Vanessa Caixeta Perdigão
Suscetibilidade de duas populações de Biomphalaria tenagophila guaibensis Paraense, 1984 do estado do Rio Grande do Sul (RS, Brasil) à infecção por
diferentes linhagens de Schistosoma mansoni Sambon, 1907.
Campinas 2016
Suscetibilidade de duas populações de Biomphalaria tenagophila guaibensis Paraense, 1984 do estado do Rio Grande do Sul (RS, Brasil) à infecção por
diferentes linhagens de Schistosoma mansoni Sambon, 1907.
Orientadora: Profª. Drª. Eliana Maria Zanotti-Magalhães
Campinas 2016
Dissertação apresentada ao Instituto da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Biologia Animal na Área de Biodiversidade Animal.
Este arquivo digital corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna Vanessa Caixeta Perdigão, orientada pela Profª. Draª. Eliana Maria Zanotti-Magalhães.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof.(a) Dr.(a). Eliana Maria Zanotti-Magalhães Prof.(a). Dr.(a) Julio Mendes
Prof.(a) Dr(a). Patricia Jacqueline Thyssen
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico esta dissertação aos meus pais e ao Bruno que sempre me deram muito amor e incentivo durante a realização deste trabalho.
Primeiramente agradeço a Deus por ter me dado toda a força que precisei para conseguir passar pelas dificuldades que tive durante este percurso.
Agradeço aos meus pais pelo apoio que eles me deram nos meus estudos e por sempre me incentivarem a acreditar no meu potencial e terem me passado a sabedoria de passar por todos obstáculos da vida com muita fé e paciência. À minha irmã Laureane e ao meu cunhado Heitor, que me ajudaram e sempre me apoiaram nessa jornada.
Ao Bruno, meu amor, que esteve do meu lado durante todo este trabalho, sempre me apoiando, tendo muita paciência, amor, compreensão e me ajudando a superar todas dificuldades que tive durante este percurso.
Aos meus tios Gilson, Paula, Geraldo e Fabiana que me acolheram, me incentivaram e ajudaram durante meus estudos. Agradeço também a todos meus familiares que mesmo distante sempre preocuparam comigo e me apoiaram. Às minhas amigas queridas Suellen e Tais que tiveram toda paciência do mundo comigo e me ajudaram em todos momentos que precisei.
À minha orientadora, Dra. Eliana Maria Zanotti Magalhães e ao Professor Luiz Augusto Magalhães pelos ensinamentos e pelo suporte durante todo meu trabalho. À Pra. Dra. Patricia Jacqueline Thyssen e ao Demetrius da Silva Martins por terem cedido o material de trabalho e pelo suporte que me deram.
À Monica Ammon Fernandez pela ajuda e ensinamentos na dissecação dos moluscos.
Agradeço a Letícia, Luciana, Eliana Camargo e Kika por terem me ajudado a manusear as ferramentas que usei no meu trabalho e pelo suporte nas minhas dificuldades. Em especial à Eliana Camargo, que me ajudou muito.
Aos meus colegas do laboratório de Helmintologia e aos técnicos
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal da Unicamp e aos professores pelos conhecimentos que me proporcionaram contribuindo para minha formação.
Desde a descrição da subespécie Biomphalaria tenagophila guaibensis Paraense, 1984, poucos estudos foram realizados em relação à sua suscetibilidade ao S. mansoni. Resultados preliminares mostraram que esta subespécie não foi suscetível à infecção quando exposta à 5 miracídios da linhagem SJ. Posteriormente, estudos mostraram que esta subespécie também não foi suscetível quando exposta à 50 e a 100 miracídios de cada uma das linhagens SJ, Al (Alagoas) e LE (Belo Horizonte). Desde o alerta da possibilidade de expansão da esquistossomose em direção ao Sul do Brasil, casos autóctones de esquistossomose no estado do Rio Grande do Sul têm sido notificados. Os extensos campos alagadiços neste estado favorecem o estabelecimento e reprodução dos moluscos do gênero Biomphalaria, contribuindo desse modo, para um aumento da população de moluscos suscetíveis ao S. mansoni. Todos estes fatores, relacionados às condições de saneamento inadequado, contribuem para a transmissão e expansão da doença. Sabendo que há relatos da enfermidade no estado do Rio Grande do Sul, e que, além das espécies de moluscos hospedeiros naturais, a subespécie B. t. guaibensis está presente neste estado e inclusive em municípios onde houveram relatos da doença, tornou-se relevante um estudo mais abrangente sobre a suscetibilidade desta subespécie a diferentes linhagens do S. mansoni. O objetivo deste trabalho foi estudar a suscetibilidade de populações de B. t. guaibensis provenientes do município de Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim, ambos situados no Rio Grande do Sul, frente às linhagens Bahia, Sergipe, BH, SJ e SJS do S. mansoni. No estudo de atração miraxonal, B. t. guaibensis das duas localidades atraiu miracídios de forma semelhante à atração exercida pelos grupos controles, constituídos por moluscos hospedeiros naturais das linhagens de S. mansoni testadas. No estudo da suscetibilidade, após a exposição a 10 miracídios de cada uma das linhagens do trematódeo, não foi registrada eliminação de cercárias após 12 semanas de observação. No estudo histopatológico realizado após a exposição dos moluscos a 100 miracídios, em B. t. guaibensis do Capão do Leão, a maioria dos esporocistos viáveis encontrados nos moluscos estavam sem reação amebocitária, enquanto a maioria dos esporocistos inviáveis estavam envoltos por reação amebocitária. Esses moluscos apresentaram esporocistos das linhagens SJ e SJS viáveis e sem reação amebocitária 72 horas após a infecção. Às 96 horas, somente esporocistos da
predominância de esporocistos inviáveis envoltos por reação amebocitária intensa, e às 96 horas da infecção, todos os esporocistos das linhagens Sergipe, BH, SJ e SJS visualizados estavam inviáveis e apresentavam reação amebocitária. Estes dados apresentam uma importância epidemiológica, visto que, apesar de não ter liberado cercárias, B. t. guaibensis demonstrou alta capacidade de atração dos miracídios e a presença de esporocistos viáveis em moluscos do Capão do Leão, indicam o provável início de uma adaptação entre B. t. guaibensis e o S. mansoni, conferindo a esta subespécie a possibilidade de tornar-se hospedeira natural do trematódeo futuramente.
Since the description of the subspecies Biomphalaria tenagophila guaibensis Paraense 1984, few studies have been conducted with regard to their susceptibility to S. mansoni. Preliminary results showed that this subspecies was not susceptible to infection when exposed to five miracidia SJ strain. Subsequently, studies have shown that this subspecies was also not susceptible when exposed to fifty and a hundred miracidia of SJ, Al (Alagoas) and LE (Belo Horizonte) strains. Since the warning of the possibility of expansion of schistosomiasis into the south of Brazil, autochthonous cases of schistosomiasis in Rio Grande do Sul state have been notified. The extensive wetlands fields in this state favors the establishment and reproduction of Biomphalaria, thereby contributing to an increase in population of susceptible mollusks to S. mansoni. All of these factors related to inadequate sanitation conditions contributes to the transmission and spread of the disease. Considering the reports of schistosomiasis in the state of Rio Grande do Sul, and the fact that not only the natural host mollusk species but also the subspecies B. t. guaibensis are present in this state, notably in municipalities where there were confirmed reports of the disease, a more comprehensive study became relevant on the susceptibility of this subspecies to different strains of S. mansoni. The aim of this research was to study the susceptibility of populations of B. t. guaibensis from the municipality of Capão do Leão and Reserva Ecológica do Taim, both located in Rio Grande do Sul, to Bahia, Sergipe, BH, SJ and SJS S. mansoni strains. In the study of miraxonal attraction, B. t. guaibensis of two locations attracted miracidia similarly to the attraction of the control groups consisting of mollusks natural hosts of S. mansoni strains. In the susceptibility study, after exposure to 10 miracidia of each trematode strains, there was no elimination of cercariae after 12 weeks of observation. After exposure the mollusks to 100 miracidia, the histopathological study in B. t. guaibensis from Capão do Leão, showed that, most viable sporocysts found in mollusks were not surrounded by an amebocyte reaction, while most unviable sporocysts were enveloped by amebocyte reaction. These mollusks presented sporocysts of SJ and SJS strains without amebocyte reaction 72 hours after infection. Nine six hours post infection, only sporocysts of the SJ strain were found viable without amebocyte reaction. Histopathological study of B. t. guaibensis of the Estação Ecológica do Taim revealed a predominance of unviable
amebocyte reactions. These data show an epidemiological importance, whereas, despite not having released cercariae, B. t. guaibensis demonstrated high capacity attraction of miracidia and the presence of viable sporocysts in Capão do Leão mollusks, indicates the likely start of an adaptation between B. t. guiabensis and the S. mansoni, giving this subspecies the possibility of becoming a natural host of the trematode in the future.
