, no nível do resíduo F50, localizado dentro do ciclo ligando as hélices α-1 e α-2, as primeiras hélices na extremidade N-terminal do domínio de formação de poros da molécula de toxina (Gómez et al. 2002). Subsequentemente, a remoção da hélice α-1 permite a oligomerização do resto da toxina e a formação de uma estrutura chamada de pré-poro (Gómez et al. 2002). Este oligômero, em seguida, liga-se ao receptor aminopeptidase (Bravo et al. 2004). Finalmente, a ligação à aminopeptidase favorece a inserção da estrutura pré-poro na membrana resultando na formação do poro (Vachon et al. 2012). Foram feitos estudos com toxinas Cry selvagens e modificadas (sem a hélice α-1) em lepidópteros e verificaram que não houve diferença nas etapas secundárias do modo de ação, e o que ocorrem após a interação com os receptores da caderina como oligomerização, ligação ao receptor e a formação de poros são semelhantes na Cry1AbMod e Cry1Ab do tipo selvagem, como mostrado no trabalho de Muñoz-Garay et al. (2009), onde essas foram igualmente tóxicas a larvas suscetíveis de Manduca sexta (L.).. 6.

(18) Um estudo recente (Tabashnik et al. 2011) forneceu uma demonstração convincente de que a diferença entre a atividade destas toxinas modificadas e do tipo selvagem não é simplesmente atribuível para a possibilidade das toxinas modificadas (sem a hélice α-1), poderem funcionar sem a necessidade de interagir com o receptor caderina. Neste estudo, Cry1AbMod e Cry1AcMod foram testadas contra diversos insetos resistentes a Cry1Ab e Cry1Ac e verificou-se ter uma atividade melhorada, em relação às toxinas do tipo selvagem, contra alguns insetos em que a resistência não está relacionada a uma mutação que afeta o receptor de caderina. Além disso, essas toxinas modificadas e selvagens tiveram potências comparáveis contra os insetos de linhagens resistentes com os receptores de caderina alterados. De acordo com o modelo via de sinalização, a citotoxicidade é mediada pela ligação específica da toxina de Bt com os seus receptores de caderina. A ligação específica de uma toxina ativa com os receptores caderina é suficiente para matar a célula, ressaltando o fato de que a interação das toxinas com células sensíveis, sem dúvida, tem consequências importantes no metabolismo celular e sua regulação (Zhang et al. 2005, 2006). O modelo de via de sinalização não é facilmente sustentável, especialmente por eliminar a formação de poros no mecanismo de ação de toxinas Bt o qual demostra capacidade para permeabilizar eficientemente a membrana alvo no epitélio do intestino médio de insetos (Vachon et al. 2012). Durante os últimos anos, o modelo de via de sinalização e, mais importante, o modelo sequencial de ligação atraíram considerável atenção. No entanto, uma avaliação cuidadosa dos dados disponíveis revela que infelizmente ambos os modelos são suportados por pouca evidência experimental (Vachon et al. 2012). Por outro lado, com relação à sinalização intracelular, vários caminhos parecem ser ativados em células suscetíveis às toxinas Cry, mas os mecanismos pelos quais estas vias. 7.

(19) contribuem para a patogênese ou proteção contra os efeitos prejudiciais das toxinas permanecem praticamente inexplorados. Por fim, o modelo clássico proposto nas décadas de 80 e 90 continua a ser o quadro disponível mais válido para orientar estudos futuros visando a elucidação do modo de ação das toxinas e de ação do B. thuringiensis (Vachon et al. 2012).. 1.3 A utilização de Bacillus thuringiensis na agricultura Os inseticidas biológicos, utilizados há mais de 50 anos, são alternativas práticas para o controle mais seletivo de insetos pragas, que inclui, principalmente, o emprego de microorganismos (Monnerat & Bravo 2000, Cardénas et al. 2001, Bobrowski et al. 2003). São conhecidos muitos microrganismos entomopatogênicos, especialmente fungos, vírus e bactérias, que podem ser empregados no controle biológico de insetos pragas (Valadares-Inglis et al. 1998). Dentre os organismos entomopatogênicos, o B. thuringiensis tem sido considerado o principal agente. Ele é o inseticida biológico mais produzido e comercializado no mundo, usado como agente de controle de pragas (Vega 1999, Alam 2000). A eficácia e a especificidade das cepas dessa bactéria e suas toxinas no controle de insetos pragas possibilitaram o desenvolvimento de formulações de biopesticidas à base deste patógeno. Atualmente, mais de 200 formulações têm sido colocadas no mercado mundial, sendo responsáveis por mais de 97% do faturamento dos bioinseticidas (Polanczyk et al. 2008). Apesar do extenso uso de B. thuringiensis, algumas características ainda limitam a sua aplicação, como à perda de estabilidade, à ausência de translocação nas plantas, o espectro limitado de ação, a degradação rápida pela ação da luz ultravioleta (Navon 2000) e a incapacidade de controlar pragas que se alojam no interior das plantas (Sales & Baldani 1998), como as brocas da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis e Diatraea flavipennella.. 8.

