ANÁLISE HISTOLOGICA DE TUMORES MAMARIOS SUBMETIDOS À TERAPIA FOTODINÂMICA

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XX Encontro Latino Americano de Iniciação Científica, XVI Encontro Latino Americano de Pós-Graduação e VI

Encontro de Iniciação à Docência – Universidade do Vale do Paraíba. 1

ANÁLISE HISTOLOGICA DE TUMORES MAMARIOS SUBMETIDOS À TERAPIA

FOTODINÂMICA

Almeida RMS

1

_{, Fontana LC}

1

_{, Pereira AHC}

1

_{, Freitas MAA}

1

_{, Nascimento ACDR}

1

_,

Ferreira I

2

_{, Strixino-Ferreira J}

1

1_{Universidade do Vale do Paraíba – UNIVAP, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) – Av.}

Shishima Hifumi, 2911 – São José dos Campos, SP, 12244-000. Email: raimsanches@hotmail.com

2_{Universidade Paulista – UNIP,}_{Rod. Presidente Dutra, km 157,5 - Rio Comprido, São José dos}

Campos - SP, 12240-420

Resumo - A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica empregada no tratamento de diversas neoplasias malignas. Ela consiste na ação combinada de um composto fotossensível (FS), luz em comprimento de onda adequado a esse composto e oxigênio molecular, gerando espécies reativas de oxigênio que levam as células tumorais a morte por necrose ou apoptose. O presente estudo teve como objetivo a análise histológica de tumores mamários, induzidos quimicamente, após a realização da terapia fotodinâmica. Foram utilizadas 15 ratas da linhagem Sprague-Dawley, divididas em dois grupos, grupo controle (GC - tumor mamário não tratado) e grupo submetido à terapia fotodinâmica (G1 – tumor mamário retirado após 24h da realização da TFD). Na análise histológica observaram-se diversas características gerais de malignidade no grupo controle e no grupo tratado com TFD. No entanto, o grupo tratado com TFD apresentou uma alta resposta inflamatória e presença de necrose mostrando a eficácia desse tratamento no combate ao câncer de mama.

Palavras-chave:Terapia fotodinâmica, câncer de mama, histologia. Área do Conhecimento: Biomedicina

Introdução

O câncer de mama é uma das neoplasias malignas mais comuns entre as mulheres. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), aproximadamente 104 mil mulheres morrem de câncer no Brasil, sendo o mais prevalente o câncer de mama (16,8%) (INCA, 2014). Assim como em outros tipos de câncer, sua disseminação para tecidos vizinhos e até mesmo em tecidos ou órgãos distantes como, por exemplo, fígado e pulmão são comuns. Dessa forma, há a necessidade de tratamento logo nos primeiros estágios

(

COUTO et al., 2015).

Normalmente é diagnosticado na pré-menopausa e na pós-menopausa, sendo a quimioterapia o tratamento convencional, seguida de terapia hormonal, radioterapia e retirada total ou parcial da mama, ou a combinação desses (BARROS et al., 2016). No entanto os tratamentos convencionais possuem diversos efeitos secundários indesejáveis, como náuseas, fadiga, disfunção ovariana e perda dos pelos (incluindo cabelo e sobrancelhas), pelo uso da quimioterapia. A cirurgia de retirada total ou parcial da mama, apesar de eficaz, trás consigo efeitos psicológicos que interferem, principalmente, na autoestima feminina (SANTOS; VIEIRA, 2011).

Dentre os tratamentos alternativos em estudo, destaca-se a Terapia Fotodinâmica (TFD), uma técnica menos agressiva que pode substituir ou ser coadjuvante aos tratamentos convencionais. A técnica consiste na ação de um fotossensibilizador (FS) que combinado à luz em comprimento de onda adequado ao espectro de absorção do FS, reage com oxigênio molecular presente no tecido formando espécies reativas de oxigênio, desencadeando a morte das células tumorais por necrose ou apoptose (LONGO et al

.,

2012)

.

