RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar as taxas de gestação e de perdas embrionários em receptoras equinas após a administração de benzoato de estradiol e progesterona. Para tanto, foram utilizadas 40 éguas doadoras das raças Quarto-de-milha e Mangalarga durante a estação de monta. Os animais foram alocados em dois grupos (n=20 por grupo): G1 (estro induzido)-fêmeas em anestro submetidas ao protocolo hormonal utilizando 5 mg de benzoato de estradiol (BE) no dia da ovulação da doadora (D0) seguido de 4 mg de BE no D1 e progesterona de longa duração no D2, repetida em administrações semanais do D9 ao D120; e G2- éguas cíclicas controle (estro natural). A transferência de embrião foi realizada entre o D3 e D8. Os animais foram submetidos a exame ultrassonográfico transretal nos dias 15 e 60 pós transferência para diagnóstico de gestação. As porcentagens de animais gestantes e as perdas embrionárias nos dois grupos foram comparadas pelo teste qui-quadrado. Não houve diferença significativa entre os dois grupos em relação ao percentual de animais gestantes (p=0,52) e ao percentual de perdas embrionárias, tanto aos 15 (p=0,52) como aos 60 dias (p=0,97) de gestação. Conclui-se, portanto, que o protocolo utilizado neste estudo é viável para a transferência de embriões na espécie equina.
Palavras-chave: reprodução assistida, equino, hormônios.
MV Izabella B. Jardim1, MV Juliana M. Duarte2, MV MSc Dr Wilter R.R. Vicente3,
MV MSc Beatrice Ingrid Macente3, MV MSc Dr Maricy Apparicio3,4*
EFICIÊNCIA DO PROTOCOLO DE
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO
PARA ÉGUAS RECEPTORAS
ACÍCLICAS
Viability of the Embryo Transfer Protocol
in Acyclic Recipient Mares
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate pregnancy and embryo loss rates in recipient mares after the administration of estradiol benzoate and progesterone. Fourty Quarter horse and Mangalarga donor mares were using during the breeding season. The mares were allocated into two groups (n=20 per group): G1 (induced estrus)- female in anestrus submitted to a hormonal protocol using 5mg of estradiol benzoate (BE) on the day of the donor ovulation (D0), 4mg of EB on D1, progesterone on D2 and weekly progesterone treatment from D9 to D120; G2- naturally cycling mares as control (natural estrus). Embryo transfer was performed between D3 and D8. Transrectal ultrasound examination was carried out on the 15th and 60th day after the embryo transfer in order to diagnose pregnancy. Pregnancy and embryo loss rates were compared by using chi-square test. No significant difference was found between the groups with regards to pregnancy rates (p=0,52) and embryo loss at 15 (p=0,52) and 60 (p=0,97) days after transfer. We conclude that the protocol employed in this study was suitable for embryo transfer in mares.
Keywords: Assisted reproduction, equine, hormones.
1 Universidade de São Paulo-USP, Reprodução Animal, Av. Pádua Dias, 11, Piracicaba, São Paulo, Brasil. 2 Médica Veterinária autônoma, Al. Campinas 1360, São Paulo, Brasil. 3 Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP, Jaboticabal)
4 Universidade de Franca (UNIFRAN)
Na última década observou-se o desenvolvimento de várias técnicas de reprodução assistida na espécie equina, as quais, embora dispendiosas de tempo e dinheiro, se justificam pelo alto valor econômico desta espécie (HINRICHS, 2013). A técnica de transferência de embriões consiste na colheita de um ou mais embriões de uma égua doadora com características genéticas superiores e transferência (inovulação) para o útero de outra fêmea da mesma espécie, denominada receptora, a qual terá a função de gerar e criar a prole (ANDRADE, 1986).
As éguas são animais de ciclicidade estacional de dias longos (verão), por isso no hemisfério sul sua estação reprodutiva ocorre de outubro a março e fora desse período elas entram em transição e posteriormente em anestro. Uma alternativa para ampliar esse período reprodutivo é utilizar o ciclo artificial, administrando hormônios exógenos com o intuito de mimetizar um ciclo natural, preparar o útero da égua para recepção do embrião e para manutenção da gestação.
Muitos são os protocolos empregados nos programas de transferência de embriões em equinos e, recentemente, a utilização de benzoato de estradiol e progesterona de longa duração mostrou-se viável para indução do estro e manutenção da gestação equina durante a fase transicional (BOTELHO et al., 2015). A associação destes hormônios permite a obtenção de um tônus uterino de máxima intensidade (semelhante ao encontrado entre o 16º e o 25º dia de gestação), razão pela qual poderia incrementar as taxas de gestação e reduzir o número de embriões absorvidos (BOTELHO et al., 2015).