(20) A seleção de novos isolados de B. thuringiensis e, consequentemente, a descoberta de novas proteínas com atividade inseticida é uma forma de incrementar o manejo da resistência, pois possibilita o desenvolvimento de bioinseticidas e cultivares com maior potencial de resistência através dos avanços na engenharia genética, com a introdução de genes codificadores das proteínas tóxicas aos insetos-praga no genoma da planta (Stewart et al. 2001, Bobrowski et al. 2003, Escudero et al. 2004).. 1.4 Cultura de cana-de-açúcar A cana-de-açúcar, Saccharum spp. (L.) é uma monocotiledônea de origem asiática pertencente à família Poaceae. A teoria mais aceita é que ela tenha origem na Polinésia. Desde os tempos mais remotos ela vem sendo utilizada como alimento. Essa cultura foi introduzida no Brasil em 1502, sendo considerada de grande importância no âmbito socioeconômico, devido a sua matéria prima na produção de alimento (Mendonça 1996). No Brasil, com a colonização portuguesa, caracterizou-se como umas das primeiras culturas introduzidas no país com fins lucrativos (Lucchesi 2001). A cana-de-açúcar hoje é cultivada nos dois hemisférios. Atualmente, o Brasil destaca-se como o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo seguido da Índia, China, Tailândia, Paquistão, México, Filipinas, Austrália, EUA e Argentina (FAOSTAT 2013). A ação de pragas causa grande redução dos rendimentos agroindustriais da cultura de cana-de-açúcar. A produção está concentrada principalmente no Centro-Sul do país e o Estado de São Paulo é o principal centro de produção com 51,87% (4.419,46 mil hectares), seguido por Goiás com 8,52% (725,91 mil hectares), Minas Gerais com 8,47% (721,86 mil hectares), Paraná com 7,17% (610,83 mil hectares), Mato Grosso do Sul com 6,37% (542,70 mil. 9.

(21) hectares), Alagoas com 5,23% (445,71 mil hectares) e Pernambuco com 3,84% (327,61 mil hectares). Nos demais estados produtores as áreas são menores, com representações abaixo de 3% (CONAB 2013). Segundo levantamento da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB 2013), a previsão do total de cana moída na safra 2012/13 é de 595,13 milhões de toneladas, com aumento de 6,2% em relação à safra 2011/12, que foi de 560,36 milhões de toneladas, significando que a quantidade que será moída deve ser 34,76 milhões de toneladas a mais que na safra anterior. A produção de cana-de-açúcar da Região Centro-Sul deve ser de 535,43 milhões de toneladas, 8,2% maior que a produção da safra anterior. A produção total de açúcar está estimada em 37,66 milhões de toneladas, 4,72% a mais que na safra anterior. A produção de etanol é estimada em 23,62 bilhões de litros, 5,22% menor que a produção da safra 2011/12. Deste total, 9,66 bilhões de litros serão de etanol anidro e 13,96 bilhões de litros serão de etanol hidratado. Um dos fatores que limita a produtividade da cana-de-açúcar é a ocorrência de pragas que ocasionam perdas, quer pela redução de cana disponível para moagem, quer pela diminuição de açúcar por tonelada de cana. Entre as pragas de maior importância nos canaviais de Pernambuco destacam-se a broca gigante Telchin (Castnia) licus licus (Drury), as brocas Diatraea spp. e a cigarrinha da folha Mahanarva posticata (Stal.) (Lima & Marques 1985, Mendonça 1996). No Brasil, D. saccharalis e D. flavipennella infestam a cana-de-açúcar, sendo a primeira de distribuição generalizada em todo o país, enquanto a segunda restringe-se apenas aos canaviais dos Estados do Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, e no Norte e Nordeste do país (Mendonça et al. 1996, Pinto 2006).. 10.

