RODOLFOXAVIERDESOUSA-LIMA
PROPRIEDADES FÍSICAS E BIOLÓGICAS DE SISTEMAS ADESIVOS AUTOCONDICIONANTES EXPERIMENTAIS
NATAL/RN 2018
www.posgraduacao.ufrn.br/ppgscol ppgscol@dod.ufrn.br 55-84-3342-2338 CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROPRIEDADES FÍSICAS E BIOLÓGICAS DE SISTEMAS ADESIVOS AUTOCONDICIONANTES EXPERIMENTAIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva, Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Saúde Coletiva. Orientador: Prof. Dr. Boniek Castillo Dutra Borges
NATAL/RN 2018
Aos meu pais; Maria Adelaíde Xavier de Sousa Lima e José de Fátima Lima, por me concederem o privilégio de sonhar.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradecer a energia mentora do universo pelas bençãos, força e inspiração que inquestionavelmente está presente em cada detalhe dos meus dias.
Aos meus pais, José de Fátima e Maria Adelaíde, e irmã Virgínia Maria, pelo suporte, lições grandiosas sobre honestidade, generosidade e amor que vocês me dão sempre. Sem vocês, seria impossível realizar este sonho. A minha tia/irmã Andréia e minha “sobrinha” Maria Cecília pela afetuosidade de cada encontro, onde há sempre bons abraços, beijos e um tantão de afeto que deixam o coração do “tio” cheio de amor e vontade de seguir em frente. A minha madrinha Silvia pelo carinho e diligência comigo.
Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Boniek Castillo Dutra Borges pela sensibilidade de perceber potencial em mim, por ter sempre respostas pertinentes, pela incrível disponibilidade durante todos esses anos de trabalho em conjunto e por me estimular a ser melhor enquanto pessoa e pesquisador.
Aos queridos Bruna, Eva, Erick, Jean, Rafaella, Rômulo e Ruan, que estiveram próximo a mim desde o momento em que o mestrado era só sonho até hoje. O vínculo que guardamos é de uma preciosidade imensurável para mim. Obrigado pelo combustível de humanidade que me inspiram. Aos ilustres: Victor, Kezia, Carla e Aliane pelas doses de afeto gratuitas que me enchem o coração. A querida Raíza, com quem compartilhei o mesmo teto, angústias, felicidades, (des)amores e bons cafés durante os últimos anos em Natal, obrigado! Dividir tudo isso com você me salvou da vida, quando ela parecia pesada demais.
A Paloma, João, Tibério, Carlos e Raquel pelos momentos divertidos e inesquecíveis. Aos amigos que a vida acadêmica me trouxe e que hoje guardam lugar especial na minha vida: Ana Margarida, Débora, Lílian, Maria Eduarda, Claudiana e, em especial, Letícia com quem compartilhei dúvidas, conquistas, anseios e muito trabalho durante os últimos três anos. Obrigado por estarem na minha vida.
Aos professores Dr. Cícero Aragão e Dr. Carlos Augusto pela parceria, disponibilidade e resolutividade durante esta pesquisa. A Dayanne e Vladimir, pessoas fundamentais para a realização de dois dos testes deste trabalho. A Diego, que muito me ajudou em etapas fundamentais. A Isabel, Guilherme e todos que nos ajudaram no recolhimento dos dentes para esta pesquisa. Ao professor Hugo, que abriu as portas do laboratório para a realização dos experimentos. Ao professor Dr. Rafael Ratto e a Ana Carla pelo embasamento inicial para esta pesquisa.
para que essa pesquisa pudesse ser realizada. A funcionária Nilma, do Departamento de Farmácia, pela simpatia e hospitalidade com que eu sempre era recebido.
Ao programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva – UFRN com área de concentração em odontologia da UFRN e ao coordenador do programa, Prof. Dr. Angelo Giuseppe Roncalli Da Costa Oliveira, meu respeito e admiração. A Universidade Federal do Rio Grande do Norte, de forma geral, pela oportunidade incrível de ter contato com o conhecimento em sua forma mais inspiradora. A CAPES pelo financiamento desta pesquisa.
“O sonho encheu a noite Extravasou pro meu dia Encheu minha vida E é dele que vou viver Porque sonho não morre”
Objetivo: avaliar a Liberação de Monômeros Residuais (LMR), resistência Flexural (RF), módulo de elasticidade (ME) e citotoxicidade de adesivos experimentais (AE) formulados à base de GDMA-P. Metodologia: os AE foram divididos em 9 grupos, de acordo com os seguintes parâmetros: a) % monomérica em massa de GDMA-P/ HEMA/ UDMA (10/30/30; 20/30/20 e 30/30/10); mol % de fotoiniciadores CQ/BAPO/EDMAB/DH (1,0/0,0/1,0/0,2; 0,0/1,0/0,0/0,2; 0,5/0,5/1,0/0,2). Para citotoxicidade, foram utilizadas células NIH-3T3 e os testes MTT Assay e Alamar Blue (n=8). Para RF e ME, seguiu-se o método descrito na ISO 4049 (n=7). Para aferir LMR, foram usados 54 terceiros molares para obtenção de uma área plana de dentina (n=6), as quais receberam os sistemas adesivos e, após 24h, a LMR foi lida em aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência. A análise estatística foi feita com ANOVA a dois fatores e pós teste de Tukey (p<0,05). Resultados: para o % de redução do Alamar Blue, não houve diferença entre as concentrações testadas. Entre os fotoiniciadores, CQ e BAPO, isoladamente, apresentaram melhores valores para 30% e CQ+BAPO para a concentração 20%. Para % de citotoxicidade através do MTT Assay, não houve diferença entre fotoiniciadores e % de GDMA-P. Para LMR, entre os mesmos fotoiniciadores e diferentes concentrações de GDMA-P, a concentração 10% liberou mais HEMA. Para as diferentes concentrações de GDMA-P e mesmos fotoiniciadores, os grupos contendo CQ liberaram mais HEMA. Para UDMA, entre os grupos de fotoiniciadores, apenas CQ apresentou diferenças, sendo a porcentagem de 10% de GDMA-P a que mais liberou monômeros UDMA. Para as três concentrações de GDMA-P, CQ liberou mais monômeros UDMA. Para a liberação de GDMA-P, entre os mesmos fotoiniciadores, a concentração de 10% proporcionou maior liberação de monômeros para os grupos que contém CQ. Entre as mesmas concentrações e diferentes fotoiniciadores, CQ proporcionou maior liberação de GDMA-P para 10% e 30%. Para a concentração 20%, BAPO permitiu a maior liberação. Para RF, 10% de GDMA-P apresentou diferenças entre os fotoiniciadores, sendo o grupo BAPO a maior RF. A mistura BAPO+CQ permitiu maior valor de RF para as concentrações 20% e 30%. Para ME, 30% GDMA-P foi o único a apresentar diferença significativa, sendo o grupo BAPO+CQ o maior valor. Conclusões: de forma geral, CQ liberou mais monômeros, de forma que a concentração de 10% de GDMA-P em associação com o grupo de fotoiniciador BAPO foi capaz de proporcionar melhores resultados para as propriedades testadas.
ABSTRACT
Objective: to evaluate the Clearence of Residual Monomers (CRM), flexural strength (FS), elastic modulus (EM) and cytotoxicity of experimental adhesives (EA) formulated based of GDMA-P. Methodology: the EA were divided into 9 groups, according to the following parameters: % of monomeric mass of GDMA-P GDMA-P/ HEMA/ UDMA (10/30/30; 20/30/20 e 30/30/10); mol % of photoinitiators CQ/BAPO/EDMAB/DH (1,0/0,0/1,0/0,2; 0,0/1,0/0,0/0,2; 0,5/0,5/1,0/0,2). For cytotoxicity, NIH-3T3 cells and MTT Assay and Alamar Blue tests were used (n=8). To measure RRM, 54 third molars were used to obtain a flat area of dentin (n=6) that received the adhesives and, after 24 h, the CRM was in HPLC. For FS and EM, followed by the method described in ISO 4049 (n = 7). Statistical analysis was performed with two-way ANOVA and post Tukey test (p <0.05). Results: for the % of reduction of Alamar Blue, between 10%, 20% and 30% there was no difference. Among the photoinitiators, CQ and BAPO, singly, presented better values for 30% and CQ + BAPO for the concentration 20%. For% cell viability through MTT Assay, there was no difference between photoinitiators and % GDMA-P. For CRM, for the same photoinitiators and different concentrations of GDMA-P, 10% of GDMA-P released more HEMA. For the different concentrations of GDMA-P and the same photoinitiators, the groups containing CQ released more HEMA. For UDMA, among the groups of photoinitiators, only CQ presented differences, being the percentage of 10% of GDMA-P that most released UDMA monomers. For the three concentrations of GDMA-P, CQ released more UDMA monomers. For the release of GDMA-P, among the same photoinitiators, the 10% concentration gave greater release of monomers to the groups containing CQ. Among the same concentrations and different photoinitiators, CQ provided greater release of GDMA-P to 10% and 30%. For the 20% concentration, BAPO allowed the highest release. For RF, 10% of GDMA-P presented differences between the photoinitiators, being the BAPO group the highest RF. The BAPO + CQ mixture allowed higher RF values for the 20% and 30%. For EM, 30% GDMA-P was the only one to present a significant difference, the BAPO + CQ group being the highest value. Conclusions: In general, CQ released more monomers, so that the 10% concentration of GDMA-P in association with the BAPO photoinitiator group was able to provide better results for the properties tested.
