DIVERSIDADE DE RIZÓBIO DA UNIDADE DE CONSERVAÇÃO PARQUE NACIONAL DE UBAJARA NO ESTADO DO CEARÁ. Ceará

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₄₁ DIVERSIDADE DE RIZÓBIO DA UNIDADE DE CONSERVAÇÃO PARQUE

NACIONAL DE UBAJARA NO ESTADO DO CEARÁ

Leandro Lopes Silva1, Marcelo de Sousa Pinheiro2, Juliani Barbosa de Sousa3, Suzana Cláudia Silveira Martins4, Claudia Miranda Martins4

1

Bolsista de Iniciação Científica da Universidade Federal do Ceará 2

Doutorando em Agronomia-Fitotecnia da Universidade Federal do Ceará 3

Mestranda em Ecologia e Recursos Naturais da Universidade Federal do Ceará 4

Professora do Departamento de Biologia da Universidade do Ceará, Fortaleza-Ceará (claudia.miranda.martins@gmail.com)

Recebido em: 30/09/2014 – Aprovado em: 15/11/2014 – Publicado em: 01/12/2014

RESUMO

Os micro-organismos responsáveis pela fixação biológica de nitrogênio através da simbiose estabelecida com as plantas leguminosas são as bactérias genericamente conhecidas como rizóbios. O nitrogênio fixado através dessa simbiose é disponibilizado para as plantas de uma forma absorvível e em quantidades necessárias para o seu crescimento. A diversidade desses micro-organismos no solo atua como uma fonte de recursos genéticos para seleções de isolados adaptados às diversas condições e que sejam capazes de estabelecer simbiose eficiente. As condições edafoclimáticas do Nordeste são susceptíveis de exercer um efeito sobre a diversidade de rizóbios. O objetivo deste trabalho foi isolar e avaliar características fenotípicas de rizóbios da Unidade de Conservação “Parque Nacional de Ubajara”. Após o isolamento e autenticação das culturas, as mesmas foram submetidas à caracterização cultural, resistência intrínseca a antibióticos, tolerância à salinidade e temperaturas elevadas. Das 29 estirpes de rizóbio, 17 apresentaram crescimento rápido com acidificação do meio de cultura, colônias brancas, diâmetro maior que 2 mm e produção variável de muco. Doze estirpes foram resistentes pelo menos a dez antibióticos. A partir de 1 g de NaCl/L houve redução no crescimento de 27,58% das estirpes, com 10 g ocorreu a inibição do crescimento de 24% e 50 g foi capaz de inibir o crescimento de mais de 90% das estirpes. A temperatura de 41º C inibiu o crescimento de 50% das estirpes, e a 43° C e 45º C foi inibido o crescimento de 90%. As estirpes LAMAB-86 e LAMAB-93 destacaram-se por apresentar tolerância e resistência aos parâmetros avaliados.

PALAVRAS-CHAVE: bactérias diazotróficas, fixação biológica de nitrogênio, Leguminosae.

DIVERSITY OF RHIZOBIUM FROM CONSERVATION UNITY OF NATIONAL UBAJARA PARK IN THE CEARÁ STATE

ABSTRACT

The microrganisms responsible for biological nitrogen fixation through the established symbiosis with leguminous plants are generally bacteria known as rhizobia. The atmospheric nitrogen fixed by this symbiosis is available to the plants of an absorbable form and in quantities necessary for their growth. Soil and climatic conditions in the Northeast are likely to have an effect on the diversity of rhizobia.

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₄₂ The diversity of these microrganisms in the soil acts as a source of genetic resources for selection of isolates adapted to different conditions and are able to efficiently establish symbiosis. The aim of this work was to isolate and assess phenotypic characteristics of rhizobia Conservation Unit "Parque Nacional de Ubajara". Soil samples were collected from them was made the isolation and authentication of cultures that underwent cultural characterization; intrinsic resistance to 14 antibiotics; salinity tolerance in Petri plates satisfactorily YMA with altered composition and tolerance to high temperatures. Were obtained 29 strains of Rhizobium and 17 strains grew rapidly with acidification of the culture medium, white colonies larger than 2 mm and mucus production variable diameter were obtained. Twelve rhizobia strains were resistant to at least ten of antibiotics. From 1 g of NaCl/L decreased the growth of the strains 27.58%, NaCl 10 g/L growth inhibition of 24% of the strains of NaCl and 50 g/L occurred was able to inhibit the growth of more than 90% of the strains. The temperature rise of strains inhibited growth, temperature of 41° C inhibited the growth of 50% of the strains, and temperatures of 43° C and 45° C inhibited the growth of 90% of the strains. Strains LAMAB-86-93 LAMAB highlighted by having tolerance and resistance parameters evaluated.