Figura 1: Países ou áreas em risco de transmissão de esquistossomose no ano de 2014...17 Figura 2: Percentual médio da prevalência da esquistossomose por município no Brasil no ano de 2007 a 2010...19 Figura 3: Localidades no Rio Grande do Sul mostrando os casos notificados de esquistossomose pelo Sistema Nacional de Agravos de Notificação (SINAN)...19 Figura 4: Ponto de coleta dos moluscos provenientes da Reserva Ecológica do Taim ...29 Figura 5: Ponto de coleta dos moluscos provenientes do município de Capão do Leão ...30 Figura 6: Complexo peniano de um exemplar da geração F1 de B. t. guaibensis do Capão do Leão mantido no departamento de Biologia da Animal na Unicamp...31 Figura 7: Diferenças entre o complexo peniano de de B. tenagophila de São José dos Campos (A) e de B. t. guaibensis da Reserva Ecológica do Taim (B)...31 Figura 8: Aparelho utilizado no experimento de atração miraxonal...33 Figura 9: Experimento de atração miraxonal...33 Figura 10: Taxa de atração miraxonal de B. t. guaibensis do Capão do Leão e dos grupos controles (A); Taxa de atração miraxonal de B. t. guaibensis da Reserva Ecológica do Taim e dos grupos controles (B); Taxa de atração miraxonal de B. t. guaibensis do Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim (C)...37 Figura 11: Taxa de mortalidade no final do experimento dos moluscos dos grupos controles, de B. t. guaibensis de Capao do Leão e da Reserva Ecológica do Taim expostos às diferentes linhagens do S. mansoni...40 Figura 12: Sobrevivência dos moluscos B. t. guaibensis de Capao do Leão (A), Reserva Ecológica do Taim (B) e dos moluscos dos grupos controles (C), expostos às diferentes linhagens do S. mansoni...41 Figura 13: Média dos esporocistos encontrados em B.t. guaibensis do Capão do Leão e da Reserva Ecológica no Taim nos variados tempos de infecção (A), na exposição às diferentes linhagens do S. mansoni (B), na exposição às diferentes linhagens do S. mansoni para cada tempo de infecção (C)...43
Esporocistos inviáveis e viáveis encontrados em B. t. guaibensis do Capão do Leão nos tempos de infecção estabelecidos (B)...45 Figura 15: Percentagem de esporocistos viáveis e inviáveis encontrados em exemplares de B. t. guaibensis do Capão do Leão...46 Figura 16: Esporocistos inviáveis com reação amebocitária (A) e sem reação amebocitária (B) encontrados em B. t. guaibensis do Capão do Leão...47 Figura 17: Esporocistos viáveis com reação amebocitária (A) e sem reação amebocitária (B) encontrados em B. t. guaibensis do Capão do Leão...48 Figura 18: Esporocistos viáveis encontrados em B.t. guaibensis do Capão do Leão com 72 horas de infecção pelas linhagens SJ (A), (B) e SJS (C), (D). Esporocistos viáveis encontrados em B.t. guaibensis do Capão do Leão com 96 horas de infecção pela linhagem SJ (E), (F)...49 Figura 19: Esporocistos inviáveis encontrados em B.t. guaibensis do Capão do Leão com 24 horas de infecção pelas linhagens: Bahia (A); Sergipe (B); BH (C); SJ (D) e SJS...50 Figura 20: Esporocistos viáveis com reação amebocitária das linhagens Bahia (A) e SJ (B); esporocistos viáveis contendo células germinativas em crescimento com 72 horas de infecção pela linhagem SJS (C); esporocisto viável contendo células germinativas em crescimento com 96 horas de infecção pela linhagem SJ (D); esporocistos inviáveis com reação celular intensa da linhagem BH (E), (F)...51 Figura 21: Esporocistos encontrados em B.t. guaibensis do Taim para cada linhagem exposta ao S. mansoni nos tempos de infecção estabelecidos (A). Esporocistos inviáveis e viáveis encontrados em B. t. guaibensis do Taim nos tempos de infecção estabelecidos (B)...53 Figura 22: Percentagem de esporocistos viáveis e inviáveis encontrados em exemplares de B. t. guaibensis da Reserva Ecológica do Taim...54 Figura 23: Esporocistos inviáveis com reação amebocitária (A) e sem reação amebocitária (B) encontrados em B. t. guaibensis da Reserva Ecológica do Taim...55 Figura 24: Esporocistos viáveis com reação amebocitária encontrados em B. t. guaibensis da Reserva Ecológica do Taim...56
guaibensis da Reserva Ecológica do Taim...57 Figura 26: Esporocistos viáveis com reação amebocitária em processo de degeneração das linhagens Bahia (A), Sergipe (B), BH (C), SJ (D) e SJS (E) encontrados em B. t. guaibensis da Reserva Ecológica do Taim...58
Abstract ... 9
1- Introdução ... 16
1.1- Considerações gerais sobre a Esquistossomose ... 16
1.2- Esquistossomose no Brasil e sua extensão para o Rio Grande do Sul ... 17
1.3- Ciclo Biológico ... 20
1.4- Distribuição dos moluscos do gênero Biomphalaria ... 21
1.5- Suscetibilidade dos moluscos do gênero Biomphalaria ... 22
1.6- Atração miraxonal ... 23
1.7- Mecanismos internos de defesa dos moluscos hospedeiros do S. mansoni .. 25
1.8- Biomphalaria tenagophila guaibensis e o complexo B. tenagophila ... 26
2- Justificativa ... 27
3- Objetivo ... 28
4- Planejamento experimental ... 28
5- Material e métodos ... 29
5.1- Populações de moluscos utilizadas ... 29
5.2- Identificação dos moluscos ... 30
5.3- Linhagens do S. mansoni utilizadas ... 32
5.4- Criação e manutenção dos moluscos em laboratório ... 32
5.5- Atração miraxonal ... 32
5.6- Verificação da suscetibilidade à diferentes linhagens de S. mansoni ... 33
5.7- Estudo histopatológico dos moluscos ... 34
5.8- Grupos controles ... 34
5.9- Análise estatística ... 35
6- Resultados ... 35
6.1- Atração miraxonal ... 35
6.2- Suscetibilidade e mortalidade dos moluscos submetidos à infecção por diversas linhagens de S.mansoni... 38
6.2.1- Taxa de infecção ... 38
6.2.2- Sobrevivência dos moluscos ... 39
6.3- Estudo histopatológico dos moluscos ... 42
6.3.1- Análise dos esporocistos em B. t. guaibensis das duas localidades ... 42
7- Discussão ... 59 8- Conclusões ... 70 9- Referências Bibliográficas ... 72
1- Introdução
1.1- Considerações gerais sobre a Esquistossomose
A esquistossomose é uma doença causada por platelmintos parasitas da classe Trematoda. As espécies que causam esta doença ao homem são: Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum, Schistosoma mekongi e Schistosoma malayensis (COURA & AMARAL, 2004). Dentre estas espécies a única que ocorre no Brasil é a S. mansoni e sua distribuição está relacionada com algumas espécies de molusco de água doce do gênero Biomphalaria (Preston, 1910), que são os hospedeiros intermediários deste trematódeo. Mais de 700 milhões de pessoas ao redor do mundo estão em risco de contrair a esquistossomose e aproximadamente 240 milhões estão infectadas (WHO, 2016).
A doença é endêmica em 76 países e territórios presentes na África, no Oriente Médio, na América do Sul, no Caribe, nas Filipinas e no sudeste Asiático (figura 1). Apesar da extensa distribuição, apenas 52 países endêmicos com moderada e alta transmissão recebem em suas comunidades o tratamento adequado (WHO, 2016). Nas últimas décadas houve um progresso significativo na quimioterapia com drogas mais eficazes e criação de programas de controle baseados no uso de moluscicidas químicos. Estes avanços levaram à diminuição da morbidade e mortalidade em certas áreas endêmicas na América e na Ásia, porém não foi o que ocorreu na África, onde a morbidade e prevalência ainda é alta. Além disso, a doença ainda continua se expandindo para novas áreas geográficas (PATZ et al., 2000; WHO, 2005).