Diferentemente das terapias convencionais a TFD é um procedimento não cirúrgico, não invasivo e seletivo, o que diminui os efeitos colaterais pós-tratamento (LONGO, 2008).

A TFD é uma técnica promissora para o tratamento de várias doenças, seu sucesso pode ser observado em diversas patologias como em neoplasias malignas internas e dermatológicas, além de seu uso na área odontológica. (WEN et al., 2011; LANG et al., 2014).

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No câncer de mama, o desenvolvimento de sondas ou equipamentos laser tem possibilitado o uso da TFD como tratamento (WANG et al., 2011). Outro fator importante para o sucesso da terapia é o fotossensibilizador utilizado. Um FS ideal deve apresentar características como, ser minimamente tóxico ao organismo e ser captado mais rapidamente pelo tecido alvo do que pelo tecido saudável (ISSA; MANELA-AZULAY, 2010). Tendo em vista a necessidade da analise histológica tumoral para a avaliação da TFD, este trabalho teve como objetivo a análise histológica de tumores mamários malignos quando submetido à terapia fotodinâmica, analisando-se as diferenças celulares por microscopia ótica convencional.

Metodologia

Aspectos legais de bioética e biossegurança

Este projeto foi vinculado ao projeto “Estudo dos Mecanismos Celulares Envolvidos na Terapia Fotodinâmica” coordenado pela Profa. Dra. Juliana Ferreira Strixino e financiado pela FAPESP: 2010/00488-5, sendo o mesmo aprovado pelo comitê de ética da Universidade do Vale do Paraíba, sob o protocolo no 09/CEAU/2010 segundo as diretrizes e normas regulamentadoras de pesquisa envolvendo animais, conforme Lei nº 11.794/2008, que regulamenta o inciso VII do § 1o do art. 225 da Constituição Federal.

Casuística

Foram utilizadas 15 ratas fêmeas, da linhagem Sprague-Dawley, pesando entre 230 e 380g, com 40 dias de vida, virgens, divididas em dois grupos: 07 animais GC (Grupo controle – Tumor mamário não tratado) e 08 animais G1 (grupo 24h após terapia). Todos os animais foram provenientes do Centro Multidisciplinar de Investigação Biológica, UNICAMP. Os animais foram acondicionados no alojamento do Laboratório de Terapia Fotodinâmica, no Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D), UNIVAP, em caixas de policarbonato especiais para estes animais, sendo acondicionados de dois a quatro animais por caixa. As condições ambientais foram de temperatura constante à 22ºC, com iluminação natural. As ratas foram alimentadas com ração específica e água ad libitum.

Indução Química

O tumor mamário foi induzido quimicamente pelo carcinógeno 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA) na dosagem de 80 mg/Kg dissolvido em óleo de soja, e administrado por gavagem. Os animais foram submetidos à inspeção de viabilidade diária e ao exame clínico realizado semanalmente (palpação) até observação do desenvolvimento do tumor.

Fotossensibilizador

Foi utilizado o fotossensibilizador Photodithazine® (PDZ), uma clorina, de origem russa, extraída a partir da cianobactéria Spirulina platensis.

Fonte de Luz

Para aplicação da terapia fotodinâmica a fonte de luz utilizada foi um laser de diodo (Habilita – QuantumTech®_{- Brasil) no comprimento de onda de 670 nm para excitação do PDZ, no qual foi}

acoplado uma fibra óptica difusora para irradiação intersticial. Método

Os animais foram pesados e anestesiados por injeção intramuscular contendo solução estéril de cloridato de Cetamina a 10% (Syntec®_{) na dose de 0,08 mg/Kg de peso corporal associado ao}

relaxante muscular analgésico e sedativo de Xilazina 2% (Syntec®_{) na dose de 0,04 mg/Kg.}

Os animais foram fotossensibilizados por via intraperitoneal na dose de 8 mg/Kg (PDZ), permanecendo no escuro por 1h após a fotossensibilização. A irradiação do tumor foi intersticial por meio de uma fibra óptica difusora acoplada ao laser, utilizando como parâmetros de irradiação 100 mW/cm de intensidade e dose de luz de 100 J/cm.

