FACULDADE DE ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO IN VITRO E IN VIVO DE MICROESFERAS DE
HI-DROXIAPATITA ASSOCIADA À DOXICICLINA
Niterói – RJ 2019
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO IN VITRO E IN VIVO DE MICROESFERAS DE
HI-DROXIAPATITA ASSOCIADA À DOXICICLINA
HELDER BARRETO VALIENSE Tese apresentada à Faculdade de Odonto-logia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Área de Concentração: Odontologia
Orientadora: Profa. Dra. Mônica Diuana Calasans Maia
Co-orientador: José de A. Calasans Maia
Niterói – RJ 2019
Prof. Dr. José de Albuquerque Calasans Maia Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão:______________________ Assinatura: ________________________ Profa. Dra. Suelen Cristina Sartoretto Lorenzi
Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão:______________________ Assinatura: ________________________
Prof. Dr. Rodrigo Figueiredo de Brito Resende Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão:______________________ Assinatura: ________________________ Prof. Dr. Carlos Alberto Soriano de Souza
Instituição: Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas
Decisão:______________________ Assinatura: ________________________ Prof. Dr. Paulo Vicente Barbosa da Rocha
Instituição: Universidade Federal da Bahia
Dedico esse trabalho aos meus filhos, Cami-la e Caio, e a Morena, peCami-la base familiar e apoio em todos os momentos.
Aos meus Pais, Valiense (in memorian) e Vilma, pela vida, apoio inconteste e pela alegria na vida de tê-los como pais.
Às minhas irmās Helma e Halana, pelas ale-grias que proporcionaram em minha vida. AMO TODOS!!!
AGRADECER – palavra simples, mas nāo simplória; ela contém um signifi-cado imenso e valoroso, que traz consigo um profundo e sincero sentimento de Gra-tidāo – o que, para mim, tem um valor imensurável. Por isso, A DEUS EU PEÇO que ilumine a vida de cada um que participou desta caminhada, de forma direta ou indireta. Em razão disso, agradeço:
A Deus e rogo que Ele possa me proporcionar a cada raiar do dia o sorriso sublime e iluminado de minha Morena, que foi fonte de luz e força em todos esses momentos, que soube como ninguém administrar minhas ausências mesmo presen-te fisicamenpresen-te, dar aquela palavra de conforto e incentivo nos momentos difíceis; saiba que nāo conseguiria sem você.
Aos meus filhos, pela compreensão e amor energizante e incessante, eram vocês que recarregavam minhas energias.
Aos meus pais, ainda que tenha um lado de mim que chora, pela ausência de meu pai neste momento. Obrigado meu Velho (VAVA) por ser exemplo de vida, como pai, amigo, como pessoa, sei que aonde estiver, estará agora sorrindo aquele sorriso largo e empolgante!! Um outro lado sorri, pela força da mulher vibrante e contagiante que é você minha māe, obrigado por tudo, sempre me apoiando e acreditando nos meus sonhos, quando passei no vestibular a senhora que é orgulhosamente profes-sora disse: “– voe, meu filho”, nunca esqueci isso e a prova se resume aqui.
Às minhas irmās Helma e Halana, pela certeza do amor e carinho que recebo de vocês; apesar de minhas ausências, saibam que é reciproco.
À minha orientadora, Professora Doutora Mônica Diuana Calasans Maia! A se-nhora será sempre uma célula viva nos meus pensamentos, palavras e orações, fonte segura daquilo de mais sincero e exemplar de uma Docente: a energia, entusiasmo, comprometimento, seriedade e dedicaçāo sāo marcas registradas da senhora; espero que o convívio perdure por muito mais tempo e, nesse período de oito anos, nosso contato fez aumentar o respeito e adimiraçāo. Vamos trabalhar!! Em tempo, agradeço também o grande Calasans, sou seu fā também, sua estrela é de primeira grandeza, sua serenidade e paz sāo encorajadoras, um forte abraço meu amigo.
mesmo um colo, digno dos pais!, a me apoiar.
Como chegar aqui e nāo agradecer a Silvia!? Minha linda, agradeço cada conversa, cada dúvida, cada telefonema e, claro, cada choppinho regado a uma conversa sobre química – o que, talvez, fizesse as pessoas ao nosso redor pensa-rem: “dois nerds”!
Ao querido Soriano, ou melhor, como todos carinhosamente o chamam de Soso, pela paciência, presteza e atenção, saiba que você é parte fundamental deste trabalho, muito obrigado.
Á querida professora Adriana pelo carinho, atençāo e pronta disposiçāo em ajudar, ensinar e motivarmos, sempre com um sorriso estampado no rosto.
E o Patota??? É incrível como Deus consegue unir de forma randomizada, infinitos cegos e controlados, pessoas que nunca se viram e desde o primeiro mo-mento parece que tínhamos uma amizade muito além daquele instante, se tornando amigos e irmāos da vida! Esses quatro anos foram singulares com vocês, obrigado pelas resenhas, conversas, infinitos risos e pela plena sensaçāo de estarmos perto, ainda que distantes!!! Somos quase uma maçonaria, “kkk”, Anderson, Igor, Mourāo, eu, Uzeda, Rodrigo, agora recentemente o Daniel, o Rafael e o Vitório. Pessoas comprometidas e compromissadas com a odontologia e que servem de exemplo; mas que também sabem zoar como ninguém.
Aos meus amigos Gabriel, Hugo, Marcelo Teles, Ledson, Oseas Teles, Frutos Bolaños, Tatiana, Leonardo Neves, Mateus, e todos que me incentivaram a continuar nesta jornada.
Às minhas raizes iniciais, que me deram régua e compasso, na pessoa da Dona Adelia Melo, no Colégio Nossa Senhora das Vitórias, onde descobri a química pelos ensinamentos da professora Olívia Santana e que muito contribuiu para a mi-nha vida acadêmica.
Por fim, reitero o agradecimento a DEUS, em razão de ter me concedido o prazer da vida e ter me proporcionado conviver com pessoas tāo fantásticas. Obri-gado, Senhor!
Valiense HB. A influência de implante de microsferas de hidroxiapatita tratadas com doxicilina como sistema de liberaçāo de fármacos na regeneraçāo óssea após a ex-traçāo dentária de ratos wistar. [Tese]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2019.