1.2- Esquistossomose no Brasil e sua extensão para o Rio Grande do Sul
Acredita-se que esta parasitose foi introduzida no Brasil devido ao tráfico de escravos, sendo os fluxos migratórios responsáveis por espalha-la a partir do litoral para o interior (COURA & AMARAL, 2004). Estima-se que no Brasil há cerca de 6 a 7 milhões de pessoas parasitadas pelo S. mansoni e 25 milhões sob risco de infecção (WHO, 2009). Atualmente a transmissão da doença ocorre em uma vasta área endêmica, do Maranhão ao Espírito Santo e Minas Gerais acometendo 19 estados com focos isolados no Distrito Federal, Pará, Piauí, Goiás, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e no Rio Grande do Sul (COURA & AMARAL, 2004). A maior prevalência da doença ocorre em uma faixa litorânea do Nordeste, atingindo também o Sudeste de Minas Gerais. Maiores áreas endêmicas estão presentes nos estados de Minas Gerais e Bahia (AMARAL et al., 2006) (figura 2).
A esquistossomose é uma doença que apresenta importância na saúde pública não só pelo fato de abranger uma grande parte do território brasileiro, mas também por atingir populações mais pobres que já estão fragilizadas pela desnutrição ou por outras doenças. Ela está diretamente relacionada com a falta de saneamento básico, sendo que a dificuldade do controle desta parasitose propicia a expansão para novas áreas previamente consideradas indenes. Os programas criados que visam o controle Figura 1. Países ou áreas em risco de transmissão de esquistossomose no ano de 2014. Fonte: WHO, 2015.
da esquistossomose, como por exemplo, o uso da quimioterapia em larga escala contribuíram para a diminuição da morbidade, contudo, a expansão da doença ainda é preocupante no Brasil (COURA & AMARAL, 2004; KATZ, 2008; SCHOLTE et al., 2014).
Os primeiros casos autóctones registrados no estado de São Paulo ocorreram em 1923 na Baixada Santista e posteriormente no Vale do Paraíba, devido às migrações de indivíduos provenientes do Nordeste, principalmente Bahia, Pernambuco, Alagoas e Sergipe (SUCEN, 1982). Paraense & Corrêa (1987) alertaram sobre uma possível expansão da esquistossomose para o Sul do Brasil e da América do Sul, quando comprovaram a suscetibilidade de B. tenagophila deTramandai (RS). Desde então foram relatados alguns casos autóctones de esquistossomose na Região Sul (BERNADINI & MACHADO, 1981), com casos inclusive no estado do Rio Grande do Sul, confirmando tal previsão (GRAEFF-TEIXEIRA et al., 1999; MARTINS et al., 2015).
Até o ano de 1999 no Rio Grande do Sul, só havia registros de casos de esquistossomose no município de Esteio (RS). Entretanto, através de dados obtidos pelo SINAN (Sistema Nacional de Agravos de Notificação) Martins et al. (2015) relataram 95 casos positivos de esquistossomose nesse estado entre os anos de 2001 a 2013, nas localidades de: Candiota, Maximiliano de Almeida, Canoas, Caxias do Sul, Esteio, Porto Alegre, São Leopoldo, Sapucaia do Sul e Tramandaí. Esses casos estão inseridos nas três regiões hidrográficas do estado (figura 3). O Estado do Rio Grande do Sul é composto por vários campos alagadiços utilizados para o cultivo de arroz que possuem um sistema de irrigação e drenagem que facilita a dispersão de moluscos, inclusive de moluscos vetores do S. mansoni. (LANZER, 2001). A prática agrícola é um dos fatores que contribuem para a infecção e dispersão da esquistossomose (BARBOZA, et al., 2012; BARBOSA et al., 2015; SAUCHA et al., 2015). No entanto, outros fatores também podem estar contribuindo para o surgimento de novos casos neste estado, como migrações de pessoas infectadas para áreas indenes, falta de saneamento básico, condições de temperatura ideais, ampla distribuição dos moluscos vetores e resistência extrema dos moluscos às diversas condições ambientais (MARTINS et al., 2015).
Figura 2. Percentual médio da prevalência da esquistossomose por município no Brasil no ano de 2007 a
2010. Fonte: Sistema de Informação do Programa de Controle da Esquistossomose – MS/ SISPCE, 2011.
Figura 3. Localidades no Rio Grande do Sul mostrando os casos notificados de esquistossomose pelo
Sistema Nacional de Agravos de Notificação (SINAN). Dados destacados por regiões hidrográficas. Branco: Região hidrográfica do Litoral. Cinza claro: Região hidrográfica de Guaiba. Cinza escuro: Região hidrográfica do Uruguai. As localidades numeradas indicam: 1. Candiota; 2. Canoas; 3. Caxias do Sul; 4. Esteio; 5. Maximiliano de Almeida; 6. Porto Alegre; 7. São Leopoldo; 8. Sapucaia do Sul; 9. Tramandaí. Fonte: Martins et al., 2015.
1.3- Ciclo Biológico
O ciclo do S. mansoni envolve dois hospedeiros. Um é o hospedeiro definitivo abrangendo alguns mamíferos, onde ocorre a reprodução sexuada do parasito e o outro é o hospedeiro intermediário, que são moluscos do gênero Biomphalaria, onde ocorre reprodução por poliembrionia. Os moluscos em condições de temperaturas adequadas liberam cercárias, formas larvais aquáticas, que penetram na pele ou mucosa do hospedeiro definitivo quando em contato com água contaminada. A penetração dura cerca de 15 minutos, quando as cercárias perdem a cauda, sofrem mudanças fisiológicas e morfológicas se transformando em esquistossômulos. Os esquistossômulos, após alguns dias, atingem a circulação sanguínea passando pelo coração e pelos pulmões. Dos pulmões migram para o fígado e se desenvolvem atingindo a maturidade se diferenciando em macho e fêmea. O macho apresenta uma estrutura chamada canal ginecóforo, local onde a fêmea é albergada e fecundada. Os vermes adultos migram acasalados para as veias mesentéricas inferiores do intestino, onde as fêmeas iniciam a postura de ovos cerca de 40 dias após a infecção. As fêmeas liberam aproximadamente 300 ovos por dia sendo que cerca da metade desses ovos são eliminados nas fezes e a outra metade fica retida no interior do hospedeiro, induzindo reações granulomatosas responsáveis pela principal patologia da doença (COLLEY et al., 2014). Os ovos liberados nas fezes em contato com o meio aquático, influenciado pelas condições ambientais, eclodem e liberam os miracídios, correspondendo a outra forma larval aquática, que irão tentar penetrar nos moluscos hospedeiros. O fototropismo positivo, a temperatura e substâncias químicas emanadas dos moluscos são fatores que influenciam na penetração dos miracídios CHERNIN (1970, 1974). No interior do molusco, através da reprodução por poliembrionia, o miracídio se transforma em esporocisto primário, e após o 14 º dia depois da infecção, o esporocisto primário origina os esporocistos secundários e então se transformam em cercárias. As cercárias são liberadas pelos caramujos e nadam aproximadamente por 72 horas até encontrar o hospedeiro definitivo e dar continuidade ao ciclo.
O ciclo da doença está intimamente ligado às questões sociais, como a falta de saneamento básico e falta de infraestruturas que possibilitem melhores condições de higiene atingindo principalmente comunidades mais pobres onde os cuidados com a saúde são escassos. Questões comportamentais e culturais também são fatores importantes, a partir do momento que mesmo tendo condições de saneamento
adequadas a infecção se dá pelo frequente hábito de entrar em contato com coleções hídricas contaminadas (BARBOSA et al., 2015).
1.4- Distribuição dos moluscos do gênero Biomphalaria
No Brasil foram descritas até o momento onze espécies e uma subespécie de Biomphalaria: Biomphalaria glabrata (Say, 1818); Biomphalaria tenagophila (Orbigny, 1835); Biomphalaria straminea (Dunker, 1948); Biomphalaria peregrina (Orbigny, 1835); Biomphalaria schrammi (Crosse, 1864); Biomphalaria kuhniana (Clessin, 1883); Biomphalaria intermedia (Paraense & Deslandes, 1962); Biomphalaria amazonica Paraense, 1966; Biomphalaria cousini (Paraense, 1966); Biomphalaria oligoza Paraense, 1974; Biomphalaria occidentalis Paraense, 1981 e Biomphalaria tenagophila guaibensis Paraense, 1984. Três espécies apresentam importância na transmissão da esquistossomose por terem sido encontradas infectadas naturalmente pelo S. mansoni: B. glabrata, B. tenagophila e B. straminea (PARAENSE, 1972). B. amazonica, B. cousini e B. peregrina são consideradas potenciais hospedeiras por se infectarem experimentalmente (CORRÊA & PARAENSE, 1971; PARAENSE, 1973; TEODORO et al., 2010).