Os animais do grupo G1 foram eutanasiados após 24h da realização da terapia e os animais do grupo GC foram eutanasiados após aproximadamente 2 semanas do surgimento tumoral.

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Os tumores foram coletados e fixados com solução de formol 10%. As lâminas foram preparadas e coradas, pela técnica de HE, na Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus Botucatu.

A leitura das lâminas foi realizada em microscópio óptico (Leica DM2500), com as fotos feitas por meio de uma câmera acoplada ao microscópio (câmera Leica DFC425), utilizando-se o software Leica Aplication Suite (LAS V3.7.0), para a visualização das mesmas. Foram utilizados 5 aumentos, 5x, para verificação da celularidade da amostra, e distribuição celular, seguindo-se para os aumentos de 10x, 20x, 40x e 100x para o detalhamento das características celulares e verificação das características de malignidade.

Resultados

A análise histológica realizada permitiu classificar os tumores desenvolvidos em carcinoma papilífero, carcinoma ductal, carcinoma ductal-papilífero e carcinoma tubular, sendo esse último o mais incidente entre os animais (cerca de 57% dos tumores analisados) e podendo ser considerado o carcinoma mamário invasivo mais bem diferenciado, caracterizado por túbulos ou alvéolos bem formados. Em todas as amostras, foram observadas diversas caracteristicas de malignidade, tais como: núcleolos evidentes, anisocitose, anisocariose (Figura 1A), mitoses atipicas, presença de secreção e infiltado neutrofílico (Figura 1B), aumento da irrigação tecidual (Figura 1C) e perda de estrutura túbulo-alveolar, caracteristicos do tecido mamário (Figura 1D).

Figura 1. Lâminas histológicas de tumor mamário não tratado. A) Aumento 40x, (a) nucléolos evidentes, (b) anisocitose; B) Aumento 40x, (c) secreção, (d) figura de mitose, (e) infiltrado neutrofílico; C) Aumento 40x, vaso sanguíneo; D) Aumento 10x, panorama geral.

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Os grupos tratados com TFD apresentaram diferenças do grupo controle. Em G1, foi possível observar (Figura 2C) grande destruição tecidual, infiltrado inflamatório com número moderado de células polimorfonucleares e aparente destruição tecidual, dificultando visualizar sua estrutura. Pode-se obPode-servar também área de hemorragia e prePode-sença de hemossiderina, resultante da destruição da hemoglobina (Figura 2D), além de maior quantidade de macrófagos (Figura 2A) quando comparado ao grupo GC.

Figura 2. Lâminas histológicas de tumor mamário pós-tratamento com TFD. A) Aumento de 20x. (Células apresentando evidências de malignidade (nucléolos evidentes, anisocitose, hipercromatose), grande quantidade de secreção e infiltrado sanguíneo e presença de macrófagos (setas) B) Aumento de 100x presença de necrose de coagulação. C) Aparente destruição tecidual comparado ao GC. D) Presença de hemossiderina (setas).

Discussão

O carcinoma mais frequente encontrado nas analises histologicas é o carcinoma tubular. Segundo Faustino (2014) os tumores mamários podem ser quimicamente induzidos em animais por dois agentes carcinogénicos: N-metil-N-nitrosureia (MNU) e 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA). O agente carcinogênico DMBA, utilizado nesse projeto, desenvolve tumores sem a capacidade de metástase para locais distantes, além de uma proporção maior de tumores benignos desenvolvidos. No entanto, nas análises histológicas realizadas apresentaram uma proporção maior de tumores malignos.

