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Caracterização biológica e molecular de um lentivírus de ovino isolado
em Portugal
Biological and molecular characterization of an ovine lentivirus isolated
in Portugal
Miguel Torres Fevereiro* e Sílvia Santos Barros
Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, Departamento de Virologia
Estrada de Benfica 701, 1549-011 Lisboa, Portugal
Trabalho galardoado com o Prémio Pfizer Ciências Veterinárias 2003, atribuído pela Sociedade Portuguesa de Ciências Veterinárias
Resumo: O genoma de um lentivírus de ovino com um fenótipo
de replicação in vitro lento/baixo, foi totalmente sequenciado.
Este vírus, denominado P1OLV, foi isolado a partir de células de
pulmão e do plexo coroide de um ovino naturalmente infectado,
proveniente da região de Trás-os-Montes. O RNA genómico do
P1OLV constituído por 9189 nucleótidos, tem respectivamente
80% e 70% de similaridade com as sequências nucleotídicas do
vírus Maedi Visna (MVV) padrão K1514 e com a estirpe Cork do
vírus da artrite encefalite dos caprinos (CAEVco). A análise
filo-genética, baseada em sequências nucleotídicas da glicoproteína
de superfície do invólucro (SU) e da transcriptase reversa (RT)
viral, revelou que o P1OLV agrupa claramente com os isolados
MVV de ovino. Para o estudo da replicação viral in vitro,
cultu-ras de macrófagos (MØ), células do pulmão e do plexo coroide
(SCP) de ovino e células da bainha sinovial do carpo de cabra
(GSM) foram inoculadas com o isolado nacional e com a estirpe
lítica Norte Americana WLC-1 do MVV. As culturas foram
se-guidas durante vários dias para observação do efeito
citopatogé-nico (CPE) e quantificação do RNA viral nos sobrenadantes por
RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) em tempo real. Ao contrário da
estirpe WLC-1 que teve um crescimento rápido e lítico,
atingin-do níveis elevaatingin-dos de produção de RNA viral em toatingin-dos os tipos
de células testados, o isolado nacional multiplicou de forma mais
lenta e com níveis de produção de RNA viral mais baixos. Em
células de pulmão e SCP, o P1OLV originou infecções
persisten-tes sem CPE evidente e níveis de produção de RNA viral quatro a
cinco vezes inferiores aos observados para a estirpe WLC-1. Em
células GSM e MØ os valores máximos de RNA viral
produzi-dos pelo P1OLV foram cerca duas vezes inferiores aos registaproduzi-dos
para o WLC-1. O isolado nacional P1OLV é, até à data, o único
lentivírus de ovino com padrão de replicação lento/baixo cujo
genoma foi totalmente sequenciado.
Summary: The sequence of the complete genome of an ovine
lentivirus with a slow/low phenotype in vitro was determined.
The virus, named P1OLV, was isolated from the lung and
cho-roid plexus cells of a naturally infected sheep in Portugal. The
genome of P1OLV is 9,189 nucleotides long and has an
over-all similarity of approximately 80% with K1514 Maedi Visna
virus (MVV) and approximately 70% with the caprine
arthri-tis encephaliarthri-tis virus (CAEV) Co strain. Phylogenetic analysis
based on sequences of the virus surface glycoprotein (SU) and
reverse transcriptase (RT) clearly grouped P1OLV with
previ-ously reported ovine MVV. To assess the virus replication rate in
* Correspondência: tel.: 217115288, fax: 21217115387
e-mail: miguel.fevereiro@lniv.min-agricultura.pt
vitro
, cultures of sheep macrophages (MØ), lung and SCP cells,
and goat synovial membrane (GSM) cells were inoculated with
either P1OLV or with the lytic North American strain WLC-1.
The cultures were maintained for several days and examined
for cytophatic effects (CPE) consisting of either cytolysis and/
or development of syncitia. Viral RNA in culture supernatants
was measured by one-tube real time quantitative RT-PCR
(qRT-PCR). As expected, WLC-1 grew rapidly, produced high levels
of viral RNA and induced CPE in all the cells tested. On the
contrary, the national isolate replicated more slowly and to lower
levels of viral RNA. In SCP and lung cells, P1OLV induced
per-sistent infections without notorious CPE and with levels of viral
RNA four to five times lower than those registered for WLC-1.