Biomphalaria glabrata é a principal espécie transmissora da esquistossomose, sendo altamente suscetível ao trematódeo, com altas taxas de infecção na natureza e em laboratório (FILES & CRAM, 1949). No Brasil ela se encontra no Distrito Federal, e em 16 estados nas regiões Norte, Nordeste, Centro Oeste, Sudeste e Sul do País (PARAENSE, 2001).
Biomphalaria tenagophila é a segunda espécie em importância na transmissão da esquistossomose, tendo como localidade-tipo a Província de Corrientes na Argentina. Esta espécie ocorre no Brasil, Argentina, Bolívia, Paraguai, Uruguai e Peru (PARAENSE, 2001). No Brasil ela é encontrada em uma extensa área no Sul e Sudeste ocorrendo também nos Estados da Bahia, Goiás e no Distrito Federal (PARAENSE, 1972; PARAENSE, 1981; PARAENSE, 1986). Esta espécie foi registrada em coleções hídricas de uma extensa área do Rio Grande do Sul como: Capão Seco, Chuí, Curral Alto, Tramandaí (PARAENSE, 1972), Osório, Pedro Osório, Torres (FRÓES & LIMA, 1975), Uruguaiana (OLAZARRI, 1981) e em São Borja e Pirapó (TELES et al., 1991).
Biomphalaria straminea apresenta a distribuição geográfica mais extensa do País, tem sido notificada em 24 estados brasileiros, apresentando maior predomínio na região Nordeste (PARAENSE, 2001). As taxas de infecção natural ao S. mansoni são inferiores a 1%, contudo são capazes de manter elevadas taxas de infecção humana em determinadas áreas do Nordeste (PARAENSE & CORRÊA, 1963).
1.5- Suscetibilidade dos moluscos do gênero Biomphalaria
A suscetibilidade dos moluscos à certas linhagens de S. mansoni é condicionada por fatores genéticos conforme estudos de Newton (1953). Estudos posteriores comprovaram, por meio de cruzamentos entre caramujos resistentes e suscetíveis, que o caráter resistência do molusco à infecção, adquirido na maturidade, segue uma segregação mendeliana de caráter dominante (Richards, 1970).
Paraense & Corrêa (1963) descreveram duas linhagens distintas de S. mansoni, as linhagens SJ e BH, ao observar que a B. tenagophila do Vale do Rio Paraíba do Sul (SP) apresentava elevado grau de resistência à infecção por S. mansoni de Belo Horizonte (MG), porém era suscetível à linhagem simpátrica do parasito (SJ). O mesmo ocorreu com B. glabrata de Belo Horizonte (MG), que se apresentou suscetível ao S. mansoni local (BH) e resistente à infecção pelo parasito do Vale do Rio Paraíba do Sul (SP). Desse modo, sugeriu-se uma adaptação fisiológica entre a população do molusco e a linhagem local do parasito. Posteriormente, Paraense & Corrêa (1978) verificaram diferentes graus de suscetibilidade entre populações de Biomphalaria e o S. mansoni quando expuseram diferentes populações de B. glabrata e B. tenagophila ao parasito de diversas localidades.
Através de processos de seleção genética, foi possível o isolamento de populações de B. glabrata e de B. tenagophila altamente suscetíveis à infecção por S. mansoni das linhagens BH e SJ respectivamente (SANTANA et al., 1978; ZANOTTI-MAGALHÃES et al., 1991b). Esse processo de obtenção de moluscos altamente suscetíveis se deu através da seleção de gerações utilizando a autofecundação de moluscos suscetíveis à infecção, obtendo-se taxas próximas a 100% de suscetibilidade após a quarta geração.
Pesquisa realizada por Mascara et al. (1999) com seleção de B. tenagophila, resultou em duas populações de moluscos, uma com níveis de suscetibilidade entre
93% a 100% e outra com níveis entre 0 e 5%. Procurando um melhor esclarecimento sobre a suscetibilidade e resistência dos moluscos, Zuim et al. (2005) realizaram um estudo sobre a suscetibilidade e a resistência de B. glabrata e B. tenagophila à infecção pelo S. mansoni respectivamente das linhagens BH e SJ através da seleção genética. As gerações obtidas por autofecundação de moluscos que se apresentaram suscetíveis ou resistentes foram expostas aos miracídios do S. mansoni e os resultados mostraram que a suscetibilidade foi mais facilmente obtida do que a resistência, indicando que o parasita apresentou mais condições de escapar ou bloquear os mecanismos de defesa do hospedeiro e se desenvolver.
Uma linhagem geográfica de B. tenagophila resistente ao S. mansoni foi identificada pela primeira vez por Santos et al. (1979). Ela foi coletada na Estação Ecológica do Taim, Rio Grande do Sul (RS) e vem sendo alvo de muitos estudos por ter apresentado resistência à infecção por todas as linhagens testadas do S. mansoni em todas as fases de desenvolvimento do caramujo (FREITAS et al., 1985; BEZERRA et al., 1997; MARTINS-SOUZA et al., 2003; ROSA et al., 2005; COELHO et al., 2008). Partindo desse pressuposto, experimentos foram realizados com cruzamentos entre B. tenagophila da Reserva Ecológica do Taim (RS) e B. tenagophila de Joinville (SC) (linhagem suscetível à infecção), mostrando dominância do caráter de resistência à infecção por S. mansoni (Rosa et al., 2005). Esta linhagem inclusive vem sendo introduzida no município de Bananal (SP) para controlar populações suscetíveis de B. tenagophila e desse modo reduzir novas ocorrências de esquistossomose (ROSA, 2008; MARQUES et al., 2014).
1.6- Atração miraxonal
Em experimentos envolvendo moluscos B. glabrata e S. mansoni procedente de Minas Gerais e Alagoas, Kloetzel (1958) verificou a existência de um tropismo entre a larva e o molusco, sendo este tropismo uma resposta às substâncias emanadas pelo molusco. O autor observou que ao chegar próximo do hospedeiro, os miracídios que antes se movimentavam em linha reta, diminuíam a velocidade, curvavam o corpo e rodopiavam como em busca de algo. A atração foi testada também com uma concha vazia de molusco e o mesmo comportamento não foi observado. Mais tarde, Kloetzel (1960) afirmou que os miracídios não são capazes de perceber a presença do hospedeiro a longas distâncias e que a atração acontece através do conjunto de
fatores como a intensa atividade física do miracídio e a liberação de substâncias emanadas pelo molusco, exercendo então um quimiotropismo sobre estes, porém a curta distância.
Etges & Decker (1963) utilizaram um aparelho de quatro câmaras e observaram que os miracídios de S. mansoni foram atraídos pelos moluscos hospedeiros B. glabrata, porém, não foram atraídos pelos moluscos Heliosoma anceps e Bulinus sp., verificando que a atração apresentava certo grau de especificidade. Mac Inns (1965) realizou um estudo utilizando pequenas pirâmides de ágar contendo várias substâncias possivelmente presentes no muco de moluscos e verificou a existência de uma atração e estimulo sobre o miracídio em resposta a alguns componentes químicos do molusco. Chernin (1970, 1972) observou que várias substâncias solúveis em água emanadas naturalmente por B. glabrata e outros moluscos alteravam o comportamento dos miracídios e denominou de SCW (“snail condition water) a água que continha essas substâncias. Estudos posteriores revelaram algumas dessas substâncias como: aminoácidos (WRIGHT & RONALD, 1972; MAC INNS et al., 1974); ácidos graxos, ions H+ (MAC INNS, 1965); Mg2+, Ca2+ (SPANHOLTZ & SHORT, 1976);
seratina (ETGES et al., 1975), amônia e peptina (MANSON & FIPP, 1977). Brasio et al. (1985), estudando a SCW e a hemolinfa de B. glabrata de Belo Horizonte (MG) e de B. tenagophila do Vale do Rio Paraíba do Sul (SP), verificaram que a SCW de B. tenagophila atraiu mais intensamente miracídios simpátricos (linhagem SJ) e a SCW de B. glabrata exerceu uma atração semelhante sobre miracídios simpátricos (linhagens BH) e alopátricos (linhagem SJ). Observaram também que a hemolinfa de B. tenagophila apresentou forte poder de atração sobre miracídios SJ e BH, sendo mais intensa para a linhagem simpátrica, superando o poder de atração de B. glabrata.
