Microscopia de varredura por sonda aplicada a materiais biológicos

Universidade Estadual de Campinas

Instituto de Física ‘Gleb Wataghin’

MICROSCOPIA DE VARREDURA POR SONDA

APLICADA A MATERIAIS BIOLÓGICOS

Gabriela Simone Lorite

Orientadora: Profa. Dra. Mônica Alonso Cotta

Banca Examinadora

Prof. Dr. Daniel Mario Ugarte (IFGW/UNICAMP)

Prof. Dr. André Avelino Pasa (DF/UFSC)

Dissertação apresentada ao Instituto de Física ‘Gleb Wataghin’ da Universidade Estadual de Campinas como parte dos

requisitos à obtenção do título de Mestre em Física.

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO IFGW - UNICAMP

Lorite, Gabriela Simone

L892m Microscopia de varredura por sonda aplicada a materiais biológicos / Gabriela Simone Lorite. -- Campinas, SP : [s.n.], 2007.

Orientador: Mônica Alonso Cotta.

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Física “Gleb Wataghin”.

1. Biomembranas. 2. Microscopia de força atômica. 3. Anestésico local. 4. Dibucaína. 5. Elasticidade. 6. Cinética de adsorção. I. Cotta, Mônica Alonso. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Física “Gleb Wataghin”. III. Título.

Aos meus pais, que merecem tudo Com todo meu amor

Agradecimentos

À Deus, Nosso Pai, pela oportunidade da vida e do trabalho

À professora Mônica pela orientação, incentivo, mas principalmente pelas conversas de amiga À professora Eneida de Paula (IB/UNICAMP) pela co-orientação e paciência

Aos meus tão amados pais por todas as horas, pela força, pelo amor e por compartilharem um sonho À amiga mais querida Jana pela melhor amizade, pelos almoços no laboratório e todos outros ‘quebra-galhos’

À minha família que mesmo longe sempre torceu por mim

Aos amigos Alexandre, Rita, Ana Cláudia e Scheila por acompanharem a realização do sonho À todas amigas da Morada, em especial à Lílian, Cris, Heloísa, Anne e Ângela pela forte torcida À Humberto, Roberto, Klaus e Vitor pelos velhos tempos do laboratório em que aprendi muito Aos novos companheiros de laboratório Alberto e Guilherme

Ao professor Daniel Ugarte (IFGW/UNICAMP) pelas críticas construtivas À professora Beatriz Guimarães (LNLS) pelos primeiros cristais

À professora Tânia Beatriz Creczynski Pasa (UFSC) pelas sugestões e empréstimos

À professora Anete Pereira de Souza (CBMEG/UNICAMP) e Dra. Suzely Ferraz de Siqueira Tada (CBMEG/UNICAMP) pela parceria e colaboração

À professora Maria Elisabete Darbello Zaniquelli (FFCLRB/USP) e a doutoranda Thatyane Morimoto Nobre (FFCLRB/USP) pelas medidas de última hora e parceria

Aos alunos e funcionários, em especial ao Márcio, do grupo de Biomembranas pela ajuda e paciência À Márcia não só pelo excelente serviço, mas por nos ouvir na hora do ‘stress’

À Rosa, Antônio (Totó) e João Hermes por toda ajuda e dedicação À Armando, Cássia e Maria Ignez pela simpatia e serviços

Ao IFGW pela infra-estrutura necessária e aos seus funcionários pelo apoio À CAPES, FAPESP e CNPq pelo suporte financeiro

Resumo

Apresentamos nesta dissertação o estudo realizado em cristais de proteínas e membranas modelo (bicamadas lipídicas) utilizando microscopia de força atômica (AFM) como principal técnica de análise. Para os cristais de proteína foram adquiridas imagens topográficas e óticas com a finalidade de obtermos maiores informações sobre o processo de cristalização dos mesmos. No caso das membranas modelo investigamos sua interação com o anestésico local dibucaína (DBC) através de imagens de topografia e fase durante a adição gradual da DBC à solução em contato com a bicamada, além de medidas adicionais de cinética de adsorção e elasticidade.

Os cristais de proteína forma preparados pelo método de difusão de vapor em gota posicionada. Para a realização das imagens dos cristais em sua solução de crescimento (altamente viscosa) foi desenvolvida uma metodologia com a finalidade de evitar o amortecimento da vibração da alavanca. Imagens topográficas do cristal de proteína da bactéria patogênica Mycobacterium Tuberculosis) mostraram que a técnica de AFM permite avaliar o grau de ordem cristalina, bem como a existência de defeitos. No cristal da proteína da bactéria Xylella Fastidiosa, foi observada a presença de uma superfície suave com alguns terraços e degraus com altura de aproximadamente 3nm. Também foram observadas formações anisotrópicas na superfície do cristal, em forma de nanofios, sugerindo uma rota diferente de cristalização em condições de baixa concentração de proteína. A partir dessa observação, variamos as condições de crescimento, revelando mudanças significativas nas taxas de crescimento ao longo das diferentes direções do cristal que favoreciam o aumento da anisotropia de forma.

As bicamadas lipídicas foram preparadas a partir dos fosfolipídios: fosfatidilcolina de ovo (EPC) e dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) pelo método de fusão de vesículas. Imagens de topografia e fase foram adquiridas por AFM, tanto para caracterização topográfica, bem como para observação da ação da DBC (adicionada gradualmente durante a aquisição) sobre a bicamada. As imagens AFM mostram que as bicamadas EPC se formam em domínios sobre a mica e não apresentam um formato típico nem distribuição uniforme. Por outro lado, bicamadas de DMPC se formam em domínios extensos com multi camadas e de maneira mais homogênea quando comparadas com as bicamadas de EPC.

No caso da EPC, observamos a ação da DBC em função do aumento de sua concentração e ao longo do tempo. A seqüência de imagens topográficas mostra o desaparecimento de arranjos lipídicos com o aumento da concentração de DBC. Também observamos que para concentrações elevadas (5mM) o efeito da DBC na membrana é muito drástico. Já para bicamadas de DMPC, observamos as alterações morfológicas para única concentração de DBC (5mM) ao longo do tempo. Neste caso, apesar da concentração elevada, o desaparecimento das bicamadas ocorreu lentamente em comparação com as

Abstract

In this work we report the study on protein crystallization mechanisms and the interaction of local anesthetic dibucaine (DBC) with lipids domains in model membranes by Atomic Force Microscopy (AFM). We have also used optical microscopy for crystals analysis as well as adsorption kinetics and elasticity measurements for the dibucaine-membrane interaction.

Crystallized proteins were prepared by the sitting drop vapor diffusion method. Experimental procedures were developed for imaging the crystal in the very viscous solution where they grow, in order to prevent strong dampening of the cantilever vibration. Topographic images of the protein crystal of the pathogenic bacterium Mycobacterium Tuberculosis show that AFM can provide an evaluation of the crystalline quality and information on existing defects. Moreover, protein crystals of the phytopathogenic bacterium Xylella Fastidiosa were more thoroughly analyzed. The AFM topography of this protein crystal shows smooth surfaces with terraces and step edges about ~3nm high. We also observed anisotropic structures on the surface (nanowires), indicating a possible different route for crystallization at lower protein supersaturations. Based on this interpretation, we have changed growth conditions, thus altering growth rates along the different directions and obtaining a more anisotropic crystal shape.

Supported egg phosphatidylcholine (EPC) and dimyristoylfosfatidylcholine (DMPC) were formed on mica using the vesicle fusion method. Topography and phase images were acquired on the lipid membrane in the absence or presence of DBC. The AFM images show irregularly distributed and sized EPC domains on mica. On the other hand, DMPC formation presents extensive bilayer (on mica) with multi-bilayer domains.

For EPC bilayers, we have observed a progressive decrease in size of the original EPC domains with increasing DBC concentration. At higher concentrations (5mM), the DBC effect was more drastic, causing disruption of the EPC bilayer. In the DMPC bilayer case, at 5mM DBC concentration, we observed a progressive disruption of the domains with time, but more slowly than in the EPC case. In both cases, phase images show the formation of small structures on the bilayer surface, indicating changes in the elastic properties of the bilayers when DBC is present. Adsorption kinetics and elasticity measurements of EPC and DMPC monolayers in the presence of DBC by pendant drop method confirm this hypothesis. A discussion of possible mechanisms for these effects is presented.