In GSM and MØ P1OLV was lytic but the peak levels of viral
RNA were approximately two times lower than those produced
by WLC-1. We have presented a full-length sequence of the first
Portuguese isolate of ovine lentivirus that is potentially useful
for studying genes responsible for the slow/low phenotype, as
all the MVV that have been totally sequenced so far, are of the
rapid/high phenotype.
Introdução
O vírus Maedi Visna (MVV) Islandês K1514
(Sigur-dsson et al., 1957) e a estirpe Norte Americana Cork,
do vírus da artrite encefalite dos caprinos (CAEVco)
(Cork et al., 1974), são os protótipos de um grupo de
lentivirus dos pequenos ruminantes (SRLV) associados
a doenças de evolução lenta e progressiva nestas
espé-cies. Nos ovinos, a infecção manifesta-se
habitualmen-te sob a forma de pneumonia inhabitualmen-tersticial progressiva
(Maedi) e mais raramente sob a forma neurológica
(Visna) (Cheevers e McGuire, 1988; Narayan et al.,
1992; DeMartini et al., 1993; Zink e Johnson, 1994).
Nos caprinos a doença caracteriza-se pelo
aparecimen-to de artrites e mastites nos animais adulaparecimen-tos e por
ence-falites nos animais jovens (Crawford et al., 1980; Zink
e Johnson, 1994). A transmissão do vírus MVV faz-se
por ingestão do colostro e leite no caso dos animais
jovens e por via aerógena nos animais adultos (Pálsson,
1985).
Contrariamente aos lentivírus dos humanos, símios,
felinos e bovinos que originam infecções produtivas
em macrófagos (MØ) e linfócitos T, os SRLV têm
tro-pismo para as células da linha monócito-macrofágica.
Nestas células, a expressão viral está estreitamente
associada à diferenciação e maturação dos monócitos
em MØ (Gendelman et al., 1985, 1986; Narayan et al.,
1983). A manifestação primária da doença nas
infec-ções por SRLV é a inflamação. Esta resulta da
replica-ção do vírus nos MØ com libertareplica-ção de mediadores da
inflamação nos tecidos onde estas células se encontram.
A baixa susceptibilidade dos linfócitos T dos ovinos e
caprinos à infecção pelos SRLV pode explicar, em
par-te, a ausência de uma síndrome de imunodeficiência
nestas espécies.
Os SRLV embora relacionados entre si, tanto a
ní-vel genético como antigénico, evidenciam padrões de
replicação in vitro muito diferentes. As diferenças
fe-notípicas entre os vários SRLV reflectem a aptidão de
certa estirpe para realizar uma infecção produtiva numa
determinada linha celular, a capacidade de induzir a
formação, de sincícios e a sua taxa de replicação em
cultura. A cinética de replicação dos SRLV in vitro tem
sido utilizada para os classificar em vírus do tipo
rápi-do/alto ou lento/baixo, conforme atinjam rapidamente
títulos elevados ou, pelo contrário, sejam necessários
vários dias ou semanas para atingir, apesar disso,
títu-los baixos (Lairmore et al., 1987, Querat et al., 1984;
Woodward et al., 1995; Zanoni et al., 1992).
Os pequenos ruminantes são reservatórios de
len-tivírus com uma linha filogenética própria e os
den-dogramas inferidos a partir das sequências dos genes
gag
, pol e env de vários lentivírus de ovinos e caprinos,
sugerem que o CAEV teve origem no MVV (Valas et
al
., 1997). Além disso, os ensaios de infecção
expe-rimental e a análise filogenética dos SRLV sugerem
que a transmissão de lentivírus entre ovinos e caprinos
ocorra na natureza com alguma frequência (Banks et
al
., 1983; Shah et al., 2004), devendo este facto ser
le-vado em consideração nos estudos epidemiológicos e
nos planos de erradicação das infecções por SRLV.
A nível mundial, apenas se conhecem quatro
sequên-cia genómicas completas do MVV nomeadamente das
estirpes Islandesas K1514 e KV1772 (Andrésson et al.,
1993; Sonigo et al., 1985), e dos vírus Sul Africano
(SA-OMVV) (Querat et al.,1990) e britânico (EV-1)
(Sargan et al., 1991), todos eles do tipo rápido/alto. O
pequeno número de sequências genómicas MVV
dis-poníveis nas bases de dados internacionais, tem sido
um obstáculo ao conhecimento mais aprofundado da
epidemiologia molecular e patogénese do vírus, bem
como ao aperfeiçoamento das técnicas de detecção do
vírus por PCR.