(22) 1.5 Diatraea saccharalis (Fabr.) e Diatraea flavipennella (Box) Vinte e uma espécies desse inseto estão distribuídas nos canaviais do Continente americano. A cana-de-açúcar apresenta-se vulnerável as espécies de Diatraea, durante todo o seu desenvolvimento, ocorrendo uma menor incidência quando a cana é jovem, aumentando consideravelmente o seu ataque com o crescimento da planta (Macedo & Botelho 1988). A espécie D. saccharalis é considerada uma das principais pragas da cana-de-açúcar nas Américas e D. flavipennella no Brasil, cujas lagartas provocam injúrias diretas devido ao hábito de perfurar a cana jovem, causando a morte da gema apical, conhecido como “coração morto”, enquanto que na cana adulta provoca brotações laterais, enraizamento aéreo, atrofiamento dos entrenós e tombamento, reduzindo assim, a produção agrícola e industrial (Mendonça 1996). As injúrias indiretas são consideráveis, pois ao penetrar no colmo, as lagartas formam galerias por onde penetram fungos que causam a podridão vermelha Colletotrichum falcatum (Went) e Fusarium moniliforme (Sheldon). Estes fungos invertem a sacarose, diminuindo a pureza do caldo e o rendimento em açúcar (Botelho & Macedo 2002, Gallo et al. 2002). As brocas da cana-de-açúcar apresentam desenvolvimento holometabólico, ou seja, passam pelas fases de ovo, larva, pupa e adulto (Botelho & Macedo 2002). Em campo, as fêmeas ovipositam em média 430 ovos, sendo frequentemente depositados nas folhas ainda verdes, tanto na face superior como inferior do limbo foliar e, ocasionalmente, na bainha. São de formato oval e achatado, sendo depositados em grupos de forma imbricada e se assemelha a escama de peixe ou couro de cobra. Quando os embriões estão desenvolvidos, os ovos adquirem forma elíptica e coloração amarelada, tornando-se escuros, quando são visíveis as cápsulas cefálicas das lagartas no interior dos mesmos (Botelho 2007, Freitas et al. 2007). Após a eclosão, as lagartas neonatas se deslocam de uma folha a. 11.

(23) outra, penduradas por fio de seda, alimentando-se inicialmente do parênquima foliar, fazendo galerias na nervura central. Depois de efetuarem as primeiras ecdises, penetram no colmo, procurando as partes mais moles, na base do cartucho ou na região das gemas (Mendonça et al. 1996, Freitas et al. 2007). A lagarta de D. saccharalis apresenta coloração branca leitosa com pontuações marrons dispostas uniformemente formando linhas no dorso e sua cápsula cefálica é marrom-escura, enquanto que a D. flavipennella apresenta coloração amarelada com manchas castanhas dispostas de forma desuniforme, sem formação de linhas no dorso e sua cápsula cefálica possui cor amarelada ou marrom amarelada (Mendonça 1996). Possuem três pares de pernas torácicas, quatro pares de falsas pernas abdominais e um par de falsas pernas anais. Quando completamente desenvolvida, mede cerca de 25 mm (Botelho & Macedo 2002). Próximo à pupação, a lagarta abre um orifício na casca e o fecha parcialmente com fios de seda e os restos de sua alimentação e, assim protegida, passa à fase de pupa. A pupa livre é inicialmente de coloração marrom-claro, escurecendo à medida que se aproxima do estágio adulto. Quando emerge o adulto, este é de coloração amarelo-palha com manchas escuras nas asas anteriores, lembrando dois “Vs” invertidos quando fechadas para D. saccharalis e totalmente parda para D. flavipennella. As asas posteriores são brancas. Há diferenças entre sexo, sendo a fêmea maior, normalmente, apresentando abdome volumoso, o macho apresenta como característica principal a presença de uma concentração de cerdas no último par de pernas, ausentes na fêmea (Botelho & Macedo 2002). O seu ciclo biológico em laboratório tem duração média de 65 dias, no qual o período de maturação dos ovos tem a duração média de 8,35 dias, o período de larva 34,87 dias, de pupa 12,75 e adultos 9,17 dias. Neste caso, os ovos, as pupas e os adultos foram mantidos a uma. 12.