Sumário

Capítulo 1 Introdução 1

Capítulo 2 Materiais e Métodos 5

2.1 Cristais de Proteína ...5

2.2 Membrana Modelo...7

2.2.1 Fosfolipídios...7

2.2.2 Preparação dos Lipossomas...9

2.2.3 Método de Fusão de Vesículas...10

2.3 Anestésico Local: Dibucaína...11

Capítulo 3 Técnicas de Caracterização 13

3.1 Microscopia Óptica...13

3.2 Microscopia de Força Atômica (AFM)...13

3.2.1 Descrição da Técnica...13

3.2.2 Análise das Medidas de AFM...18

3.3 Medidas de Tensão Superficial e Elasticidade...21

Capítulo 4 Resultados e Discussões 24

Cristais de Proteína 4.1 Imagens Topográficas...24

4.2 Cristais da Proteína XF2234...26

Bicamadas Sustentadas 4.3 Caracterização das Bicamadas...32

4.3.1 Bicamadas de EPC...32

4.3.2 Bicamadas de DMPC...35

4.4 Interação bicamadas de EPC com anestésico local dibucaína...38

4.5 Interação bicamadas de DMPC com anestésico local dibucaína...44

Capítulo 1

Introdução

A técnica de microscopia, como um termo geral, permitiu grandes progressos em ciências biológicas. Dentre elas, podemos mencionar a microscopia ótica e eletrônica. Contudo, ambas as técnicas possuem limitações fundamentais ao tratarmos de sistemas in vivo. A primeira devido a seu limite de resolução (~200nm), enquanto a microscopia eletrônica exige um processamento da amostra que causa a desidratação da mesma, não permitindo medidas em meio fisiológico. Na década de 80 ocorreu o desenvolvimento das técnicas de microscopia de varredura por sonda (SPM, do inglês

Scanning Probe Microscopy) das quais podemos destacar a microscopia de força atômica (AFM, do

inglês Atomic Force Microscopy). Essa técnica possui algumas vantagens sobre as outras citadas anteriormente quando tratamos sistemas de origens biológicas. Dentre elas, podemos citar a possibilidade de realizar as medidas em meio fisiológico e em tempo real com resolução molecular [1]. Essas características permitem não somente a caracterização morfológica do material, mas também o estudo dinâmico de sistemas biológicos. No final da década de 80 já havia um grande número de publicações descrevendo aplicações de SPM em sistemas biológicos. O DNA foi um dos primeiros materiais biológicos a ser estudado por SPM, do ponto de vista de caracterização morfológica e como sistema dinâmico [2-6]. Desde então, as aplicações da técnica de AFM em ciências biológicas têm apresentado aumento significativo. Dois outros exemplos, dentre a vasta gama de materiais biológicos que têm sido estudados por AFM, são os cristais de proteínas e membranas fosfolipídicas sustentadas.

A cristalografia de proteínas tem se revelado uma maneira eficiente na determinação de sua estrutura tridimensional. Conhecer a estrutura macromolecular da proteína é de extrema importância, pois está diretamente relacionada com sua função. A técnica mais usual, a difração de raios-X, pode revelar a posição tridimensional precisa da maioria dos átomos que compõem a molécula. Contudo, nem sempre os cristais apresentam boa qualidade cristalina e tamanho suficiente para aplicação da técnica. A microscopia de força atômica tem se mostrado um método não apenas alternativo na análise de cristais, mas também complementar a outras técnicas, incluindo a difração de raios-X.

No caso de cristais de boa qualidade, a técnica de AFM permite identificar características particulares da superfície do cristal em solução, que pode ser seu próprio meio de crescimento [1]. Com isso é possível a investigação dos mecanismos, inclusive cinéticos, do crescimento do cristal,

como observado por Land e colaboradores [7]. Após a nucleação (formação inicial) do cristal da proteína canavalin, este foi fixado em substrato de vidro e colocado em contato com uma mistura da proteína com a solução de crescimento para medida em fluido no AFM. Eles observaram que o crescimento ocorre por fluxo de degraus monomoleculares e também identificaram a formação de um grande número de clusters com diâmetro de até 10 moléculas sobre os terraços definidos por esses degraus. Por outro lado, pelo mesmo procedimento de observação para cristais do vírus CMV (do inglês, cucumber mosaic vírus), Malkin e McPherson [8] observaram a formação de defeitos locais durante o crescimento, que se propagam pelo volume do cristal. Sob esse ponto de vista, a técnica de AFM permite observar defeitos associados a impurezas, bem como o grau de ordem cristalina associada a diferentes mecanismos de crescimento. A observação estática da superfície de cristais, embora mais limitada, também pode fornecer informações sobre o processo de crescimento, por analogia aos modelos e resultados reportados na literatura.

Este é um dos objetivos desta dissertação: a análise de cristais que, não difratam com resolução suficiente para a obtenção da estrutura tridimensional da proteína que os compõem. As imagens topográficas foram adquiridas por AFM para cristais de duas proteínas distintas. Primeiramente, o cristal da proteína Alkil-hidroperoxido-redutase tipo E (proteína da bactéria patogênica Mycobacterium Tuberculosis), cedidos pela Dra. Beatriz Guimarães (LNLS), foi analisado qualitativamente, para o desenvolvimento da metodologia de medida e determinação das possíveis contribuições com AFM. Já no segundo caso, estudamos o cristal da proteína extraída da bactéria fitopatogênica Xylella Fastidiosa, preparados pelas Dra. Suzely Ferraz de Siqueira Tada e pela Dra. Anete Pereira de Souza (CBMEG – UNICAMP), não somente através da topografia adquirida no AFM, mas também pela observação do formato macroscópico do cristal por microscopia ótica. Essa última técnica nos permite verificar a influência que diferentes condições de cristalização provocam na forma do cristal.

Nosso segundo tema de estudo é a interação entre membranas fosfolipícas e o anestésico local dibucaína (DBC). O modelo de membranas biológicas atualmente aceito é o mosaico-fluido, proposto em 1972 por Singer e Nicholson [9]. O modelo consiste em três proposições importantes: estrutura da membrana em bicamada (grupamentos hidrofílicos expostos a água e cadeias acilas formando rede hidrofóbica), inserção de proteínas ao longo dessa estrutura básica e possibilidade de movimento livre

então, e cada vez mais, estes sistemas têm sido estudados a fim de responder a pergunta: qual a

contribuição ou influência da ‘parte’ lipídica nas funções das membranas e como afeta a interação da membrana, como um todo, com outras moléculas (por exemplo, no nosso caso, anestésicos locais)?

Na busca da resposta a essa pergunta, pesquisas com diferentes abordagens em membranas modelo têm sido realizadas, através de várias técnicas, entre elas a microscopia de força atômica. Num caso mais simples, podemos citar a caracterização da morfologia e estabilidade de domínios∗ simples formados por único lipídio como foi estudado por Spangenberg e colaboradores [11] ou, ainda, a caracterização de domínios formados por diferentes lipídios como foi realizada por Burns [12] através de AFM acoplado a microscopia de fluorescência. Ainda podemos citar estudos dinâmicos das propriedades desse sistema utilizando a técnica de AFM, como por exemplo, a investigação da transição de fase em domínios do fosfolipídio DOPC (dioleilfosfatidilcolina) induzida pela temperatura realizada por Leonenko e colaboradores [13].

Berquanda, Mingeot-Leclercqb e Dufrêne [14], em trabalho recente (2004), utilizaram a técnica de AFM para a visualização em tempo real da ação do antibiótico azitromicina em membrana modelo de DPPC (dipalmitoilfosfatidilcolina). Outro trabalho bem recente (2006), dos autores

Leonenko, Finot e Cramb [15], mostra um estudo sobre a interação entre um anestésico geral

(halotano) com membranas fosfolipídicas de DPPC. Eles observaram a redução da altura dos domínios lipídicos após a adição de halotano e um comportamento idêntico ao de transição de fase induzida pelo aumento da temperatura. Os anestésicos gerais diferem dos anestésicos locais não somente pela composição química, mas por agirem sobre os axônios ao invés das transmissões sinápticas [16].