Os resultados de rastreios serológicos realizados no
nosso país revelaram existir uma elevada prevalência
da infecção MVV nos ovinos nacionais (Fevereiro,
1995).
Neste trabalho é apresentada a sequência genómica
completa de um lentivírus isolado de um ovino
natu-ralmente infectado. O vírus, designado P1OLV, replica
de forma lenta, originando infecções persistentes e sem
efeito citopatogénico (CPE) evidente em células do
plexo coroide (SCP) e pulmão de ovino. Com base nas
características de replicação in vitro o isolado P1OLV
foi classificado como um vírus do tipo lento/baixo. A
análise filogenética baseada nos alinhamentos das
se-quências nucleotídicas dos genes pol e env, colocou o
P1OLV no grupo dos vírus Maedi Visna.
Material e métodos
Isolamento do vírus
O vírus P1OLV foi isolado a partir de células de
pulmão e explantados do plexo coroide provenientes
de um ovino da raça Badana naturalmente infectado,
proveniente de Trás-os-Montes. Estas células foram
cultivadas em meio DMEM e após 5 subculturas foram
congeladas em azoto líquido. A presença do vírus foi
detectada nestas células por imunocitoquímica, PCR e
RT-PCR.
Imunocitoquímica
As culturas celulares infectadas com P1OLV ou
WLC-1 (Cutlip et al., 1977), depois de fixadas com
uma solução de 10% formol em PBS (v/v) durante 15
min à temperatura ambiente (TA), foram lavadas e
in-cubadas a 37 ºC durante 2 h com o anticorpo
mono-clonal (Mab) 16D9 anti-MVV (Fevereiro et al., 1999).
Depois de nova lavagem, as culturas foram incubadas
durante 30 min a 37 ºC com imunoglobulinas de
co-elho anti-IgG de murganho, conjugadas com biotina
(Zymed Laboratories). A reacção antigénio-anticorpo
foi revelada pela adição de streptavidina-HRP (Zymed
Laboratories), durante 15 min à TA, seguida da solução
substrato/cromogénio (3-amino-9-ethylcarbazole
car-bazol/ H
2O
2) em tampão acetato (pH 5,0). As células
foram em seguida contrastadas com hematoxilina.
Células e ensaios de infecciosidade
Células SCP, obtidas de explantados do plexo
corói-de corói-de ovino, foram cultivadas em meio DMEM
suple-mentado com aminoácidos não-essenciais, piruvato de
sódio, antibióticos e 10% de soro fetal de bovino, a 37
ºC em atmosfera com 5% de CO
2. As células de
pul-mão de ovino e da bainha sinovial da articulação do
carpo de cabra (GSM), foram obtidas pelos processos
habituais de digestão com tripsina e cultivadas no meio
e condições acima descritas. Os MØ foram obtidos
a partir de leucócitos do sangue periférico (PBL) de
ovinos seronegativos ao MVV. Depois de colhido em
tubos contendo EDTA, o sangue foi centrifugado (800
x g, 10 min, a 22 ºC) e ao sedimento celular
adicio-nou-se tampão de lise dos eritrócitos (0,3 M NH
4Cl, 24
mM NaHCO
3, 0,5 mM EDTA, pH 7,2). Após 10 min
de incubação à temperatura ambiente, os PBL foram
recuperados por centrifugação, lavados duas vezes em
PBS e suspensos em meio RPMI 1640 (Invitrogen),
suplementado com antibióticos e 10% de soro de
ovi-no inactivado. Os PBL foram distribuídos por tubos de
teflon e incubados a 37 ºC durante uma semana para
permitir a diferenciação dos MØ. A ausência do MVV
e do CAEV nestas células foi garantida pela utilização
de dadores seronegativos e por ensaios de PCR
efec-tuados ao DNA extraído das células. A capacidade
in-fectante e a cinética de replicação do P1OLV in vitro
foi avaliada em células do pulmão, SCP, GSM e MØ e
comparada com a estirpe WLC-1. Para estes ensaios,
utilizaram-se stocks de vírus P1OLV e WLC-1,
ante-riormente produzidos e titulados em células GSM. As
diferentes culturas celulares foram inoculadas com 100
TCID
50, incubadas durante 24 h e depois de lavadas
com PBS adicionou-se meio de cultura completo. Os
MØ mantidos em tubos teflon foram nesta fase
trans-feridos para frascos de cultura de tecidos de 25 cm
2.
