Análise comparativa da determinação de antígenos HLA- DR por métodos sorológicos e por PCR-SSP

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Análise comparativa da determinação de antígenos

HLA-DR por métodos sorológicos e por PCR-SSP

DR por métodos sorológicos e por PCR-SSP

Maria Lúcia C. Marin, Anna Carla Goldberg, Hélcio Rodrigues, Cláudia Rosales, Carlos

Sérgio Viggiani, Marly A. Oliveira, Jorge Kalil

O objetivo deste trabalho foi comparar a determinação dos antígenos HLA-DR por sorologia, utilizando-se A) anti-soros policlonais ou B) anticorpos monoclonais, com a determinação em nível de DNA em amostras de sangue de receptores e doadores de rim e medula óssea. Observamos que os anticorpos monoclonais apresentam maior concordância com o PCR-SSP. Podemos concluir que as determinações sorológicas têm menor precisão, acarretando aproximadamente 48% de imprecisões com anti-soros policlonais e 21% com anticorpos monoclonais. O PCR-SSP permite melhor definição da compatibilidade HLA-DR entre receptor e doador,

o q u e s e r á , e m ú l t i m a análise, adjuvante de melhor sobrevida do enxerto.

Laboratório de Imunologia de Transplantes, INCOR-HCFMUSP Endereço para correspondência: Anna Carla Goldberg Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar, 500, 30_andar

CEP: 05403-000 São Paulo, SP Tel./Fax (011) 282-9350

HLA, Antígenos de Classe II, PCR, Sorologia,

T i p i f i c a ç ã o

Molecular

HLA, Class II Antigens, PCR, Serology, Mo-lecular Typing

Introdução

O Complexo Principal de Histocompatibilidade (CPH) codificado no cromossomo 6 humano, contém, entre outros, os genes do sistema HLA. Tais genes codificam para

estruturas de superfície celular altamente polimórficas, os antígenos HLA. Inicialmente definidos como antígenos de transplantação por Dausset em 1958, 1,2 _{o seu papel na} rejeição ao enxerto é hoje incontestável, sendo alvo pri-mordial da resposta alogênica. Estes antígenos estão intimamente ligados aos processos de defesa imunológica do organismo. Os antígenos de classe I têm seus produtos expressos em praticamente todas as células do organismo. Uma outra parte destes genes do sistema HLA codifica para os antígenos HLA de classe II que são expressos, normalmente, nas células imunocompetentes. A estrutura e função destas duas classes de proteínas em muito se assemelham. O reconhecimento de moléculas estranhas ao organismo (não próprias) é feito em associação com os antígenos de histocompatibilidade. A apresentação destes produtos é possibilitada pela estrutura característica das moléculas HLA que abriga os peptídeos, isto é, fragmentos de proteínas que serão apresentados aos linfócitos. Estas proteínas (antígenos) podem também originar-se das próprias moléculas HLA do doador, dando origem à resposta alogênica.

A parte externa da molécula HLA acumula a maior parte da variablidade ou polimorfismo presente neste sistema. É este polimorfismo que define o nível de compatibilidade

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entre doador e receptor. Estas diferenças devem ser identificadas para a escolha adequada de um doador.

A determinação dos antígenos HLA tem sido realizada, na maior parte dos laboratórios, através do método sorológico, utilizando-se a técnica de microlinfocitotoxicidade mediada por complemento. Esta técnica encontra-se atualmente aperfeiçoada e valendo-se de reagentes biológicos padronizados, oferecidos por companhias especializadas. Esses reagentes biológicos são anti-soros policlonais ou anticorpos monoclonais que reconhecem as especificidades HLA-DR e soro de coelho, como fonte de complemento para a lise celular. Estes reagentes apresentam uma limitação importante, principalmente no que se refere a sua aplicabilidade à população brasileira. Os anti-soros policlonais utilizados são, predominantemente, de origem caucasóide, dificultando a definição dos antígenos oriundos das outras etnias que compõem a nossa população.