(24) temperatura de 22 ± 1°C, 70 ± 10% de umidade relativa e fotoperíodo de 12 h e as larvas a 26 ± 1°C, 80 ± 10% de umidade relativa e fotoperíodo de 12 h (Freitas et al. 2007).. 1.6 Manejo das brocas comuns da cana-de-açúcar O manejo integrado das brocas da cana-de-açúcar vem sendo realizado, utilizando-se principalmente o controle biológico, com parasitoides multiplicados em laboratório e liberados no campo. Os parasitoides larvais das brocas são os mais utilizados como método de controle no Brasil e no mundo (Pinto et al. 2006). O controle biológico de Diatraea spp. com o parasitoide larval Cotesia flavipes (Cam.) tem sido empregado desde 1974 no Brasil através da criação e liberações inundativas em canaviais infestados (Mendonça et al. 1996). Apesar da ampla utilização deste parasitoide para o controle de Diatraea spp. observa-se nos canaviais nordestinos uma predominância da espécie D. flavipennella (Freitas et al. 2006). Geralmente, este método apresenta custos iniciais muito altos, além da necessidade de estrutura para produção dos agentes de controle. Com o advento de tecnologias como a transgenia, particularmente com toxinas de B. thuringiensis, a possibilidade de um controle mais efetivo é uma realidade. A utilização de inseticidas químicos para o controle das brocas da cana-de-açúcar não é recomendada devido aos prejuízos ambientais provocados, e pela forma de aplicação dos mesmos na lavoura, que torna difícil sua penetração no interior dos colmos onde as lagartas provocam os maiores prejuízos. Devido a essas restrições e a necessidade de alternativas seguras aos inseticidas químicos, tem ocorrido um aumento no interesse pelos inseticidas biológicos para o controle dessas pragas (Gitahy et al. 2006). Com a clonagem e a caracterização de um gene de B. thuringiensis codificador de uma proteína responsável pela atividade tóxica a insetos (Schnepf & Whiteley 1981), novas. 13.

(25) perspectivas do uso desta bactéria e de suas proteínas inseticidas foram vislumbradas. A possibilidade de se introduzir os genes de B. thuringiensis codificadores das toxinas nos genomas dos vegetais, tem permitido a expressão contínua das proteínas em todos os tecidos da planta e atingindo, assim, apenas os insetos pragas que se alimentam dos tecidos (de Maagd et al. 1999). A importância de se identificar novas toxinas de B. thuringiensis é devida a um significativo número de pragas ainda não controladas por proteínas Cry (Bravo et al. 1998), bem como pela possibilidade do aparecimento de populações resistentes a essa proteína em produtos formulados. Aplicações intensivas destes produtos de B. thuringiensis têm exercido forte pressão de seleção, resultando no aparecimento de populações de insetos resistentes em diversos locais do mundo (Ferré et al. 1991, Wright et al. 1997, Frutos et al. 1999, Sayyed & Wright 2001, Ferré & Van Rie 2002, Heckel et al. 2007), levando à perda da efetividade das estirpes de B. thuringiensis existentes no mercado em alguns locais. A D. saccharalis é particularmente muito suscetível a algumas delta-endotoxinas. Contudo, população resistente de D. saccharalis a toxina Cry1Ab tem sido selecionada após identificação de pais carreando gene de resistência através da geração F2 (Huang et al. 2007). Isto mostra que a evolução da resistência em campo nesta espécie é provável em campo de transgênicos, se não forem estabelecidos programas de manejo. No Brasil, vários trabalhos têm sido realizados com o objetivo de obter isolados de B. thuringiensis de várias regiões (Valicente & Barretos et al. 2003, Polanczyk et al. 2004, Gobatto et al. 2010, Silva et al. 2012). No Nordeste, porém, os levantamentos têm sido muito restritos aos Bacillus com atividade ao grupo dos insetos vetores de doenças ou poucas amostras têm sido testadas a pragas agrícolas (Silva-Werneck et al. 2000, Vilas-Bôas & Lemos. 14.