Figura 1 - Imagem caracterizando a reação de síntese do monômero GDMA-P. 27 Figura 2 - Imagem com detalhamento da formulação dos sistemas adesivos... 28 Figura 3 - Imagem ilustrativa de metodologia da análise da citotoxicidade... 30 Figura 4 - Imagem ilustrativa com metodologia para análise de liberação de
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Resultados das médias do percentual de redução de Alamar Blue em células NH3-T3 ± desvio padrão para concentração de GDMA-P utilizada versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle... 34 Tabela 2 - Resultados das médias do percentual de sobrevida de células NH3-T3
em MTT Assay ± desvio padrão para concentração de GDMA-P utilizada versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle... 35 Tabela 3 - Resultados das médias do percentual monômeros HEMA liberados ±
desvio padrão, de acordo com a porcentagem de GDMA-P, versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle... 35 Tabela 4 - Resultados das médias do percentual monômeros UDMA liberados ±
desvio padrão, de acordo com a porcentagem de GDMA-P, versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle... 36 Tabela 5 - Resultados das médias do percentual monômeros GDMA-P liberados
± desvio padrão, versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle... 37 Tabela 6 - Resultados das médias do módulo de Resistência Flexural (MPa) ±
desvio padrão para concentração de GDMA-P utilizada versus tipo de fotoiniciador... 37 Tabela 7 - Resultados das médias do módulo de elasticidade (MPa) ± desvio
padrão para concentração de GDMA-P utilizada versus tipo de fotoiniciador... 38
1 INTRODUÇÃO... 12
2 REVISÃO DA LITERATURA... 14
2.1 SISTEMAS ADESIVOS: EVOLUÇÃO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA... 14
2.2 CITOTOXICIDADE E LIBERAÇÃO DE RESÍDUOS DE SISTEMAS ADESIVOS E SEUS COMPONENTES... 20
2.3 RESISTÊNCIA FLEXURAL E MÓDULO DE ELASTICIDADE DE SISTEMAS ADESIVOS... 22 3 OBJETIVOS... 25 3.1 OBJETIVO GERAL... 25 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 25 4 MÉTODO... 26 4.1 CARACTERÍSTICAS DA PESQUISA... 26 4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS... 26
4.3 SÍNTESE DO MONÔMERO ÁCIDO... 26
4.4 FORMULAÇÃO DOS SISTEMAS ADESIVOS EXPERIMENTAIS SIMPLIFICADOS... 27
4.5 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE... 38
4.6 LIBERAÇÃO DE MONÔMEROS RESIDUAIS... 30
4.7 RESISTÊCIA FLEXURAL E MÓDULO DE ELASTICIDADE... 32
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 33
5 RESULTADOS... 34
5.1 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE... 34
5.1.1 Alamar Blue... 34
5.1.2 Mtt Assay... 34
5.2 LIBERAÇÃO DE MONÔMEROS RESIDUAIS... 35
5.2.1 HEMA... 35 5.2.2 UDMA... 36 5.2.3 GDMA-P... 36 5.3 RESISTÊNCIA FLEXURAL... 37 5.4 MÓDULO DE ELASTICIDADE... 48 6 DISCUSSÃO... 39
7 CONCLUSÕES... 47 REFERÊNCIAS... 48
1 INTRODUÇÃO
Sistemas adesivos são materiais utilizados para proporcionar adesão entre dois materiais de natureza distinta, sendo, no caso da Odontologia, entre os substratos dentário e o material restaurador (REIS; PEREIRA; GIANNINI, 2007). O processo de adesão clássico ocorre em três passos: aplicação de um ácido sobre os tecidos dentários, seguida da aplicação de um primer e um adesivo que penetra nas rugosidades criadas pelo ácido e proporciona uma microrretenção que origina a adesão (BUONOCORE, 1955). Esse protocolo, no entanto, apresenta muitos passos, deixa a técnica sensível a falhas e requer maior tempo clínico. Nesse quesito, tentando simplificar, surgiram os adesivos autocondicionantes, que dispensam a aplicação de ácido, desmineralizando e penetrando simultaneamente nos tecidos dentários (SILVA et al., 2013; MOSZNER; SALZ; ZIMMERMANN, 2005).
Estes adesivos baseiam-se em monômeros ácidos tais como o 10-metacriloxidecil dihidrogênio fosfato (10-MDP) (TAKAHASHI, 2014). No entanto, a tendência para o futuro são melhorias na adesão química ao dente a partir de novos monômeros ácido-funcionais (VAN MEERBEEK et al., 2011). Surge, neste contexto, o GDMA-P, um monômero ácido funcional dimetacrilato que tem habilidade de formar ligações cruzadas quando suas duplas ligações de carbono reagem intermolecularmente com outra cadeia polimérica em crescimento ou intramolecularmente com radicais livres na propagação da cadeia para oferecer maior grau de conversão aos sistemas. A composição e concentração adequada desses monômeros ácidos na composição dos sistemas adesivos é essencial afim de que os iniciadores e co-iniciadores não sejam inibidos (MEEREIS et al., 2014; ZHANG; WANG., 2012; ARIKAWA et al., 2004).
Permitir uma ativação adequada destes fotoiniciadores é importante para que seja atingido grau de conversão adequado, tendo em vista que esta propriedade tem relação direta com o desempenho do adesivo em vários aspectos. Entre os fotoiniciadores mais utilizados, temos a Canforoquinona (CQ), classificada como fotoiniciador tipo II (NORRISH et al, 1949) e devido depender de moléculas co-iniciadoras, há a geração de subprodutos que podem originar problemas como o amarelamento da restauração e maior citotoxicidade (ALBUQUERQUE et al., 2013; JAKUBIAK et al., 2003; STANBURY, 2000; ASMUSSEN, 1985). Tentando resolver esses problemas, iniciadores alternativos, tipo I, tais como Óxido bil-alquil fosfínico (BAPO), Etil 4-dimetilamino benzoato (EDMAB) e Difenilidônio Hexafluorfosfato (DH) passaram a ser mais usados tanto por serem macromoléculas (fato que
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torna mais difícil a disseminação no complexo dentino-pulpar), quanto por apresentarem maior reatividade, proporcionando maior grau de conversão e menos monômeros residuais na interface adesiva (SALGADO et al., 2015; ALBUQUERQUE et al., 2013; SCHNEIDER et al., 2012; PRICE; FELIX, 2009; NOMURA et al., 2006; NEUMANN et al., 2006; NEUMANN et al., 2005).
Como estes monômeros ácidos dos sistemas autocondicionantes permitem a desmineralização e infiltração simultânea, a smear layer é englobada na camada híbrida (SILVA, 2013; SUYAMA et al., 2013) e o sistema adesivo fica em contato maior com os tecidos dentários, tendo em vista que o passo da lavagem é dispensado. Além disso, a polimerização incompleta dos materiais seja pela inativação dos fotoiniciadores diante da acidez ou pela menor reatividade inerente à molécula, pode favorecer a presença de monômeros residuais na interface adesiva que oportuniza maior citotoxicidade de sistemas adesivos através da dispersão destes produtos residuais para tecidos circunvizinhos e polpa dentária (WEISBURGER et al., 1978; NOMURA et al., 2006). Dessa maneira, é importante entender o papel dos monômeros ácidos, tais como o GDMA-P, e sua combinação com diferentes grupos fotoiniciadores e a capacidade citotóxica/ comportamento biológico dos diferentes adesivos (SCHWEIKL; SPAGNUOLO; SCHMALZ, 2006).