KEYWORDS: diazotrophic bacteria, biological nitrogen fixation, Leguminosae

INTRODUÇÃO

Devido à importância do nitrogênio para a produtividade das culturas, seu alto custo e efeitos ao ambiente associados com o uso de fertilizantes químicos, micro-organismos fixadores de nitrogênio têm atraído grande atenção (LYRA et al., 2013). O mundo está focado no sentido de reduzir o uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos, devido também ao seu alto custo de produção e transporte (SINGH et al., 2013). A simbiose entre leguminosas e bactérias fixadoras de nitrogênio atmosférico é amplamente aceita como alternativa à fertilização química (FREITAS et al., 2007), fazendo com que a seleção de novas cepas capazes de fixar nitrogênio atmosférico, quando em simbiose com leguminosas, venha se tornando alvo de pesquisas (FERREIRA et al., 2013).

A fixação biológica de nitrogênio desempenha um papel importante na manutenção da fertilidade dos solos em sistemas agrícolas e agroflorestais, áreas de pastagens ou para recuperação de áreas degradadas, uma vez que contribui com quantidades significativas de nitrogênio necessárias para o crescimento das plantas (FLORENTINO et al., 2012; ALMEIDA et al., 2013). Quando comparada ao uso de fertilizantes nitrogenados, a fixação biológica apresenta vantagens como baixo custo e abundância do nitrogênio na atmosfera (NASCIMENTO et al., 2010), além de contribuir para reduzir o uso e o consequente impacto dos agroquímicos no meio ambiente (ALCANTARA et al., 2014).

Os rizóbios pertencem a um grupo de bactérias do solo que são capazes de formar nódulos em raízes de leguminosas, estas bactérias apresentam uma grande diversidade taxonômica e fenotípica (FERNANDES JÚNIOR et al., 2012). A avaliação das características culturais é um dos primeiros passos para a identificação de novos grupos taxonômicos de micro-organismos (CHAGAS JÚNIOR et al.,2010).

A diversidade de solo brasileiro e as condições edafoclimáticas são fatores importantes para selecionar estirpes capazes de estabelecer relações simbióticas eficientes com diversas leguminosas em elevadas temperaturas, altas concentrações de sais, e baixos valores de pH (FLORENTINO et al., 2010). Além dos estresses abióticos, essas bactérias competem com uma grande diversidade de

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₄₃ micro-organismos presentes no solo para obtenção de recursos e superação das relações antagônicas, onde uma ampla gama de antibióticos estão envolvidos (LONGATTI et al., 2013).

As mudanças na diversidade de rizóbios no solo podem ser resultado das profundas modificações impostas ao ambiente do solo pela aplicação de agroquímicos, por perturbação física, ou pela própria cultura implantada na área (COUTINHO et al., 1999). Um dos métodos mais utilizados para avaliar a diversidade desses micro-organismos nos solos é a utilização de plantas-isca, cuja principal característica é a promiscuidade, ou seja, devem ser capazes de nodular com uma grande diversidade de espécies (MELLONI et al., 2006).

Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi isolar, caracterizar fenotipicamente estirpes de rizóbio da Unidade de Conservação “Parque Nacional de Ubajara”.

MATERIAL E MÉTODOS

Origem dos isolados

O Parque Nacional de Ubajara se localiza no Planalto da Ibiapaba, ao noroeste do Estado do Ceará a 320 km de Fortaleza, limitando-se com o Estado do Piauí. A área do parque está compreendida entre a latitude 3°46’ S e longitude 40°54’ W com altitudes que variam de 800 a 1.100 m (CUNHA & ARAÚJO, 2014). O parque possui o clima mais ameno dentro de uma região semiárida, a temperatura média é de 20 a 22° C no Planalto da Ibiapaba e em torno de 24 e 26° C na depressão periférica. O parque apresenta dois períodos climáticos distintos: no primeiro semestre do ano, mais chuvoso e frio, e o segundo semestre praticamente sem chuvas e com temperaturas mais elevadas. A média pluviométrica em torno de 1.436,3 mm por ano (IBAMA, 2006).