A tecnologia de drug delivery é uma forma prática e promissora de melhorar a eficá-cia terapêutica de drogas. Em consonâneficá-cia a esta perspectiva, o objetivo deste es-tudo é avaliar as propriedades físico-químicas da hidroxiapatita contendo doxiciclina (HADOX), avaliar seus efeitos na viabilidade dos osteoblastos in vitro, atividade an-timicrobiana e determinar os efeitos da doxiciclina (DOX) na cicatrização de alveólos de ratos após a extração dentária. A porosidade interna das microesferas foi eficaz ao tratamento utilizado para adsorver DOX na sua superfície. As microesferas sem DOX apresentaram 26% de poros, enquanto as microesferas com DOX 0,15% apre-sentaram 52%. Observou-se a liberação inicial de 49,15 µg/mg nas primeiras 24 h (aproximadamente 20%). O teste de concentração inibitória mínima (MIC) contra E.
faecalis demonstrou que o crescimento bacteriano foi inibido por até sete dias. Os
resultados da viabilidade celular e proliferação celular não indicaram diferenças esta-tísticas na atividade metabólica das amostras de HADOX em relação a HA (p> 0,05).Para o estudo, foram utilizados vinte ratos Wistar, divididos de acordo com os seguintes grupos experimentais: Grupo 01. Hidroxiapatita e Grupo 02. Hidroxiapatita contendo 15% de doxiciclina e, subdividido de acordo com os períodos experimen-tais. Após a extração dentária do incisivo superior direto, foram implantados nas ca-vidades alveolares os biomateriais,de acordo com os grupos experimentais. Após 7 e 42 diasm, os animais foram eutanasiados, os blocos ósseos foram removidos e as amostras foram processadas histologicamente. Cortes com 5µm de espessuras co-rados com Hematoxilina e Eosina foram obtidos para análise histológica e histomor-fométrica. ãntba Após uma semana, observou-se reação de inflamação discreta no grupo controle e, após seis semanas, foi observado osso neoformado no grupo HA-DOX 0,15 (p <0,05). A HAHA-DOX não interferiu no reparo ósseo e controlou a resposta inflamatória precoce, o que possibilita inferir que o HADOX pode ser um biomaterial promissor que não interfere no reparo ãósseo e controla a resposta inflamatória precoce.
Valiense HB. The influence of implant of hydroxyapatite microspheres treated with doxycycline as a system of release of drugs in the bone regeneration after the dental extraction of Wistar rats. [Thesis]. Niterói: Fluminense Federal University, School of Dentistry; 2019.
Drug delivery technology is a practical and promising way to improve the therapeutic efficacy of drugs. This study aimed to evaluate the physicochemical properties of doxycycline-containing hydroxyapatite (HADOX), to evaluate its effects on the in vitro osteoblast viability, antimicrobial activity and to determine the effects of doxycycline (DOX) on alveolar healing of rats after tooth extraction. The internal porosity of the microspheres was adequate to the treatment used to adsorb DOX on its surface. The microspheres without DOX presented 26% of pores, while the microspheres with DOX 0.15% presented 52%. The initial release of 49.15 µg / mg in the first 24 h (ap-proximately 20%) was observed. The minimal inhibitory concentration (MIC) test against E. faecalis demonstrated that bacterial growth was inhibited for up to seven days. The results of cell viability and cell proliferation did not indicate statistical diffe-rences in the metabolic activity of HADOX samples concerning HA (p> 0.05). Twenty Wistar rats were divided into the study according to the following experimental groups: Group 01. Hydroxyapatite and Group 02. Hydroxyapatite containing 15% doxycycline and, subdivided according to the experimental periods. After the dental extraction of the right superior incisor, the biomaterials were implanted in the alveolar cavities, according to the experimental groups. After 7 and 42 days, the animals were euthanized, the bone blocks were removed, and the samples were histologically pro-cessed. Five µm thick sections stained with Hematoxylin and Eosin were obtained for histological and histomorphometric analysis. After a week, a mild inflammation reac-tion was observed in the control group and, after six weeks, new bone was observed in the HADOX group 0.15 (p <0.05). HADOX did not interfere with bone repair and control the early inflammatory response, which makes it possible to infer that HADOX may be a promising biomaterial that does not interfere with bone repair and controls the early inflammatory response.
1 INTRODUÇÃO
A hidroxiapatita (HA) é um fosfato de cálcio sintético extensivamente usado como enxerto ósseo devido a sua similaridade química e estrutural com a fase mine-ral do osso, biocompatível, osteocondutor, não-tóxico, não-inflamatório, não-imuno-gênico e bioativo (Ono K et al., 1990). Recentemente, também tem sido utilizado como carreador de drogas em diversas aplicações médicas (Krajewski A et al., 2000; Vinay R & Kusumdevi V, 2014; El-Figi A et al. 2017; Ramírez-Agudelo R et al. 2017; Sakellariou V et al. 2015; Maia ALC et al. 2017; Ramagnoli C. 2013) e em odontologia, com ênfase na periodontia – área em quealguns estudos demonstram sua eficácia a curto e longo prazo, por apresentar uma diminuição da flora patogêni-ca em pacientes com periodontite moderada e avançada crônipatogêni-ca (Preshaw PM et al. 2004; Bogren A et al. 2008; Yagan A et al. 2014; Ding L et al. 2018).
Em função da baixa circulação sanguínea nos sítios de defeito ósseo, drogas como antibióticos, antimicrobianos e fatores de crescimento têm seu acesso limita-do às regiões afetadas. Por isso, para contornar essas limitações, sistemas de libe-ração controlada têm sido utilizados com o objetivo de aumentar a eficácia dos tra-tamentos de regeneração óssea (Kim HW et al., 2004), incluindo-se, nesse contexto, as pesquisas desenvolvidas com a HA.
Uma das causas principais de insucesso nos tratamentos da regeneração ós-sea são as infecções microbianas (Quirynen M 2002, Duyck J & Naert I, 1998), tor-nando a associação de um agente antimicrobiano ao biomaterial uma alternativa importante. Apesar de inúmeras estratégias terem sido desenvolvidas para qualificar a associação HA/medicamentos, a liberação da droga normalmente é abrupta nos períodos iniciais, sendo que a liberação sustentada é difícil de se obter (Horbylon 2008).
Apesar das características químicas positivas da HA, estudos recentes têm demonstrado a importância da forma tridimensional do biomaterial na interação com as células. Microesferas de fosfato de cálcio nanoestruturadas foram recentemente enxertadas com sucesso para a regeneração óssea, em diversos modelos animais, como alvéolos dentários, na tíbia e seio maxilar de coelhos (Calasans-Maia M et al., 2015; Calasans-Maia M et al., 2014; Valiense HB et al., 2016).
O tratamento e a prevenção da osteomielite são complicados devido ao pobre fornecimento de sangue para o tecido ósseo. A administração sistêmica de antibióti-cos proporciona concentrações baixas na zona infectada e um antibiótico em over-dose tem, muitas vezes, efeitos colaterais adversos. Neste contexto, a liberação lo-cal de antibióticos mostra-se bastante relevante. Para tal efeito, o sistema de entre-ga de droentre-gas (DDS – Drug Delivery Sistem) foi desenvolvido no intuito de liberar drogas localmente nos sítios implantados. Em cirurgias ósseas, este sistema é usa-do para prevenir ou tratar a infecção crônica ou osteomielite relacionada ao implante (Korkusuz F et al., 2001).
A alveolite é uma das complicações mais comuns no pós-operatório da extra-ção de dentes permanentes. É uma condiextra-ção caracterizada por dor intensa que se inicia entre o primeiro e terceiro dia após a cirurgia, associada à ausência do coágu-lo no alvéocoágu-lo de onde o dente foi extraído (Cardoso et al., 2010). Aproximadamente 45% dos pacientes necessitam de quatro ou mais consultas para a solução dos sin-tomas. Apesar da etiopatogenia não estar totalmente esclarecida, acredita-se que uma microbiota mista, composta por bactérias Gram-positivas e negativas, facultati-vas e anaeróbias possa ter importante participação (Bosco JM et al., 2008).
A tetraciclina é uma classe de antibióticos de amplo espectro, na qual a ativi-dade antimicrobiana é causada pela inibição da síntese de proteína bacteriana de forma seletiva, quando considerada a ação em células eucarióticas. Tetraciclina, oxi-tetraciclina, doxiciclina e minociclina são exemplos de drogas que se tornam desse grupo (Brion M et al., 1981) que pode interferir positivamente no tratamento desse tipo de quadro.