(26) 2004, Gobatto et al. 2010). A descoberta de novas toxinas podem ainda representar novas fontes de recursos genéticos para o desenvolvimento de novas tecnologias baseadas em engenharia genética com os genes de toxinas de B. thuringiensis, através da inserção destes em plantas de interesse agrícola. Desta forma, o objetivo desse estudo foi avaliar a patogenicidade a lepidópteros de interesse local e caracterizar os isolados de B. thuringiensis, para aplicação em programas de controle de insetos pragas de importância agrícola.. Literatura Citada Agaisse, H. & D. Lereclus. 1995. How does Bacillus thuringiensis produce so much insecticidal crystal protein? J. Bacteriol. 177: 6027-6032. Almeida, J.E.M. & A. Batista Filho. 2001. Banco de microrganismos entomopatogênicos: biodiversidade para o controle microbiano de pragas. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 20: 30-33. Alam, G. 2000. A study of biopesticides and biofertilisers in Haryana, India. London Gatekeeper. Series 93: 27p. Arantes, O.M.N., L.A. Villas-Bôas & G.T. Villas-Bôas. 2002. Bacillus thuringiensis estratégias no controle biológico, p. 271-291. In L.A. Serafini, N.M. Barros & J.L. Azevedo (eds.), Biotecnologia: avanços na agricultura e na agroindústria. Caxias do Sul, EDUCS, 433p. Aronson, A.I., W. Beckman & P. Dunn. 1986. Bacillus thuringiensis and related insect pathogens. Microbiol. Rev. 50: 1-24. Arora, N., A. Selvapandiyan, N. Agrawal & R.K. Bhatnagar. 2003. Relocating expression of vegetative insecticidal protein into mother cell of Bacillus thuringiensis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 310: 158-162. Bernhard, K., P. Jarrett, M. Meadows, J. Butt, D. J. Ellis, G.M. Roberts, S. Pauli, P. Rodgers & H.D. Burges. 1997. Natural isolates of Bacillus thuringiensis: worldwide distribution, characterization, and activity against insect pests. J. Invertebr. Pathol. 70: 5968. Bravo, A., S.S. Gill & M. Soberón. 2007. Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and potential for insect control. Toxicon 49: 423-435.. 15.

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(33) Vilas-Bôas, G.F.L.T, L.A. Vilas-Bôas, D. Lereclus & O.M.N. Arantes. 1998. Bacillus thuringiensis conjugation under environmental conditions. FEMS Microbiol. Ecol. 25: 369-374. Wright, D. J., M. Iqbal, F. Granero & J. Ferré. 1997. A change in a single midgut receptor in the diamondback moth (Plutella xylostella) is only in part responsible for field resistance to Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki and B. thuringiensis subsp. aizawai. Appl. Environ. Microbiol. 63:1814–1819. Zhang, X., M. Candas, N.B. Griko, R. Taussig & L.A. Bulla. 2006. A mechanism of cell death involving an adenylyl cyclase/PKA signaling pathway is induced by the Cry1Ab toxin of Bacillus thuringiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103: 9897–9902. Zhang, X., M. Candas, N.B. Griko, L. Rose-Young & L.A. Bulla. 2005. Cytotoxicity of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin depends on specific binding of the toxin to the cadherin receptor BT-R1 expressed in insect cells. Cell Death Differ. 12: 1407–1416.. 22.

(34) CAPÍTULO 2 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E ATIVIDADE DE ISOLADOS DE Bacillus thuringiensis (BERLINER) PARA AS BROCAS DA CANA-DE-AÇÚCAR Diatraea saccharalis (FABR.) E Diatraea flavipennella (BOX) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE)1. LILIANE M. SILVA1, HERBERT A.A. SIQUEIRA1, EDMILSON J. MARQUES1, MARIA C. SILVA2, SUZANA M.F.A. SILVA1 & REBEKA C. ALVES1.. 1. Departamento de Agronomia – Entomologia, Rua Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE, Brasil.. 2. Departamento de Química e Biologia – Universidade Estadual do Maranhão, Praça Duque de Caxias, s/n, Morro do Alecrim, 65604-090, Caxias, MA, Brasil.. 1. Silva, L.M., H.A.A. Siqueira, E.J. Marques, M.C. Silva, S.M.F.A. Silva & R.C. Alves. Caracterização molecular e atividade de isolados de Bacillus thuringiensis (Berliner) para as brocas da cana-de-açúcar Diatraea saccharalis (Fabr.) e Diatraea flavipennella (Box) (Lepidoptera: Crambidae). A ser submetido.. 23.