Portanto, o presente estudo objetiva avaliar a liberação de monômeros residuais, a citotoxicidade e resistência flexural/módulo de elasticidade de sistemas adesivos experimentais de frasco único com diferentes concentrações de GDMA-P e sistemas fotoiniciadores a base de CQ, DH, EDMAB e BAPO. Desta forma, a hipótese nula testada nesta pesquisa é de não haverá diferenças estatisticamente significativas na liberação de monômeros residuais, citotoxicidade e resistência flexural/módulo de elasticidade entre os sistemas adesivos testados com diferentes concentrações de GDMA-P/fotoiniciadores.
2 REVISÃO DA LITERATURA
Para construção desta revisão de literatura, foram utilizadas as bases de dados PubMed e Google Acadêmico. Na base PubMed foram utilizadas combinações das palavras chaves: “self-etching adhesives”, “Citotoxicity”, “flexural strength” and “Elastic modulus”. Para o Google Acadêmico foram utilizadas combinações das palavras chave “adesivos autocondicionantes”, “citotoxicidade”, “Resistência flexural” e “Módulo de elasticidade”. Na base PubMed, foram selecionados apenas artigos na língua inglesa e que se enquadraram dentro da temática abordada e na base Google Acadêmico, foram selecionados artigos em inglês e português com preferência aos trabalhos de dissertação de mestrado e tese de doutorado em repositórios das universidades.
2.1 SISTEMAS ADESIVOS: EVOLUÇÃO E COMPOSIÇÃO QUÍMICA
A função primordial dos sistemas adesivos é manter unidos dois materiais de natureza igual ou distinta, aderindo a superfície de cada um. Essa possibilidade de unir materiais de naturezas diferentes, no caso da Odontologia, se deu com o auxílio das descobertas dos estudos de Buonocore (1955) e o condicionamento ácido nos substratos dentários, propiciando o surgimento da Odontologia adesiva de forma que, com sua evolução, hoje, os procedimentos adesivos são utilizados em diversas áreas, desde a fixação de restaurações (diretas e indiretas) a esplintagem de dentes periodontalmente comprometidos (REIS; PEREIRA; GIANNINI, 2007).
Em todo procedimento restaurador existem sempre, no mínimo, dois materiais aderentes (biológicos ou sintéticos) a ser unidos por intermédio de um adesivo. Dessa forma, para que se obtenha uma adesão duradoura, peculiaridades estruturais de cada parte envolvida devem ser conhecidas, bem como, as variações morfológicas que podem causar alterações na qualidade da adesão (AGGARWAL et al., 2013; PERDIGÃO, 2002). O processo de adesão em esmalte tem relação com as diferentes inclinações dos prismas de hidroxiapatita, de forma que na região interprismática há uma inclinação progressiva desses cristais, formando uma espécie de depressão chamada de bainha. Essas diferentes orientações permitem a formação de saliências e depressões após a aplicação do ácido fosfórico que facilitam a microrrentenção dos sistemas adesivos (BUONOCORE, 1955). Isso ocorre porque o esmalte é constituído de 95% mineral, 2% de material orgânico e 3% a 4% de água em peso. Assim, a adesão em
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esmalte é baseada na retenção micromecânica gerada pela introdução e polimerização dos monômeros resinosos infiltrados em microporosidades geradas pela dissolução química dos cristais de hidroxiapatita (VERMELHO, 2015).
A dentina, no entanto, é descrita como um composto biológico heterogêneo em sua composição e morfologia, dinâmico em sua fisiologia, quando comparado ao esmalte. É formada por uma matriz de colágeno somada a alguns minerais que origina uma rede de túbulos, onde são abrigados os prolongamentos dos odontoblastos, fluidos dentinário e fibras nervosas. Esses túbulos são uma das características mais marcantes da dentina, estando diretamente relacionados com a permeabilidade do tecido e se estendem desde a câmara pulpar até a junção amelodentinária e amelocementária. A composição da dentina, de forma quantificada é de aproximadamente 50% volume mineral, 20% água e 30% de matriz orgânica (MARSHAL et al., 1997).
Toda essa diferenciação traz algumas peculiaridades à dentina como: tecido úmido e orgânico, aumento do número de túbulos com o aumento da profundidade, pressão pulpar, presença de smear layer e baixa resistência coesiva/presença de minerais nos túbulos quando afetada pela cárie, o que torna adesão mais dificultada nesse substrato (PERDIGÃO, 2010). Ao invés dos monômeros penetrarem nas fissuras do substrato inorgânico, como ocorre em esmalte, em dentina eles adentram a malha de fibras colágenas e túbulos através de uma complexa relação química entre material/substrato de forma que após a polimerização, possibilitam a microretenção do bloco restaurador ao dente (VAN MEERBEEK et al. 2011; PASHLEY et al., 2011, MUNOZ et al., 2013). É por isso que se torna importante manter a dentina sob certas condições de umidade, para evitar o colabamento das fibras de forma a permitir a infiltração dos monômeros originando a camada híbrida e os tags resinosos dentro dos túbulos de forma que a microestrutura da dentina e suas propriedades são os principais determinantes de boa parte dos procedimentos em Odontologia Restauradora (PEREIRA et al., 2001).
A partir do desenvolvimento dos monômeros resinosos e início da sua utilização em 1952, começaram os estudos mais importantes da adesão em esmalte e dentina. Buonocore (1955) começou a observar maiores valores de resistência de união em esmaltes tratados com ácido fosfórico, com posterior observação de que os monômeros podiam penetrar nos prismas de esmalte condicionados e envolver os cristais de hidroxiapatita. Era essa incorporação dos monômeros nos tecidos dentários, a primeira definição de camada híbrida, sendo o termo adotado anos depois (VERMELHO, 2015).
A inserção dos compositos poliméricos se deu na década de 60 com o desenvolvimento do bisfenol-A glicidilmetacrilato (Bis-GMA), por Bowen. Com a preconização, por Fusayama et al. (1979) do condicionamento total com ácido fosfórico e posterior caracterização da hibridização da dentina por Nakabayashi, Kojima e Masuhara (1982), os sistemas adesivos e as resinas compostas passaram a ser materiais de uso rotineiro para os clínicos, dando início a uma era mais conservadora e capaz de restabelecer melhor forma, função e estética dos elementos dentários (VERMELHO, 2015). Desde então, os sistemas adesivos passaram por grandes mudanças, numa tentativa de simplificação do uso e menor susceptibilidade a falhas por parte do operador (VILLELA-ROSA et al., 2011). Assim, pode-se classificar os sistemas adesivos de algumas formas, tais como: gerações (1ª, 2ª, 3ª), tipo de solvente, presença ou não de partículas de carga, tipo de ativação (física, química ou dual), modo de ação (autocondicionante ou não) e número de frascos (1 ou 2) (REIS; PEREIRA; GIANNINI, 2007; VERMELHO, 2015).
A classificação por gerações vem sendo utilizada durante muitos anos e, de acordo com esta, já estamos na 8ª geração de sistemas adesivos, assim, no mercado, atualmente, temos disponíveis da 4ª a 8ª geração (NIRWAN et al., 2017). A quarta geração é formada pelos adesivos em que o protocolo clínico é feito separadamente em 3 passos: condicionamento ácido, aplicação do primer e do adesivo em frascos separados. A quinta geração é formada pelos adesivos onde o protocolo clínico é feito em dois passos: a aplicação do ácido e, em seguida, de um primer e adesivo em um só frasco. A sexta geração é formada por um adesivo onde o protocolo clínico é feito em dois passos, a partir dessa geração, no entanto, não há mais o uso do ácido em separado, dessa forma, nesta geração há aplicação de um primer acídico seguido de um adesivo (ROSA; PIVA; SILVA, 2015). A sétima geração é formada pelos adesivos de passo único, ou seja, todos os elementos do protocolo adesivos em apenas um frasco, com a aplicação sendo feita em um só passo (WAGNER et al., 2014). A oitava geração, ainda pouco estudada, é formada pela inserção de compostos bio-ativos nos frascos para estimular respostas dos tecidos dentários.
Diante do surgimento dos adesivos autocondicionantes, a classificação preferencial passou a ser a que se baseia na estratégia de ação, onde os adesivos podem ser classificados como os que exigem condicionamento ácido prévio/ convencional (etch and rinse) e aqueles que dispensam a aplicação do ácido, ou seja, são autocondicionantes (self-etching) . Associado a isso, o número de passos da aplicação, podendo ser de três, dois ou de
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passo único completam essa classificação (VAN MEERBEEK et al. 2011; PASHLEY et al. 2011).