Os anestésicos locais AL compreendem grande número de moléculas com diferentes composições químicas; seu mecanismo da ação ainda não está completamente elucidado. Várias teorias sobre esse mecanismo são descritas na literatura. Podemos classificá-las em duas categorias: a que atribui o efeito anestésico à ligação direta do AL na proteína canal de sódio e a que considera a interação do AL com os lipídios da membrana (hipótese do lipídio). O efeito de um anestésico local em bicamadas lipídicas ainda não foi observado por AFM. De maneira geral, analisando a interação dos anestésicos locais somente com a região lipídica da membrana, de Paula e Schereier [17] observaram efeitos de expansão de bicamada, aumento da fluidez e alteração na temperatura de transição de fase por técnicas de ressonância nuclear magnética (NMR) e raios-X.

∗

Dentro desse contexto, o objetivo nessa segunda parte do trabalho de mestrado é investigar a ação do anestésico local dibucaína (DBC) em membranas fosfolipídicas a fim de elucidar o mecanismo de ação desse AL em particular por microscopia de força atômica. A escolha da DBC foi feita pela existência de fortes evidências, obtidas com várias técnicas (ressonância paramagnética eletrônica (EPR), fluorescência e NMR), de que a DBC age na superfície da bicamada [18]. Estes resultados foram obtidos pelo grupo de biomembranas-UNICAMP supervisionado pela professora Eneida de Paula, nossos colaboradores nesta parte do trabalho. Além disso, Nakagawa e colaboradores [19, 20] observaram, através de técnicas de RMN, que a DBC interage com as membranas aumentando a mobilidade das cadeias acila e alterando a cabeça polar dos lipídios. Para nosso trabalho, inicialmente, escolhemos o fosfolipídio EPC (fosfatidilcolina de ovo) por se tratar de um lipídio muito utilizado por nossos colaboradores. Contudo, enfrentamos alguns problemas na formação da bicamada deste lipídio; por este motivo, utilizamos também um segundo fosfolipídio, o DMPC (dimiristoilfosfatidilcolina). Desta forma, num primeiro momento caracterizamos as bicamadas fosfolipídicas de EPC e DMPC sustentadas em mica utilizando imagens de topografia e fase adquiridas por AFM. Numa segunda etapa, investigamos a interação das bicamadas de EPC com o aumento gradual de DBC e a interação das bicamadas de DMPC com uma concentração fixa de DBC em função do tempo, pelos mesmos métodos de medida. Também realizamos medidas de tensão superficial e elasticidade de monocamadas de ambos os lipídios acima na presença de DBC a fim de observar possíveis alterações nas propriedades elásticas induzidas por este AL. Estas últimas medidas foram realizadas juntamente com a doutoranda Thatyane Morimoto Nobre e a Dra. Maria Elisabete Darbello Zaniquelli do Departamento de Química da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP. Com o objetivo de dar uma seqüência lógica para os pontos acima mencionados, esta dissertação está estruturada como segue. A descrição dos materiais e métodos utilizados para a preparação das amostras observadas é feita no capítulo 2. No capítulo 3 apresentamos as técnicas empregadas na caracterização da morfologia dos cristais e das bicamadas, na observação da interação membrana-anestésico, assim como para investigar as propriedades elásticas no caso das bicamadas e DBC.

No capítulo 4 são descritos os resultados experimentais e discussões gerais. No caso dos cristais, são apresentadas as imagens topográficas de cristais de duas proteínas diferentes, bem como

futuras são apresentadas no capítulo 5. Enfim, incluímos no final dessa dissertação um apêndice onde apresentamos e discutimos os problemas enfrentados na utilização da EPC em bicamada.

Capítulo 2

Materiais e Métodos

2.1 Cristal de Proteína

A proteína em estudo é extraída da bactéria fitopatogênica Xylella Fastidiosa [21], denominada por XF2234, onde o número 2234 representa o vetor da proteína extraída e a sigla XF vem do nome da bactéria. Essa proteína está envolvida na estabilização da parede celular da bactéria durante episódios que exigem uma adaptação para a sua sobrevivência. Esses episódios podem ser de origem fisiológica temporária (por exemplo, formação de esporos) ou mudanças mais drásticas como um choque térmico.

Para o crescimento do cristal, a primeira etapa é a obtenção da proteína. Esse processo dura dias e envolve os procedimentos de extração do DNA da bactéria, clonagem do gene da proteína de interesse e, por fim, a expressão (produção), extração e purificação da proteína [22]. Uma vez obtida a solução de proteína, pode-se dar início a etapa de cristalização.

O processo de cristalização ocorre em dois estágios: nucleação e crescimento. Para ocorrer a nucleação, é necessário levar a proteína a um estado de supersaturação. Existem duas possibilidades para se atingir essa situação: aumentando a concentração da proteína ou a concentração do agente precipitante presente na solução da proteína. Ao atingir o estado de supersaturação, aumenta a probabilidade de moléculas da proteína formarem núcleos cristalinos estáveis (nucleação). Após a nucleação, o estágio de crescimento se inicia. Todo o processo, da nucleação à formação final do cristal de proteína, pode durar horas, dias, e até meses.

Existem várias técnicas de cristalização de proteína [23]. No nosso caso, foi utilizado o método de difusão de vapor em gota posicionada [24]. O método consiste em colocar uma gota composta de uma mistura da solução de proteína e o reagente precipitante em contato com o mesmo reagente em um reservatório (figura 2.1). Tipicamente a gota apresenta menor concentração do reagente do que o reservatório. Uma vez que o sistema se apresente bem vedado, moléculas de água se difundem da gota para o reservatório até que se atinja o equilíbrio, ou seja, que as concentrações de

reagente da gota e do reservatório sejam aproximadamente a mesma. Esse processo leva ao aumento da concentração de ambos, proteína e reagente, na gota, atingindo o estado de supersaturação.

(A) (B)

Figura 2.1 – (A) placa de crescimento; (B) esquema do ‘poço’ e reservatório da placa de crescimento.

Infelizmente, não existe uma lógica para a escolha de um reagente precipitante, nem para a condição de concentração de proteína/reagente. Por esse motivo, centenas de testes devem ser feitos para determinar a melhor condição de cristalização. Existem no mercado kits de reagentes precipitantes para testes de cristalização de proteínas. Após a realização de vários testes, utilizando estes kits, chegou-se a condições ideais que permitiram a cristalização da proteína XF2234.

Desta forma, depois de três dias de crescimento, foram obtidos cristais da proteína XF2234, depositando-se uma gota de 2µl de proteína a 11mg/ml e 2µl da solução contendo 20% isopropanol, 100 mM HEPES-Na (pH 7.5), 200 mM citrato de sódio (kit JBScreen 9, Jena, Alemanha) no ‘poço’ da placa de crescimento. Esses cristais foram utilizados para observação topográfica no AFM. Já para observação na microscopia ótica foram variadas a concentração de proteína e a proporção proteína/solução de crescimento.

Os cristais de proteína XF2234 foram preparados e fornecidos pela Dra. Suzely Ferraz de Siqueira Tada e pela Dra. Anete Pereira de Souza, do Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) - UNICAMP. Outros cristais que também serão mencionados na seção 4.1 foram fornecidos pela Dra. Beatriz Guimarães do LNLS.

Proteína + precipitante

reservatório

2.2 Membrana Modelo

2.2.1 Fosfolipídios

Os fosfolipídios são uma classe de moléculas anfifílicas que compõem a maior parte dos lipídios de membrana. Essas moléculas são compostas de uma cabeça polar (hidrofílica) e duas cadeias de hidrocarbonos (hidrofóbicas) – figura 2.2 [25].

Figura 2.2 – esquema da estrutura geral dos fosfolipídios.