Esse trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência do benzoato de estradiol e da progesterona como protocolo para a transferência de embriões em éguas da raça Manga-larga
e Quarto de milha em relação as taxas de gestação e perdas embrionárias.
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais e grupos experimentais
O trabalho foi realizado em uma central de reprodução de equinos no município de Santo Antônio de Posse- SP, durante a estação de monta. Como doadoras dos embriões, foram utilizadas éguas da raça Mangalarga e Quarto-de-milha, de diferentes haras no interior paulista. Os animais tinham entre 2 e 16 anos de idade, com escore corporal entre 3-4 (referência de mínimo e máximo é na relação de 1-5 respectivamente) aptas para a atividade reprodutiva. Como receptoras foram utilizadas 40 éguas SRD, com condição corporal compatível com a atividade reprodutiva, sendo 20 de ciclo natural e 20 de ciclo artificial (indução farmacológica).
O manejo nutricional das éguas doadoras variava entre as propriedades, porém, consistiu em regimes similares à base de feno, água, sal mineral à vontade e concentrado (13% PB) em baias separadas. Todas as receptoras foram alojadas na central com um regime de pastagem Tifton 85, com água e sal mineral à vontade e receberam concentrado (12% PB) em bretes com cochos separados uma vez ao dia.
As doadoras foram submetidas ao exame ultrassonográfico em dias intercalados para controle de cio. As receptoras do grupo controle (G2) foram manipuladas diariamente com o ultrassom para acompanhar desenvolvimento e tamanho folicular, dobras uterinas em estágios de cio, ovulação, tônus uterino, presença de CL e regressão de CL; as receptoras do grupo hormonal (G1) foram manipuladas diariamente com o ultrassom para
acompanhamento das dobras uterinas induzidas pela ação do benzoato de estradiol (Sincrodiol®, Ouro Fino, Ribeirão Preto, Brasil) e também tônus uterino decorrente da ação da progesterona (Sincrogest®,Ouro Fino, Ribeirão Preto, Brasil). Para tanto foi utilizado um ultrassom modelo CTS-900V neo, da marca SIUI, acoplando uma probe transretal linear de 7,5MHz.
O tônus uterino foi classificado de 1 a 4 de acordo com os parâmetros a seguir: tônus 1- mínimo de tônus uterino desde o anestro até início da atividade cíclica; o formato e consistência do útero ainda não apresentavam tonicidade desejada; tônus 2- início de reação a fase estrogênica do ciclo estral (estro) no qual a sua consistência ainda era macia, porém, iniciando um formato tubular; ao ultrassom o útero apresentava-se com menos dobras quando comparado ao do tônus 1; tônus 3- característico da fase progesterônica (diestro) na qual o formato tubular do útero era evidente, com aumento do tônus da parede e de sua consistência, juntamente com presença de contratilidade do miométrio; tônus 4- tônus uterino máximo oriundo de um começo de gestação e após o 13° dia a contratilidade uterina era mais evidente e formato completamente tubular e de consistência firme.
As doadoras foram inseminadas com sêmen fresco contendo 800 x 106 espermatozoides. O sêmen foi proveniente de garanhões comprovadamente aptos a reprodução, sendo utilizado animais da mesma raça das fêmeas. A inseminação foi realizada conforme detecção de folículo dominante (com diâmetro igual ou superior a 35mm) juntamente com acompanhamento do tônus uterino típico de éguas em estro (tônus 1) e posteriormente foram submetidas a um exame ultrassonográfico diário para detecção da ovulação. O dia da ovulação foi considerado D0 da doadora, e a colheita do embrião
O manejo diário das receptoras G2 consistiu em controle minucioso do desenvolvimento folicular através de escaneamento ultrassonográfico, no qual a partir da detecção de um folículo dominante com diâmetro igual ou superior a 35 mm, administrou-se 750µg de deslorelina/animal (análogo do GnRh; Sincrorrelin®, Ouro Fino, Ribeirão Preto, Brasil), pela via intramuscular. A ovulação foi registrada como o D0 e quando confirmada, os animais foram selecionados para a transferência que ocorreu entre o D3 e D8. O manejo diário das receptoras G1 consistiu na administração de 5mg de benzoato de estradiol (BE) no D0, seguido de 4mg de BE no D1 e 1500 mg de progesterona de longa ação pela via intramuscular em veículo oleoso. As receptoras foram acompanhadas diariamente para controle do tônus uterino e o programa de transferência de embriões foi iniciado quando havia tônus 4.