Neste estudo, procuramos avaliar a eficiência da determinação dos antígenos HLA-DR pela técnica da microlinfocitotoxicidade, que é avaliada por porcentagem de lise celular quando da interação antígeno-anticorpo em presença de complemento. Como teste padrão, utilizamos a reação de amplificação em cadeia denominada PCR. Realizada a partir de DNA obtido de amostras de sangue, trata-se de um processo de ampliacão gênica que utiliza iniciadores (“primers”) de seqüências específicas (SSP) e uma enzima DNA polimerase (Taq polimerase), sendo a ampliação obtida através de um termociclador. Trata-se de uma tipificação de baixa resolução que fornece resultados equivalentes ao método sorológico, podendo reduzir a incidência de antígenos não definidos (brancos) que poderiam caracterizar uma homozigose.3 _{O PCR-SSP foi} principalmente aplicado a amostras de doadores e receptores candidatos a transplante vivo-parente de medula óssea e rim.

Materiais e Métodos

As amostras de sangue analisadas neste estudo foram coletadas de doadores e receptores candidatos a transplante de medula óssea e rim. Apenas 13 amostras do total foram provenientes de doadores cadávericos.

Foram analisadas 59 determinações feitas com anti-soros policlonais (grupo A) e 79 feitas com anticorpos monoclonais (grupo B). Foram obedecidos os seguintes critérios de escolha:

1) qualidade da amostra de sangue: foi dada preferência a amostras de doadores normais de medula e de rim inter-vivos. No grupo A, 39 e no grupo B, 41 das amostras eram

provenientes destes doadores.

2) ausência de amostra do doador: esta amostragem compreendeu 17 e 27 casos, respectivamente, do grupo A e do grupo B.

3) ausência de amostra do receptor: é o caso das amostras de doador cadáver que perfizeram 3 e 11 casos dos grupos A e B, respectivamente.

Extração de DNA

A extração de DNA foi realizada pela técnica rápida com DTAB/CTAB, 4_{onde a camada de leucócitos obtida a} partir de 5 ml de sangue é misturada com 1 volume de DTAB 12% (DTAB 12%, NaCl 2,25%M, Tris 150mM pH8,6, EDTA 75mM) e incubada por 5 minutos a 68o _{C. Dois} vol-umes de clorofórmio são adicionados, seguindo-se vigorosa agitação. Após centrifugação por 2 minutos a 10.000 rpm, recupera-se o sobrenadante ao qual são adicionados 2 vol-umes de CTAB 0,5% (CTAB 5%, NaCl 0,4M), homogeneizando-se em seguida para obter-se o precipitado DNA/CTAB. Após nova centrifugação por 2 minutos a 10.000 rpm, o precipitado é ressuspendido em 300 ml de NaCl 1,2 M e 750 ml de etanol 99,5%. Centrifuga-se por 2 minutos a 13.000 rpm. Nova lavagem e centrifugação são realizadas com etanol 70%.

Microlinfocitotoxicidade

Para a separação das subpopulações celulares T e B foi utilizada a metodologia do cotonete de lã de nylon, 5_{que se} baseia na propriedade das células B de aderirem à lã de ny-lon.

O método da microlinfocitotoxicidade se baseia na reação específica de anti-soros contra os antígenos HLA presentes na superfície das células. A reação é realizada em microplacas com poços onde estão contidos os anti-soros. A suspensão linfocitária a ser tipificada é adicionada a cada poço, seguindo-se uma incubação. Posteriormente, adiciona-se soro de coelho como fonte de complemento para desencadear lise celular onde houver reação antígeno-anticorpo,6_{sendo esta visualizada pela adição de corante} vital Eosina Y.

Para determinação dos antígenos HLA-DR foram utilizadas microplacas de Terasaki com 72 poços contendo 3 a 4 anti-soros anti-HLA para cada especificidade. Foram utilizados anti-soros mono e poliespecíficos perfazendo um total de 70 anti-soros policlonais (C-six Diagnostics, Inc., Mequon, WI, EUA) ou anticorpos monoclonais (One Lambda, Inc., Canoga Park, CA, EUA), para antígenos de Classe II.