Os fosfolipídios diferem primariamente no tamanho da cadeia de carbonos, forma, polaridade, e na carga dos grupos-x das cabeças polares (podendo ser negativa ou zwiteriônica∗). As cadeias de hidrocarbonos, além de variarem em números de carbonos, também podem apresentar ou não insaturações (ligações duplas entre carbonos da cadeia). Essas variações estão correlacionadas com a temperatura de transição de fase (Tc) e, conseqüentemente, com a ordenação e fluidez da membrana.

Abaixo da temperatura de transição de fase a membrana se apresenta na fase gel, enquanto acima desta temperatura se apresenta na fase líquido cristalina (figura 2.3). Na fase gel, os lipídios da membrana se apresentam mais ordenados formando uma estrutura mais compacta e menos fluida (menor movimentação). Já na fase líquido cristalina, os lipídios se apresentam ‘desorganizados’, com

∗

maior movimento, e assim, maior fluidez. As membranas biológicas sempre se encontram na fase líquido cristalina.

Figura 2.3 – esquematização das fases gel e liquido cristalina da membrana.

Convém mencionar ainda que, a fase líquido cristalina é classificada em dois estados: termotrópico e liotrópico [10]. Esses estados diferem pelo número de componentes no sistema. O termotrópico envolve somente um componente, enquanto o liotrópico é composto por dois ou mais componentes, como por exemplo lipídio-água (nosso caso de interesse). O estado liotrópico pode ser dividido em diferentes arranjos lipídicos (também denominados por fases). Assim, podemos ter as fases lamelar, cúbica, hexagonal e micelar, dependendo das condições do meio e do tipo de lipídio. Em particular, a fase micelar ocorre somente para lipídios que apresentam uma única cadeia acila; no caso dos fosfolipídios com duas cadeias acilas, por uma questão de minimização da energia envolvida, ocorre a formação de lipossomas. A esquematização das fases lamelar e hexagonal e a formação em lipossomas está representada na figura 2.4.

(A) (B) (C)

Neste trabalho, utilizamos os fosfolipídios: fosfatidilcolina de ovo (EPC) e dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), ambos da Avanti Polar Lipids, Inc (figura 2.5). Esses lipídios possuem a mesma cabeça polar, contudo apresentam cadeias de hidrocarbonos diferentes. A EPC, por se tratar de um fosfolipídionatural, é uma mistura de lipídios cuja composição média apresenta uma cadeia de 16 carbonos sem insaturação e uma cadeia de 18 carbonos com duas insaturações, com Tc= – 5oC [10]. Diferentemente, a DMPC é um lipídio sintético com ambas cadeias acilas

apresentando 14 carbonos sem insaturações e Tc = 23oC [10]. Essas características implicam que

membranas de EPC são mais fluidas e, assim, menos ordenadas que membranas compostas de DMPC.

Figura 2.5 – estrutura dos fosfolipídios: (a) EPC e (b) DMPC.

2.2.2 Preparação dos lipossomas

O método utilizado para a preparação das bicamadas sustentadas (seção 2.2.3) é baseado na utilização de lipossomas, que foram preparados como segue.

Alíquotas de EPC e DMPC foram retiradas de soluções estoque e ressuspensas em clorofórmio, o qual foi evaporado sob fluxo de N2 seguido de vácuo por 2 horas para que não

houvesse clorofórmio residual. Foram obtidos lipossomas multilamelares*1 (LMV) por adição de

*1 _{Lipossomas formados por mais de uma bicamada.}

água deionizada e agitação vigorosa, em vortex por 3 minutos. Os lipossomas unilamelares*2 (SUV) foram preparados a partir de LMV por dois procedimentos:

• Sonicação: LMV submetidos a sonicação (sonicador Sonics & Materials Inc. modelo

VC50 – Laboratório de Biomembranas, IB/UNICAMP) em tubos mergulhados em banho de gelo. A sonicação foi feita em ciclos alternados de 15s para evitar o aquecimento da amostra. Esse processo foi utilizado para EPC para uma concentração final de 0.1mM.

• Extrusão: LMV passados por filtros de 0.1µm (Poretics) por 12 vezes consecutivas utilizando um extrusor (Lipex Biomembranes Inc. – Laboratório de Biomembranas, IB/UNICAMP). Esse processo foi utilizado para DMPC, para uma concentração final de 5mM. A concentração mais alta que no caso anterior é exigência deste tipo de procedimento.

Com a finalidade de desestabilizar e induzir a ruptura dos lipossomas na superfície, para a formação de bicamadas fosfolipídicas sustentadas, em algumas soluções foi adicionado fosfato de cálcio, conforme consta na tabela 2.1 (seção 2.2.3). Acredita-se que o papel do Ca++ como agente fusogênico [26-28] está associado a sua capacidade de se ligar aos grupamentos fosfato de dois lipídios adjacentes, aproximando-os e desestruturando o arranjo lipídico (em nosso caso, os lipossomas).

2.2.3 Método de Fusão de Vesículas

As bicamadas fosfolipídicas sustentadas, tanto de EPC quanto de DMPC, foram preparadas através do método de fusão de vesículas [29, 30, 32]. Este método consiste em depositar lipossomas em solução sobre uma superfície plana. Embora muitos autores utilizem esse método [12, 15, 29-32], o processo de formação da bicamada via fusão de vesículas é ainda desconhecido no nível molecular. Uma das hipóteses é a existência de dois estágios (figura 2.6) [29, 32]. Primeiramente, os lipossomas

deposição, os lipossomas se deformam, tensionando as ligações das bordas e provocando a ruptura do lipossoma. Por fim, ocorre uma reorganização dos fosfolipídios resultando na bicamada sustentada.

(A) (B) (C)

Figura 2.6 – Ilustração esquemática da formação das bicamadas fosfolipídicas sustentadas via método de fusão de vesícula. (a) o lipossoma interage com a superfície. (b) o lipossoma se rompe. (c) os fosfolipídios se reorganizam nas bordas para minimizar as interações hidrofóbicas resultando na formação da bicamada.

O substrato utilizado para a deposição dos lipossomas foi mica tipo muscovita (TED PELLA, INC) por apresentar superfície plana carregada negativamente quando em contato com meio aquoso [1].

Desta forma, para a preparação de cada amostra foi depositado um determinado volume de solução de lipossomas (SUV) sobre a mica, seguido de um período de incubação (tempo de repouso) a temperatura ambiente. A amostra é posteriormente hidratada no momento de início das medidas. As características de preparação de cada uma das amostras detalhadas no capítulo 4 estão descritas na tabela 2.1.

Concentração Volume Tempo de Amostra Fosfolipídio de lipídio na solução depositado na mica repouso antes da hidratação

EPC_1 EPC* 0.1mM 2µl 3 horas

EPC_2 EPC* 0.1mM 60µl 4 horas

EPC_3 EPC* 0.1mM 60µl 2 horas

DMPC DMPC 2mM 10µl 2 horas

Tabela 2.1 – Características da preparação de cada amostra. (*) indica que foi adicionado fosfato de cálcio após o processo de sonicação na proporção lipídio:Ca++ (1:1).

A dibucaína (DBC) apresenta estrutura diferenciada dos demais anestésicos locais de uso clínico (figura 2.7). Seu anel rígido e volumoso impõe restrições à molécula e deve modular sua interação em membranas. Em pH fisiológico, as moléculas de DBC encontram-se presentes nas formas: carregada (protonada) e neutra (desprotonada). Em nossos experimentos, o pH se apresentava sempre abaixo do pH fisiológico e, assim, a DBC se encontrava em forma protonada. Como já citamos no capítulo 1, sob essas condições, a interação da DBC com membranas modelos é de caráter superficial, e depende de interações eletrostáticas com a cabeça polar dos fosfolipídios [19, 20, 33].