A doxiciclina (DOX) é um antibiótico de amplo espectro e é aplicada clinica-mente como adjuvante da plastificação radicular ou do desbridamento cirúrgico para o tratamento de periodontite e peri-implantite (Golub LM et al., 2016). É usado no tratamento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e inibe a biossíntese de proteínas bacterianas (Injac R et al., 2007). Além de sua ação antibacteriana por ini-bir a síntese de proteína microbiana, a DOX suprime os leucócitos polimorfonuclea-res e anticolagenases da regulação alterada do cálcio citoplasmático mediada pelos osteoclastos e inibe a reabsorção óssea adicional (Golub LM et al., 2001).
Além disso, Kinugawa S et al., em estudo realizado em 2012, mostrou que a DOX inibe a diferenciação de osteoclastos. Este estudo indica efeitos benéficos da DOX na regeneração óssea. O efeito da doxiciclina na promoção da formação óssea
após a colocação do implante é esperado devido às suas propriedades inibitórias na inflamação e osteoclastogênese (Walter MS et al., 2014; Ding L et al., 2018). Desse modo, a par das informações apresentadas e com base nas pesquisas acadêmicos que vêm sendo desenvolvidos, entende-se como pertinente o estudo da hidroxiapati-ta ser um potencial carregador de fármacos.
2 PROPOSIÇĀO
O presente trabalho tem como objetivo avaliar in vitro através de testes mi-crobiológicos e de citotocompatibilidade e in vivo o reparo ósseo alveolar após im-plantação de microesferas de hidroxiapatita associada à doxiciclina (HADOX) como biomaterial para enxerto ósseo em ratos Wistar.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Preparação e caracterização físico-química da hidroxiapatita
Os pós de HA foram sintetizados por adição gota a gota de solução aquosa de (NH4) 2HPO4 a uma solução de Ca(NO3)2 (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) a
90°C e pH = 10. Utilizou-se fluorescência de raios X (espectretro de fluoresência de raios X PW 2400, Philips Analytical X-Ray, Almelo, Holanda) para determinar a pro-porção molar HA Ca/P. A estrutura da HA foi analisada por espectroscopia de infra-vermelho com transformada de Fourier (FTIR) (espectretro IR-Prestige-21 / AIM-880, Shimadzu Corp.). A espectroscopia de FTIR das amostras de pó foi realizada em modo de transmissão usando discos de KBr operando na faixa de 400 a 4000 cm-1,
com 128 varreduras. A cristalinidade do HA foi analisada por difraçāo de raios X (DRX) com radiação CuKa a 40 kV e 40 mA (difratômetro X'Pert Pro X-Ray, PANa-nalytical).
3.2 Preparaçāo das microesferas de hidroxiaptita
O pó de HA foi disperso numa solução aquosa a 10 mg/mL de alginato de só-dio (Fluka Biochemika, Buchs, Suíça) para alcançar uma razão 1:15 de alginato-HA. A mistura de alginato/HA foi extruída gota a gota à temperatura ambiente em uma solução de CaCl2 0,15 M usando uma agulha com 0,55 mm de diâmetro (BD
Preci-sion Glide, São Paulo, SP, Brasil). Partículas esféricas foram instantaneamente for-madas e deixadas a amadurecer na solução de CaCl2 por 24 h para a completa
geli-ficação. As microesferas de HA-alginato foram secas durante a noite em estufa a 30oC e sinterizadas a 1100oC. Após a sinterização, os diâmetros das microesferas
3.3 Adsorçāo da doxicilina na hidroxiapatita
Os experimentos de adsorção foram realizados em um sistema de lotes de acordo com o procedimento descrito por De Souza CA et al, 2011. Resumidamente, a HA foi incubada em solução de cloridrato de doxiciclina (DOX) - solução salina tamponada com fosfato (Sigma-Aldrich) (PBS, pH 7,4 0,25 a 20 mg/mL) na propor-ção de 50 mg HA/mL e moderadamente agitado durante 24 h a 37oC. Após a
incu-bação nas soluções DOX, as amostras de pó da HA foram centrifugadas (6000 RPM durante 5 min.), lavadas ligeiramente durante 1 min. para remover as frações de DOX fisicamente adsorvidas e secas pelo modo de liofilizaçāo por 24 h.
A concentração de DOX adsorvida na superfície da HA foi determinada por espectrofotometria UV-Vis a um comprimento de onda de 275 nm (Espectrofotôme-tro UV-Vis 2550, Shimadzu Corp.) e os espec(Espectrofotôme-tros UV-Vis após experimentos de ad-sorção foram obtidos também por UV –Vis espectrofotometria (Espectrofotômetro UV-Vis 2550 com Acessório de Esfera de Integração ISR-2200, Shimadzu Corp.) em um modo de refletância operando na faixa de 200-600 nm. O espectro de UV foi rea-lizado usando alíquotas sólidas (400 mg) compostas por HADOX (100 mg), DOX em pó (100 mg) e grau analítico BaSO4 em pó (300 mg - Sigma-Aldrich). As funções
gaussianas foram usadas para ajustar os espectros de UV da DOX adsorvidos na superfície de HA.
Para experimentos biológicos e ensaios de liberação de fármaco, 100 mg de microesferas de HA foram incubadas em 2 mL de solução de DOX PBS a 0,05% (0,5 mg / mL) ou 0,15% (1,5 mg / mL) por 24 h a 37oC (HADOX0.05 e HADOX0.15,
res-pectivamente). O grupo HA foi obtido por incubação de microesferas de HA em solu-ção de PBS sob as mesmas condições descritas anteriormente. Após incubasolu-ção nas soluções DOX, as microesferas foram centrifugadas (6000 RPM por 5 min), lavadas levemente por 1 min para remover as frações DOX fisicamente adsorvidas, secas durante 24 h a 37oC e esterilizadas por raios gama (15 kGy). A concentração de
DOX adsorvida na superfície da HA foi determinada por espectrofotometria UV-Vis a um comprimento de onda de 275 nm (Espectrofotômetro UV-Vis 2550, Shimadzu Corp).
3.4 Microscopia eletrônica de varredura e estudo da porosidade
A topografia da superfície de microesferas de HA antes e depois da adsorção de DOX foi analisada usando um microscópio eletrônico de varredura (MEV) (JEOL JSM-6490LV, Tóquio, Japão) operado a 15 kV. Para análise de porosidade, as mi-croesferas HA ou HADOX0.15 foram embebidas em resina epóxi (EPON) e polimeri-zadas a 60°C por 48 h. Em seguida, a resina foi montada em suportes de alumínio e feito o polimento até atingir o diâmetro máximo da microesfera. A amostra foi reves-tida com uma fina camada de ouro e uma fita de carbono foi anexada à amostra para evitar o carregamento durante a análise do MEV. As imagens foram adquiridas usando uma estação de trabalho de feixe duplo LYRA-3 (TESCAN - República Tche-ca) e registradas com 1024 x 1144 pixels, sendo o tempo de permanência de 32 µs/ pixel. A porosidade das microesferas foi calculada usando imagens tratadas pelo software FIJI. A área porosa foi delimitada a partir da superfície até o centro da mi-croesfera com largura de 33 µm e altura igual ao seu raio.