Utilizando um aparelho de vidro, Brasio et al. (1985) verificaram que quando os miracídios foram colocados em presença de uma só espécie de molusco, apresentaram maior atração para a linhagem simpátrica, e que quando em presença simultânea das espécies B. tenagophila e B. glabrata, os miracídios não discriminaram seu hospedeiro. Nesse mesmo estudo, observaram também que os miracídios não foram atraídos frente aos girinos de Hyla fuscovaria, confirmando a presença de substâncias quimiotáxicas emanadas pelos moluscos hospedeiros do S. mansoni. Zanotti-Magalhães et al. (1991a) estudaram a atração miraxonal exercida por B. tenagophila selecionada geneticamente para a suscetibilidade e observaram que estes atraíram mais intensamente os miracídios da linhagem SJ do que moluscos não
selecionados para a suscetibilidade. Em outro estudo referente a atração miraxonal realizado por Magalhães et al. (1991), verificaram-se que um exemplar de B. straminea exerceu efeito repulsivo sobre miracídios da linhagem BH, quando todos os miracídios colocados no canal, rapidamente se dirigiram para o lado oposto da câmara que continha o molusco.
1.7- Mecanismos internos de defesa dos moluscos hospedeiros do S. mansoni Diversos fatores influenciam na suscetibilidade do molusco ao S. mansoni, sendo que um deles é a atividade do mecanismo interno de defesa do molusco. Em Biomphalaria, o mecanismo interno de defesa é composto por elementos solúveis da hemolinfa e células circulantes chamadas hemócitos, que atuam juntos durante a resposta contra agentes infecciosos (VAN DER KNAAP & LOCKER, 1990). Os hemócitos são células com morfologia variável e conteúdos enzimáticos distintos sendo classificados como: hialinócitos e granulócitos. Estes últimos são os principais elementos envolvidos na encapsulação e destruição da larva de S. mansoni dentro do molusco hospedeiro (BAYNE et al., 1980; VAN DER KNAAP & LOCKER, 1990; NEGRÃO-CORRÊA et al., 2007; CAVALCANTI et al., 2012). Estudos comprovaram que os componentes solúveis da hemolinfa também são importantes no mecanismo de defesa contra patógenos em vários invertebrados, sendo responsáveis por destruir o patógeno através da produção de substâncias tóxicas. (BERNHEIMER & RUDY, 1986; CONNORS et al., 1995; LEE et al., 2000; SAPP & LOCKER, 2000; NEGRÃO-CORRÊA et al., 2007).
Em moluscos Biomphalaria, os hemócitos circulantes na hemolinfa ou fixos nos tecidos são produzidos por uma região localizada entre o pericárdio e epitélio posterior da cavidade do manto, chamado de: “amebocyte producing organ” (APO) (LIE et al., 1976). Estudos referentes à infecção de Biomphalaria por S. mansoni, mostraram que a infiltração de hemócitos ao redor dos esporocistos era muito mais rápida e intensa em moluscos resistentes à infecção (GUARALDO et al., 1981; SOUZA et al., 1997; NEGRÃO-CORRÊA et al., 2007). Com intuito de comprovar a presença dos hemócitos na participação da defesa contra esporocistos de S. mansoni, foram realizados estudos com o transplante do APO de moluscos resistentes para moluscos suscetíveis, verificando que os moluscos que receberam o APO conseguiram
controlar melhor a infecção pelo parasito (SULLIVAN & SPENCE, 1994; BARBOSA et al., 2006).
Estudos realizados com a finalidade de entender como funciona o processo de defesa de B. tenagophila procedente da Reserva Ecológica do Taim, mostraram que o miracídio do S. mansoni é capaz de penetrar no molusco, entretanto, Negrão-Corrêa et al. (2007) verificaram uma intensa infiltração celular ao redor do esporocisto destruindo-o em poucas horas, comprovando a importância dos hemócitos na defesa contra o parasito. Os hemócitos presentes em moluscos Biomphalaria resistentes podem reconhecer, encapsular e destruir os esporocistos logo após a penetração do S. mansoni. Porém, estudos comprovaram que o parasito apresenta a habilidade de escapar da resposta de defesa do hospedeiro, sendo esta característica fundamental na compatibilidade entre parasito-hospedeiro. Uma importante habilidade do S. mansoni é de mimetizar moléculas presentes no molusco, fazendo com que ele não seja reconhecido pelos mecanismos internos de defesa do hospedeiro (PETERSON et al., 2009; LEHR et al., 2010).
1.8- Biomphalaria tenagophila guaibensis e o complexo B. tenagophila
Paraense (1984) relatou uma nova subespécie, Biomphalaria tenagophila guaibensis que foi assim denominada por ter sido encontrada no município de Guaíba no Rio Grande do Sul. Ele dividiu o táxon B. tenagophila em B. tenagophila tenagophila e B. tenagophila guaibensis. Paraense (1984) comparou B. t. guaibensis com a B. t. tenagophila e B. occidentalis pelo fato de as três apresentarem a morfologia das conchas indistinguíveis, sendo diferenciadas por características no sistema genital. Biomphalaria t. guaibensis desde a sua descrição, tem sido encontrada em Arroio Grande (RS), Capão do Leão (RS), Guaíba (RS), Jaguarão (RS), Rio Grande (RS), Tapes (RS), parte média do Uruguai (PARAENSE, 1984), Camaquã (RS), Dom Pedrito (RS) e Santa Vitória do Palmar (RS) (PEPE et al., 2009), Pelotas (RS), Reserva Ecológica do Taim (RS), Porto Alegre (RS), Esteio (RS), Eldorado do Sul (RS) (PARAENSE, 1984) (MARTINS, 2015).
Paraense (1984) ao descrever esta subespécie citou a necessidade de realizar cruzamentos entre B. t. guaibensis e B. t. tenagophila e entre B. t. guaibensis e B. occidentalis, para confirmar tal classificação de subespécie. Braga (2012) realizou tais cruzamentos propostos, tendo como resultado o isolamento reprodutivo no
cruzamento entre B. t. guaibensis e B. occidentalis. No cruzamento entre B. t. guaibensis e B. t. tenagophila, houve de fato o cruzamento e juntamente com as semelhanças entre elas, foi confirmado o status de subespécie.
Análises moleculares apontaram uma estreita relação entre B. t. tenagophila, B. occidentalis e B. t. guaibensis, colocando-as assim no agrupamento do complexo B. tenagophila (SPATZ et al., 1999; VIDIGAL et al., 2004). Inclusive foi observado através de estudos genéticos moleculares que a B. t. guaibensis apresentou mais afinidade com a B. occidentalis do que com B. t. tenagophila (SPTAZ et al., 1999; VIDIGAL et al., 2004; MARTINS, 2015) sendo as populações de B. t. guaibensis do Sul (Pelotas, Taim) mais próximas a B. occidentalis do que as populações de B. t. guaibensis coletadas ao norte do RS (Porto Alegre, Esteio e Eldorado do Sul) (MARTINS, 2015). A formação da subespécie B. t. guaibensis pode ser explicada por uma separação geográfica que isolou populações de B. tenagophila e que ao longo do tempo levou a subespeciação (VAZ, 1989). Para um melhor esclarecimento sobre a semelhança entre B. t. guaibensis e B. occidentalis torna-se necessário mais estudos com um número maior de indivíduos para comparar a estrutura genética das populações (MARTINS, 2015).
Estudos relacionados à suscetibilidade de B. t. guaibensis realizados por Paraense & Corrêa (1987) mostraram a resistência desta subespécie à linhagem SJ de S. mansoni, quando expostas a 5 miracídios por molusco. Braga (2012) testou a suscetibilidade de B. tenagophila guaibensis às linhagens LE (Belo Horizonte), AL (Alagoas) e SJ utilizando 50 e 100 miracídios, e os moluscos não foram suscetíveis.