Figura 2.7 – representação da molécula de DBC em sua forma desprotonada

A DBC também é caracterizada por ser uma molécula anfifílica solúvel (tensoativa). Isto implica, entre outras características, que acima de uma determinada concentração (denominada concentração micelar critica, CMC) ela se agrupa em micelas. Na literatura há controvérsias sobre o valor de CMC para a DBC. Malheiros, Meirelles e de Paula [34] encontraram o valor de 66mM, contudo Matsuki e colaboradores [35], através de medidas de tensão superficial, obtiveram resultados que indicam que até uma concentração de 140mM a DBC ainda não atingiu sua CMC. Baseado nesses dados da literatura podemos afirmar que em nossos experimentos estamos abaixo da CMC da DBC (utilizamos concentrações até 30mM) e, portanto, não há a formação de micelas na solução.

Desta forma, com o propósito de investigar possíveis mudanças superficiais provocadas pelo anestésico em membranas lipídicas através da microscopia de força atômica, volumes de solução de DBC (Sigma Chem. Co.) diluída em água foram adicionados à solução em contato com as bicamadas fosfolipídicas sustentadas, aumentando a concentração de DBC gradualmente. Para medidas de tensão superficial e elasticidade foram preparadas soluções de DBC em diferentes concentrações.

C

O

NH

(CH

)

N

C

H

C

H

N

H

C

O

Capítulo 3

Técnicas de Caracterização

3.1 Microscopia Ótica

Imagens de microscopia óptica foram realizadas num sistema óptico acoplado ao AFM (Auto

Probe CP - Park Scientific Instruments) do nosso laboratório. Para estas imagens foi utilizada uma

objetiva com distância de trabalho longa (modelo M Plan Apo SL 20x - Mitutoyo) com magnificação de até 100 vezes. Essas imagens possibilitaram determinar diferentes formas do cristal dependendo da concentração de proteína utilizada no processo do crescimento, assim como detectar possíveis alterações no seu formato ao longo do tempo. Para a aquisição dessas imagens não foi necessária a remoção dos cristais de dentro da placa de crescimento.

3.2 Microscopia de Força Atômica (AFM) 3.2.1 Descrição da Técnica

Esta técnica de microscopia consiste em monitorar a força entre uma ponta de prova e a superfície da amostra. Existem várias forças de interação entre ponta-amostra. Dependendo do regime de forças envolvido, repulsiva ou atrativa, existem três modos de operação para a microscopia de força atômica (figura 3.1). Num regime de força repulsivo a ponta e amostra estão em contato, por essa razão denominamos modo contato. Devido à delicadeza de amostras biológicas, esse modo de operação pode causar deformações e danos na superfície analisada, uma vez que a força e área envolvidas na medida são pequenas (na ordem de 10-7N e nm2, respectivamente) provocando uma grande pressão no local da medida. Assim, no modo não contato não existe um contato físico direto entre ponta e superfície (regime de força atrativo) preservando a qualidade dos resultados. As

medidas ainda podem ser realizadas no modo contato intermitente onde existe a inversão no tempo entre os regimes atrativo e repulsivo.

Figura 3.1 – Comportamento qualitativo da dependência da força com a distância entre a ponta de prova e a superfície da amostra.

Para monitorar a força de interação entre ponta e amostra utilizamos uma ponta de prova situada na extremidade de uma alavanca. No modo não contato, a alavanca vibra na sua freqüência de ressonância através de um oscilador, por exemplo, um bimorfo. Ao aproximar a ponta da superfície da amostra ocorre um amortecimento na amplitude de vibração da alavanca que é medido por meio de um feixe laser que incide sobre a alavanca e atinge um fotodetector sensível a posição (PSPD). A amplitude modificada é comparada com uma referência no sistema que deve ser mantida constante - isto implica em manter a força constante, uma vez que a força é proporcional a amplitude de vibração da alavanca. Uma vez alcançada a distância ponta-amostra que fornece a amplitude de vibração de referência, um piezoelétrico (PZT) produz o movimento da superfície em relação a ponta ou da ponta em relação a superfície (dependendo do equipamento), realizando varreduras nas direções x e y. A figura 3.2 mostra um esquema geral da montagem e funcionamento do AFM em modo NC-AFM.

Figura 3.2 – Esquema geral da montagem e funcionamento do AFM em modo NC-AFM.

Durante a varredura em x e y, a alavanca sofre variações na amplitude de vibração devido à mudança na força de interação entre ponta e amostra, provocada pelas diferenças de alturas encontradas na superfície. Essa variação da amplitude de vibração é medida pelo PSPD. O sinal de erro gerado (em relação ao set point estabelecido para a medida) re-alimenta o movimento do PZT na direção z (modo de força constante). O número de passos relativo a esse movimento é gravado em uma matriz que é convertida na topografia através de um fator de conversão proveniente de calibração.

Simultaneamente à imagem topográfica, no modo não contato, pode-se adquirir a imagem de fase. O amortecimento da oscilação da alavanca provocado pela interação ponta-amostra gera um atraso na fase do sinal de oscilação da alavanca (medido pelo PSPD) em relação ao sinal de oscilação aplicado ao oscilador. A presença de materiais com elasticidades diferentes numa mesma amostra provoca amortecimentos diferentes, que por sua vez geram diferentes atrasos de fase, gerando a imagem de fase (figura 3.3). Desta forma, a imagem de fase fornece um resultado qualitativo das propriedades elásticas da amostra observada. A técnica de AFM permite quantificar a elasticidade da amostra, contudo além de se tratar de um procedimento não trivial, é necessário um conhecimento prévio do material em observação, que não é o caso neste trabalho.

Figura 3.3 – Esquema geral para obtenção da imagem de fase.

No caso dos cristais de proteína, foram adquiridas apenas imagens topográficas, através do modo NC-AFM. O equipamento utilizado foi o modelo Auto Probe CP (Park Scientific Instruments) pertencente ao nosso laboratório. Devido à fragilidade dos cristais e por se encontrarem imersos em solução de alta viscosidade, foi necessário o desenvolvimento de uma metodologia para a realização das medidas. Os cristais foram retirados da placa de crescimento – com o auxílio de um ‘laço de cristais’ (0.2 a 0.3mm, 20µm – figura 3.4) e um microscópio ótico com aumento de 30 vezes (Bausch & Lomb) – e depositados sobre superfície de vidro cobertos por solução de crescimento. Para a aquisição das imagens, aproximamos manualmente a alavanca da amostra (através dos motores de passo que controlam a distância ponta-amostra), evitando imergi-la na solução. Desta forma minimizamos o amortecimento da vibração da alavanca – pois uma vez imersa, devido a alta viscosidade da solução, não conseguíamos realizar a medida devido à baixa relação sinal-ruído. Este procedimento também evitou outros problemas, como sujar a alavanca com a solução (depositando solutos), o que prejudica a vibração da mesma ou provoca espalhamento da luz do laser, impedindo a

O cuidado de penetrar a ponta na solução para alcançar o cristal é de extrema importância, pois corremos o risco de estar obtendo a topografia da gota e não do cristal.

Figura 3.4 – ‘laço de cristal’ (interior do quadrado com 50vezes de aumento à direita) utilizado para remoção do cristal de dentro da placa de crescimento.

Para o estudo das bicamadas fosfolipídicas sustentadas foram adquiridas imagens topográficas e de fase, tanto para caracterização quanto para observação da interação DBC-membrana. Neste caso foi utilizado o AFM PicoScan 3000 (Molecular Imaging - atual Agilent) em dois modos: modo acústico (AC-AFM) e modo acústico-magnético (MAC). Ambos os modos são de não contato. No modo AC a alavanca vibra através de um bimorfo e todo conjunto que acopla o oscilador a alavanca está imerso em solução. Por essa razão, o modo AC apresenta uma dissipação de energia maior que o modo MAC onde a vibração é provocada por uma pequena bobina magnética (o que requer o uso de alavancas que possuam um fino filme magnético) limitando a vibração apenas na alavanca. Desta forma, o modo MAC apresenta grande vantagem sobre o modo AC em medidas realizadas em solução, uma vez que uma menor dissipação de energia provocará uma menor perturbação no líquido fornecendo uma maior estabilidade na medida. Além disso, este microscópio permite não somente a medida da amostra em meio fisiológico como também a inserção de outras substâncias (por exemplo, anestésico) em sua célula líquida (figura 3.5). Outra consideração relevante é o fato desse modelo, diferentemente do microscópio utilizado nos cristais, apresentar o PZT acoplado à alavanca, de maneira que a amostra permanece imóvel, diminuindo a perturbação no interior da solução. Assim, essa configuração, mais adequada para trabalhar em líquidos, proporciona estabilidade ao nosso sistema e possibilita a adição gradual do anestésico local à solução através de seringas e mangueiras acopladas à célula líquida, sem interrupção da medida. Após a adição de DBC foi estabelecido um intervalo para observação de no mínimo 30 minutos até uma próxima adição. Esse intervalo é necessário não somente pelo tempo de ação da DBC na bicamada, como também para haver a difusão da DBC no interior da célula líquida, para chegar à superfície da bicamada.