Coleta de solo

As coletas foram realizadas no Parque Nacional de Ubajara no período seco de 20 a 24 de agosto de 2012. Na área experimental, de aproximadamente 400 m2, foram selecionadas 13 diferentes gêneros/espécies de arbóreas da família Fabaceae/Leguminosae. Foi coletada uma amostra de solo rizosférico de cada leguminosa, equidistantes entre si, composta de três sub-amostras tomadas na projeção da copa ao redor da árvore utilizando-se uma enxada de jardinagem (LUCENA et al., 2013). Esse conjunto (três pontos/leguminosa) constituiu amostras compostas, que foram acondicionadas em sacos plásticos etiquetados, conservadas em caixas de isopor com gelo e encaminhadas para o Laboratório de Microbiologia Ambiental (LAMAB) do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará (UFC).

Obtenção, isolamento e purificação das colônias

Para a obtenção dos isolados a partir das amostras de solo, utilizou-se o feijão-caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp) cv. “setentão” como planta-isca. Essas amostras foram transferidas para copos de 300 mL, adotando-se duas repetições, em seguida plantou-se três sementes de feijão-caupi desinfestadas em cada vaso. Após cinco dias do plantio foi feito o desbaste deixando apenas uma planta por vaso. Decorrido o período de 35 dias foram retirados os nódulos das raízes e acondicionados em potes com sílica e levados ao Laboratório de Microbiologia

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₄₄ Ambiental (LAMAB) do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará (UFC).

Os nódulos coletados foram reidratados com água destilada por uma hora e em seguida desinfestados com álcool etílico absoluto por 30 segundos e solução de hipoclorito de sódio 5% por três minutos, depois lavados com água destilada estéril cinco vezes. Após a desinfestação, os nódulos foram macerados em placas de Petri contendo meio ágar extrato de levedura manitol (YMA) (VINCENT, 1970) adicionado do corante vermelho congo, e incubados por sete dias. Após esse período foi realizada a purificação dos isolados pela diferenciação das colônias através da cor, até obtenção da cultura pura de cada isolado. Os isolados de rizóbio possuem colônias com coloração branca ou rósea no meio YMA com vermelho congo, e os contaminantes coloração vermelha.

Autenticação dos isolados

Os isolados obtidos foram autenticados mediante plantio e inoculação em feijão-caupi (HUNGRIA & ARAÚJO, 1994). Foi preparado um substrato composto por areia e vermiculita na proporção de 2:1 sendo o mesmo esterilizado em autoclave a 121º C durante uma hora. O plantio foi feito em copos de 300 mL adotando-se três repetições por isolado. Antes do plantio as sementes foram desinfestadas, por imersão em etanol 95% por 30 segundos, em seguida foram imersas em hipoclorito de sódio (5% por cinco minutos), e logo após, lavadas seis vezes em água destilada esterilizada.

Efetuou-se o plantio de três sementes por vaso, e após sete dias foi realizado o desbaste deixando uma planta por vaso. Para preparo do inóculo adicionou-se 100 mL do meio YM (extrato de levedura manitol) em erlenmeyer, sendo em seguida adicionada a cultura permanecendo sob agitação orbital a 150 rpm por três a seis dias até observação do crescimento da cultura.

Aos três dias do plantio foram aplicados 3 mL do inóculo por planta e aos 35 dias foram verificadas as raízes para observação de presença de nódulos radiculares e de leghemoglobina no interior dos nódulos, que indica atividade da enzima nitrogenase. As estirpes autenticadas foram incorporadas a coleção de culturas de bactérias diazotróficas do Laboratório de Microbiologia Ambiental (LAMAB) do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará (UFC). Caracterização cultural

As estirpes autenticadas foram repicadas em placas de Petri contendo meio de cultura YMA adicionado do indicador de pH azul de bromotimol para realização da caracterização cultural.