(35) RESUMO - A bactéria Bacillus thuringiensis (Berliner) apresenta características essenciais no controle de insetos-praga, tais como seu modo de ação, especificidade e seletividade. Isolados de Bt foram avaliados quanto ao conteúdo gênico e as suas atividades inseticidas contra Diatraea saccharalis (Fabr.) e Diatraea flavipennella (Box). Bioensaios na concentração 108 (esporos + cristais/mL) de B. thuringiensis foram conduzidos com 24 isolados para D. saccharalis e 23 isolados D. flavipennella e estes analisados por PCR, utilizando-se pares de iniciadores gerais e específicos para identificação de toxinas. Para D. saccharalis e D. flavipennella, 16 e 18 isolados mostraram-se ativos, respectivamente. Os valores de CL50 para a população de D. saccharalis variaram entre 0,08 x 105 (LIIT-0105) e 4104 x 105 (LIIT-2707) esporos + cristais/mL. Para D. flavipennella, os valores de CL50 variaram entre 0,40 x 105 (LIIT-2707) e 542,75 x 105 (LIIT-2109) esporos + cristais/mL. O isolado LIIT-0105 que teve a menor CL50 para D. saccharalis apresentou os genes cry1, cry2, cry8, cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1, cry2Ab2 e cry9C foram amplificados e para D. flavipennella o isolado LIIT-2707 que apresentou a menor CL50, amplificou os genes cry1, cry2, cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1 e cry2Ab2. A atividade e conteúdo gênico de toxinas nesses isolados de B. thuringiensis sugerem uma grande variabilidade com potencial para serem utilizados no desenvolvimento de novos biopesticidas ou transformação de plantas que expressem genes de Bt para o controle destas pragas.. PALAVRAS-CHAVE:. Patogenicidade,. controle. Lepidoptera, broca da cana-de-açúcar. 24. microbiano,. proteínas. Cry,. inseto,.

(36) ACTIVITY AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF Bacillus thuringiensis (BERLINER) ISOLATES TO SUGARCANE BORER Diatraea saccharalis (FABR.) AND Diatraea flavipennella (BOX) (LEPIDOPTERA: CRAMBIDAE). ABSTRACT – The bacterium Bacillus thuringiensis (Berliner) presents remarkable aspects for the control of insect pests, such as its mode of action, specificity and selectivity. Bt isolates were evaluated for their gene content and insecticide activities against Diatraea saccharalis (Fabr.) and Diatraea flavipennella (Box). Bioassays concentration at 108 (spore + crystals/ml) of Bt were conducted with 24 isolates to D. saccharalis and 23 isolates to D. flavipennella and further analyzed by PCR, using general and specific pairs of primers to identify toxins. Sixteen and eighteen isolates were respectively active to D. saccharalis and D. flavipennella. The LC50 values for D. saccharalis ranged from 0.08 x 105 (LIIT-0105) and 4,104 x 105 (LIIT-2707) crystals + spores/mL. The LC50 values ranged from 0.40 x 105 (LIIT-2707) and 542.75 x 105 (LIIT-2109) crystals + spores/mL for D. flavipennella. The isolate LIIT-0105 presented the lowest LC50 for D. saccharalis that harbored the genes cry1, cry2, cry8 cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1C, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1, cry2Ab2, cry9C. For the borer D. flavipennella, the isolated LIIT-2707 presented the lowest LC50 and the following genes cry1, cry2, cry9, cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1D, cry1F, cry1I, cry2A, cry2Aa1 and cry2Ab2 were amplified. The results suggest that B. thuringiensis isolates present a great variability of genes for bioprospection, and thus potential for developing new products and insertion on plants to express Bt genes for the control of these pests.. KEY WORDS: Pathogenicity, microbial control, cry proteins, insect, Lepidoptera, sugarcane borer. 25.