Colheita e Transferência de embriões
As doadoras foram submetidas a higienização da genitália com água e sabão seguido de assepsia do local com solução de Iodo degermante a 1%. Os embriões foram colhidos com sonda específica através de lavagem uterina utilizando solução de Ringer com lactato de sódio. O material colhido foi despejado sobre filtro coletor de embrião, repetindo-se a operação por até três vezes nos casos em que o embrião não fosse identificado a olho nu. Após a última lavagem, o conteúdo final do processo de filtração foi avaliado em estereoscópio com aumento de 10 a 40 vezes com o intuito de procurar algum embrião que, porventura, não fosse visível a olho nu. Após a colheita, as doadoras receberam 260µg de cloprostenol/animal (Sincrocio®, Ouro Fino, Ribeirão Preto, Brasil) pela via intramuscular para lise do corpo lúteo.
Os embriões foram manipulados e lavados sequencialmente em placa Petri contendo meio HAM F10, com auxilio de palhetas de 25mm ou 50mm de diâmetro, conforme tamanho do embrião. Os embriões foram classificados de acordo com sua qualidade, seguindo os critérios de McKinnon e Squires (1998) e apenas aqueles de grau 1, sem anormalidades foram selecionados. Na sequência, foram imersos em tubos Falcon contendo solução HAM F10, refrigerados em pequenas caixas de isopor e transportados até a central.
As receptoras de ambos os grupos foram inovuladas com os embriões entre o D3 e D8. Para tanto, procedeu-se a higienização seguindo a mesma sequência do utilizado para as doadoras. Os embriões refrigerados foram inovulados no útero via transcervical com o auxílio de uma pipeta de inseminação artificial.
As receptoras foram submetidas a exame ultrassonográfico transretal 15 dias após a transferência para confirmação de gestação e o procedimento foi repetido aos 30 e 60 dias.
O número de animais gestantes e as perdas embrionárias foram comparadas entre os grupos pelo teste qui-quadrado com nível de significância de 95%.
RESULTADOS
Na tabela 1 constam os dados referentes as avaliações ultrassonográficas realizadas aos 15, 30 e 60 dias após a transferência embrionária em relação a taxa de gestação. Nota-se que não houve diferença significativa entre o percentual de éguas gestantes entre o G1 e o G2 aos 15 dias (p=0,52), 30 e aos 60 dias (p=0,75). Taxa de gestação GRUPOS D15 (%) D30 (%) D60 (%) G1 (n=20 11 (55) 11 (55) 11 (55) G2 (n=20) 13 (65) 12 (65) 12 (60)
Não foi encontrada diferença significativa, p>0,05.
Tabela 1. Taxa de gestação após 15, 30 e 60 dias da transferência de embrião em éguas submetidas a tratamento hormonal usando benzoato de estradiol e progesterona (G1) e controle (G2).
Na tabela 2 constam os dados referentes aos grupos G1 e G2 em relação às perdas embrionárias. O grupo G1 apresentou nove perdas embrionárias na avaliação ultrassonográfica com 15 dias após transferência de embrião, correspondendo a 45%, enquanto o grupo G2 apresentou sete perdas no mesmo período, correspondendo a 35% (p=0,52). Aos 60 dias foi realizada nova avaliação ultrassonográfica na qual notou-se perda embrionária apenas no G2, correspondendo a 5% (p=0,97).
Taxa de perda embrionária
Grupos D15 (%) D30 (%) D60 (%)
G1
(n=20) 9 (45) 0 (0) 0 (0) G2
(n=20) 7 (35) 0 (0) 1 (5)
Não foi encontrada diferença significativa, p>0,05. MON
Tabela 2. Taxa de perda embrionária após 15, 30 e 60 dias da transferência de embrião em éguas submetidas a tratamento hormonal usando benzoato de estradiol e progesterona (G1) e controle (G2).
Após esses períodos de avaliação não foi detectado mais perdas embrionárias em nenhum dos grupos; todos os animais levaram a gestação a termo.