Dessa maneira, o sistema adesivo clássico (ácido, primer e adesivo) é considerado convencional de três passos. O sistema de dois passos com condicionamento prévio, ou seja, com a junção em um frasco de primer e adesivo e aplicação do ácido separadamente, constitui, juntamente ao sistema convencional de três passos os dois sistemas adesivos convencionais disponíveis no mercado (ARAÚJO et al., 2017; PERDIGÃO, 2002). O de dois passos contendo um primer acídico seguida por um adesivo e o de passo único constituem os autocondicionantes disponíveis no mercado, ou seja, tratam o substrato dentinário através da ação de monômeros ácidos ou ácido fosfórico que desmineralizam e infiltram nos tecidos de forma simultânea (ROSA; PIVA; SILVA, 2015).
Desse modo, cada sistema adesivo apresenta sua composição própria, de acordo com o que se propõe, sendo importante conhecer seus componentes básicos para melhor indicá-los nas diferentes situações clínicas, de forma que a composição monomérica é um dos fatores determinantes para o desempenho do sistema adesivo. Como é sabido, a dentina possui uma umidade intrínseca (AGGARWAL et al., 2013) onde para que ocorra a união a este substrato, é necessária a utilização de monômeros hidrófilos. Um dos monômeros hidrófilos mais utilizados é o 2-hidroxietil metacrilato (HEMA), pois apresenta um radical hidrófilo, com afinidade pelo substrato úmido, e um radical hidrófobo que irá promover a polimerização com outros monômeros (MILIA et al., 2012). Por possuir baixo peso molecular, é de fundamental importância para permitir a infiltração do adesivo, embora não seja capaz de promover sozinho a formação de uma rede polimérica adequada para união (BARBOSA et al., 2015).
Assim, monômeros hidrófobos bifuncionais são necessários para promover a união. Além destes dois tipos anteriormente citados, nos sistemas autocondicionantes há, ainda, a incorporação de monômeros ácidos/funcionais. Estes possuem radicais derivados do ácido carboxílico, fosfórico ou seus ésteres, ou da incorporação de seus ácidos orgânicos e minerais como aditivos que desmineralizam e penetram simultaneamente nos tecidos dentários criando uma forte retenção micromecânica e reduzem a possibilidade de falhas, tais como condicionamento excessivo e desidratação da dentina, evitando-se, assim, problemas na adesão (SILVA, 2013; MOSZNER; SALZ; ZIMMERMANN, 2005; NAKABAYASHI; KOJIMA; MASUHARA, 1982)
Como dito anteriormente, cada adesivo autocondicionante possui em sua composição um monômero funcional específico, que exerce um papel fundamental na sua performance (YOSHIDA et al., 2004; VAN LANDUYT et al., 2011). O monômero ácido mais utilizado em sistemas adesivos atualmente é o 10-metacriloxidecil dihidrogênio fosfato (10-MDP) (TAKAHASHI, 2014), no entanto, a tendência para o futuro são melhorias na adesão química ao dente a partir da síntese de novos monômeros ácido-funcionais (VAN MEERBEEK et al., 2011). Surge, nesse contexto, o GDMA-P, um monômero ácido funcional dimetacrilato que tem habilidade de formar ligações cruzadas quando suas duplas ligações de carbono reagem intermolecularmente com outra cadeia polimérica em crescimento ou intramolecularmente com radicais livres na propagação da cadeia para oferecer maior grau de conversão aos sistemas adesivos autocondicionantes e, consequentemente, menor concentração de monômero residual.
Além dos monômeros, todo sistema adesivo possui algum tipo de solvente em sua composição. Os mais utilizados são água, acetona e etanol onde sua principal função é facilitar o molhamento da superfície dental pelos monômeros resinosos. Após o condicionamento ácido, principalmente nos sistemas etch-and-rise, o solvente, por possuir uma característica hidrófila, penetra na dentina úmida de forma a “guiar” os monômeros. Em seguida, o solvente se une com moléculas de água que, com a aplicação de um leve jato de ar, favorece a sua evaporação e remoção da água presente no substrato, deixando os monômeros que serão polimerizados para formar a camada híbrida (REIS et al., 2003). Nos sistemas autocondicionantes, o solvente utilizado é, normalmente, água e etanol. A presença de água, nesses sistemas, é essencial para permitir a ionização dos monômeros ácidos e a desmineralização do esmalte e dentina subjacentes, não dispensando, também, a aplicação de um leve jato de ar para evaporação da água que pode ser prejudicial a vida clínica da restauração (REIS; PEREIRA; GIANNINI, 2007).
Os sistemas adesivos podem ser de cura química, fotoativáveis ou duais. Estes adesivos duais surgem a partir da adição de ativadores contendo co-iniciadores como sais de sódio de ácidos aril-sulfínicos aos adesivos simplificados (KIM et al., 2013). Os mais utilizados, no entanto, são os fotoativáveis e para que ocorra a reação de polimerização, são necessárias moléculas fotoiniciadoras e de aminas aromáticas que são despertadas pela luz e iniciam o processo (IKEMURA; ENDO, 2010). Em ocasiões onde a ativação com luz torna-se inviável, são utilizados sistemas com cura química ou duais. Estes sistemas adesivos do tipo “duais”, ou seja, ativados quimicamente e através da luz, são utilizados principalmente para
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cimentação de restaurações indiretas e pinos pré-fabricados. É importante ressaltar que a composição e concentração adequada de monômero ácido na composição de sistemas adesivos autocondicionantes é essencial, afim de que os iniciadores e co-iniciadores não sejam inibidos (MEEREIS et al., 2014; ZHANG; WANG, 2012; ARIKAWA et al., 2004).
Entre os fotoiniciadores, a Canforoquinona (CQ) é a mais utilizada na composição de adesivos e é classificada como fotoiniciador tipo II (NORRISH et al, 1949) porque é dependente de uma molécula doadora de elétrons chamada de co-iniciador, que pode ser uma amina aromática que formam subprodutos durante a reação e são responsáveis, em parte, pelo amarelecimento das restaurações (ALBUQUERQUE et al., 2013; STANSBURY, 2000; ASMUSSEN, 1985). Além disso, a CQ produz um único radical livre ativo, o que diminui o seu poder de conversão de monômeros em polímeros e favorece maior citotoxicidade de sistemas adesivos pela presença de monômeros dispersos nos tecidos circunvizinhos, como a polpa dentária (WEISBURGER et al., 1978; NOMURA et al., 2006).
Tentando resolver esse problema, tem se buscado fotoiniciadores alternativos como Etil 4-dimetilamino benzoato (EDMAB), Difenilodônio hexafluorfosfato (DH) e Óxido bis-alquil fosfínico (BAPO), por exemplo, menos citotóxicos comparados a CQ porque são macromoléculas. O BAPO não necessita de amina terciária (tipo I) e produz quatro radicais livres por molécula, oferecendo uma cor mais estética, bem como, maior reatividade na formação de ligações cruzadas e propagação da rede polimérica, respectivamente. (SALGADO et al., 2015; ALBUQUERQUE et al., 2013; SCHNEIDER et al., 2012; PRICE; FELIX, 2009; NOMURA et al., 2006; NEUMANN et al., 2006; NEUMANN et al., 2005).
Além de monômeros, solvente e sistemas fotoiniciadores, componentes inorgânicos, como partículas de carga, podem ser adicionados em uma tentativa de se obter melhores características físico-mecânicas com suposta infiltração destas partículas na camada híbrida. Análises microscópicas, no entanto, mostram que as partículas normalmente se agregam no topo da camada híbrida, de forma a não compor completamente o corpo da camada híbrida. Nunes, Swift e Perdigão (2001) avaliaram sistemas adesivos contendo carga em comparação àqueles sem carga e concluíram que o sem partículas inorgânicas apresentou maior resistência de união diante dos outros testados. Além disso, há a tentativa de inserção de partículas de flúor para posterior liberação semelhante ao que ocorre nos materiais ionoméricos, mas a eficácia ainda é controversa (REIS; PEREIRA; GIANNINI, 2007).
Diante de tantas particularidades exigidas para os sistemas adesivos e consequente complexidade química que possuem, ainda se constitui um desafio a criação de materiais que
sejam completamente satisfatórios em todos os aspectos, necessitando de mais pesquisas e estudos para o desenvolvimento de constituintes e uma combinação adequada.