O grupo controle, representado pela Figura 1 mostra diversas características clássicas de malignidade presentes em tecidos tumorais, tais como nucléolos evidentes, anisocitose, surgimento de novos vasos, figuras de mitose e presença de secreção. Na Figura 1A pode-se observar a presença de nucléolos evidentes e anisocitose, variações morfológicas importantes para classificar as lesões tumorais em malignas ou não. Na Figura 1B, representado pela seta, pode-se observar o surgimento de novos vasos. O aporte de oxigênio e nutrientes ao tumor se dá pela vascularização, sendo a angiogênese, uma das características de tecidos malignos. O prognóstico de indivíduos com

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câncer de mama está associado ao aumento do número de vasos, sendo esse cerca de cinco vezes maior em tecidos tumorais malignos e duas vezes em benignos. (FAUSTINO, 2014; KUMAR et al., 2013).

Na Figura 1D é observado presença de secreção e mitose atípica representadas pelas setas, características que desempenham um importante papel na progressão de neoplasias malignas. Segundo Cassali et al, (2014) o índice mitótico e a presença de infiltrado linfoplasmocitário de moderado a intenso, são características de tecidos malignos.

Na análise histológica foi possível observar a presença acentuada de hemossiderina no grupo tratado com TFD. Esta substância pode se originar a partir da lise de hemácias (CORTEZ et al., 2009), o que tem relação com a indução da inflamação observada.

A perda da arquitetura geral do tecido tumoral, apresentando alterações no tamanho dos núcleos e indução do aumento do processo inflamatório sugere caracteristicas clássicas do efeito fotodinâmico. Segundo Flores et al, (2011) a destruição do tumor se da tanto por dano celular direto como vascular, junto com um importante papel do processo inflamatório e do sistema imune. A terapia fotodinâmica induz dano intenso ao tecido a partir do envolvimento de dois componentes, luz e oxigênio, que juntos induzem lesões no tecido canceroso, produzindo agentes citotoxicos que levam as células malignas a morte por necrose ou apoptose. A retenção seletiva do fotossensibilizador pelas células cancerígenas faz com que apenas células malignas sejam afetadas pelo processo fotodinâmico (ISSA; MANELA-AZULAY, 2010).

No grupo tratado com TFD ocorre o aparecimento de células do sistema imunofagocitário, um dado que não pode ser observado de forma acentuada no GC. Na Figura 2 a análise histológica permitiu observar a presença de macrófagos. Segundo Yamamoto et al, (1992) a terapia fotodinâmica pode causar alterações nas membranas citoplasmáticas e de organelas e induzir uma rápida ativação de fosfolipases de membrana levando a uma acelerada degradação de fosfolipidios e uma maciça liberação de mediadores inflamatórios. A sinalização inflamatória após a TFD desencadeia uma invasão regulada de neutrofilos, mastócitos e monócitos/macrófagos, estimulando o sistema imune, principalmente os leucócitos, a reconhecer e destruir células malignas localizadas no local da inflamação ou em outros locais adjacentes.

Após o tratamento com TFD, estudos comprovam respostas nos tecidos malignos como a vasoconstrição, seguido por respostas como hemorragia e formação de agregados plaquetários o que explica a presença de um quadro inflamatório mais intenso em G1 do que no grupo GC (AGOSTINIS et al., 2011).

Conclusão

Após a TFD foi possivel observar diferenças entre o GC e G1, como aparente destruição tecidual e uma grande resposta celular, principalmente resposta inflamatória. Em G1 pode-se observar dano direto as células cancerígenas, indução de colapso a microvascularização e ativação de uma resposta imune na área tratada, características que sugerem a eficácia da TFD no tratamento contra o câncer de mama e a importância da análise histológica na avaliação desses efeitos sobre o tecido maligno. Assim, torna imperativo que profissionais da área da medicina, farmácia, biomedicina, fisíca, entre outros, continuem o desenvolvimento e pesquisas na área da TFD.

Referências

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