Figura 3.5 – esquema da célula líquida, aparato utilizado sobre a amostra durante a medida de AFM, permitindo que a amostra fique imersa em solução aquosa e a adição de substâncias (no caso, anestésico) através das seringas acopladas as mangueiras (setas) sem interrupção das medidas.

O tamanho das imagens topográficas e de fase foi determinado de forma a observarmos os possíveis efeitos em toda a área de bicamada de interesse. Por este motivo, e para facilitar a localização destas regiões de interesse, utilizamos o scanner com área de varredura máxima de 100µm, Em algumas ocasiões realizamos scans menores durante a seqüência sem deslocar a origem e voltamos novamente ao tamanho da seqüência original. Contudo, devido ao longo tempo de aquisição da imagem (10 a 15 minutos), muitas vezes ‘perdíamos’ o efeito global da DBC ao realizarmos esse procedimento, pois ao voltarmos à varredura com tamanho maior a bicamada já havia sido modificada substancialmente ou desaparecido totalmente. Outro problema, nesse caso, é o deslocamento da origem provocado pelo comportamento do scanner (drift e histerese) durante o procedimento. Mesmo sendo mínimo, esse deslocamento podia impedir a observação de regiões que vinham sendo anteriormente observadas.

3.2.2 Análise das Medidas de AFM • Cristais de Proteína

No caso dos cristais, as imagens topográficas nos permitem verificar a existência de diferentes formações em sua superfície, além de possíveis defeitos. As alturas dessas formações encontradas

• Bicamadas Fosfolipídicas Sustentadas

A primeira análise possível a partir das imagens de AFM é uma observação qualitativa da morfologia da amostra em estudo. Sob esse aspecto as imagens de topografia e fase se completam. No caso da topografia podemos observar a distribuição das bicamadas sobre a superfície, o aspecto de estrutura formada, a reprodutibilidade na preparação das amostras e acompanhar alterações estruturais na presença de DBC. A imagem de fase é caracterizada por ser uma medida qualitativa que fornece uma indicação da presença de diferentes materiais.

O método utilizado para a formação de bicamadas fosfolipídicas (método de fusão de vesículas – seção 2.2.3) não permite o controle da deposição dos lipossomas, nem a área de cobertura da bicamada. Os resultados da literatura sugerem uma dependência da concentração de lipídios, da hidrofobicidade da superfície utilizada e do tempo esperado após a deposição [29, 30]. Por esse motivo, estabelecemos dois critérios para caracterizar as estruturas observadas como bicamadas. A altura é o primeiro deles. De forma generalizada, uma bicamada lipídica possui uma altura média de 5 nm [10]. Convém mencionar que as variações das caudas produzem bicamadas de alturas diferentes, mas mantêm na média a altura de 5nm. Nos poucos casos encontrados na literatura de bicamadas de EPC, há uma variação de bicamadas entre 3-5nm, como será apresentado no apêndice I. Com estas informações em mente, para a adição do anestésico os domínios deviam apresentar, em média, uma altura de 5 nm ou múltiplos desse valor (formação de multicamadas). A distinção da superfície de mica e da bicamada fosfolipídica na imagem de fase foi utilizada para confirmar a presença de uma estrutura lípidica sobre o substrato.

As alturas das bicamadas fosfolipídicas na ausência ou presença de DBC foram analisadas similarmente ao caso dos cristais, através da análise estatística dos dados de seções transversais das imagens topográficas.

• Fontes de erro

Como toda medida experimental, nosso sistema de medida também apresenta um limite em sua precisão. O primeiro cuidado que devemos tomar ao observar uma imagem topográfica é identificar o que denominamos artefatos na imagem. Um exemplo é o efeito de ponta dupla, onde uma ponta, quebrada, por exemplo, “dobra” os degraus ou relevos presentes na imagem. Esses artefatos podem ser identificados durante a medida fazendo, por exemplo, rotações da amostra e

realizando novas varreduras ou trocando a ponta. Contudo, outras fontes de erros podem interferir quando analisamos as imagens quantitativamente, por exemplo, quando realizamos medidas de altura como é o nosso caso.

Dentre as fontes de erro podemos citar o raio da ponta de prova, curvatura natural do movimento do scanner, filtros utilizados no processamento da imagem, erros de calibração e, ainda, ruídos. Estes geralmente são de baixa freqüência e não interferem significativamente na imagem. Para obtermos uma estimativa da exatidão e do erro relativo em nossas medidas de altura, analisamos estatisticamente uma amostra de grade com altura padrão (200nm), cuja topografia foi adquirida na época de nossos experimentos. Também utilizamos como referência de altura a mica que serve de substrato para nossas amostras. Neste último caso, no entanto, não otimizamos as condições do microscópio para a observação dos degraus. Apenas observamos que os degraus porventura presentes nas imagens estivessem com altura próxima de 1nm (ou de múltiplos deste valor), que corresponde a altura inter-planos na mica.

Desta forma, a análise de dezenas de seções transversais da amostra padrão nos permite obter a distribuição mostrada na figura 3.6. A análise gaussiana nos fornece uma altura média de (207±2)nm para a grade (aproximadamente 1% de erro relativo e desvio do valor de calibração de 3.5%). Com base nestes resultados, e nas observações na mica, consideramos a calibração do AFM adequada uma vez que a dispersão dos resultados experimentais é maior que estes valores.

Convém mencionar que nas imagens que serão apresentadas ao longo deste trabalho, em alguns casos, existe a dúvida da presença ou não de ponta dupla. Contudo devido a metodologia escolhida para a observação dos efeitos do anestésico, a realização de testes para comprovação da existência da ponta dupla ou mesmo a troca da ponta representaria um risco de perda da sequência de imagens e de todo o trabalho a ela associada, uma vez que dificilmente retornaríamos a mesma região de medida e nada garantiria que após a troca da ponta o problema não se repetiria. Dessa forma, optamos continuar nossas medidas mesmo sob tais condições. No caso de ponta dupla, o principal efeito será a mudança na forma da superfície; a altura máxima em geral não é afetada. Por este motivo, fixamos nossa atenção na variação da altura da superfície com o tempo, quando da adição de anestésicos à solução.

Figura 3.6 – Distribuição de alturas do degrau da grade de calibração obtidas a partir de análise estatística de seções transversais em imagens de topografia.

3.3 Tensão Superficial e Elasticidade

Como serão apresentados na seção 4.5 e 4.6, as imagens de fase indicam uma mudança na elasticidade da bicamada na presença do anestésico. Por essa medida nos fornecer apenas resultados qualitativos, realizamos medidas de tensão superficial e elasticidade com a finalidade de obter informações quantitativas sobre as propriedades elásticas da bicamada na presença de DBC.

Qualitativamente, pode-se dizer que a tensão superficial é causada pela força de atração entre as moléculas do líquido [1]. Em outras palavras, as moléculas da superfície do líquido se encontram num estado de maior energia que as moléculas no interior do líquido, devido às ligações não saturadas. Para diminuir a energia superficial, é preciso minimizar o número destas ligações e, portanto, minimizar a área da superfície.