Foram analisadas características como tempo de crescimento das colônias, em dias, segundo NÓBREGA et al. (2004a) as estirpes que apresentaram crescimento significativo em até três dias de incubação são classificadas como de crescimento rápido e as que apresentaram crescimento maior após três dias de incubação, são classificadas como de crescimento lento. Alteração do pH do meio após o crescimento das estirpes é um parâmetro de suma importância, sendo aquelas em que o meio adquiriu a coloração amarela, classificadas como acidificantes e as que o meio adquiriu coloração azul, alcalinizantes.

Com relação a produção do muco, as estirpes foram classificadas como viscosa, seca, gomosa e butírica. Quanto ao diâmetro das colônias em milímetros (mm), as mesmas foram classificadas como puntiforme, quando as colônias apresentam diâmetro inferior a 0,5 mm, menor que 1 mm, igual a 1 mm, maior que 1

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₄₅ mm, menor que 2 mm, e maior que 2 mm. A coloração das colônias foi classificada como branca ou amarela (MARTINS et al., 1997).

Tolerância à salinidade

Os isolados foram cultivados em tubos rosqueados contendo caldo extrato de levedura manitol (YM), que permaneceram em agitação orbital por sete dias, a 125 rpm. Após esse período foi retirado 1 mL do caldo com suspensão de células dos tubos e transferidos para microtubos estéreis. Os microtubos foram centrifugados por quatro minutos a 8000 rpm e em seguida, descartado o sobrenadante. As células foram ressuspensas em solução salina 0,85%. O processo de centrifugação e ressuspensão de células foi repetido três vezes (TRANNIN et al., 2001). O objetivo foi a remoção de resíduos do meio de cultura do inóculo que poderia resultar num falso crescimento positivo (NÓBREGA et al., 2004b). Após esse procedimento foi retirado 0,1 mL do microtubo contendo células em solução salina e inoculados em placas de Petri contendo meio YMA modificado com adição de NaCl. As concentrações utilizadas em cada tratamento foram 1; 2; 2,5; 3; 10; 20; 30 e 50 g de NaCl/L. Foram utilizadas placas com meio YMA sem alteração na sua composição como controle. Adotou-se três repetições para cada tratamento. As placas inoculadas foram incubadas por 10 dias em estufas incubadoras B.O.D. (Biochemical oxygen demand) a 28 °C. Em seguida ava liou-se a intensidade do crescimento das estirpes em cada tratamento e comparados com a intensidade de crescimento das estirpes cultivadas no meio sem alteração da composição.

Resistência intrínseca a antibióticos

As estirpes foram testadas utilizando o kit POLISENSIDISC da DME (Diagnósticos Microbiológicos Especializados) com 14 antibióticos para bactérias Gram-negativas, sendo os seguintes antibióticos: Amicacina (AMI 30), Amoxicilina (AMC 30), Ampicilina (AMP10), Aztreonam (ATM 30), Cefalotina (CFL 30), Cefepime (CPM 30), Cefoxitina (CFO 30), Ceftadizima (CAZ 30), Ceftriaxona (CRO 30), Ciprofloxacina (CIP 05), Cloranfenicol (CLO 30), Gentamicina (GEN 10), Piperacilina (PIT 110), Tetraciclina (TET 30).

As estirpes foram cultivadas em tubos contendo caldo YM, que permaneceram em agitação orbital por sete dias, a 125 rpm. Posteriormente foi inoculado 100 µL do caldo com células em suspensão, em placas de Petri contendo meio extrato de levedura triptona (TY) (BERINGER, 1974) e, em seguida, espalhado por toda a superfície da placa. Foram utilizados três discos de papel impregnados com antibióticos por placa, adotando três repetições. As estirpes foram incubadas em B.O.D. por sete dias a 28 °C. Após esse período foi observado a presença ou ausência de halo de inibição ao redor dos discos e feito a medição dos halos utilizando paquímetro digital. Os valores encontrados foram comparados na tabela padrão, sendo as estirpes classificadas como resistentes ou sensíveis.

Teste de resistência a elevadas temperaturas

Para avaliar a capacidade das estirpes de rizóbio em crescer sob diferentes temperaturas, as mesmas foram inoculadas em placas de Petri contendo meio de cultura YMA, foram adotadas três repetições por estirpe para cada teste, e em seguida incubadas em B.O.D. por uma semana. O controle foi incubado a 28° C por uma semana. As temperaturas utilizadas no experimento foram: 39°, 41°, 43º e 45° C. Após esse período observou-se se houve ou não crescimento das estirpes.