2- Justificativa
Paraense & Corrêa (1987) alertaram sobre uma possível expansão da esquistossomose para o Sul do Brasil e Sul da América, quando comprovaram a infecção de B. tenagophila de Tramandaí, Rio Grande do Sul, pelo S. mansoni da linhagem SJ e devido aos casos relatados de esquistossomose no estado de São Paulo (PIZA & RAMOS et al., 1960) e Santa Catarina (BERNARDINI & MACHADO, 1981) transmitidos pela B. tenagophila. Desde então foram relatados alguns casos autóctones de esquistossomose no estado do Rio Grande Do Sul, nos municípios de: Candiota, Maximiliano de Almeida, Canoas, Caxias do Sul, Esteio (GRAEFF-TEIXEIRA et al., 1999), Porto Alegre, São Leopoldo, Sapucaia do Sul e Tramandaí
(MARTINS et al., 2015). Com os processos de migrações para o sul do Brasil, juntamente com as deficiências de saneamento e condições favoráveis para criadouros de moluscos, como os extensos campos alagadiços de arrozais e a ocorrência de moluscos suscetíveis nestes locais, são fatores que favorecem a expansão da endemia na região. Sabendo que há portadores de esquistossomose no Rio Grande do Sul, que B. t. guaibensis ocupa uma vasta área nesse estado e que há poucos trabalhos relacionados à suscetibilidade desta subespécie, torna-se relevante um estudo mais aprofundado sobre a suscetibilidade desta subespécie frente às diversas linhagens de S. mansoni.
3- Objetivo
Estudar a suscetibilidade de populações de Biomphalaria tenagophila guaibensis do município de Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim, localizados no estado do Rio Grande do Sul, frente às diferentes linhagens de Schistosoma mansoni.
4- Planejamento experimental
O presente trabalho foi dividido em três etapas:
4.1- Atração miraxonal
O experimento de atração miraxonal consistiu em testar a capacidade de atração que os moluscos B. t. guaibensis do Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim exerceram sobre os miracídios das linhagens Bahia, Sergipe, BH, SJ e SJS do S. mansoni.
4.2- Verificação da suscetibilidade à diferentes linhagens de S. mansoni
Neste estudo avaliou-se a liberação de cercárias nos moluscos B. t guaibensis de Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim após a exposição destes aos miracídios das linhagens Bahia, Sergipe, BH, SJ e SJS do S. mansoni.
4.3- Estudo histopatológico dos moluscos
Este estudo consistiu em avaliar o desenvolvimento dos esporocistos primários das linhagens Bahia, Sergipe, BH, SJ e SJS do S. mansoni em B.t. guaibensis do Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim.
5- Material e métodos
5.1- Populações de moluscos utilizadas
Foram utilizadas populações de moluscos procedentes da Reserva Ecológica do Taim e do Capão do Leão, ambos situados no estado do Rio Grande do Sul. Os moluscos procedentes da Reserva Ecológica do Taim foram coletados no dia 14 de janeiro de 2013 em um banhado próximo as mediações da bomba d’água na localização geográfica: 32°32’28.23”S e 52°32’19.59”W (Figura 4). Os moluscos provenientes do município de Capão do Leão foram coletados no dia 16 de abril de 2014 em um pequeno corpo d’agua localizado próximo da Barragem-Eclusa que fica na extremidade nordeste do Canal São Gonçalo, a 3km distante da cidade de Pelotas, na seguinte localização geográfica: 31°48'36.50"S e 52°23'26.96"W (Figura 5) (MARTINS, 2015).
Ponto de coleta
Figura 4. Ponto de coleta dos moluscos provenientes da Reserva Ecológica
5.2- Identificação dos moluscos
Após a coleta, parte dos caramujos foram levados para a Universidade Federal de Pelotas (RS) e a outra destinada a Universidade Estadual de Campinas. Posteriormente eles foram identificados morfologicamente e molecularmente por Demetrius da Silva Martins como B. t. guaibensis (MARTINS, 2015). Uma quantidade de 10 moluscos do Capão do Leão e 10 moluscos da Reserva Ecológica do Taim, da geração F1 mantidos na Unicamp, foram dissecados e classificados de acordo com os caracteres morfológicos propostos por Paraense (1975, 1984), confirmando tal subespécie (figuras 6 e 7).
Figura 5. Ponto de coleta dos moluscos provenientes do município de Capão
do Leão (Foto cedida por Demetrius da Silva Martins).
Canal Santa Bárbara
Eclusa
Figura 6. Complexo peniano de um exemplar da geração F1 de B. t. guaibensis
do Capão do Leão mantido no departamento de Biologia Animal na Unicamp; pp: prepúcio, bp: bainha do pênis, cd: canal deferente.
Figura 7. Diferenças entre o complexo peniano de B. tenagophila de São José
dos Campos (A) e de B. t. guaibensis da Reserva Ecológica do Taim (B); pp: prepúcio, bp: bainha do pênis, cd: canal deferente.
A B pp bp cd pp bp cd pp bp cd
5.3- Linhagens do S. mansoni utilizadas
Foram utilizadas as linhagens Bahia, Sergipe, BH, SJ e SJS de S. mansoni que são mantidas no Laboratório de Parasitologia da Unicamp. A linhagem Bahia foi isolada de turista proveniente do estado da Bahia, sendo mantida em B. glabrata de Belo Horizonte. A linhagem Sergipe foi isolada de B. glabrata de Ilha das Flores, do estado do Sergipe e é mantida em B. glabrata simpátrica. A linhagem BH é proveniente de Belo Horizonte (MG) e é mantida em B. glabrata simpátrica. A linhagem SJ é proveniente de São José dos Campos (SP) e é mantida em B. tenagophila simpátrica. A SJS é uma linhagem de São José dos Campos (SP) mantida por passagens sucessivas em B. tenagophila selecionada geneticamente para suscetibilidade ao S. mansoni da linhagem SJ (ZANOTTI-MAGALHÃES et al.,1991). A manutenção dos ciclos das diversas linhagens foi realizada através de sucessivas passagens por camundongos (Mus musculus) e moluscos das espécies B. glabrata e B. tenagophila.
5.4- Criação e manutenção dos moluscos em laboratório
Os moluscos foram mantidos em frascos com água declorada e alimentados com alface hidropônica “ad libitum”. Através de fecundações cruzadas, obtiveram-se populações descendentes dos caramujos, que foram colocados em frascos separados das gerações parentais e mantidos da mesma forma que estes.
5.5- Atração miraxonal
A atração miraxonal foi realizada em um aparelho de vidro composto de duas câmaras circulares com 30mm de diâmetro e 20mm de profundidade, unidas por um canal de 40mm de comprimento, 11 mm de largura e 10mm de profundidade (BRASIO et al., 1985) (Figura 8). Após o preechimento do aparelho com água declorada colocou-se um exemplar de molusco em uma das câmaras e no canal foram colocados 10 miracídios correspondentes a uma das linhagens de S. mansoni a serem testadas. A outra câmara foi preenchida somente com água declorada. O conjunto recebeu iluminação homogênea e após 15 minutos contou-se o número de miracídios presentes em cada uma das câmaras (figura 9). Para realização deste experimento foram utilizados 20 caramujos da geração F1 da Reserva Ecológica do Taim e 10 caramujos da geração F1 do Capão do Leão para cada linhagem do S. mansoni. Para
os grupos controles foram utilizados 10 moluscos de cada população expostos à diferentes linhagens do S. mansoni de acordo com a tabela 1.
5.6- Verificação da suscetibilidade à diferentes linhagens de S. mansoni
Para verificar a taxa de infecção foram utilizados 50 exemplares da geração F1 de cada população de B. t. guaibensis medindo entre 5 e 7 mm. Os exemplares foram expostos individualmente a 10 miracídios de cada uma das linhagens. Após três semanas, os moluscos foram examinados duas vezes na semana e por três meses para verificação da liberação de cercárias. Para esta finalidade os moluscos foram
Figura 8. Aparelho de vidro utilizado no experimento de atração miraxonal.
expostos à luz fornecida por lâmpadas incandescentes de 60 W por 2 horas. As águas dos frascos dos moluscos foram trocadas semanalmente, ocasião em que foi anotada a ocorrência de mortalidade. Durante o experimento os moluscos foram alimentados com alface “ad libitum”. O experimento foi realizado com grupos controles compostos por 30 moluscos de cada população expostos à diferentes linhagens do S. mansoni de acordo com a tabela 1.
5.7- Estudo histopatológico dos moluscos
No exame dos cortes histológicos realizados, analisou-se a viabilidade dos esporocistos e a ocorrência de reação amebocitária em torno das larvas de S. mansoni. Foram utilizados 60 exemplares de moluscos da geração F2 da Reserva Ecológica do Taim e 60 exemplares de moluscos da geração F2 do Capão do Leão. Os caramujos foram expostos individualmente a 100 miracídios das diversas linhagens de S. mansoni. Após a exposição, os caramujos em grupos de três foram sacrificados e fixados desde 24 horas de infecção até 96 horas para a realização de cortes histológicos que foram examinados em microscópio óptico. Os cortes histológicos seriados de 5μm de espessura foram corados com tricrômico de Gomori (GUARALDO et al., 1981). Analisou-se o desenvolvimento dos esporocistos primários, verificando-se a ocorrência ou não de reação amebocitária.