Do ponto de vista termodinâmico, a tensão superficial é definida como o trabalho necessário para aumentar a superfície [36]:

dA

dW =γ. (3.1)

onde γ representa a tensão superficial. Ainda da termodinâmica, define-se energia livre de Gibbs (G) como:

TS H

G= − (3.2)

onde H representa a entalpia, T representa a temperatura e S a entropia. Assim, à pressão e temperatura constantes e considerando um processo reversível, temos que:

T P dA dG , ) ( = γ (3.3)

Para as medidas de tensão superficial utilizamos o método de gota pendente usando um tensiômetro automático modelo OCA-20 (Dataphysics). O método consiste em analisar o perfil eixo-simétrico de uma gota pendente (figura 3.7) oticamente [37, 38]. Os dados obtidos dessa análise são ajustados à equação de Young-Laplace:

) 1 1 ( ) ( 2 1 2 1 R R gh P= − = + ∆ ρ ρ γ (3.4)

onde ∆P é a variação de pressão entre o interior e a parte externa da gota, ρ1 e ρ2 são as densidades do

ar e da água, g é a aceleração da gravidade e h a altura do eixo de simetria da gota e R1 e R2 os raios

de curvatura da superfície da gota*1.

Figura 3.7 – fotografia da gota pendente (esquerda).

Medidas de cinética de adsorção (tensão superficial em função do tempo) foram realizadas depositando uma monocamada de fosfolipídio (EPC e DMPC) na superfície da gota formada pela solução de DBC. O lipídio dissolvido em clorofórmio foi depositado*2 na superfície da gota até que fosse atingida uma pressão superficial de 30mN/m (tensão superficial característica de camada de membrana biológica [39]) garantindo a existência de uma monocamada de lipídios em todo contorno da gota. Essas medidas foram realizadas para uma concentração fixa de DBC de 2.72 mM.

A elasticidade é um parâmetro que quantifica a resposta do sistema diante de uma deformação [40]. A medida é realizada aplicando-se uma perturbação à interface da gota depois que o sistema

com o mesmo tensiômetro utilizado nas medidas de tensão superficial, porém neste caso um dispositivo piezoelétrico produz um movimento senoidal na gota com uma amplitude e freqüência pré-determinadas. Para um estado de equilíbrio a elasticidade E é definida por:

A d d E ln γ = (3.5)

Sob condições dinâmicas, o filme formado na superfície pode variar de um filme perfeitamente viscoso a perfeitamente elástico. Isto é detectado experimentalmente através da comparação do ângulo de fase, ϕ, entre a perturbação (deformação) aplicada e a resposta do sistema (mudança na tensão superficial). O sistema é considerado totalmente elástico quando essa diferença de fase é nula. Por outro lado, diferenças de fase não nulas caracterizam interfaces com propriedades viscoelásticas. Matematicamente, o módulo de elasticidade é dado por [40]:

η ε ϕ ϕ iE i E E= cos + sen = + (3.6)

onde E representa o módulo de elasticidade, a parte real se refere ao coeficiente de elasticidade (ε) e a parte imaginária ao coeficiente de viscosidade (η).

As medidas de elasticidade foram realizadas similarmente às de tensão superficial no que se refere à deposição de lipídios sobre a superfície da gota, porém para várias concentrações de DBC.

Ambas as medidas foram realizadas com a doutoranda Thatyane Morimoto Nobre no laboratório da Dra. Maria Elisabete Darbello Zaniquelli do Departamento de Química da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP.

Capítulo 4

Resultados

Cristais de Proteína

4.1 Imagens topográficas

Apresentaremos aqui uma análise qualitativa de medidas realizadas com AFM no cristal da proteína Alkil-hidroperoxido-redutase tipo E. Esta proteína faz parte do sistema de defesa da bactéria patogênica Mycobacterium Tuberculosis, causadora da tuberculose. Esse cristal foi fornecido pela Dra. Beatriz Guimarães (Centro de Biologia Estrutural - LNLS) e serviu como teste do procedimento para a aquisição de imagens descrito no capítulo 3. Por este motivo, não foi estudado mais detalhadamente como o cristal da proteína XF2234.

A figura 4.1(A) mostra um cristal de má qualidade, onde formações alongadas, relativamente alinhadas, podem ser observadas ao redor de uma fratura no cristal. Malkin e McPherson [8] também observaram a presença de estrutura cristalina típica de nucleação bidimensional organizadas ao redor de uma falha profunda (10-14 nm) no cristal do vírus CMV (do inglês, cucumber mosaic vírus). Eles sugerem que esse tipo de defeito pode surgir devido à tensão (stress) provocada por uma região má formada, e da relaxação desta tensão no interior do cristal. Eles também observaram que, uma vez formado o defeito, este se propaga ao longo do volume do cristal. Convém mencionar que estes autores observaram o crescimento bidimensional deste cristal, ou seja, o cristal já formado foi colocado em célula líquida do AFM em contato com uma solução de proteína e reagente precipitante, permitindo a observação da superfície em crescimento do cristal.

Observando ainda a figura 4.1 (B), podemos notar também outros tipos de defeitos. As formações observadas na figura 4.1 podem ser devido à evaporação da solução da gota, que ocorre durante a medida devido ao aquecimento da amostra causado pela iluminação do microscópio ótico

Figura 4.1: imagens de AFM do cristal da proteína Alkil-hidroperoxido-redutase tipo E. Podemos observar em ambas imagens um cristal mal formado: (A) estruturas relativamente alinhadas com fratura, (B) defeitos (seta branca) que podem ser provenientes de diferentes origens.

A evaporação da solução não impede, porém, a observação de formações típicas de superfícies cristalinas, como mostrado na figura 4.2. Neste caso, um cristal diferente da mesma proteína mostra uma região ordenada de degraus com altura de aproximadamente 3nm (concorda com os parâmetros de raios-X*1) e terraços onde defeitos locais (setas brancas) na cristalização podem ser observados. McPherson, Kuznetsov, Malkin e Plomp [41] denominam formações similares a estas como defeitos planares (planos que estão sendo formados sobre a superfície e são interrompidos). Em cristais convencionais, estes defeitos e as descontinuidades de longo alcance por eles geradas correspondem aos contornos de grão. Eles consideram esse tipo de imperfeições mais sério que defeitos locais (normalmente provenientes de impurezas), pois produz um maior grau de desordem no cristal e podem se estender através de centenas e até milhares de camadas de moléculas do cristal.

Observando a figura 4.2 (A) podemos identificar uma morfologia (em destaque – retângulo branco) similar à denominada screw dislocations [41]; contudo não possuímos imagens adequadas para confirmar esse tipo de formação. No nosso caso, não foi nosso objetivo aprofundar este tipo de análise e discussão, uma vez que utilizamos estes cristais basicamente para teste da metodologia de medida em líquidos. Porém com estes resultados mostramos que através da análise morfológica via AFM é possível avaliar o grau de ordem cristalina, bem como a existência de defeitos provenientes de diferentes origens.

*1 _{os parâmetros de rede medidos por difração de raios X de um cristal similar da mesma proteína forneceram os valores}

a=b=145Å e c= 33,36 Å

Figura 4.2: imagens de AFM do cristal da proteína Alkil-hidroperoxido-redutase tipo E – mostram formações mais próximas às esperadas para um cristal com planos separados por degraus e defeitos locais sobre os terraços formados por estes degraus (setas brancas)

4.2 Cristais da Proteína XF2234

No caso da proteína XF2234, foi observada uma morfologia diferente na superfície dos cristais, em forma de nanofibrilas ou nanofios superpostos a uma superfície plana como mostra a figura 4.3. A princípio, cogitamos a hipótese que esses nanofios fossem provenientes da cristalização de lisozima, por esta apresentar formações semelhantes [42]. A lisozima foi utilizada no processo de extração da proteína para os cristais apresentados na figura 4.3. Contudo, repetindo todo o procedimento, desta vez sem a utilização de lisozima, obtivemos resultados similares ao anterior como mostra a figura 4.4. Os nanofios sobre a superfície apresentam alturas entre 5 e 6 nm, sem uma organização preferencial. Também é possível observar a aglomeração destes nanofios em algumas regiões.