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₄₆ Utilizou-se como referência para os testes realizados as estirpes padrão: BR 3471 (Cupriavidus taiwanensis), BR 3486 (Burkholderia phymatum), INPA 03-11B - Bradyrhizobium sp (BR 3301), UFLA 03-84-Bradyrhizobium sp (BR 3302), BR 3267 (Bradyrhizobium sp), BR 3262 (Bradyrhizobium sp), BR 2003 e BR 2801 (Bradyrhizobium elkanii).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Caracterização cultural

Foram obtidos 42 isolados a partir das amostras de solo, e destes, 29 isolados foram capazes de formar nódulo nas raízes das plantas, sendo confirmados como estirpes de rizóbio e 13 não foram capazes de formar nódulos.

A caracterização cultural das colônias permite a verificação da diversidade de micro-organismos que foram isolados (ALMEIDA et al., 2013). Das 29 estirpes nativas, 65,52% acidificaram o meio de cultura (FIGURA 1), 27,58% não modificaram o pH do meio permanecendo neutro e 6,9% alcalinizaram o meio. Em relação à velocidade de crescimento 37,93% das estirpes apresentaram um crescimento lento, enquanto 62,07% apresentaram crescimento rápido. Quanto à consistência do muco, 44,83% das estirpes apresentaram consistência viscosa, 51,72% butírica e 3,44% consistência gomosa, não foi observada a consistência seca do muco em nenhuma das estirpes. Para o diâmetro médio das colônias, observou-se que 75,86% apresentaram diâmetro maior que 2 mm, 17,24% menor que 2 mm, 3,44% maior que 1 mm e 3,44% igual a 1 mm. A coloração branca do muco foi observada em 68,96% das estirpes e coloração amarela em 31,04%.

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₄₇ Os resultados obtidos são semelhantes aos de MEDEIROS et al. (2009) que obtiveram isolados de rizóbio no Rio Grande do Norte, proveniente de nódulos de feijão-caupi e FREITAS et al. (2007) que ao isolarem rizóbios de nódulos de raízes de jacatupé provenientes do Agreste e do Sertão de Pernambucano, observaram que de uma forma geral os isolados apresentavam crescimento rápido, acidificando o meio de cultura. Em contrapartida, PINHEIRO et al. (2014) ao isolarem estirpes de regiões semiáridas do Ceará e do Rio Grande do Norte observaram que 86,1% apresentaram velocidade de crescimento lenta. Essa característica é geralmente associada a estirpes do gênero Bradyrhizobium (MELLONI et al., 2006).

A predominância de colônias com coloração branca e produção variável de muco foram observadas por SANTOS et al. (2007) em isolados de nódulos das espécies Arachis, Stylosanthes e Aeschynomene em Pernambuco assim como, por TEIXEIRA et al. (2010) em nódulos das espécies Cratylia mollis Mart. ex Benth, Calliandra depauperata Benth e Mimosa tenuiflora (Willd.) onde a maioria dos isolados formaram colônias em até dois dias.

Para as oito estirpes padrão que foram usadas como modelo, quatro destas (50%) acidificaram o meio de cultura, uma (12,5%) alcalinizou o meio e três (37,5%) não alteraram o pH do meio. Sete estirpes (87,5%) apresentaram crescimento lento e uma estirpe (12,5%) apresentou crescimento rápido. Em relação ao muco quatro estirpes (50%) apresentaram colônias com muco viscoso e quatro (50%) com butírico. Para o diâmetro das colônias, três (37,5%) apresentaram diâmetro maior do que 1 mm, e cinco (62,5%) apresentaram diâmetro maior do que 2 mm. Todas as estirpes apresentaram colônias de coloração branca.

Considerando somente as 19 estirpes nativas que acidificaram o meio de cultura, 17 destas apresentam crescimento rápido e duas apresentam crescimento lento. Das oito estirpes que não alteraram o pH do meio de cultura, todas apresentaram crescimento lento. Das duas estirpes que alcalinizaram o meio, uma apresentou crescimento lento e a outra crescimento rápido.