DISCUSSÃO
As taxas de gestação encontradas no presente trabalho (55 e 66% para éguas tratadas e controle) se enquadram no reportado na literatura, as quais oscilam entre 50 e 75% (SQUIRES
et al., 2003; RAZ et al., 2011; BOTELHO et al., 2015). Notamos ainda que a taxa de prenhez dos animais com ciclo natural foi equivalente à de animais em anestro submetidas a tratamento hormonal, evidenciando o sucesso do tratamento e a viabilidade de sua utilização a campo. Pesquisa recente utilizando o mesmo protocolo reportou taxa de prenhez próxima de 70% no grupo tratado e significativamente superior ao grupo controle (36.6%; BOTELHO et al., 2015). A diferença entre as taxas relatadas no referido trabalho e no presente estudo pode ser atribuída principalmente a fase do ciclo em que as fêmeas estavam (transição x anestro, respectivamente). Sabe-se que durante a fase de transição, os níveis de LH e a função ovariana são inferiores aos demais períodos, acarretando menor quantidade de progesterona circulante (IRVINE et al., 2000). Esta condição pode explicar a diferença entre as taxas de prenhez do grupo controle do referido trabalho e deste estudo (36.6% vs. 66%, respectivamente) e também ratifica a eficiência e abrangência deste protocolo para éguas anovulatórias receptoras, estejam elas em anestro ou na fase de transição.
Em relação as perdas embrionárias durante os períodos avaliados, nota-se que aos 15 dias, ambos os grupos apresentaram perdas superiores a 30%, não havendo diferença entre o grupo suplementado e o controle. Entretanto, na repetição do exame ultrassonográfico aos 60 dias, apenas no grupo controle houve perda embrionária. Esse dado difere do encontrado na literatura, na qual as maiores taxas de perdas embrionárias são identificadas nos exames ultrassonográficos realizados entre os 30 e 60 dias (BOTELHO et al., 2015; HINRICHS, 2013). Squires & Seidel (1995) referem a qualidade do embrião como um fator primordial para se obter altas taxas de prenhez e embriões com escores de qualidade pobres (≥3) dificilmente se desenvolvem
até estádios tardios. De modo similar, a sincronização entre doadoras e receptoras e as condições nutricionais e uterinas das doadoras e receptoras também são imputados como influentes sobre a taxa de prenhez e perdas embrionárias (HINRICHS, 2013), embora também se sugira que exista uma janela grande para o estabelecimento de gestação após transferência de embriões em receptoras assíncronas (WILSHER et al., 2010). No presente trabalho, os embriões utilizados apresentavam boa qualidade (grau 1), as fêmeas estavam em boas condições nutricionais e a sincronização manteve-se dentro do intervalo -3 a +1 dia, características que podem ter contribuído para o bom resultado encontrado.
A utilização de benzoato de estradiol e progesterona já havia sido reportado anteriormente em programas de transferência de embrião equino (ROCHA-FILHO et al., 2004; KAERCHER et al., 2013; BOTELHO et al., 2015). As pesquisas têm revelado que tanto a progesterona de curta duração, como a de longa duração isoladamente ou em associação ao benzoato de estradiol permitem a manutenção da gestação de receptoras anovulatórias equinas após a transferência de embriões, com distintas taxas de prenhez. Na presente investigação a utilização de 5 mg de benzoato de estradiol associado a 1500 mg de progesterona de longa duração possibilitou que 55% das receptoras mantivessem a gestação a termo, resultado semelhante ao de Kaercher et al. (2013) que utilizaram 400 mg de progesterona de longa duração. Por outro lado, empregando doses crescentes de benzoato de estradiol (2-5 mg) associado a 1500 mg de progesterona de longa duração, Botelho et al. (2015) obtiveram taxas de gestação superiores nas receptoras submetidas a este protocolo quando comparadas às controle que estavam na fase de transição do ciclo estral. Em vista disso,
embora os resultados do presente trabalho sejam animadores, correspondem a número limitado de animais. Acreditamos que uma investigação mais aprofundada incrementando o número de fêmeas e ampliando o intervalo de colheita dos embriões contribuiria para ratificar a eficiência deste protocolo para utilização na rotina reprodutiva de equinos.
CONCLUSÃO
Conclui-se com esse trabalho que o protocolo hormonal utilizando 5mg de benzoato de estradiol associado a progesterona de longa ação foi viável, seguro e eficiente para a transferência de embriões em receptoras equinas em anestro estacional, possibilitando a obtenção de taxas de prenhez semelhantes às de animais com ciclicidade fisiológica.
REFERÊNCIAS
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Hinrichs, K. 2013. Assisted Reproduction Techniques in the Horse. Reproduction,
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Kaercher F, Kozicki LE, Camargo CE, Weiss RR, Santos IW, Muradas PR, Bertol MAF. 2013. Embryo transfer in anovulatory recipient mares treated with estradiol benzoate and long-acting progesterone. Journal of Equine Veterinary Science. 33: 205–209. McKinnon AO, Squires EL. 1988. Morphologic asscessment of equine embryo. Journal
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