Figura 4.3: imagens topográficas obtidas para o cristal de proteína XF2234 na presença de lisozima durante a extração da proteína da bactéria. Observa-se a presença de nanofios sobre a superfície do cristal.

Figura 4.4: Imagens para proteína XF2234 cristalizada sem presença de lisozima durante sua extração. A presença dos nanofios sobre a superfície permanece.

A figura 4.5 apresenta a morfologia de um cristal diferente da proteína XF2234, contudo com o mesmo procedimento de preparação do cristal da figura 4.4. Nesse cristal, podemos observar a presença de uma superfície suave com alguns ‘terraços’ e degraus com altura de aproximadamente 3nm (figura 4.5 A, B). Esse tipo de morfologia também foi observado no trabalho de Malkin e McPherson [8] para o cristal do vírus CMV. Eles acompanharam a coalescência desses ‘terraços’ que culminavam na formação de um plano completo sem a formação de defeitos. No nosso caso, ocasionalmente, foram observadas pequenas depressões em regiões específicas da superfície (figura

4.5 A, seta). Os nanofios também foram observados nesse cristal, porém se encontravam na região interna das depressões (figura 4.5 C, D).

Figura 4.5: Imagens para proteína XF2234 cristalizada sem presença de lisozima durante o processo de extração da proteína da bactéria. Observa-se sobre a superfície terraços que indicam a formação de novos planos (A,B) e, ainda, a presença dos nanofios em depressões próximas a esses terraços.

Uma hipótese para a presença dos nanofios seria a degradação do cristal devido à evaporação da solução de crescimento durante a medida. Para averiguar este ponto fizemos imagens topográficas contínuas por cerca de 30 minutos (não mostradas); não foram observadas, porém, alterações

(A)

(D) (C)

cristais serem relativamente grandes (~200 a 300µm), acreditamos que a solução já se encontrava em condições de baixa supersaturação de proteína. Desta forma, a presença dos nanofios poderia indicar um processo diferente de nucleação ocorrendo na superfície do cristal devido à depleção da proteína. Para verificar essa hipótese, alteramos as condições de crescimento simulando condições de baixa supersaturação de proteína e observamos os cristais formados por microscopia ótica. Infelizmente, não foi possível realizar medidas de AFM devido ao fato dos cristais serem muito pequenos (~70 a 100 µm – os cristais medidos no AFM possuíam tamanho maior que 200µm).

Mudanças nas condições de crescimento podem afetar o formato macroscópico do cristal e, desse modo, fornecer alguma informação sobre sua microestrutura. Por exemplo, Pan e Gallagher [43] observaram que a forma do cristal de subtilisin s88 depende fortemente do pH e da força iônica, mas não há dependência com a concentração de proteína. Eles atribuíram esse efeito a uma interação especifica no cristal afetada pela quantidade de sal utilizada no crescimento. No nosso caso, utilizamos a microscopia ótica na observação do efeito causado sobre a forma do cristal pela variação da concentração de proteína e da proporção proteína:solução de crescimento. A figura 4.6 (A) mostra o cristal típico utilizado para a aquisição das imagens de AFM mostradas anteriormente. Já na figura 4.6(B, C) podemos observar que a curvatura das extremidades do cristal sofre mudanças em comparação com as do cristal da figura 4.6 (A). Ainda comparando a figura A com as figuras B e C, podemos notar que existe uma mudança nas taxas de crescimento do cristal ao longo das diferentes direções cristalográficas. Estas mudanças ocorrem de forma a privilegiar uma forma mais anisotrópica do cristal, diminuindo a velocidade de crescimento da região central. Isso ocorre, provavelmente, devido à mudança de uma alta supersaturação para baixa supersaturação, já que existe um volume relativo muito maior de solução de crescimento no caso dos cristais da fig.4.6 (B, C). Este raciocínio é corroborado pela imagem do cristal da figura 4.6 (D); crescido a uma concentração de proteína mais baixa (8mg/ml) e menor diluição (1:8). Também podemos observar uma diminuição do tamanho do cristal sob essas condições, uma vez que as imagens foram obtidas para cristais com um mesmo tempo de crescimento.

Figura 4.6 – Microscopia óptica de cristais de proteína crescidos com concentração de 11 mg/ml e proporção proteína:solução de crescimento: (A)1:1, (B) 1:4 (C) 1:16. A figura (D) foi adquirida para um cristal crescido a uma concentração de proteína mais baixa (8mg/ml) e na proporção proteína:solução de crescimento de 1:8. Barras de Escala: 100µm.

Além dos fatores concentração de proteína e razão proteína/solução de crescimento, outro fator determinante no crescimento é a temperatura. A figura 4.7 mostra cristais crescidos sob as mesmas condições de concentração e diluição a uma temperatura controlada de 20oC (figuras 4.7 B,D) e a temperatura ambiente (sem controle) – figuras 4.7 A,C. Podemos notar que no último caso os cristais surgem em menor número, maiores em tamanho e com muitos defeitos, de maneira completamente oposta aos cristais submetidos à temperatura controlada. Contudo, a tendência de mudança na forma dos cristais é mantida.

A B

Figura 4.7 – Microscopia óptica de cristais da proteína XF2234 com concentração de proteína e proporção proteína:solução de crescimento, respectivamente, iguais a (A,B) 10mg/ml e 1:2, (C,D) 9mg/ml e 1:4 . Os cristais (B,D) permaneceram em ambiente com temperatura controlada a 20oC. As imagens possuem mesma magnificação (20 vezes).

Nossos resultados mostram que condições de crescimento com menor supersaturação de proteína sob temperatura controlada podem levar a formação de um cristal mais próximo do equilíbrio, possivelmente, de melhor qualidade cristalina. Uma sugestão deste trabalho é repetir algumas das condições de crescimento, mencionadas anteriormente nesta seção, em poços de maior volume de modo a obter cristais melhores e mais organizados, de tamanho suficiente para difração de raios-X e análise complementar de AFM.

A

B

Bicamadas Sustentadas

4.3 Caracterização das Bicamadas

4.3.1 Bicamadas de EPC

A figura 4.8 mostra imagens de topografia e fase típicas de bicamadas de EPC segundo os critérios estabelecidos na seção 3.2.2. Em ambas as imagens (topografia e fase), observamos que as bicamadas se formam em domínios distribuídos aleatoriamente sobre a mica e não apresentam um formato típico. Os domínios também podem ocupar longa extensão de área sobre a mica (figura 4.8 E, F), e podemos caracterizá-los como bicamadas devido a aberturas presentes em sua superfície que apresentam altura de multi-bicamadas e distinção na imagem de fase.

Podemos observar também a presença de pequenos arranjos junto das bicamadas (figuras 4.8: A, B). Esses arranjos apresentam altura média entre 2 e 5 nm (indicado pelas setas). Acreditamos que possam ser compostos por fosfolipídios que não integraram a bicamada e que se reorganizam de maneira a proteger a parte hidrofóbica da presença da água.

A ausência de reprodutibilidade na formação das bicamadas de EPC do ponto de vista não somente do formato e números de bicamadas, mas também de distribuição dos domínios sobre a mica pode ser atribuída ao próprio método de obtenção das bicamadas. Egawa e Furusawa [32] realizaram um estudo sobre a adesão de lipossomas de EPC na mica. Eles observaram diferentes morfologias na superfície em função do tempo de incubação. Arranjos esféricos foram observados para tempos de incubação de poucos minutos (~5 min). Após meia hora, eles observaram esses mesmos arranjos juntamente com domínios de bicamadas de EPC. Com o aumento do tempo, esses domínios apresentam uma cobertura maior (em área) até atingirem uma cobertura completa da superfície de mica sem defeitos aparentes (após 4horas). Muresan e Lee [44] também observaram a formação de domínios de EPC após um tempo de incubação de 50 minutos e, ainda, a união desses domínios em função do tempo. Uma seleção de imagens que descrevem a distribuição não uniforme e inomogênea das bicamadas de EPC obtidas em nosso trabalho, bem como uma discussão geral sobre as possíveis causas dessa formação, serão apresentadas no apêndice I desta tese.