3.5 Microtomografia
A microtomografia de raios X (µTC), utilizando radiação síncrotron, foi utiliza-da para caracterizar a estrutura interna utiliza-da microesfera de HA. As amostras foram analisadas por meio de microrradiografias, na linha de imagem de alta resolução (IMX), na Fonte de Luz Síncrotron Brasileira (LNLS). As amostras foram iluminadas por um feixe policromático (4 a 24 keV) e um filtro de Si de 550 µm foi posicionado antes da amostra para reduzir o efeito de endurecimento do feixe. 1001 projeções foram capturadas por uma câmera CCD (PCO.2000), uma lente 10x foi usada para ampliar a imagem e obter um tamanho de pixel de 0,82 µm. Os experimentos foram realizados em modo contraste e o modo contagem foi utilizado para garantir o mes-mo fluxo em todas as projeções, pois a corrente de feixe tem um tempo de meia hora e de 12 h, as mudanças são consideráveis durante o experimento (normalmen-te, uma varredura 3D completa leva 45 min). Um algoritmo de retrotradução rápida
foi usado para reconstruir os dados, enquanto o Avizo 9.5, um software de visualiza-ção 3D, foi usado para filtrar, segmentar, analisar as imagens e determinar a distri-buição interna dos poros e o diâmetro equivalente dos poros.
3.6 Ensaios de liberação in vitro de doxiciclina
Os ensaios de liberação da DOX foram realizados in vitro incubando amostras de microsferas HADOX0.15 em PBS durante nove dias. Resumidamente, 100 mg de microesferas HADOX foram incubadas em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 a 37°C. Em intervalos definidos de 1 a 120 minutos e 1 (um), 3 (três), 6 (seis) e 9 (nove) dias, alíquotas do sobrenadante foram recuperadas, o PBS era então completamente substituído nos intervalos de tempos estabelecidos, para evitar a saturaçāo do meio e, com isso, limitar a saída da Dox, e uma nova alíquota de PBS foi adicionada até 9 (nove) dias quando a amostra final foi coletada. A quan-tidade de DOX liberada foi determinada por espectrofotometria UV-Vis a 275 nm.
3.7 Ensaios microbiológicos
Os experimentos de atividade antimicrobiana das microesferas HADOX 0,15 antes e após 1 (um), 3 (três) e 7 (sete) dias de testes liberados foram baseados em métodos de diluição padrão publicados pelo National Committee for Clinical
Labora-tory Standards Institute. Resumidamente, Enterococcus faecalis (ATCC 29212),
fo-ram cultivados a partir de estoques congelados em caldo tripticase de soja (TSB - Plast Labor, Rio de Janeiro, RJ, Brasil). As culturas foram preparadas de fresco para cada experimento e diluídas para 0,5 de padrões de turbidez de McFarland, aproxi-madamente 1.5 × 108cells/mL. Os inóculos bacterianos foram incubados em TSB
contendo microesferas HADOX em concentrações de 25 mg HADOX / mL a con-centrações de 0,012 mg/mL. De modo a avaliar a capacidade de inibir o crescimen-to, após 18 h, a turbidez do caldo foi medida utilizando um espectrofotômetro de UV a 595 nm (UV-VIS 2550, Shimadzu). Os valores de MIC (concentração mínima
inibi-tória) foram definidos pela menor diluição para manter o meio de cultura sem turbi-dez. Os testes completos foram realizados em triplicado.
3.8 Ensaio de citocompatibilidade
Para a avaliação da citocompatibilidade, foram escolhidas células de osteo-blastos de fragmentos livres de periósteo de fêmures murinos (F-OST) (Balduino, A et al 2005), pois essas células são altamente diferenciadas e se comportam mais como osteoblastos. As células foram rotineiramente cultivadas com meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM, Gibco) suplementado com 10% de soro bovino fe-tal (FBS) e incubado a 37°C a 5% de atmosfera de CO2. Passagens baixas
confluen-tes foram tripsinizadas, contadas em uma câmara de Neubauer e usadas em todos os experimentos.
Para determinar se alguma liberação de DOX pode causar citotoxicidade celu-lar, foi realizado um ensaio de viabilidade celular após a exposição das células a ex-tratos de cada material (grupos HA, HADOX 0,05 e HADOX 0,15). Já a fim de prepa-rar os extratos das amostras, microesferas esterilizadas por radiação gama foram imersas em DMEM livre de soro bovino fetal e agitadas por 24 horas a 37oC
confor-me preconizado pela ISO 10993-5. Em seguida, os extratos foram coletados e cen-trifugados a 3000 rpm por 10 min., para garantir que nenhuma partícula interferiria no ensaio de biocompatibilidade.
Células F-OST foram semeadas numa placa de cultura de células de 96 po-ços (8 x 103 células/poço) e cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS
durante 24 horas a 37 em 5% de CO2 / 95% de ar. Após 24 h, o DMEM foi removido
e as células foram expostas aos extratos das amostras por mais 24 h. Uma solução a 1% de dodecil sulfato de sódio (SDS) foi usada como controle positivo de citotoxi-cidade (C +) e as células foram usadas como controle negativo de citotoxicitotoxi-cidade (C-). O controlo negativo é utilizado para demonstrar a resposta celular no ensaio e o controlo positivo para provar uma resposta apropriada dos reagentes.
O ensaio de viabilidade celular foi realizado utilizando o Reagente de Viabili-dade Celular PrestoBlue™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA, EUA). O reagente Pres-toBlue™ é uma solução à base de resazurina
(7-hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona-10-óxido). As células vivas reduzem este composto à resafurina e as medidas de fluo-rescência e absorbância da solução dão uma indicação da atividade metabólica ce-lular e, consequentemente, a presença de células viáveis medidas a 590 nm. O en-saio de eluição do corante violeta cristal (CVDE) avalia a densidade celular por colo-ração de DNA e a absorvância a 540 nm é proporcional à quantidade de células em cada poço. Os ensaios colorimétricos foram realizados por espectrofotômetro Sy-nergy II UV-Vis (Biotek Instruments, EUA).
3.9 Caracterização dos Animais
3.9.1 Princípios éticos
Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso Animal da Universi-dade Federal Fluminense (CEUA/UFF nº 348). Todos os procedimentos que foram adotados para criação, tratamento, manutenção e/ou eutanásia dos animais foram realizados de acordo com a DBCA do CONCEA e com a Prática de Eutanásia do CONCEA, ambos disponíveis em www.mctic.gov.br.
O presente estudo é relatado de acordo com as diretrizes do ARRIVE e PRE-PARE e de acordo com o programa dos 3 Rs (Reduction, Replacement and
Refine-ment) que preconiza a redução do número de animais em experimentação sem
per-der a precisão na análise estatística. O tamanho da amostra foi definido baseado em estudos anteriores que utilizaram o mesmo sítio cirúrgico e modelo animal.
3.9.2 Manutenção dos animais
No presente estudo, foram utilizados 20 ratos Wistar, machos ou fêmeas, pe-sando de 300 a 400 gramas, fornecidos pelo Núcleo de Animais de Laboratório (NAL), localizado na Universidade Federal Fluminense, Niterói, Rio de Janeiro. An-tes e após o período experimental os animais foram mantidos em mini-isoladores
(n=2) e foram alimentados por ração peletizada e água à vontade. Foram escolhidos aleatoriamente dez animais para cada grupo experimental (HA e HADOX 0,15) e cinco animais para cada período experimental (7 e 42 dias).