As culturas foram mantidas durante 1 a 6 semanas e
observadas diariamente para registo de CPE e colheita
de amostras dos sobrenadantes para avaliação do RNA
viral produzido.
qRT-PCR quantitativo
O RNA viral presente nos sobrenadantes das
cultu-ras inoculadas foi quantificado por RT-PCR em tempo
real, num termociclador iCycler iQ (Bio-Rad). Para a
reacção foram utilizados os reagentes Superscript
One-Step RT-PCR (Invitrogen), 50 pmol de cada primer,
10 pmol de sonda e 10 µl de sobrenadante clarificado
(10000 x g, durante 20 min) das culturas inoculadas ou
de controlo, num volume final de 50 µl.
As condições de amplificação e detecção foram as
seguintes: 45 min a 50 ºC; 2 min a 94 ºC; 40 ciclos de
15 seg a 94 ºC; 1 min a 53 ºC e 30 seg a 68 ºC. Os
pri-mers (gag510f 5’-GGCTCAAAGGAGAAAAAGG-3’
e gag638r 5’GTCTATAGTTTTTAATGCCCA-3’) e
a sonda (gagP610,
5’-TTCCCTTCTGTCAAGGTC-TCCTT-3’) utilizados, foram escolhidos com base
numa região conservada do gene gag dos lentivírus de
ovino. A sonda foi marcada no extremo 5’ com FAM
(6-carboxifluoresceína), fosforilada e marcada com
TAMRA (6- carboxi-tetrametilrodamina) no extremo
3’. A recta padrão RNA foi obtida a partir da
correla-ção entre diferentes concentrações do RNA WLC-1 e
os correspondentes valores Ct (limiar de detecção). A
eficácia da reacção RT-PCR com o vírus total, presente
no sobrenadante das culturas, relativamente ao RNA
padrão foi verificada pela comparação dos declives da
recta padrão e das rectas obtidas com as diluições dos
sobrenadantes das culturas inoculadas com P1OLV
e WLC-1. As diferenças (�s) dos declives foram � 0,1
para P1OLV e � 0,2 para WLC-1, indicando que o RNA
padrão utilizado permitia a quantificação fidedigna do
RNA viral de ambos os vírus presente nos
sobrena-dantes das culturas celulares. O RNA viral foi então
calculado a partir da intercepção dos valores Ct com a
recta padrão.
Extracção de DNA e RNA viral
Culturas de células de pulmão, infectadas com o
P1OLV, foram dissociadas com tripsina e lisadas
du-rante 20 min a 65 ºC com 1% de SDS. O DNA viral não
integrado foi obtido a partir de preparações de DNA
ex-tracromossomal extraído pelo método de Hirt (1967).
O RNA total foi extraído utilizando o sistema Rneasy
(Qiagen), segundo as indicações do fabricante.
Amplificação do DNA proviral por PCR
O genoma do P1OLV foi amplificado por PCR,
tendo sido obtidos três fragmentos contíguos
compre-endendo a totalidade do genoma P1OLV. Os primers
utilizados (Tabela 1) foram escolhidos a partir de
se-quências MVV anteriormente publicadas (Somigo et
al
., 1985; Querat et al., 1990; Sargam et al., 1991;
An-drésson et al., 1993). Para a reacção PCR foi utilizada
uma Taq DNA polimerase com actividade de
exonucle-ase 3’-5’ (Expand long template system, Roche), 50
pmol de cada primer e 0,5-1 µg de DNA, num volume
final de 50 µl. Para a síntese e amplificação do cDNA
do gene rev utilizou-se o sistema Superscript One-Step
RT-PCR-Platinum Taq (Invitrogen). As reacções foram
efectuadas num volume de 50 µl, com 50 pmol de cada
primer e 1,5 µg de RNA total extraído das células de
pulmão do animal infectado pelo P1OLV. As condições
de amplificação para os diferentes pares de primers
es-tão descritas na legenda da Figura 3.