2.2 CITOTOXICIDADE E LIBERAÇÃO DE RESÍDUOS DE SISTEMAS ADESIVOS E SEUS COMPONENTES
Tão importante quanto proporcionar uma adesão duradoura e possuir boas propriedades físicas, tendo em vista que os sistemas adesivos vão estar em contato com dentina vital, eles devem estabelecer com as estruturas a que vão ser aplicados uma relação harmônica e de biocompatibilidade (SCHWEIKL; SPAGNUOLO; SCHMALZ, 2006). Sabe-se que a dentina, principalmente, é um tecido biológico complexo e que, por possuir túbulos, pode ser uma via de conexão direta com a polpa dos elementos dentários, a depender da proximidade/profundidade da restauração e da composição química dos sistemas adesivos (GIANINNI et al., 2001).
Os túbulos apresentam formato cônico e convergem para a polpa com sua forma e densidade variando dependendo da localização e de alterações no tecido dentário (GIANINNI et al., 2001). A densidade tubular na dentina profunda de aproximadamente 45.000 túbulos/mm², enquanto na dentina superficial diminui para aproximadamente 20.000 túbulos/mm² (REIS; PEREIRA; GIANNINI, 2007).
Assim, apesar de existir um mecanismo biológico de defesa; o surgimento da dentina reacionária e a diminuição do diâmetro dos túbulos nas proximidades da polpa, eventualmente, os sistemas adesivos chegarão em maior ou menor grau às células do tecido pulpar e causarão reações que podem ser de inflamações transitórias à necroses pulpares. Por isso, é de grande importância que o perfil biológico dos sistemas adesivos sejam estudados antes de ser aplicados (SCHWEIKL; SPAGNUOLO; SCHMALZ, 2006).
Como é praticamente impossível a análise das características biológicas dos materiais in vivo, em humanos, pesquisas em animais e com cultura de células tem se tornado comum. O estudo com animais, porém, torna-se demorado e muitas vezes inaplicável à realidade humana devido às proporções dos modelos animais utilizados. Nesse contexto, a cultura de células torna-se mais rápida, mais facilmente reprodutível e aplicável (SCHUESTER et al., 2001). Entre os testes utilizados para avaliar viabilidade celular/citotoxicidade de sistemas adesivos, os mais comuns são MTT Assay, Alamar Blue e teste da barreira dentinária (SILVA et al., 2013; ELIAS et al., 2015).
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Lee et al. (2016) avaliaram a citotoxicidade através do teste de MTT de células odontoblásticas expostas a adesivos autocondicionantes e concluiu que todas as marcas testadas induziram atividade apoptótica, variando entre os produtos testados. Lanza et al. (2009) chegaram a resultados similares ao avaliar o poder de difusão em dentina e a citotoxicidade de sistemas adesivos autocondicionantes através do teste MTT. Segundo os autores, as quatro marcas testadas apresentaram poder de difusão em dentina e induziram uma significante redução da atividade celular na linhagem testada. Kusdemir et al. (2011) avaliaram a citotoxicidade de seis sistemas autocondicionantes em células L929 e concluiu que todos apresentaram toxicidade em maior ou menor grau, a depender da marca. Assim, é quase consensual o poder citotóxico dos sistemas adesivos, apontando para a necessidade e desafio de desenvolver de novos monômeros, componentes e adesivos, em geral, com menor potencial lesivo.
Uma das principais problemáticas no que se refere à toxicidade de sistemas adesivos, refere-se a presença de componentes residuais na interface adesiva. Com a evolução dos sistemas adesivos, há uma perspectiva de se adicionar mais componentes nos frascos, como já relatado. Após a ativação e reação de polimerização, há uma taxa de monômeros e outras substancias residuais que não participam da reação e ficam na interface adesiva (SILVA et al., 2013). Esses monômeros, tais como HEMA, BisGMA, entre outros, são tóxicos e podem penetrar nos túbulos dentinários e ocasionar danos pulpares (ELIAS et al., 2015). O monômero HEMA, por exemplo, é amplamente utilizado em sistemas adesivos e possui baixo peso molecular e uma característica hidrofílica que facilita a penetração e difusão no complexo dentino-pulpar (BARBOSA et al., 2015).
Muito além do complexo dentino-pulpar, os monômeros residuais podem entrar em contato com gengiva e mucosas (VAN LANDUYT et al., 2011), apresentando potencial genotóxico, mutagênico e indutor de apoptose. Dessa forma, características básicas de componentes químicos dos adesivos tem relação direta com a possível toxicidade do material não apenas pelo potencial tóxico inerente da sua composição química, mas, também, pela sua função dentro do adesivo. Fotoiniciadores com alto poder reativo, unidade fotoiniciadora capaz de ativar adequadamente os iniciadores, monômeros com alto poder de ligação e solventes estáveis e que não interfiram na ação dos outros constituintes, por exemplo, podem proporcionar um maior grau de conversão de forma a diminuir o acúmulo de substâncias residuais na interface adesiva.
Nesse contexto, torna-se pertinente a avaliação da citotoxicidade de forma indireta através da avaliação e quantificação desses componentes residuais após a polimerização dos adesivos. Para essa análise, a Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) vem sendo empregada (ELIAS et al., 2015; DANESH et al., 2012; PONGPRUEKSA et al., 2014). Este método se apresenta como um excelente separador dos componentes individuais com alta confiabilidade e eficiência na análise utilizado para o controle de qualidade das drogas produzidas na indústria farmacêutica (SOLON et al., 2016). Pongprueksa et al. (2014) avaliaram a eluição dos monômeros HEMA e Bis-GMA através de HPLC em 8 formulações de adesivos, com diferentes fotoiniciadores, e concluíram que o fotoiniciador utilizado possui importante papel na concentração residual dos monômeros corroborando com outros estudos que utilizaram HPLC para aferir a interferência de fatores como unidades fotoativadores, fotoiniciadores e monômeros constituintes na proporção de monômeros residuais liberados.
Mais uma vez deparamos com a complexidade que é desenvolver sistemas adesivos que associem protocolos simplificados, boas características físico-mecânicas e que respeite os princípios biológicos do complexo sistema dentino-pulpar e tecidos adjacentes, nos indicando a necessidade de mais pesquisas e estudos.
2.3 RESISTÊNCIA FLEXURAL E MÓDULO DE ELASTICIDADE DE SISTEMAS ADESIVOS
Conhecer as propriedades físico-mecânicas dos sistemas adesivos e das resinas compostas utilizadas é de grande importância para que possamos predizer o comportamento destes materiais diante das forças mastigatórias impostas sobre estes materiais em boca.
Nesse quesito, avaliar a resistência flexural e o módulo de elasticidade nos permite ter noção da deformação desses materiais, tendo em vista que essas propriedades nos propicia estimar a quantidade de tensão que o material pode suportar em áreas de grande esforço mastigatório (GORACCI et al., 2014). Reproduzir este complexo sistema de forças mastigatórias “in vitro”, no entanto, se estabelece como um grande desafio metodológico (KUMAR, 2013). A literatura relata alguns testes para avaliar essas propriedades nos materiais resinosos, tais como: teste flexural de três pontos, teste flexural de quatro pontos, teste de flexão biaxial, mini flexão, entre outros. De acordo com a International Standards Organization (ISO), o teste de flexão com três pontos é o ideal para ser utilizado em compósitos resinosos (KUMAR, 2013).
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O teste de flexão em três pontos utilizar espécimes em barra (25 mm x 2 mm x 2 mm) que são colocados sobre suportes a 20 mm de distância e empurrados por um êmbolo a uma velocidade média de 0,75 mm/min de forma que a força de flexão é feita na superfície inferior da amostra (KUMAR, 2013). No entanto, são relatados problemas diante desse teste: podem ocorrer falhas nas bordas que levem a fratura não necessariamente no ponto da flexão, que pode originar vieses, além disso, devido ao tamanho longo da amostra (25mm), o procedimento de fotoativação pode ser inadequado ou insuficiente, mesmo sendo feito de forma padronizada como exige a ISSO 4049, pois a ativação ocorre de forma intensa no ponto principal de foco de luz e não nas bordas, favorecendo a fratura do espécime (YAP; TEOH, 2003; PALLIN et al., 2003; PALLIN; FLEMING; MARQUIS, 2005). Um fator notório é a discrepância de se avaliar resistência flexural de sistemas adesivos em barras com 2 mm de espessura, uma condição inatingível clinicamente e que dificulta correlacionar os achados “in vitro” com o que ocorre no ambiente bucal.