3.9.3 Procedimentos de anestesia e cirurgia
Todos os procedimentos que foram realizados nos animais e que poderiam resultar em ansiedade e/ou dor foram conduzidos sob anestesia geral. Os animais foram privados de ração seis horas antes do ato operatório, mas não de água, e, no momento da cirurgia, pesados em balança digital de precisão.
Os ratos foram operados sob anestesia geral e receberam como medicação anestésica 20mg/kg de Quetamina IM (Francotar® – Virbac – Jurubatura, São Paulo, SP, Brasil) e 1 mg/kg de Xilazina (Sedazine® – Fort Dodge, Rio de Janeiro,RJ,
Brasil), por via intraperitoneal. Após observar ausência de reflexos à dor, os animais foram instalados na mesa operatória para colocação dos campos cirúrgicos esterili-zados, isolando-se as regiões operatórias e foi realizada a antissepsia na região dos incisivos superiores dos ratos.
Inicialmente, foi realizada a sindesmotomia dos tecidos periodontais utilizando um sindesmótomo (DUFLEX®, Juiz de Fora, BH, Brasil) e em seguida o incisivo
su-perior direito foi extraído com um fórceps adaptado para este dente (Okamoto T & Russo MC, 1973). O procedimento cirúrgico foi menos traumático possível, com o intuito de preservar as tábuas ósseas alveolares adjacentes e o dente homolateral. Após a extração, foi realizada curetagem alveolar e os alvéolos foram tratados se-gundo cada um dos 2 (dois) grupos experimentais:
➢ Grupo I (HA), os alvéolos foram preenchidos com microesferas de hidroxiapa-tita (grupo controle);
➢ Grupo II (HADOX 0,15), os alvéolos preenchidos com microesferas de hidro-xiapatita tratadas com doxiciclina 0,15%.
Após o término dos procedimentos cirúrgicos, a mucosa gengival foi suturada com fio de seda 5-0 para proteger o leito cirúrgico (Ethicon®, Johnson & Johnson, Sāo Paulo, SP, Brasil). Todos os animais foram observados diariamente a fim de fos-se avaliada e registrada qualquer complicação pós-cirúrgica. Todos os animais
rece-beram anti-inflamatório por meio de injeção intramuscular de Maxicam® (Ourofino pet, São Paulo, SP, Brasil) 1 mL/kg e mais 2 doses nos dias subsequentes. Para a recuperação anestésica, os ratos foram devolvidos aos mini-isoladores, sendo per-mitido aos animais ração e água à vontade.
Figura 1. Procedimentos cirúrgicos realizados nos ratos. (A) Visão anterior dos incisivos su-periores e tecidos circunjacentes; (B) Procedimento de luxaçāo do incisivo superior direito; (C) Incisivo superior direito extraído, fácil observação do alvéolo pós extraçāo e (D) alvéolo preenchido com biomaterial de acordo com os grupos experimentais. Fonte: Dados da pes-quisa (2019).
3.10 Obtenção dos blocos e processamento histológico
Após os períodos experimentais de 7 e 42 dias, os animais foram eutanasia-dos (n=5 por grupo/período experimental) com eutanasia-dose letal de anestésico (sobreeutanasia-dosa- (sobredosa-gem anestésica), utilizando 200 mg / kg de quetamina (Francotar® – Virbac, Juruba-tuba, São Paulo, SP, Brasil) e 20 mg /kg de xilazina (Sedazine® – Fort Dodge, Rio
A
B
de Janeiro, RJ, Brasil) em uma mesma seringa, sendo administrado por via intra-muscular. Somente após a ausência dos sinais vitais do animal foi iniciada a obten-ção das amostras.
As amostras foram dissecadas para remoção do tecido mole e fixadas duran-te 48 horas em formol 4% tamponado (tampão fosfato, pH 7,4) e submetidas a pro-cedimento histológico padrão do Laboratório de Biotecnologia Aplicada (LABA- His-tologia) da UFF. Após fixação em formol, as amostras foram lavadas por 1 h em água corrente, desmineralizadas em descalcificador de ossos e medula (Allkimia®) durante 48 hs para completa desmineralização, lavadas novamente para remoção do agente desmineralizador, desidratadas em concentrações crescentes de etanol (70, 80, 90 e 100%) por 1 h em cada concentração e diafanizadas em dois banhos de xilol, sendo 1 h cada. Finalizando com banhos de 1 h cada, em parafina I e II e incluídas em “paraplast embedding media” SIGMA 58ºC-60ºC utilizando os moldes metálicos previamente aquecidos. Cortes longitudinais do alvéolo dental com 5 µm de espessura nos blocos de parafina foram obtidos em um micrótomo e montadas em lâminas para microscópio para colorações pelos métodos da Hematoxilina e Eo-sina (HE).
3.11 Análise Microscópica Descritiva
Os cortes histológicos foram examinados em um microscópio de luz de cam-po claro binocular, utilizando um filtro 80A (para correção da temperatura de cor), equipado com objetivas plano-apocromáticas (40x, N.A. 0,65). As imagens selecio-nadas foram capturadas por uma câmera digital. Foram realizadas descrições e aná-lises histológicas dos alvéolos de cada amostra, para observação de tecido ósseo neoformado, tecido conjuntivo, infiltrado inflamatório, células gigantes de corpo es-tranho, áreas de necrose ou partículas resíduas dos biomateriais.
4 RESULTADOS
4.1 Caracterização físico-química
O padrāo de difraçāo de raios X de microsferas era típico de uma fase de hi-droxiapatita cristalina estequiometrica (HA), como mostrado na Figura 2A, todos os dados do DRX obtidos foram comparados com os padrões do arquivo 9-432 do ICDD (International Centre for Diffraction Data), empregando o software PCPDF Win 2.1. O espectro de FTIR apresentou bandas de fosfato ((PO4)-3 560, 601, 632, 962 e
1039 cm-1) e OH- (632 e 3572 cm-1) de uma estrutura de HA bem formada (Figura
2B) confirmando os resultados do DRX. A análise realizada com Microscopia Eletrô-nica de Varredura (MEV) ilustraram que as microesferas apresentam uma topografia de superfície irregular com rugosidade à escala do micrómetro (Figura 3A).
As imagens também mostraram que a porção interna da microesfera era composta de áreas densas heterogêneas com compactação na granulação da HA devido à temperatura de sinterização de 1100°C aplicada ao material (Figura 3B). O estudo da porosidade indicou que as microesferas de HA sem DOX apresentaram 26,18% (± 5,39) de poros na escala micrométrica, enquanto que as microesferas de HADOX 0,15 apresentaram 52,30% (± 2,52) (Quadro 1). A análise por microtomogra-fia de raios-X usando a linha de luz síncrotron mostrou que a porosidade interna foi de 14,29% (±3,6), com 12,3% (±3,6) de porosidade interligada; o tamanho interno médio dos poros foi de 5,3 (±0,3) µm (Figura 4), conforme é possível observar nas ilustrações apresentadas a seguir:
$
Figura 2 – Padrão DRX da microesfera de HADOX 0,15 mostrando os picos esperados de uma estrutura de hidroxiapatita estequiométrica (A) e espectros de FTIR da microesfera HADOX 0,15 mostrando bandas (PO4)-3 e OH- (B). Fonte: Dados da pesquisa (2019).