Tabela 1 - Primers utilizados para amplificação dos fragmentos
subge-nómicos do P1OLV.
Primers Sequência nucleotídica (5’-3’)
Posição (genoma P1OLV) LTR1 CAGGATGACACAGCAAATGT 8979-8998 Pol2 TAGATTAGTCCTGAATTTGTTTCT 4443-4420 Pol1(W) AAGCTTGATCAACAGGAGCATATTGG 4161-4186 EnviR2 ACGCAATGGGGATGTCAACCTGAAGG 6421-6396 Env-XhoI CCGCTCGAGTGGGGATGTCTCATGTGGG 6252-6270 LTR2 CGGTGTTGCACGGAATTAGT 137-118 RevF ATGGCAAGTGGAAGAAAACCTGAC 5979-6002 RevR TTTTGAGGTTGCTCTCGCCAAT 8859-8838
Nota: Os nucleótidos sublinhados indicam o local de restrição da
endo-nuclease XhoI. O primer Pol1(W) foi descrito anteriormente por Woodall
(1994).
Clonagem e Sequenciação
Os fragmentos amplificados por PCR foram
ex-cisados de géis de agarose de baixo ponto de fusão
(NUSIEVE) e purificados pelo sistema Qiaex DNA
purification system (Qiagen). Todas as tentativas de
clonagem do fragmento LTR/Pol2 com 4571 pb no
vector pBluescript II KS+ (pBS KS+) falharam. Este
fragmento foi então hidrolisado com BamHI
origi-nando dois fragmentos com 1554 pb e 3017 pb, os
quais foram clonados individualmente em pBS KS+
previamente linearizado com BamHI/EcoRV,
obten-do-se os plasmídeos pP1/gag1554 e pP1/pol3017.
O fragmento resultante da amplificação com os
primers Pol1/Env2 assim como o cDNA
correspon-dente ao gene rev foram clonados no vector pCR2.1
(Invitrogen), dando origem aos plasmídeos
pP1/pol-env2261 e pP1/rev, respectivamente. O DNA
am-plificado pelos primers Env1/LTR2 foi hidrolisado
com a endonuclease XhoI e clonado no plasmídeo
pWSK29 (Wang and Kushner, 1991) previamente
li-nearizado com EcoRV/XhoI. A construção
resultan-te foi denominada pP1/env2986. Os fragmentos
clo-nados foram sequenciados pelo método enzimático
descrito por Sanger (1977), com o sistema Thermo
Sequenase Primer Cycle Sequencing kit (Amersham
Pharmacia Biotech). Para as reacções de
sequencia-ção utilizaram-se os primers universais T7 e M13
e primers internos complementares das sequências
do P1OLV, marcados com o fluorocromo Cy-5. As
reacções foram analisadas no sequenciador
automá-tico ALFexpress II (Amersham Pharmacia Biotech).
Ambas as cadeias de DNA de pelo menos dois
clo-nes independentes foram sequenciadas. Nos casos
em que ocorreram discrepâncias nas leituras foi
se-quenciado um terceiro clone independente.
Análise de sequências e filogenia
A análise filogenética foi realizada com o
sof-tware Wisconsin Sequence Analysis Package, do
Genetics Computer Group (GCG, Universidade de
Wisconsin) (Devereux et al., 1984). Os
alinhamen-tos múltiplos das sequências dos genes pol (região
RT) e env (proteína SU) foram gerados pelo
progra-ma CLUSTALW, versão 1.6 (Thompson et al., 1994).
Para o cálculo das distâncias genéticas e construção
dos dendogramas recorreu-se ao programa PUZZLE,
versão 2.3 (Strimmer e von Haeseler, 1996). Neste,
a frequência de transições e transversões foi
calcu-lada automaticamente a partir das sequências, assim
como o parâmetro alfa para uma distribuição gama
das taxas de substituição em que se consideraram
diferentes taxas de heterogeneidade. O modelo de
substituição escolhido baseou-se no algoritmo de
distâncias de Tamura-Nei (TN-93) (Tamura e Nei,
1993). Os dendogramas foram visualizados no
pro-grama TREEVIEW, versão 1.3 (Page, 1996).