Rizóbios de crescimento rápido que acidificam o meio de cultura são mais comuns em regiões semiáridas, característica que indica uma capacidade maior de adaptação a essas condições. Essa característica constitui uma estratégia de sobrevivência e eficiência dos rizóbios de regiões tropicais áridas (FREITAS et al., 2007; SANTOS et al., 2007; MEDEIROS et al., 2009).

Das estirpes padrão, no total de oito, quatro apresentaram crescimento lento com acidificação do meio de cultura, três apresentaram crescimento lento sem alteração do pH do meio e uma apresentou crescimento rápido com alcalinização do meio de cultura.

Com os dados obtidos através da caracterização cultural, foi possível gerar um dendrograma de similaridade. Ao ser considerada uma similaridade de 64% foi possível agrupar as estirpes em nove grupos diferentes (FIGURA 2).

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₄₈ FIGURA 2: Dendrograma de caracterização cultural, gerado a partir do agrupamento

de 29 estirpes oriundas de nódulos radiculares de feijão-caupi e as estirpes padrões BR 3471, BR 3486, BR 3301, BR 3302, BR 3267, BR 3262, BR 2003 e BR 2801, método de agrupamento UPGMA. Gr: Grupo referente; N: Número de estirpes que compõem o grupo; NEP: Número de estirpes padrão no grupo; Ac.: Ácido; Ne.:Neutro; Al.: Alcalino; Le.: Lento; Ra.: Rápido; V.: Viscosa: S.: Seca; G.: Gomosa; B.: Butírica; P.: Puntiforme: Br.: Branca; A.: Amarela; L.: Lisa; R.: Rugosa.

A diversidade fenotípica das estirpes nativas possibilita a identificação de diferentes grupos, alguns deles com similaridade próxima às estirpes padrão (SILVA

et al., 2007) e outras bastante distintas. Devido à dissimilaridade entre os grupos,

pode-se afirmar que a comunidade de estirpes nativas que nodulam o feijão-caupi é bem diversificada (CHAGAS JÚNIOR et al., 2009), e que confirma a baixa especificidade do feijão-caupi com os rizóbios, tornando-a uma excelente planta-isca para avaliação da diversidade (MELLONI et al., 2006).

Tolerância à salinidade

Considerando somente a presença ou ausência de crescimento microbiano, todas as estirpes nativas e as estirpes padrão conseguiram crescer até a concentração de 3 g de NaCl/L (FIGURA 3). A partir de 10 g de NaCl/L o crescimento começou a ser inibido apresentando 75,86% de crescimento para as estirpes nativas e 37,5% de crescimento para as estirpes padrão, 24,14% de crescimento nos meios suplementados com 20 g de NaCl/L para as estirpes nativas e 12,5% de crescimento para as estirpes padrão. Das estirpes nativas, 10,35% conseguiram crescer na concentração de 30 g de NaCl/L, enquanto que essa mesma concentração inibiu o crescimento de todas as estirpes padrão. Somente 6,89% das estirpes nativas (LAMAB-105 e LAMAB-110) foram capazes de crescer no tratamento com 50 g de NaCl/L.

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₄₉ FIGURA 3: Crescimento das estirpes em meio YMA modificado.

Em testes de resistência à salinidade realizados por FREITAS et al. (2007) em isolados de rizóbio provenientes do agreste do sertão de Pernambuco, todos os isolados cresceram rapidamente até o nível de 12 g/L de sal no meio de cultura. A sensibilidade ao sal foi verificada a partir da adição de 16 g/L onde três dos 24 isolados não cresceram. NÓBREGA et al. (2004a) que estudaram 12 estirpes de bactérias que nodulam leguminosas, isoladas de diferentes locais e espécies vegetais, observaram que os padrões de crescimento de todas as estirpes foram reduzidos com o aumento da concentração de NaCl no meio de cultura. As concentrações máximas toleradas de NaCl pelas estirpes, variaram de 2 até 30 g/L. Não houve nenhuma estirpe que cresceu na concentração de 50 g de NaCl/L. Em isolados de raiz e caule de Discolobium spp CAMPOS et al. (2010) observaram que as diferentes concentrações de 0, 15 e 30 g de NaCl/L não afetaram significativamente o crescimento dos isolados, indicando que, provavelmente há relação entre tolerância in vitro à salinidade e origem dos microssimbiontes. A habilidade de crescimento dos isolados de rizóbios nativos em altas concentrações de sal pode dar alta competitividade na rizosfera para sobrevivência e no processo de nodulação das raízes das plantas que também estão em condições particulares de altas concentrações salinas no solo (KENENI et al., 2010).