Figura 3 – Micrografias eletrônicas das amostras e estudo de porosidade. Imagens das
mi-c r o-esferas de HADOX0.15 (A e B), imagens da região central das microo-esferas de HA e DOX0.15 (C e E, respectivamente) e detalhes da porosidade das microesferas de HA e HA-DOX0.15 com maior ampliação (D e F, respectivamente). Fonte: Dados da pesquisa (2019).
Tabela 1 – Porosidade comparativa entre os materiais de acordo com o tratamento térmico e com a adsorção da doxiciclina.
POROSIDADE
Amostra
Porosidade (%) Desvio padrão
Raio (um)
HA STT
15,11
± 1,69
241,99 (242,74)
HA CTT
26,18
± 5,39
252,73 (252,73)
Fonte: Dados da pesquisa (2019).
Figura 4: Tomografia de varredura e de raios X usando radiação síncrotron de microesferas de HA. Esquerda, espaço do biomaterial e direito, espaço poroso. A porosidade interna foi de 14,29% (±3,6), com 12,3%(±3,6) de porosidade interligada; o tamanho interno médio dos poros foi de 5,3(±0,3) µm. Fonte: Dados da pesquisa (2019).
4.2 Adsorção/dessorçāo de doxiciclina e ensaios microbiológicos
A adsorção de DOX nas microesferas de HA foi determinada por espectros-copia UV-Vis. A captação de DOX foi de 9,4 ± 1,6 e 28,2 ± 4,5 µgDOX/mgHA para as amostras de microesferas HADOX 0,05 e HADOX 0,15, respectivamente, mostrando uma relação linear entre as concentrações usadas e os valores de DOX carreados pelas esferas de HA. O perfil de liberação do fármaco para as microesferas HA-DOX0,15 foi apresentado na Figura 7. Observou-se liberação inicial de 49,15 µg/mg (aproximadamente 20%) nas primeiras 24 horas, seguida de aumento contínuo da liberação do fármaco ao longo dos períodos experimentais. Cerca de 60% da DOX manteve a retenção em microesferas de HA após 9 (nove) dias.
Para confirmar a atividade antibacteriana da HADOX, foram realizados ensai-os microbiológicensai-os a fim de avaliar o potencial de inibição do crescimento bacteriano do biomaterial. Concentração inibitória mínima (MIC) para inibição do crescimento de E. faecalis foi determinado. As amostras antes (T = 0) e após os experimentos de dessorção após 1, 3 e 7 dias foram analisadas. Os dados para o teste de MIC contra
E. faecalis foi apresentada na Figura 7 e demonstrou que o crescimento bacteriano
foi inibido por até sete dias, mas apesar da MIC de HADOX ter passado de 1,25 mg/ mL (inicial) para 25 mg/mL (7 dias), cerca de 20 vezes maior, as moléculas de tetra-ciclina consistem de um núcleo tetracíclico fundido linear denominado de anéis A a D contendo uma variedade de grupos funcionais substituídos; para a molécula de do-xiciclina, a estrutura pode ser apresentada como mostrado na Figura 5.
Figura 5 – Estrutura da molécula de doxiciclina comparada com a tetraciclina, a diferença constitui na presença de um radical hidroxila na posiçāo 05 na doxiciclina.
Segundo a literatura, as bandas UV-Vis das tetraciclinas são observadas perto de 270 nm atribuídas ao grupo funcional mais ácido centrado no cromóforo do anel A e uma segunda banda a ~ 365 nm atribuída ao sistema b-hidroxiqueto do cromóforo BCD, que é responsável pelas outras bandas de absorção de comprimento de onda.
A Figura 6A e 6B apresentaram os espectros de UV-Vis da DOX em solução tampão aquosa e na forma sólida. É possível notar as principais bandas de absorção a 270 e 362 nm para o pó DOX e 275 nm e 348 nm para a solução DOX. Compara-ção das bandas de deconvoluCompara-ção de ambos os espectros indicam deslocamento de bandas para valores baixos e uma banda adicional a 411 nm em uma forma sólida, sugerindo diferentes transições eletrônicas dos anéis aromáticos para essas amos-tras. Naidong W & Lee JW (1993) estudaram o comportamento da DOX na solução e na forma sólida. As análises por NMR e UV-Vis demonstraram que a DOX apre-senta apenas enol no estado sólido e uma mistura dos tautômeros ceto-enólicos em solução aquosa. A transição ceto-enol envolve a transferência de prótons de C-12 para C-11a no cromóforo BCD, a presença de bases como citrato (pH 2-6) e fosfato (pH 3-7) íons em solução aumenta a cinética da reação. Este fato poderia explicar as diferenças nos espectros UV-Vis da DOX em solução tampão aquosa e na forma sólida encontrada neste trabalho.A seguir, observa-se a Figura 6:
Figura 6 – Espectro UV-Vis: a) Solução DOX, b) DOX em pó, c) HADOX0.05 ed) HADOX2.0. Fonte: Dados da pesquisa (2019).
O pó de HA foi suspenso em soluções contendo concentrações de DOX vari-ando de 0,05% a 2% (0,5 mg/mL a 20 mg/mL). Os espectros UV-Vis das amostras de HA carregadas com DOX 0,05% (10 µgDOX / mgHA) apresentaram bandas na região de 250 e 400 nm, que foram deconvoluídas em cinco picos de absorção cen-trados em 247 nm, 275 nm, 301 nm, 350 nm e 394 nm (Figura 6C). A distribuição dos picos de desconvolução obtidos nesta amostra parece ser mais coincidente com os espectros UV-Vis da DOX em uma forma de solução e pode estar relacionada à presença de formas tautômeras da doxiciclina coordenadas com a hidroxiapatita. As bandas de 247 nm, 275 nm, 301 nm, 350 nm e 394 nm estavam também presentes
no espectro UV-Vis de amostras de HA carregadas com DOX 2% (300 µgDOX / mgHA) como mostrado na Figura 6D. A comparação das bandas de deconvolução de ambos os espectros indica uma diminuição da banda a 275 nm, o que pode estar relacionado com uma interação do cromóforo de anel ácido A com espécies básicas de composto de HA, tal como o grupo OH. Vale a pena notar que uma banda adicio-nal a 394 nm da DOX adsorvida na superfície de HA não estava presente no espec-tro de UV-Vis da DOX em solução tampão e parece ser relativa à interação D com grupos BCD com os Ca de HA.
Figura 7 – Liberação cumulativa de fármaco de DOX (µg/mL) e valores de MIC (mg/mL). Ex-plosão inicial de liberação do fármaco nas primeiras 24 horas seguida de aumento da libera-ção do fármaco até 9 dias e aumento progressivo da concentralibera-ção de microesferas de HA-DOX para inibição do crescimento de E. faecalis. Fonte: Dados da pesquisa (2019).
4.3 Ensaio de citocompatibilidade
Após caracterização físico-química, a citotoxicidade das amostras foi realiza-da para determinar se os extratos realiza-das amostras de HA dopados com DOX em dife-rentes concentrações geraram algum efeito biológico observável nas células F-OST. Na análise estatística do ensaio de viabilidade celular (a) e proliferação celular (b) as médias e desvio padrão foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e pós-teste de Dunnett considerando-se diferenças significativas se p <0,001. Os resulta-dos da viabilidade celular através do reagente de Prestoblue não indicaram diferen-ças na atividade metabólica das amostras HADOX 0,05 e HADOX 0,15 em relação ao HA.