Códigos de acesso das sequências nucleotídicas
Os códigos de acesso à base de dados GenBank das
sequências nucleotídicas usados neste trabalho são:
M18039 (K1514); M31646 (SA-OMVV); S51392
(EV-1); M33677 (CAEVco); U39826 (OLV-CU1);
U63651 (OLV 85/34); U51910 (MVV KM1071);
M60855 (CAEV 63); AJ400718 (CAEV 680);
AJ400719 (CAEV 021); AJ400720 (CAEV 032);
AJ400721 (CAEV 786); AF338226 (OLV S93);
U35674 (OLV-663); U35676 (OLV-676); U35677
(OLV-679); U35678 (OLV-680).
Resultados
Isolamento e características de replicação in
vitro do P1OLV
O P1OLV foi isolado a partir de células de
pul-mão e plexo coroide de um animal seropositivo ao
MVV. Ao exame histopatológico, os pulmões deste
animal apresentavam lesões de broncopneumonia
purulenta e hiperplasia dos folículos linfoides
pe-ribrônquicos. A presença de vírus nas culturas
ce-lulares foi detectada por imunocitoquímica, PCR e
RT-PCR.
As características de replicação in vitro do P1OLV
fo-ram estudadas em células de pulmão, SCP, GSM e MØ
e comparadas com as da estirpe lítica WLC-1.
Regista-ram-se diferenças significativas entre os dois vírus, quer
na cinética de replicação nas células testadas (Figura 1)
quer no CPE induzido. Como era esperado, a estirpe
WLC-1 replicou rapidamente em todos os tipos
celu-lares e com produção de elevados níveis de RNA viral,
com o valor máximo obtido nas células SCP. Além
dis-so, o WLC-1 replicou sempre de forma lítica,
induzin-do a formação de numerosos sincícios e destruição induzin-do
tapete celular (Figura 2). O P1OLV induziu infecções
líticas em células GSM e em MØ, enquanto que em
cé-lulas de pulmão e SCP originou infecções persistentes,
sem CPE evidente (Figura 2).
Comparativamente ao isolado WLC-1, o P1OLV
re-plicou de forma mais lenta e com níveis inferiores de
produção de RNA viral (Figura 1). Nos MØ, os picos de
RNA foram detectados cinco dias pós-inoculação (p.i.)
para o WLC-1 e ao nono dia no P1OLV, sendo duas
vezes superiores para o WLC-1. Em células de pulmão
e SCP as diferenças de crescimento entre os dois vírus
foram ainda maiores. Nestas células, os níveis máximos
de RNA-P1OLV observados ao fim de 4 a 6 semanas
p.i. foram, respectivamente quatro e cinco vezes
infe-riores aos picos de RNA registados 14 dias p.i. para o
WLC-1. Nas células GSM o pico de RNA-P1OLV foi
registado duas semanas após o observado para a estirpe
WLC-1 e cerca de 1,5 vezes mais baixo.
Clonagem e sequenciação do genoma do isolado
P1OLV
O genoma do P1OLV foi clonado a partir de três
fragmentos ampflificados por PCR com recurso
aos pares de primers LTR1/Pol2, Pol1(W)/EnviR2
e Env-XhoI/LTR2 que compreendem a totalidade
do genoma (Figura 3). A estratégia de clonagem
está representada na Figura 4.
O genoma completo do P1OLV tem 9189
nucle-ótidos (Figura 5) e possui um conteúdo em G+C de
40,8%. Apresenta uma organização genética idêntica à
dos SRLV anteriormente publicados e uma
similarida-de similarida-de 79,9%, 80,1%, 78,9% e 69,9% respectivamente
com as sequências dos isolados K1514, SA-OMVV,
EV-1 e CAEVco.
Figura 1 - Cinética de replicação dos vírus P1OLV e WLC-1 em células de pulmão, SCP, macrófagos e GSM . O RNA viral foi
quanti-ficado a partir dos sobrenadantes das culturas por qRT-PCR, como descrito nos Materiais e Métodos. Os sobrenadantes das culturas de
células não infectadas deram sempre resultados não mensuráveis.