O teste flexural de quatro pontos utiliza espécimes semelhante ao de três pontos, no entanto, as amostras recebem carga em dois pontos, com distância padronizada, de forma que neste teste a flexão máxima ocorre entre os dois pontos de carga, ao contrário do de três pontos que ocorre na superfície inferior do espécime (KUMAR, 2013). Um ponto positivo deste teste é geração de forças uniformes em todo o espécime e não apenas próximo ao ponto de carga, podendo ser mais representativo, diante de que um maior volume da amostra é estressado (HAMMANT et al., 1971). Apesar disso, é pouco utilizado devido à dificuldade metodológica comparado ao de três pontos.
O teste biaxial é comumente utilizado para avaliar resistência flexural de materiais cerâmicos (ADDISON; MARQUIS; FLEMING, 2007). Para este teste, em geral, se utiliza um espécime circular com 12 mm de diâmetro, que representa o que seria o diâmetro médio de um molar e permite uma fotoativação homogênea no centro do espécime, e 1 mm de espessura e a principal vantagem desse teste é que o estresse máximo feito pela carga de força é colocado no centro do espécime, eliminando as possíveis falhas que ocorrem no teste de resistência a flexão de três pontos (KUMAR, 2013).
Além destes testes, uma metodologia que pode ser utilizada é o teste de mini flexão. Tal método utiliza mecanismos idênticos ao teste de flexão de três pontos, no entanto, o espécime possui 12 mm de comprimento, tentando chegar mais próximo das dimensões dentárias, ao invés de 25 mm, como preconiza a ISSO 4049. Uma vantagem dessa
metodologia é que permite uma fotoativação única no espécime, fato que inviabiliza a problemática referida ao teste de três pontos (YAP; TEOH, 2003).
Yap e Teoh (2003) compararam a resistência flexural de materiais resinosos usando o teste de três pontos e o de mini-flexão e chegaram à conclusão de que há uma alta correspondência entre os valores apresentados por ambos os testes. No entanto, por se apresentar mais fácil de ser feito, o teste de mini-flexão se mostrou mais adequado. Além de ser mais simples de ser feito o espécime, o teste de mini-flexão se mostra vantajoso, pois o tamanho do espécime se assemelha mais às dimensões dentárias reais (aproximadamente 12 mm, correspondente ao que seria um molar), usa menos material para construção do espécime e, de forma geral, consegue se aproximar mais do que acontece clinicamente, nos permitindo estender os resultados para nos guiar quanto a escolha dos materiais usados em consultório.
Um outro ponto levantado pelos pesquisadores sobre os testes que mensuram resistência flexural e módulo de elasticidade é o material utilizado como matriz para a construção dos espécimes. De acordo com Kamur (2013), diferentes materiais podem proporcionar uma dissipação diferente da luz no material e alterar propriedades, tais como grau de conversão, que sabidamente tem influência nas propriedades físico-mecânicas. Dessa maneira, a literatura tem se mostrado vasta quanto aos testes possíveis para avaliar a resistência a flexão/módulo de elasticidade dos materiais resinosos se que, apesar da ISO 4049 ser bastante aceita, as pesquisas mostram que outros testes talvez se adequem mais a realidade clínica. Cabe, portanto, ao pesquisador selecionar o teste a ser utilizado devendo sempre preconizar aqueles que nos propiciem resultados mais fidedignos ao que ocorre no ambiente bucal.
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3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o comportamento físico e biológico de sistemas adesivos experimentais a base de GDMA-P.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Mensurar influência da concentração de GDMA-P/UDMA na liberação de monômeros residuais, citotoxicidade e resistência flexural/módulo de elasticidade.
b) Avaliar a influência do tipo de fotoiniciador CQ + EDMAB, BAPO e CQ + BAPO + EDMAB na liberação de monômeros residuais, citotoxicidade e resistência flexural/módulo de elasticidade.
4 MÉTODO
4.1 CARACTERÍSTICAS DA PESQUISA
Este estudo é caracterizado como um ensaio laboratorial “in vitro”, cujas variáveis de resposta são citotoxicidade, resistência flexural/módulo de elasticidade e liberação de monômeros residuais. Os fatores em estudo são a concentração de GDMA-P/HEMA/UDMA(10/30/30; 20/30/20 e 30/30/10) e o sistema fotoiniciador utilizado: (CQ + EDMAB + DH); (BAPO + DH) e (CQ+ BAPO + EDMAB + DH).
4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
A presente pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa CEP/UFRN, CAAE 85587317.3.0000.5537, tendo seu parecer (2.628.345) liberado como aprovado, estando, assim, de acordo com as normas e diretrizes regulamentadoras de pesquisas envolvendo seres humanos regidas pela resolução nº 466/2012 – CNS.
4.3 SÍNTESE DO MONÔMERO ÁCIDO
O monômero dimetacrilato de 1,3-glicerol fosfato (GDMA-P) foi sintetizado de acordo com o método previamente descrito (LEAL et al., 2011; OGLIARI et al., 2008). Pentóxido de fósforo (Vetec, Duque de Caxias, RJ, Brasil) foi lentamente adicionado dentro de um balão de vidro, por meio de um funil de adição, com uma mistura de GDMA diluído em solvente, o cloreto de metileno (DIST Indústria Comércio e Serviços Ltda, Florianópolis, SC, Brasil), agitado magneticamente (IKA RCT, Rio de Janeiro/RJ) durante 6 h e resfriado em banho de gelo. Em seguida, o banho de gelo foi removido e a reação continuou à temperatura ambiente durante 24 h.
O produto final (GDMA-P) foi filtrado, adicionado hidroxibutil tolueno (inibidor) e, então, o solvente foi evaporado em um evaporador rotativo à vácuo (Modelo MA 055, Marconi – Equipamentos para laboratório, Piracicaba, SP, Brasil) por 9 h a uma temperatura de 50°C. Para confirmar a síntese do monômero ácido (Figura 2 - seção Apêndices), o produto final da reação foi avaliado através da espectroscopia
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infravermelha por transformada de Fourier (Prestige21 Spectrometer, Shimadzu, Tóquio, Japão) (LEAL et al., 2011).
Figura 1 - Imagem caracterizando a reação de síntese do monômero GDMA-P
Fonte: o autor (2018).
4.4 FORMULAÇÃO DOS SISTEMAS ADESIVOS EXPERIMENTAIS SIMPLIFICADOS
Nove sistemas adesivos experimentais simplificados foram preparados variando a composição monomérica e o sistema fotoiniciador baseado no estudo de Loguercio et al. (2013) (figura 2). Três comonômeros (70% em massa) compostos de 1,3-dimetacrilato de glicerol fosfato (GDMA-P, monômero ácido), metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA, monômero hidrofílico) e uretano dimetacrilato (UDMA, monômero hidrofóbico) foram utilizados, variando apenas a proporção de GDMA-P e UDMA. Os solventes utilizados foram etanol e água destilada na proporção de 1:1(p/p) (MACEDO et al., 2015).
Neste estudo, foi utilizado 12% em massa de solvente, que equivale ao solvente residual presente após evaporação (MORAES et al., 2012). Três sistemas iniciadores foram testados, contendo Canforoquinona (CQ, fotoiniciador), Óxido bis-alquil fosfínico (BAPO, fotoiniciador alternativo), Etil 4-dimetilamino benzoato (EDMAB, co-iniciador/amina terciária) e Difenilodônio Hexafluorfosfato (DH, co-iniciador) em diferentes combinações.
Descrição detalhada das proporções de cada componente presente nas 9 formulações está contida na figura 2. Com exceção do BAPO (Ciba-Geisy,Basel, Swirtizeland), todos os fotoiniciadores e co-iniciadores foram obtidos através da Sigma-Aldrich (Milwaukee, Wisconsin, USA) e os monômeros através da Esstech Inc. (Essington,
Pennsylvania, EUA), com exceção do GDMA-P que foi sintetizado tal como descrito anteriormente (LEAL et al., 2011; OGLIARI et al., 2008).
Figura 2 - Imagem com detalhamento da formulação dos sistemas adesivos.
Fonte: o autor (2018).
Legenda: GDMA-P: 1,3-dimetacrilato de glicerol fosfato, HEMA: metacrilato de 2-hidroxietilo, UDMA: uretano dimetacrilato, CQ: Canforoquinona, BAPO: Óxido bis-alquil fosfínico, EDMAB: Etil 4-dimetilamino benzoato, DH: Difenilodônio Hexafluorfosfato.