O ensaio CVDE, que analisa a proliferação celular, também indicou que as amostras não apresentaram diferenças estatísticas na proliferação celular quando comparadas ao HA. Conclui-se que as amostras analisadas são citocompatíveis e que os extratos dos materiais analisados neste estudo não apresentaram efeito tóxi-co pelo método empregado. Como esperado, o tóxi-controle positivo apresentou baixa viabilidade celular para os dois reagentes, confirmando a toxicidade inerente ao ma-terial e o desempenho do método (Figura 8), conforme observado a seguir:
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Figura 8 – Ensaio de viabilidade celular utilizando o Prestoblue (a) e a proliferação celular utilizando o CVDE (b). Para análise estatística, o pós-teste de Dunnett foi utilizado como re-presentativo de duas experiências independentes realizadas em seis duplicados. As amos-tras foram normalizadas em porcentagem e comparadas ao HA. O asterisco indica que o grupo SDS apresentou uma absorvância significativamente menor do que todos os outros grupos (p <0,001, ANOVA). Fonte: Dados da pesquisa (2019).
5 DISCUSSÃO
5.1 Avaliação histológica após 7 dias ➢ HA (controle)
Após sete dias, observou-se presença de microesferas de biomaterial cirdun-dados com tecido conjuntivo contendo infiltrado inflamatório agudo, principal-mente neutrofílico (Figura 9 A e B).
➢ DOXIHA 0.15 %
Presença de tecido conjuntivo fibrocelular sediando infiltrado inflamatório mo-derado, predominantemente mononuclear entre as esferas do biomaterial. Foi possí-vel observar a presença de pavimentação osteoblástica permeando as esferas (Fi-gura 9 C e D, setas).
Figu-ra 9 – Fotomicrografias dos 2 grupos após 7 dias de implantação alveolar (A,B) Grupo Controle e (C,D) Grupo teste . Biomaterial (BM); infiltrado neutrofílico (N); osso neoformado (NFB),
se-tas- Pavimentaçāo osteoblástica. A e C. Ampliação de 20X (Bar: 100µm); B e D: Ampliação de 40X (Bar: 50 µm). Coloraçao: Hematoxilina e Eosina.
5.2- Avaliação histológica após 42 dias ➢ HA
Observou-se a presença de biomaterial como esferas, circundadas por tecido conjuntivo fibrocelular, exibindo no grupo algumas células gigantes e osso neofor-mado circundando por biomaterial (Figura 10 A e B).
➢ HADOX 0.15 %
Presença de tecido conjuntivo fibroso densamente colagenizado circundando o biomaterial, além de células gigantes multinucleadas e ocasionais células mono-nucleadas. Observar presença de neoformação óssea entre as esferas. O biomate-rial manteve-se em formato de esfera sem biodegradação aparente circundada por biomaterial (Figura 10 C e D).
Figura 10 – Fotomicrografias dos 2 grupos após 42 dias de implantação alveolar. (A,B) Gru-po Controle e (C,D) GruGru-po teste. Biomaterial (BM); osso neoformado (NFB). A e C Amplia-ção de 20X (Bar: 100µm); B e D: AmpliaAmplia-ção de 40X (Bar: 50 µm). ColoraAmplia-ção: Hematoxilina e Eosina. Fonte: Dados da pesquisa (2019).
5.3 Avaliação histomorfométrica
A análise histomorfométrica é resumida na Figura 11, houve uma diminuição na densidade de volume do tecido conjuntivo para o grupo HA de 1 (uma) semana até o final do experimento (P <0,05). O mesmo ocorreu entre o grupo HA de 1 (uma) semana e Doxi 1,0 no grupo de 6 (seis) semanas. De maneira oposta, a densidade de volume do osso novo aumentou apenas comparando o grupo de HA de 1 (uma) semana com o período de 6 (seis) semanas para os grupos HA e Doxi 1.0 (P <0.05). A densidade de volume do osso e biomaterial antigos não se alterou significativa-mente durante os períodos experimentais e grupos experimentais (P> 0,05).
!
Figura 11 – A avaliação histomorfométrica comparativa da HA controle e da HA DOX 0,15% apresentou uma diferença significativa entre os grupos quanto à neoformação óssea após 6 semanas. Fonte: Dados da pesquisa (2019).
5.4 Discussão dos dados
A composiçāo química da hidroxiapatita, constituída por um radical catiônico, um ânion e uma hidroxila, permite a sua ligaçāo com quase todos os elementos químicos da tabela periódica (Narasaraju TSB & Phebe DE, 1996), bem como a fár-macos, a exemplo da chorexidina (Soriano-Souza CA et al., 2009), da tetraciclina (Yan J et al., 2016), da aminofilina (Martin V et al., 2019) e da doxiciclina (Chang, C-Y & C-Yamada S, 2000 e Almazin SM et al., 2009), sendo que este último apresenta
uma alta afinidade ao referido composto.
Observa-se, assim, que mudanças nas propriedades, tecnologias de pro-duçāo e interaçāo do material aos tecidos podem resultar numa otimizaçāo do repa-ro ósseo, destacando-se ainda que as micrepa-roesferas de hidrepa-roxiapatita através de sua composiçāo química, superfície nano/microestruturada e a presença de microporos (arquitetura 3D) sāo considerados parâmetros importantes que podem determinar a capacidade de entrega de moléculas terapêuticas lentamente (El-Fiqi A et al., 2017). Neste estudo ficou comprovado, através da avaliaçāo quanto à porosidade, que houve um aumento significativo para as HADOX 0,15 com relaçāo as HA sem doxiciclinas, 52,30% (+/-2,52) e 15,11% (+/- 1,69) respectivamente. O aumento da solubilidade de alguns fármacos hidrofóbicos está diretamente relacionado com a área de superfície das nanoparticulas, como também a presença de microporos é uma caracteristica fundamental para a biodegraçāo dos biomateriais. (Granjeiro JM, 2011).
Dentre as vantagens citadas por Gu W et al. (2013), para o uso de nanopar-tículas como veículo de sistema de entrega para o tratamento de doenças ósseas, estāo a proteçāo do medicamento por evitar sua dispersāo ou degradaçāo pelos fluidos corporais e por aumentar o tempo de circulaçāo ou tempo de retençāo no corpo. Desta forma, utiliza-se o medicamento no local, mantendo-o concentrado.
Um importante fator quando se pensa na associaçāo de fármacos à HA é a concentraçāo, visto que, nos estudos in vitro de Almazin SM et al. (2009), foi obser-vado que a uma concentraçāo de 0,5 mg/ml de clorexidina e em menor concentra-ção a minociclina, ambos tiveram efeito citotóxico sobre a proliferaçāo de osteoblas-tos. Por outro lado, a doxiciclina apresentou melhora na maturaçāo e diferenciaçāo dos osteoblastos por aumento da atividade da enzima fosfatase alcalina. O autor atribui à doxicilina as propriedade de ser anti-inflamatório, inibidor de osteoclastos, estimulador de fibroblastos, anticolagenolítico e claro antimicrobiano.