5.8- Grupos controles
Os experimentos de atração miraxonal e suscetibilidade foram realizados também com os grupos controles representados na tabela 1.
População de molusco Linhagens do S. mansoni
B. glabrata BH Bahia
B. glabrata SE Sergipe
B. glabrata BH BH
B. tenagophila SJ SJ
B. tenagophila SJS SJS
Tabela 1. Populações de moluscos e linhagens de S. mansoni utilizadas como grupo controle dos experimentos
5.9- Análise estatística
Os experimentos foram completamente aleatorizados. Os dados obtidos foram submetidos a análise estatística utilizando-se o software JMP 12 do SAS Institute Incorporated. A análise da atração miraxonal baseou-se em regressão logística. As razões de chances de todas as comparações pareadas dos grupos experimentais foram testadas. Na análise dos esporocistos considerou-se a procedência do molusco (Capão do Leão ou Reserva Ecológica do Taim), o tempo de infecção (24, 48, 72 e 96 horas), a linhagem do S. mansoni (Bahia, Sergipe, BH, SJ e SJS) a viabilidade (viável ou inviável) e a reação amebocitária (com reação ou sem reação). Análise de variância e o teste de Tukey foram utilizados considerando o nível de significância de 5%.
6- Resultados
6.1- Atração miraxonal
Os moluscos B. t. guaibensis do Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim apresentaram altas taxas de atração miraxonal. Os moluscos do Capão do Leão atraíram mais as linhagens Bahia, SJS e Sergipe, sendo Bahia a linhagem mais atraída destas três, com 84% dos miracídios atraídos. A linhagem do S. mansoni menos atraída foi a BH, com 60% de atração. Comparando a taxa de atração destes moluscos com a taxa de atração dos grupos controles, observou-se que estes moluscos atraíram os miracídios das linhagens Bahia, SJS e Sergipe semelhantemente aos grupos controles. A atração dos miracídios das linhagens SJ e BH foi significativamente menor ao da atração exercida pelos grupos controles (Figura 10 A).
Os moluscos B. t. guaibensis da Reserva Ecológica do Taim também atraíram mais os miracídios das linhagens Bahia, Sergipe e SJS, sendo a linhagem Bahia também a mais atraída com 87% de atração. Assim como os moluscos do Capão do Leão, a linhagem menos atraída foi a BH, com 62% de atração. A atração dos miracídios das linhagens Bahia e Sergipe pelos moluscos do Taim foi semelhante à atração exercida pelos grupos controles, entretanto, a atração dos miracídios das linhagens SJ, SJS e BH foi significamente menor comparando com a atração dos grupos controles (figura 10 B). Comparando os moluscos B. t. guaibensis de Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim observou-se que a atração pelas diferentes
linhagens do S. mansoni exercida por estes dois moluscos não apresentou diferenças significativas (figura 10 C).
0 20 40 60 80 100 Bahia Sergipe BH SJ SJS % d e a tra ç ã o d o s m ira c íd io s Linhagens do S. mansoni
Atração miraxonal de B. t. guaibensis do Capão do Leão e dos grupos controles
B.t.g.Capão do Leão Grupo controle
A A A A A A B A A B A 0 20 40 60 80 100 Bahia Sergipe BH SJ SJS % d e a tra ç ã o d o s m ira c íd io s Linhagens do S. mansoni
Atração miraxonal de B. t. guaibensis do Taim e dos grupos controles
B.t.g.Taim Grupo controle
B B B A A A A A A A B 0 20 40 60 80 100 Bahia Sergipe BH SJ SJS % d e a tra ç ã o d o s m ira c íd io s Linhagens do S. mansoni
Atração miraxonal de B. t. guaibensis do Capão do Leão e de Taim
B.t.g.Capão do Leão B.t.g.Taim
A A
A A
A A A
A A A
C
Figura 10. Taxa de atração miraxonal de B. t. guaibensis do Capão do Leão e dos grupos controles (A); Taxa
de atração miraxonal de B. t. guaibensis da Reserva Ecológica do Taim e dos grupos controles (B); Taxa de atração miraxonal de B. t. guaibensis do Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim (C). Colunas com a mesma letra não difere significativamente (p = 0.05).
6.2- Suscetibilidade e mortalidade dos moluscos submetidos à infecção por diversas linhagens de S.mansoni
6.2.1- Taxa de infecção
Os moluscos B. t. guaibensis do Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim expostos às diferentes linhagens do S. mansoni não eliminaram cercárias durante o período de 12 semanas do estudo. Entretanto, os moluscos correspondentes aos grupos controles eliminaram cercárias obtendo-se taxas de infecção significativamente diferentes. A maior taxa de infecção foi verificada em B. glabrata exposta à linhagem Sergipe de S. mansoni, enquanto que B. tenagophila exposta à linhagem SJ apresentou a menor taxa de infecção (Tabela 2).
Moluscos Linhagem do S. mansoni Nº de moluscos testados (N) Nº de moluscos positivos Taxa de infecção (%) B. glabrata BH Bahia 30 13 43.3 B. glabrata SE Sergipe 30 17 56.6 B. glabrata BH BH 30 11 36.6 B. tenagophila SJ SJ 30 10 33.3 B. tenagophila SJS SJS 27 16 53.3 B. t. guaibensis Capão do Leão Bahia 50 0 0 B. t. guaibensis Capão do Leão Sergipe 50 0 0 B. t. guaibensis Capão do Leão BH 50 0 0 B. t. guaibensis Capão do Leão SJ 50 0 0 B. t. guaibensis Capão do Leão SJS 50 0 0
B. t. guaibensis Taim Bahia 50 0 0
B. t. guaibensis Taim Sergipe 50 0 0
B. t. guaibensis Taim BH 50 0 0
B. t. guaibensis Taim SJ 50 0 0
B. t. guaibensis Taim SJS 50 0 0
Tabela 2. Suscetibilidade dos moluscos B. t. guaibensis e dos grupos controles expostos às diferentes linhagens
6.2.2- Mortalidade dos moluscos
Na figura 11 estão apresentadas as taxas de mortalidade dos moluscos ao final do experimento, após a exposição às diferentes linhagens de S. mansoni. As taxas de mortalidade foram significativamente mais altas nos grupos controles do que em B. t. guaibensis da Reserva Ecológica do Taim e do Capão do Leão. As taxas de mortalidade de B. t. guaibensis foram em torno de 20%, enquanto que dos grupos controles foram em torno de 93%. B. t. guaibensis do Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim apresentaram taxas de mortalidade significativamente semelhantes para todas as linhagens do S. mansoni (P>0.05) (figura 11).
Na terceira semana após os moluscos terem sido expostos às linhagens de S. mansoni e quando deu início ao processo de análise de liberação de cercárias, a maioria dos grupos de moluscos de B. t. guaibensis das duas localidades expostos à cada linhagem do S. mansoni ainda estavam vivos com taxas de sobrevivência variando entre 100 e 88% para os moluscos do Capão do Leão e entre 100 e 90% para os moluscos da Reserva Ecológica do Taim (figura 12 A e B). Todavia, na terceira semana após a exposição dos moluscos dos grupos controles às linhagens do S. mansoni, estes apresentaram taxas de sobrevivência variando entre 37% e 0%, sendo estas taxas semelhantes entre eles e menor do que as taxas observadas nos moluscos do Rio Grande do Sul (figura 12 A, B e C).
0 20 40 60 80 100 120 %
Taxa de Mortalidade
Figura 11. Taxa de mortalidade no final do experimento dos moluscos dos grupos controles, de B. t.
guaibensis de Capao do Leão e da Reserva Ecológica do Taim expostos às diferentes linhagens do S. mansoni.