Figura 2 - Células SCP infectadas com os isolados P1OLV (A e C) e WLC-1 (B e D). A) e B) imagens de microscopia de contraste de fase;
note-se a formação de CPE (sincícios) nas células infectadas com a estirpe WLC-1. Nestas células o P1OLV induz infecções persistentes
sem CPE evidente. C) e D) imunocitoquímica efectuada com recurso ao Mab16D9, como descrito nos Materias e Métodos. As células
infectadas apresentam uma coloração avermelhada.
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Figura 4. Estratégia de clonagem do genoma do P1OLV, a partir dos
fragmentos subgenómicos amplificados por PCR, com recurso aos pares
de primers LTR1/Pol2, Pol1(W)/EnviR2 e Env-XhoI/LTR2,
compreen-dendo a totalidade do genoma. Os quatro clones recombinantes obtidos
foram denominados de pP1/gag1554, pP1/pol3017, pP1/pol-env2261 e
pP1/env2986.
Figura 3. Fragmentos subgenómicos amplificados por PCR
utili-zados na clonagem do genoma do P1OLV. M1) marcador �DNA/
HindIII; 2) produto PCR amplificado com os primers LTR1/Pol2
[94ºC-1min, 40 x (94ºC-30 s, 55ºC-1 min, 70ºC-5 min)]; 3)
produ-to PCR amplificado com os primers Pol1(W)/EnviR2 [94ºC-2 min,
10 x (94ºC-10 s, 58ºC-30 s, 68ºC-3 min), seguidos de 20 ciclos
nos quais se aumentou por ciclo 20 s ao passo de extenção)]; 4)
produto PCR amplificado com os primers Env-XhoI/LTR2
[94ºC-2 min, 40 x (94ºC-30 s, 60ºC-1 min, 68ºC-3 min)]; 5) produto rev,
obtido por RT-PCR com os primers RevF/RevR [48ºC-45 min, 40
x (94ºC-30 s, 50ºC-1 min, 72ºC-1 min)]; M2) marcador 100 bp
DNA ladder (Invitrogen).
GenBank, tendo-lhe sido atribuído o código de acesso
AF479638.
No RNA genómico do P1OLV foram identificados
os genes estruturais gag, pol e env e os genes
regula-dores vif, tat, rev, característicos dos SRLV. Nas
extre-midades do genoma localizam-se sequências repetidas
longas directas (LTR) que contêm motivos promotores
essenciais para a regulação da expressão génica. A
lo-calização dos vários genes, o tamanho dos péptidos por
eles codificados e as suas massas moleculares, estão
apresentados na Tabela 2. A análise comparativa das
sequências nucleotídicas do domínio U3 da LTR do
1101 atgatgcctggaaatagagcacagaaagaattaatacaagggaaattaaatgaagaagcagagagatgggtgaggcaaaacccaggcccgaatgctctca MetMetProGlyAsnArgAlaGlnLysGluLeuIleGlnGlyLysLeuAsnGluGluAlaGluArgTrpValArgGlnAsnProGlyProAsnAlaLeuT . . . 1201 cagtggatcaaattatgggagtgggacaaacaaatcaacaagcttcacaggctaatatggatcaagcaagacaaatatgtttacaatgggtaataacagc hrValAspGlnIleMetGlyValGlyGlnThrAsnGlnGlnAlaSerGlnAlaAsnMetAspGlnAlaArgGlnIleCysLeuGlnTrpValIleThrAl . . . 1301 attgaggtcggtgagacatctatcgcataggcctggtaatcctatgctggtaaagcaaaagaatacagagagttatgaggactttgtagcgagactgtta aLeuArgSerValArgHisLeuSerHisArgProGlyAsnProMetLeuValLysGlnLysAsnThrGluSerTyrGluAspPheValAlaArgLeuLeu . . . 1401 gaagcaattgatgcagaacctgtcacggatcctatcaaaacgtatttaaaagtaactctgtcttatacaaatgctagtacggattgtcaaaaacaaatgg GluAlaIleAspAlaGluProValThrAspProIleLysThrTyrLeuLysValThrLeuSerTyrThrAsnAlaSerThrAspCysGlnLysGlnMetA . . . 1501 acagagtgttaggggctagggtccagcaggcaacagtagaagaaaaaatgcaggcatgtagagatgtgggatcagaaggatttaaaatgcaattgttggc 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