4.5 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE
Para avaliar a citotoxicidade, seguiu-se o método descrito por Elias et al. (2015) com algumas adaptções. Para os ensaios de citotoxicidade foram utilizados fibroblastos da linhagem NIH/3T3, obtidos a partir de camundongos NIH/Swiss e comercializadas pela American Type Culture Collection (ATCC, USA). As células foram expandidas em garrafas de cultivo celular (TTP, Switzeland) contendo meio de cultivo DMEM enriquecido com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos e antimicóticos (todos da Gibco, USA). A citotoxicidade foi avaliada pelos ensaios do MTT e do Alamar Blue. Para tanto, as células foram previamente cultivadas em placas de 96 poços, na
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densidade de 5x103 células por poço, para garantir a adesão celular à superfície do plástico de cultivo.
Foram utilizados discos de papel absorvível (diâmetro de 6 mm). Para cada adesivo, n=8, foram dispensadas sobre os discos de papel gotas padronizadas de 5 µL com auxílio de uma micropipeta de alta precisão (Digipet, Paraná, Brasil), colocada uma tira de poliéster sobre, uma lâmina de vidro e em seguida fotoativadas durante 20 s com uma unidade fotoativadora LED de terceira geração geração Bluephase (G2, Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein) colocada exatamente sobre a lâmina de vidro. Após isso, os círculos foram colocados no fundo dos poços da placa de 96 poços, de forma que a superfície que recebeu a gota ficasse voltada para cima, e o meio contendo a cultura foi vertido sobre estes papéis de forma a ficar 24 h a 37ºC em contato com as células e seguiram para os testes. Todos os experimentos foram realizados em duplicata (Figura 3, seção Apêndices).
O ensaio do Alamar Blue (Invitrogen, USA) consiste em um método colorimétrico que permite a detecção da atividade metabólica das células a partir da redução da resazurina (7-hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona 10-óxido), um corante azul fracamente fluorescente, em resorufina, um corante rosa com altíssima fluorescência em vermelho. Decorridas 24 h de contato com os adesivos, o meio foi removido e as células foram cultivadas com 10 µL de Alamar blue (Invitrogen, USA) e 90 µL de meio DMEM, a 37°C em atmosfera úmida com 5% de CO2, por 4 h, de acordo com o protocolo do fabricante. Após quatro horas, as absorbâncias das soluções foram medidas em leitor de microplaca (Epoch-Biotech Instruments, USA) nos comprimentos de onda de 570 nm (forma reduzida) e 600 nm (forma oxidada).
O ensaio de MTT avalia a atividade metabólica das células quantificando a redução do MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] por desidrogenases mitocondriais, que resulta na produção de cristais de formazam intensamente corados no interior das células. Decorridas 24 h de contato com os adesivos, as células foram incubadas com 100 µL de meio de cultura contendo 1mg/mL de MTT por 4 h e em seguida o produto colorimétrico (formazan) foi solubilizado com 100 µL de dimetilsufóxido (DMSO). A absorbância das amostras foi medida em espectofotômetro (Epoch-Biotech Instruments, USA) no comprimento de onda de 570 nm.
O meio de cultura puro, sem adição de células, foi considerado como branco do ensaio e o meio contendo 10% de Alamar Blue o controle negativo. A redução do Alamar Blue foi então calculada a partir da equação fornecida pelo fabricante.
Figura 3-Imagem ilustrativa de metodologia da análise da citotoxicidade.
Fonte: o autor (2018).
Legenda: A: círculos de papel após corte; B: gotejamento de gota padronizada dos sistemas adesivos; C: cobertura com tira de poliéster + lâmina de vidro + fotoativação por 20 s; D: inserção do papel com adesivo fotoativado no fundo do poço; F: inserção do meio de cultura DMEM + células sobre os papéis impregnados com adesivos e manutenção durante 24h; G: análise de citotoxicidade através dos testes MTT Assay e Alamar Blue.
4.6 LIBERAÇÃO DE MONÔMEROS RESIDUAIS
Para avaliação da liberação de monômeros residuais foi utilizado como base, com algumas adaptações, o método descrito por Miletic, Santini e Trkulka (2009). Foram utilizados 54 terceiros molares humanos, n=6, livres de rachaduras e defeitos, desinfetados em timol (0,1%) a 40ºC por uma semana. O esmalte da face oclusal foi seccionado transversalmente ao sentido do longo eixo do dente com discos diamantados refrigerados à água (South Bay Technology, San Clement, CA) acoplados a uma máquina de corte (Isomet 1000; Buehler, Lake Forest) de forma deixar apenas a dentina logo abaixo da junção amelodentinária exposta. Na sequência, foi feita outra secção paralela à anterior com
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os mesmos discos diamantados, rente ao teto da câmara pulpar, de forma a proporcionar uma pastilha de tecido dentinário rodeada por esmalte correspondentes as faces vestibular, mesial, lingual/palatina e distal. O esmalte que margeia toda essa pastilha de dentina foi recortado em cortes retos de forma a tornar essa superfície retangular e em seguida, essa fatia de dentina foi lixada com discos de granulação 400 e 600 (Labopol-21, Copenhagen, Denmark). A partir da divisão desse substrato de dentina obtido, foram feitas amostras com dimensões padronizadas de 5 mm x 6 mm.
As amostras foram impregnadas com os sistemas adesivos experimentais (n=6) através da dispensão de uma gota de volume padronizado com 5 µL com auxílio de uma micropipeta de alta precisão (Digipet, Paraná, Brasil), friccionada durante 20 s com microbrush (KG Sorensen, Cotia, SP, Brasil), colocada uma tira de poliéster sobre a face e fotoativada durante 20 s, com uma unidade fotoativadora LED de terceira geração geração (Bluephase G2, Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein). Após fotoativados, os espécimes foram armazenados em uma solução de metanol (75%)/ água (25%) durante 24 h para liberação dos monômeros residuais que não participaram do processo de polimerização (Figura 4).
A liberação de monômeros residuais foi analisada por cromatografia líquida de alta eficiência com detector do tipo “diode array detector” (CLAE-DAD), para separação dos monômeros HEMA, UDMA e GDMA-P. Foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência da marca Shimadzu (Tóquio, Japão), composto por bomba analítica binária (LC-20A3 XR), injetor automático (SIl-20AD XR), desgaseificador ( DGU- (LC-20A3), forno para colunas (CTO- 20AC) e, detector de arranjo de diodos (SPD-M20A), com sistema controlado pelo software LC Solution®. A coluna utilizada foi do tipo Shimpack XR-005 SOL x 3.0 Shimadzu ®, C18, 50 x 50 mm; a 40ºC. Anteriormente a injeção, a amostra foi solubilizada em metanol/H2O na concentração de 1:1, foram injetados 2 µL. A fase móvel utilizada foi um gradiente de eluição com os solventes H2O e Acetonitrila (0:7min 35% acetonitrila/ 65% H2O - fase A) e (7:18min 80% acetonitrila/0%H2O - fase B). O fluxo utilizado na coluna foi de 0,2 mL/min.
Para ser feita a porcentagem de monômeros liberados, foi dispensada uma gota de 5 µl de cada um dos nove adesivos em um eppendorf com mesmo eludato em que foram colocados os espécimes. Os adesivos não foram fotoativados. Os 9 espécimes foram submetidos a análise em cromatografia líquida de alta eficiência para separação dos monônomeros estudados e, dessa forma, foi obtido um referencial de 100% de monômeros
que podem ser liberados. A proporção foi feita, assim, dividindo-se o valor liberado dos espécimes por esse valor total máximo obtido.
Figura 4-Imagem ilustrativa com metodologia para análise de liberação de monômeros residuais.
Fonte: o autor (2018).
Legenda: A: cortes transversais ao longo eixo para obtenção de fatia de tecido dentário; B: corte das bordas mesial, distal, vestibular e lingual/palatina para obtenção de substrato apenas dentinário; C: secção de substrato dentinário para obtenção de espécime de tamanho padronizado; D: acabamento e padronização do espécime; E: gotejamento de gota padronizada de cada sistema adesivo manipulado; F: fricção com microbrush durante 20 s; G: cobertura com tira de poliéster + lâmina de vidro + fotoativação durante 20 s; H: imersão em meio 25% água / 75% metanol durante 24h e na sequência submissão dos eludatos a avaliação em HPLC.
4.7 RESISTÊCIA FLEXURAL E MÓDULO DE ELASTICIDADE
A resistência flexural e módulo de elasticidade foram avaliados de acordo com a norma ISO 4049 de 2009. Sete corpos de prova de cada adesivo foram confeccionados numa matriz de aço inoxidável com as medidas de 25 ±0,2 mm x 2 ±0,1mm x 2 ±0,1mm resultando um total de 63 amostras. Foram dispensadas gotas dos adesivos na matriz e coberta com uma fita de poliéster, mas comprimida suavemente, na extremidade superior, com uma lâmina para microscopia, com a finalidade de formar uma superfície regular.