0 20 40 60 80 100 120 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 S O B R E V IV Ê N C IA ( %) PERÍODO (SEMANAS) B.t.g. Capão do LeãoxBahia B.t.g. Capão do LeãoxSE B.t.g. Capão do LeãoxBH B.t.g. Capão do LeãoxSJ B.t.g. Capão do LeãoxSJS A 0 20 40 60 80 100 120 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 S O B R E V IV Ê N C IA ( %) PERÍODO (SEMANAS) B.t.g. TaimxBahia B.t.g. TaimxSE B.t.g. TaimxBH B.t.g. TaimxSJ B.t.g. TaimxSJS B 0 20 40 60 80 100 120 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 S O B R E V IV Ê N C IA (%) PERÍODO (SEMANAS) BgxBahia BgxSergipe BgxBH BtxSJ BtxSJS C
Figura 12. Sobrevivência dos moluscos B. t. guaibensis de Capao do Leão (A), Reserva Ecológica do Taim
6.3- Estudo histopatológico dos moluscos
6.3.1- Análise dos esporocistos em B. t. guaibensis das duas localidades
De modo geral os moluscos B. t. guaibensis do Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim apresentaram um pequeno número de esporocistos. De 100 miracídios expostos aos moluscos, foram encontrados uma média de 3,3 esporocistos para cada molusco do Capão do Leão e 3,6 para cada molusco da Reserva Ecológica do Taim. O número de esporocistos por tempo de infecção foi semelhante para os moluscos das duas localidades (figura 13 A).
Esporocistos de todas as linhagens de S. mansoni foram observados em B. t. guaibensis (figura 13 B). Na figura 13 C está apresentado o número de esporocistos das diferentes linhagens observados em B. t. guaibensis do Capão do Leão e da Reserva Ecológica do Taim por período de observação. Diferença significativa por linhagem foi observada apenas às 72 horas de infecção quando maior número de esporocistos da linhagem SJS foi verificado.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 24 48 72 96 Nº m é d io d e e s p o ro c is to s
Tempo de infecção (horas)
Esporocistos encontrados em B.t. guaibensis
B.t.g.Capão do Leão B.t.g.Taim A A A A A A A A A 0 2 4 6 8 10 12 14 Bahia Sergipe BH SJ SJS Nº m é d io d e e s p o ro c is to s Linhagens do S. mansoni
Esporocistos encontrados em B.t. guaibensis expostos às diferentes linhagens do S. mansoni
B 0 2 4 6 8 10 12 14 24 48 72 96 Nº m é d io d e e s p o ro c is to s
Tempo de infecção (horas)
Esporocistos encontrados em B.t. guaibensis
Bahia Sergipe BH SJ SJS C A A A A A A A A A A A A AA A A A B B B B A
Figura 13. Média dos esporocistos encontrados em B.t. guaibensis do Capão do Leão e da Reserva Ecológica
no Taim nos variados tempos de infecção (A), na exposição às diferentes linhagens do S. mansoni (B), na exposição às diferentes linhagens do S. mansoni para cada tempo de infecção (C). Colunas com a mesma letra não difere significativamente (p = 0.05).
6.3.2- Análise dos esporocistos em B. t. guaibensis do Capão do Leão
Observamos esporocistos nos moluscos B. t. guaibensis do Capão do Leão em todos os períodos estudados (figura 14 A.). Considerando as linhagens de S. mansoni a que B.t. guaibensis de Capão do Leão foi exposta, às 24, 48 e 96 horas de infecção não foi verificada diferença significativa. No entanto, às 72 horas de infecção, maior número significativo de esporocistos SJS foi visualizado (P = 0.0001) (figura 14 A). Considerando o tempo de infecção, a viabilidade e a reação amebocitária, às 72 horas de infecção a maior parte dos esporocistos estavam viáveis e sem reação amebocitária (figura 14 B).
Percentagem significativamente semelhante de esporocistos viáveis e inviáveis foram observados nos moluscos do Capão do Leão (figura 15 A). Considerando a viabilidade e a presença ou ausência de reação amebocitária, verificou-se diferença significativa constatando-se predominância de esporocistos viáveis sem reação amebocitária sobre os esporocistos viáveis com reação (p= 0.02) (figura 15 B). Em relação aos esporocistos inviáveis, observou-se predominância de esporocistos inviáveis com reação amebocitária na comparação com esporocistos inviáveis sem reação (p= 0) (figura 15 C). Nos períodos estipulados, não foi constatada diferença significativa no número de esporocistos inviáveis das diferentes linhagens considerando a presença e ausência de reação amebocitária (figuras 16 A e B).
Às 96 horas de infecção observou-se esporocistos das linhagens Bahia e SJ viáveis com reação amebocitária (figuras 17 A e figuras 20 A e B), no entanto, esporocistos da linhagem SJ também foram encontrados viáveis e sem reação amebocitária neste mesmo período (figura 17 B e figuras 18 E e F). Às 72 horas de infecção os esporocistos viáveis e sem reação amebocitária foram das linhagens SJ e SJS, entretanto, a linhagem SJS ocorreu em quantidade significamente maior (P<0.001) (figuras 17 B e 18 A, B, C e D). Às 96 horas observamos que apenas os esporocistos da linhagem SJ estavam viáveis e sem reação (figuras 17 B e 18 E e F).
Às 72 e 96 horas de infecção observamos que as células germinativas dos esporocistos das linhagens SJS e SJ se encontravam em processo de crescimento (figuras 20 C e D). Verificamos que os moluscos B. t. guaibensis do Capão do Leão desencadearam um processo de defesa contra os esporocistos das diversas linhagens do S. mansoni com reações amebocitárias leves a moderadas (figuras 19
A, B, D e E), com exceção da linhagem BH que provocou reações amebocitárias intensas (figuras 19 C e 20 E e F). 0 5 10 15 20 24 48 72 96 Nº m é d io d e e s p o ro c is to s
Tempo de infecção (horas)
Esporocistos encontrados em B. t. guaibensis do Capão do Leão expostos às diferentes linhagens
do S. mansoni
B.t.g.Capão do LeãoxBahia B.t.g.Capão do LeãoxSergipe B.t.g.Capão do LeãoxBH B.t.g.Capão do LeãoxSJ B.t.g. Capão do LeãoxSJS A A A AA A A A A B B B A A A A 0 2 4 6 8 10 24 48 72 96 Nº m é d io d e e s p o ro c is to s
Tempo de infecção (horas)
Esporocistos viáveis e inviáveis encontrados em
B. t. guaibensis do Capão do Leão
Viável Inviável A A A A A A B A B A
Figura 14. Esporocistos encontrados em B.t. guaibensis do Capão do Leão para cada linhagem exposta ao
S. mansoni nos tempos de infecção estabelecidos (A). Esporocistos inviáveis e viáveis encontrados em B. t. guaibensis do Capão do Leão nos tempos de infecção estabelecidos (B). Colunas com a mesma letra não difere significativamente (p = 0.05).
0 10 20 30 40 50 60 70 Viável Inviável % d e e s p o ro c is to s
Esporocistos viáveis e inviáveis
A A A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Viável com reação Viável sem reação
% d e es p ro o cis to s
Esporocistos viáveis
B A B 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Inviável com reação Inviável sem reação
% d e es p o ro cis to s Esporocistos inviáveis A B C
Figura 15. Percentagem de esporocistos viáveis e inviáveis encontrados em exemplares de B. t. guaibensis
0 2 4 6 8 10 24 48 72 96 Nº m é d io d e e s p o ro c is to s
Tempo de infecção (horas)
Esporocistos de B.t. guaibensis do Capão do Leão inviáveis com reação amebocítária
Bahia Sergipe BH SJ SJS A A A A A A A A A A A A 0 2 4 6 8 10 24 48 72 96 Nº m é d io d e e s p o ro c is to s
Tempo de infecção (horas)
Esporocistos de B.t. guaibensis do Capão do Leão inviáveis sem reação amebocitária
Bahia Sergipe BH SJ SJS
B
A
A
Figura 16. Esporocistos inviáveis com reação amebocitária (A) e sem reação amebocitária (B) encontrados
0 1 2 3 4 5 24 48 72 96 Nº m é d io d e e s p o ro c is to s
Tempo de infecção (horas)
Esporocistos de B.t. guaibensis viáveis com reação amebocitária Bahia Sergipe BH SJ SJS A AA A A A A A 0 4 8 12 16 20 24 48 72 96 Nº m é d io d e e s p o ro c is to s
Tempo de infecção (horas)
Esporocistos de B.t. guaibensis do Capão do Leão viáveis sem reação amebocitária
Bahia Sergipe BH SJ SJS A A A B A A B
Figura 17. Esporocistos viáveis com reação amebocitária (A) e sem reação amebocitária (B) encontrados em
Figura 18. Esporocistos viáveis encontrados em B.t. guaibensis do Capão do Leão com 72 horas de infecção pelas
linhagens SJ (A), (B) e SJS (C), (D). Esporocistos viáveis encontrados em B.t. guaibensis do Capão do Leão com 96 horas de infecção pela linhagem SJ (E), (F). As setas indicam os esporocistos.
A B
C D