(37) Introdução Atualmente, o Brasil destaca-se como o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo (FAOSTAT 2013). A produção está concentrada principalmente no Centro-Sul do país e o Estado de São Paulo é o principal centro de produção com 51,87% (4.419,46 mil hectares), seguido por Goiás com 8,52% (725,91 mil hectares), Minas Gerais com 8,47% (721,86 mil hectares), Paraná com 7,17% (610,83 mil hectares), Mato Grosso do Sul com 6,37% (542,70 mil hectares), Alagoas com 5,23% (445,71 mil hectares) e Pernambuco com 3,84% (327,61 mil hectares). Nos demais estados produtores as áreas são menores, com representações abaixo de 3% (CONAB 2013). Dentre os fatores bióticos que limitam o desenvolvimento fisiológico da cana-de-açúcar, destacam-se a incidência de insetos-praga, dos quais estão a cigarrinha da folha Mahanarva posticata Stal., cigarrinha-da-raiz Mahanarva fimbriolata Stal.,a broca gigante Telchin licus licus (Drury) e as brocas do gênero Diatraea spp. (Castro & Christoffoletti 2005, Marques et al. 2009). A espécie Diatraea saccharalis (Fabr.) é considerada uma das principais pragas da cana-de-açúcar nas Américas e Diatraea flavipennella (Box) no Brasil. Os parasitoides larvais das brocas são os mais utilizados como método de controle no Brasil e no mundo (Pinto et al. 2006), sendo o parasitoide larval Cotesia flavipes (Cam.) amplamente utilizado em canaviais nordestinos, onde há uma predominância da espécie D. flavipennella (Freitas et al. 2006). No entanto, este método apresenta custos iniciais muito altos, além da necessidade de estrutura para produção dos agentes de controle. A utilização de inseticidas químicos para o controle das brocas da cana-de-açúcar não é recomendada devido aos prejuízos ambientais provocados e pela forma de aplicação dos mesmos na lavoura, que torna difícil sua penetração no interior dos colmos onde as lagartas provocam os maiores prejuízos. Devido a essas restrições e a necessidade de alternativas. 26.

(38) menos onerosas e seguras ao controle biológico e aos inseticidas químicos, tem ocorrido um aumento no interesse pelos inseticidas biológicos para o controle dessas pragas (Gitahy et al. 2006). Dentre os bioinseticidas para o controle de lepidópteros-praga, o mais utilizado mundialmente é a bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis (Berliner), considerada uma boa alternativa para minimizar os danos causados por D. saccharalis e D. flavipennella. No Brasil, o bioinseticida Dipel® WP é um dos produtos a base de B. thuringiensis, indicado para o controle da D. saccharalis (Agrofit 2013). No entanto, algumas características limitam a aplicação desse produto, como a incapacidade de controlar pragas que se alojam no interior das plantas (Sales & Baldani 1998), como as brocas da cana-de-açúcar de D. saccharalis e D. flavipennella. Com os avanços das pesquisas na área biotecnológica, novas estratégias para uso de B. thuringiensis foram desenvolvidas. A clonagem e expressão dos genes cry para codificar as δendotoxinas em plantas e outros microrganismos, aumentou as possibilidades do uso desse agente de biocontrole, visando inclusive, controlar pragas que se alimentam dos tecidos internos das plantas, constituindo-se, portanto, de uma estratégia para o controle das brocas da cana-de-açúcar (Gitahy et al. 2006). Dessa forma este trabalho tem com objetivo avaliar a atividade tóxica de isolados de B. thuringiensis, armazenados no banco de Bacillus do Laboratório de Interação Insetos Tóxicos/UFRPE em D. saccharalis e D. flavipennella e caracterizar o conteúdo gênico dos isolados que apresentarem toxicidade, para serem aplicados em programas de controle desses insetos.. 27.