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Tabela 2

Exemplos de falhas ocorridas na tipificação HLA-DR

Amostra Sorologia PCR-SSP 1 15, 3 15,13 2 1,X 1,15 3 11,X 11,14 4 15,13 15,17 5 6,X 1,11

Determinação de HLA-DR por ampliação seqüência-específica (PCR-SSP)

Foi utilizado o método descrito e modificado por Olerup e Zetterquist:7_{o PCR-SSP (polymerase chain reaction with}

sequence-specific primers), - reação de polimerização em

cadeia com iniciadores de seqüências específicas. O método é de baixa resolução, pois não detecta os alelos propriamente ditos, mas grupos de alelos, correspondendo no nível mo-lecular à determinação feita pela sorologia. Em outras palavras, a determinação não é fenotípica.

Para isto, foram utilizados pares de “primers” ou oligonucleotídeos iniciadores específicos para ampliação de grupos de alelos dos genes DRB1, DRB3, DRB4 e DRB5. Utilizamos 400 ng de DNA, tampão, dNTP 200 mM final, “primers” específicos e “primers” de controle interno 0,25

mM e 0,12 mM final, respectivamente, e 0,5 U de Taq polimerase (Cenbiot, RS, Brasil) em cada tubo. A reação de amplificação foi feita num volume final de 20 ml em um ciclador térmico PTC-100 (MJ Research, Inc., Watertown, MA, EUA) em 23 reações com pares de iniciadores específicos e um controle negativo de ampliação, todos contendo um controle interno. A ampliação foi feita em 35 ciclos de 1 minuto a 94o_{C para desnaturação do DNA, 1} minuto a 60o_{C para anelamento dos iniciadores e 1 minuto a} 72o_{C para extensão do fragmento ampliado. As bandas} específicas de ampliação foram visualizadas por eletroforese em gel de agarose a 1,2%.

Resultados e Discussão

Os resultados obtidos por PCR foram inequívocos em todas as amostras, havendo menos de 5 casos de antígenos não determinados (brancos) devido a homozigose ou por limitação do método. Em apenas um caso houve determinação de antígeno na sorologia (grupo A) não detectado no PCR. Os resultados obtidos na sorologia fo-ram analisados sob diferentes aspectos: a) não determinação do antígeno em relação ao PCR (considerado como branco), b) troca na determinação do antígeno em relação ao PCR e c) indefinição da subespecificidade ou “split”. Os antígenos e, entre parênteses as subespecificidades, detectados nos métodos utilizados são o DR1, 2 (15 e 16), 3 (17 e 18), 4, 5 (11 e 12), 6 (13 e 14), 7, 8, 9 e 10. Na tabela 1a e 1b encontram-se os resultados destas comparações. Os resultados mostram que os anti-soros policlonais apresentam menor discriminação de subespecificidades, problema este partilhado pelos anticorpos monoclonais no caso do DR3. Esta mesma dificuldade de discriminação se reflete no

aumento de brancos e de falsas determinações antigênicas nos grupos que contém subespecificidades (DR2,3,5,6). A forte reatividade cruzada observada entre antígenos dos grupos do DR3,5 e 6, também contribue no aumento do número de discrepâncias observadas na determinação dos antígenos pela sorologia, quando comparadas ao PCR. A tabela 2 mostra exemplos típicos ocorridos na determinação antigênica destas amostras.

O objetivo maior de se estabelecer a comparação das análises dos antígenos HLA-DR foi a de avaliar a eficácia da técnica da microlinfocitotoxicidade na determinação dos antígenos. Procuramos avaliar o uso tanto de anti-soros policlonais quanto de anticorpos monoclonais, utilizando como padrão uma técnica de resolução equivalente, mas feita com o DNA das amostras. Podemos considerar esta última como padrão, uma vez que esta identifica seqüências definidas de DNA, não havendo ampliação gênica quando a homologia dos iniciadores não for de 100%. Assim, a reatividade cruzada, um problema comumente encontrado no processo de identificação por método sorológico, deixa de existir. A reatividade cruzada foi a maior fonte dos erros por troca de determinação de antígenos, respectivamente 10,17% e 4,43% nos grupos A e B. Houve presença significante de antígenos não determinados (brancos): 15,25% no grupo A e 10,13% no grupo B. O restante das falhas foram devidas à determinação da subespecificidade (indefinição ou erro): grupo A na porcentagem de 22,88% e no grupo B na porcentagem de 6,96%. Assim, o total de imprecisões nos grupos A e B foi de 48,31% e de 21,52% respectivamente.