A fotoativação foi realizada durante 20 s com com uma unidade fotoativadora LED de terceira geração (Bluephase G2, Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein), a ponta do LED foi colocada diretamente sobre a lâmina acima da matriz, em três lugares distintos do espécime. As faces superior e inferior das amostras foram lixadas com lixas de granulação
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400 e 600 (Labopol-21, Struers, Copenhagen, Denmark) e mantidas em uma estufa a 37°C durante 24 h até a realização do teste.
Para mensurar a Resistência flexural e o Módulo de elasticidade, foi realizado o teste de flexão em três pontos, realizado em uma Máquina de Ensaios Universal (Instron 4111, Instron Corp., Dayton, OH, USA) onde a amostra em barra foi colocada sobre dois suportes (dois pontos) e um embolo (terceiro ponto e responsável pela aplicação da carga) foi pressionado perpendicularmente sobre a amostra, à uma velocidade de 0,75 mm/min com uma carga de 50N até a ruptura. Para calcular os valores, foi utilizado o software Bluehill 2 (Illinois Tool Works, Inc., Glenview, IL, USA).
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados são apresentados como médias + erro padrão da média. Os valores finais das amostras de cada teste foram submetidos ao teste de normalidade através do teste de Kolmogorv – Sminorv e, em seguida, submetidos a análise de variância (ANOVA) a dois fatores, seguida pelo teste de Tukey (p <0,05) através do software GraphPad Prism 7.
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE
5.1.1 ALAMAR BLUE
Houve diferença estatisticamente significativa entre as porcentagens de GDMA-P (p<0,001), entre os fotoiniciadores (p<0,0001) e na interação % de GDMA-P versus tipo de foto iniciador (p<0,001). Ao comparar entre grupos de fotoiniciadores iguais para as diferentes proporções de GDMA-P, para os três grupos, a concentração de 10% proporcionou maior taxa de viabilidade celular. A proporção que apresentou maior citotoxicidade foi a de 30% para os três grupos de fotoiniciador. Comparando entre as mesmas concentrações e diferentes fotoiniciadores, não houveram diferenças estatisticamente significativas.
Tabela 1 - Resultados das médias do percentual de redução de Alamar Blue em células NH3-T3 ± desvio padrão para concentração de GDMA-P utilizada versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle. Concentração de GDMA-P Fotoiniciador 10% 20% 30% 0% CQ 33,47 ± 0,89 Bb 29,32 ± 1,66 Cb 25,13 ± 4,27 Db 60,63 ± 3,38 Aa BAPO 32,00 ± 1,87 Bb 29,55 ± 2,34 CBb 27,73 ± 1,16 Cb 60,63 ± 3,38 Aa CQ+BAPO 32,94 ± 1,71 Bb 29,78 ± 2,25Cb 25,56 ± 3,28 Db 60,63 ± 3,38 Aa 0% 60,63 ± 3,38 Aa 60,63 ± 3,38 Aa 60,63 ± 3,38 Aa 60,63 ± 3,38 Aa
Diferença entre letras maiúsculas expressam diferença estatisticamente significativa nas linhas. Diferenças entre letras minúsculas expressam diferença estatisticamente significativa nas colunas. Fonte: o autor (2018).
5.1.2 MTT ASSAY
Houve diferença estatisticamente significativa entre as porcentagens de GDMA-P (p<0,001), entre os fotoiniciadores (p<0,0001) e na interação % de GDMA-P versus tipo de foto iniciador (p<0,0021). Para todos os grupos, não houve diferenças entre os grupos para as diferentes concentrações de GDMA-P e grupos de fotoiniciador.
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Tabela 2 - Resultados das médias do percentual de sobrevida de células NH3-T3 em MTT Assay ± desvio padrão para concentração de GDMA-P utilizada versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle. Concentração de GDMA-P Fotoiniciador 10% 20% 30% 0% CQ 0,067 ± 0,008 Bb 0,060 ± 0,007 Bb 0,063 ± 0,011Bb 0,107 ± 0,026 Aa BAPO 0,060 ± 0,004 Bb 0,064 ± 0,009 Bb 0,063 ± 0,008 Bb 0,107 ± 0,026 Aa CQ+BAPO 0,060 ± 0,004 Bb 0,056 ± 0,002Bb 0,059 ± 0,006 Bb 0,107 ± 0,026 Aa 0% 0,107 ± 0,026 Aa 0,107 ± 0,026 Aa 0,107 ± 0,026 Aa 0,107 ± 0,026 Aa
Diferenças entre letras minúsculas expressam diferença estatisticamente significativa nas colunas. Diferença entre letras maiúsculas expressam diferença estatisticamente significativa nas linhas. Fonte: o autor (2018).
5.2 LIBERAÇÃO DE MONÔMEROS RESIDUAIS
5.2.1 HEMA
Houve diferença estatisticamente significativa entre as porcentagens de HEMA (p<0,001), entre os fotoiniciadores (p<0,0001) e na interação % de GDMA-P versus tipo de foto iniciador (p<0,0001).
Para a liberação de monômeros HEMA, a concentração 10% de GDMA-P liberou mais monômeros quando em associação com os fotoiniciadores CQ e CQ+BAPO. Quando utilizado o fotoiniciador BAPO, não houve diferença entre as diferentes concentrações para liberação de HEMA. Para as mesmas concentrações de GDMA-P e diferentes fotoiniciadores, os grupos de fotoiniciadores contendo BAPO liberaram menos monômeros HEMA para as concentrações de 10% e 30%. Para a concentração de 20%, não houve diferença entre os tipos de fotoiniciador utilizado.
Tabela 3 - Resultados das médias do percentual monômeros HEMA liberados ± desvio padrão, de acordo com a porcentagem de GDMA-P, versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle.
Concentração de GDMA-P
Fotoiniciador 10% 20% 30%
CQ 62,84 ± 2,50 Aa 26,93 ± 13,46 Ba 35,86 ± 2,00 Ba
BAPO 31,83 ± 4,19 Ab 27,89 ± 4,84 Aa 24,01 ± 3,33 Ab
Diferenças entre letras minúsculas expressam diferença estatisticamente significativa nas colunas. Diferença entre letras maiúsculas expressam diferença estatisticamente significativa nas linhas. Fonte: o autor (2018).
5.2.2 UDMA
Houve diferença estatisticamente significativa entre as porcentagens de GDMA-P (p<0,001), entre os fotoiniciadores (p<0,0001) e na interação % de GDMA-P versus tipo de foto iniciador (p<0,0001).
Para liberação de UDMA, para os mesmos fotoiniciadores e diferentes concentrações de GDMA-P, apenas CQ apresentou diferença significativa, sendo a concentração 10% a que mais liberou monômero UDMA. Para CQ, a concentração que menos liberou UDMA foi 20% de GDMA-P. Entre as mesmas concentrações, para 10% e 30% CQ proporcionou maior liberação de monômeros. Independente da concentração: BAPO e CQ+BAPO não alteraram a liberação de UDMA.
Tabela 4 - Resultados das médias do percentual monômeros UDMA liberados ± desvio padrão, de acordo com a porcentagem de GDMA-P, versus tipo de fotoiniciador comparados ao grupo controle.
Concentração de GDMA-P
Fotoiniciador 10% 20% 30%
CQ 44,43 ± 1,96 Aa 15,92 ± 2,19 Ca 36,76 ± 1,57 Ba
BAPO 16,11 ± 3,92 Ab 17,89 ± 3,33 Aa 14,79 ± 1,90 Ab
CQ+BAPO 13,26 ± 0,54 Ab 14,38 ± 1,80 Aa 13,44 ± 2,29 Ab
Diferenças entre letras minúsculas expressam diferença estatisticamente significativa nas colunas. Diferença entre letras maiúsculas expressam diferença estatisticamente significativa nas linhas. Fonte: o autor (2018).
5.2.3 GDMA-P
Houve diferença estatisticamente significativa entre as porcentagens de GDMA-P (p<0,001), entre os fotoiniciadores (p<0,0001) e na interação % de GDMA-P versus tipo de foto iniciador (p<0,0001).
Para os mesmos grupos de fotoiniciadores e diferentes concentrações, todos os grupos apresentaram diferenças significativas. Entre os mesmos fotoiniciadores e diferentes concentrações de GDMA-P, para CQ a concentração 10% liberou mais GDMA-P e a 20% se