(39) Material e Métodos Origem e Manutenção dos Isolados de Bacillus thuringiensis. Os 24 isolados utilizados neste estudo foram provenientes do banco de Bacillus do LIIT-Laboratório de Interações InsetosTóxicos do Departamento de Agronomia da UFRPE, onde são mantidos em glicerol a 15% e SDS a 0,01% a -80C (Braum 2000). Estes 24 isolados já foram testados em outros lepidópteros pragas de importância agrícola (Silva et al. 2012). Os padrões B. thuringiensis var. kurstaki (Sorotipo H3a3b3c) (Btk) e B. thuringiensis var. tolworthi (Sorotipo H:9) (Btt), utilizados como controle positivo, foram gentilmente fornecidos pela Fiocruz/RJ. Crescimento de Isolados para Testes com a Diatraea saccharalis e Diatraea flavipennella. Cada isolado foi transferido para meio Ágar nutriente (HiMedia, Mumbai, Índia) contendo penicilina G na concentração de 100 mg/L, incubados a 30ºC por 24h para germinação. Após esse período, os isolados foram transferidos para Erlenmeyer (300 mL), contendo 200 mL de meio T3 líquido (Bacto-triptona, 1,5 g; bacto-triptose, 1 g; extrato de levedura, 0,75 g; MnCl2, 0,0025 g; e tampão fosfato 50 mM, pH 6,8; 0,5 L), incubados a 30ºC, 200 rpm, por 72 h (Travers et al. 1987, Martin & Travers 1989) para produção de esporos e cristais. Em seguida foram centrifugados a 1700 g por 15 min a 4ºC, os sobrenadantes foram descartados e os “pellets” lavados em 10 mL de água ultrapura esterilizada, este procedimento foi repetido por três vezes, e ao final foram adicionados 5 mL de solução de NaCl a 0,9% aos “pellets” e estocados a 4ºC. Posteriormente foram quantificados para preparo das suspensões de trabalho e utilizados em bioensaios. Diluições de 10-1, 10-2 e 10-3 em água ultrapura esterilizada foram preparadas determinando-se o número de células bacterianas conforme metodologia descrita por Alves et al. (1998). A quantificação de esporos foi conduzida em microscópio de contraste de fase usando câmara de Neubauer.. 28.

(40) Criação e Manutenção dos Insetos. As criações de D. saccharalis e D. flavipennella foram estabelecidas a partir de ovos obtidos junto à criação-estoque mantida no Laboratório de Patologia de Insetos/UFRPE, onde as lagartas foram alimentadas em dieta artificial de Hensley & Hammond (1968) modificada pelo PLANALSUCAR (Araújo 1985). As lagartas a partir do 3º instar foram transferidas para caixas (30 x 18 x 04 cm) contendo pedaços da dieta e ao atingirem o estágio de pupa, as mesmas foram transferidas para recipientes plásticos (26 x 17 x 08 cm), contendo no fundo papel filtro mais algodão umedecido, até a emergência dos adultos. Estes foram confinados em gaiolas de PVC (21 x 15 cm), cujo interior foi revestido com papel sulfite, como substrato para a postura, e adicionada solução glicosada a 10% para alimentação dos adultos. Os ovos coletados diariamente foram esterilizados com formol (3%) e sulfato de cobre (1%), e posteriormente armazenados em placas de Petri (15 x 02 cm) com pedaço de algodão umedecido, por aproximadamente seis dias. Após eclosão das neonatas, estas foram distribuídas em tubos de fundo chato contendo 20 mL de dieta. Os adultos mantidos a 22ºC ± 1ºC e 70 ± 10% de UR, lagartas, pupas e ovos a 26ºC ± 1ºC e 70 ± 10% de UR e fotoperíodo de 12h L: 12h E. Dos ovos coletados de D. saccharalis e D. flavipennella, cerca de 10% foram utilizados para a manutenção da criação e o restante para a realização dos bioensaios. Patogenicidade. Para os bioensaios com D. saccharalis e D. flavipennella, uma alíquota de 30 µL de suspensão de B. thuringiensis, na concentração de 108 esporos + cristais/mL com Triton X-100 a 0,01%, foi aplicada na superfície da dieta artificial previamente distribuída em bandejas de bioensaios de 128 células (Bio-Serv Frenchtown, NJ). Após a evaporação do excesso de umidade, para cada tratamento, foram feitas 48 replicações por isolado, onde lagartas neonatas de D. saccharalis e D. flavipennella foram acondicionadas individualmente e as bandejas fechadas com tampas transparentes e ventiladas (Bio-Serv Frenchtown, NJ). Para acondicionamento do material, foi utilizada câmara incubadora (BOD), regulada para 28 ± 1. 29.