Apesar de nossos resultados não terem sido analisados quanto à freqüência dos antígenos determinados nas diversas etnias, pudemos observar uma melhor definição de antígenos mais raros na população caucasóide através do PCR-SSP. Exemplo disso, é a especificidade DR18, de origem negróide, e que apresentou 100% de imprecisões em ambas as técnicas sorológicas. Desta forma, o método de PCR-SSP foi por nós considerado padrão, pois leva a uma clara definição dos “splits” (subespecificidades), um raro número de falhas na determinação dos antígenos, além de oferecer uma confirmação, no nível genético, dos antígenos DR51,52 e 53.

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Tabela 1

Resultados da determinação de antígenos HLA-DR por microlinfocitotoxicidade e por PCR-SSP. a) Anti-soros policlonais e b) Anticorpos monoclonais

a) Anti-soros Policlonais

HLA-DR PCR a % b % c % total erros % corretos %

1 6 2 33,33 0 - 0 - 2 33,33 4 66,67 2 16 0 - 0 - 11 68,75 11 68,75 5 31,25 3 8 3 37,50 0 - 5 62,50 8 100,00 0 0,00 4 10 2 20,00 0 - 0 - 2 20,00 8 80,00 5 18 0 - 6 33,33 2 11,11 8 44,44 10 55,56 6 23 7 30,43 4 17,39 9 39,13 20 86,96 3 13,04 7 18 1 5,56 0 - 0 - 1 5,56 17 94,44 8 5 0 - 0 - 0 - 0 - 5 100,00 9 4 2 50,00 0 - 0 - 2 50,00 2 50,00 10 5 1 20,00 1 20,00 0 - 2 40,00 3 60,00 branco 5 0 - *1 20,00 0 - 1 20,00 4 80,00 totais 118 18 12 27 57 48,31 61 b) Anticorpos Monoclonais

HLA-DR PCR a % b % c % total erros % corretos %

1 16 2 12,50 1 6,25 0 - 3 18,75 13 81,25 2 21 4 19,05 0 - 1 4,76 5 23,81 16 76,19 3 15 0 - 1 6,67 7 46,67 8 53,33 7 46,67 4 21 2 9,52 0 - 0 - 2 9,52 19 90,48 5 17 0 - 1 5,88 0 - 1 5,88 16 94,12 6 25 6 24,00 2 8,00 3 12,00 11 44,00 14 56,00 7 20 1 5,00 0 - 0 - 1 5,00 19 95,00 8 7 0 - 0 - 0 - 0 - 7 100,00 9 2 0 - 0 - 0 - 0 - 2 100,00 10 6 1 16,67 2 33,33 0 - 3 50,00 3 50,00 branco 8 0 - 0 - 0 - 0 - 8 100,00 totais 158 16 7 11 34 21,52 124

a - brancos, ou seja, antígenos não assinalados b - trocas, ou seja, antígenos com assinalação falsa

c - indefinição de subespecificidades, apenas nos antígenos DR2, DR3, DR5 e DR6 * - um caso em que houve assinalação pela sorologia e não pelo PCR

Summary

We have compared HLA-DR analysis obtained by DNA-based or by microlymphocytotoxicity typing with A) polyclonal antisera or B) monoclonal antibodies of samples from donors and recipients for kidney and bone marrow transplants. Polyclonal antisera show lower resolution of the HLA-DR specificities. Monoclonal antibodies show higher concordance rates to PCR-SSP. Thus, serological typings for HLA-class II have lower accuracy when compared to PCR, with approximately 48% of misstypings in group A and 21% in group B. The capacity of PCR-SSP in defining HLA-DR antigens is clearly increased when compared to serology, rendering donor-recipient matching more accurate and concurring to a better graft survival.

Referências

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7. Olerup O, Zetterquist H. HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: An alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens. 1992; 39: 225-35

Artigo recebido em 14 de abril de 1997 e aceito para publicação em 22 de setembro de 1997.