Os resultados quanto à viabilidade celular e proliferaçāo celular, neste estu-do, nāo indicaram diferença na atividade metabólica entre o grupo controle e o teste, o que permite concluir que as amostras sāo citocompatíveis, nāo apresentando as-sim efeito tóxico, nestas concentrações utilizadas. Em outra análise, desta vez em estudos in vivo, Soriano-Souza CA et al. (2015) avaliaram a osteocundutividade de microesferas de HA carreadas com clorexedina e observou que a propriedade oste-ocondutiva da HA associadas a um agente antimicrobiano, pode ser eficaz no
trata-mento de infecções ósseas, contudo, a concentraçāo do agente deve ser controlada, visto que observou diferença estatisticamente significante quando comparado a con-centraçāo de 0,12% e 2%, este último apresentou um retardo no processo de reparo ósseo. O tratamento combinado de nHA-DOX foi realizado por Ramírez-Agudelo et al. (2018) onde mostrou que a citotoxicidade esta diretamente dependente da con-centraçāo e a baixa concon-centraçāo de DOX (5 µg/ml) exibiu maior efeito inibitório so-bre a células cancerígenas quando comparadas com 30 µg/mL.
A HA como um veículo carreador de fármacos é limitada e necessita de modi-ficações na sua superfície, pois, em moléculas pequenas e hidrossolúveis, como a Doxiciclina, observa-se uma liberaçāo muito rápida deste fármaco quando absorvi-das neste fosfato (Wang S et al., 2010). O estudo de El-Fiqi A et al. (2017) também observaram uma queda dos agregados de nanoparticulas circundantes, que foram substancialmente reduzidos a partir do terceiro e sétimo dia. Isso pode ser explicado pelo fato da hidroxiapatita como transportador de fármacos apresentar uma libe-raçāo brusca inicial, o que pode limitar sua aplicaçāo, segundo Boonsongrit Y et al. (2008).
Contudo, o tempo de retençāo no organismo parece ser uma observaçāo inte-ressante, visto que quase sessenta por cento do fármaco permanecia adsorvido ao biomaterial após o nono dia de experimento. Faz-se importante salientar que há uma maior liberaçāo de doxi ao meio nas primeiras 4 (quatro) horas, quando comparada com a tetraciclina, o contrário ocorrendo das 8 (oito) às 48 horas pós implantaçāo onde a tetraciclina mostrou-se mais rápida que a doxi, entretanto, ambos os famácos mantiveram a açāo antimicrobiana durante o período estudado – o que corrobora com as evidências extraídas do presente estudo, no qualhá um aumento no meio da doxi, nas primeiras 24 horas, representando 20% do material dessorvido, e o cres-cimento bacteriano foi inibido por até 7 (sete) dias. Esses resultados demonstram que a HA é uma biocerâmica que pode ser utilizada como veículo de liberação de farmácos bem como esta associaçāo pode aumentar a eficiência do biomaterial em sitios contaminados ou inflamados.
A manutenção desse valor da DOX pode ser justificada pela alta afinidade química entre as famílias de antibióticos de tetraciclina amplamente descritos na lite-ratura (Perrin DD, 1965). Considerando a litelite-ratura, Perrin DD (1965) propôs outra configuração para o complexo HA-Tetraciclina, o autor estudou a ligação das tetraci-clinas ao osso e sugeriu um modelo de ancoragem da tetraciclina na hidroxiapatita,
no qual a molécula de tetraciclina apresentaria uma posição perpendicular relacio-nada ao plano ab do cristal de HA e os íons Ca da HA seriam coordenados com átomos de oxigênio da molécula de tetraciclina nas posições C2, C10 e C12. Mas Schmitt & Schneider (2000) demonstraram diferenças na complexação de moléculas distintas de tetraciclina com íons Ca e Mg. UV-Vis e espectros de fluorescência de tetraciclina e oxitetraciclina em solução contendo íons Ca2 + ou Mg2+ indicaram dois equilíbrios complexacionais sucessivos, nos quais a primeira complexação ocorreu entre o íon metálico com o cromóforo BCD da tetraciclina e uma segunda complexação entre o íon metálico e o cromóforo A. Mas, para a molécula DOX, o re-sultado foi diferente com as complexações de íons metálicos ocorridas com o cromó-foro BCD.
Este fato corrobora com o resultado encontrado neste trabalho e pode expli-car as alterações na banda relacionadas ao cromóforo A em 270 nm, com a comple-xação pelo grupo OH- da hidroxiapatita ao invés do Ca2+. Levando em considera-ção que após 7 (sete) dias a dose de DOX restante seria de 60% do inicial, um sis-tema dinâmico como os locais infecciosos-inflamatórios in vivo, a dose poderia ser disponibilizada pela solubilidade do biomaterial HADOX e poderia manter atividade antimicrobiana a níveis terapêuticos. Este resultado sugere que o ajuste da concen-tração inicial pode aumentar a eficiência do biomaterial.
À luz do que foi exposto e frente aos resultados encontrados no presente es-tudo, é pertinente salientar que a porosidade, comportamento das moléculas da dro-ga, altas áreas de superfície e alto volume dos poros da HA conferem a esta matriz cerâmica nanoestruturada excelentes perspectivas como veículo de retençāo de fármacos e liberaçāo por um tempo maior no meio (Mondal S et al., 2017), o que pode levar a uma otimizaçāo do desempenho desta biocerâmica em sítios infectados e/ou inflamados. Novas concentrações e diferentes fármacos parecem ser viáveis e bastante promissores quando for tratar defeitos ósseos oriundos de tumores ou mesmo infectados.
6 CONCLUSÃO
Os materiais testados mostraram-se seguros (citocompatíveis, biocompatíveis e osteocondutores) após os períodos experimentais de 7 (sete) e 42 dias em alvéo-los dentários de ratos. A HADOX 0,15 apresentou uma inibição do crescimento bac-teriano por até sete dias e apresentou mais osso neoformado (p <0,05) após 42 dias de implantação, podendo ser um biomaterial promissor para favorecer o reparo ós-seo em sítios infectados.
Estudos futuros
Diante dos resultados obtidos nesse estudo in vitro e in vivo, estudos clínicos randomizados e controlados em sítios infectados serão realizados com o intuito de comprovar a eficácia da HADOX.
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ABREVIATURAS
(NH4)2HPO4- Diamoniohidrogênio fosfato
Ca(NO3)2- Nitrato de cálcio
CaCl2 - Cloreto de Cálcio
CEUA/UFF - Comissāo de Ética de Uso Animal da Universidade Federal Flumi-nense
CO2 - Gás Carbônico
CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentaçāo Animal
DBCA - Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilizaçāo de Animais para fins Científicos e Didáticos
DDS -Drug Delivery Sistem
DMEM - Meio Essencial Modificado de Dulbecco DOX - Doxiciclina
DRX - Difraçāo de Raio-x
FTIR - Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier HA - Hidroxiapatita
HADOX- Hidroxiapatita com doxiciclina HE - Hematoxilina e Eosina
KBr - Brometo de Potássio
MIC - Concentraçāo mínima inibitória mL - Mililitro
nm - Nanômetro
PBS- Soluçāo Salina Tamponada com Fosfato RPM- Rotaçāo por Minuto
SDS - Dodecil Sulfato de Cálcio µTC - Microtomografia