Das 29 estirpes nativas, mais de 70% foram capazes de crescer a 10 g e a 20 g de NaCl/L apresentando crescimento rápido. Em geral, espécies de rizóbio de crescimento rápido são mais tolerantes a altas concentrações salinas em meio de cultura, quando comparadas a espécies de crescimento lento, pois produzem mais polissacarídeos extracelulares, que envolvem as células bacterianas, diminuindo o contato da superfície celular com o meio salino, proporcionando maior resistência da célula bacteriana ao efeito osmótico (ELSHEIKH, 1998; NÓBREGA et al., 2004a). Resistência intrínseca a antibióticos

Doze das 29 estirpes nativas (41,3%) apresentaram resistência pelo menos a dez antibióticos testados (FIGURA 4), entretanto nenhum desses apresentou resistência a todos os antibióticos. Das estirpes padrão a BR 3302 foi resistente a todos os antibióticos testados, os demais apresentaram resistência no mínimo a sete antibióticos. O antibiótico em que a maioria das estirpes nativas apresentou

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₅₀ resistência foi GEN 10, enquanto todas as estirpes padrão apresentaram resistência para o CFL 30.

FIGURA 4: Percentual de estirpes quanto à resistência aos antibióticos.

As 29 estirpes nativas apresentaram comportamento diferente quanto à resistência intrínseca a antibióticos, onde 12 estirpes foram resistentes a pelo menos dez dos antibióticos testados (LAMAB-83, LAMAB-85, LAMAB-86, LAMAB-88, LAMAB-89, LAMAB-90, LAMAB-91, LAMAB-93, LAMAB-94, LAMAB-95, LAMAB-96 e LAMAB-97), e 11 destas apresentaram elevada produção de muco, quando comparado com as demais. Segundo MARTINS et al. (1997) existe uma correlação entre a resistência aos antibióticos e produção de polissacarídeos.

A produção de polissacarídeos altera a permeabilidade das células, e também podem agir como uma barreira protetora, tornando as estirpes mais resistentes a estresses bióticos e abióticos, permitindo a adaptação e sobrevivência do rizóbio em condições edafoclimáticas adversas (LYRA et al., 2013; MEDEIROS et al., 2009).

Isolados de rizóbio de feijão-caupi oriundos de diferentes regiões do Nordeste foram estudados por XAVIER et al. (1998) que observaram uma grande diversidade em relação a resistência intrínseca aos antibióticos e sugeriram que essa resistência pode estar relacionada com a origem dos isolados e a presença de outros micro-organismos no solo que possuem efeito antagônico, tornando a presença de resistência uma estratégia de sobrevivência importante.

Resistência a elevadas temperaturas

A temperatura ideal para o crescimento de rizóbios situa-se entre 28º C. A partir do primeiro tratamento, em que a temperatura de incubação foi alterada para 39° C houve uma redução no crescimento das estirpes nativas e das estirpes padrão, onde 68 % e 62 % foram capazes de crescer, respectivamente (FIGURA 5).

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₅₁ FIGURA 5: Percentual de estirpes de rizóbio que cresceram nas

temperaturas testadas.

Quando avaliados na temperatura de 41° C o número d e micro-organismos capazes de crescer caiu para 50 %, tanto para estirpes nativas como para estirpes padrão. Nas temperaturas de 43 e 45° C apenas 10 % das estirpes nativas (LAMAB-86, LAMAB-93 e LAMAB-101) foram capazes de crescer, enquanto 50% das estirpes padrão ainda cresceram a 43° C e 25% a 45° C. Resultados estes contrastantes com os obtidos por FERNANDES JÚNIOR et al. (2012) que ao estudarem isolados de rizóbio oriundos de nódulos de raiz de guandu (Cajanus cajan (L.) Millsp.) em solos do Rio de Janeiro, observaram que 92 % dos isolados foram capazes de crescer quando incubados a 42° C.

Na região de Meknes-Tafilalet no Marrocos MESSAOUD et al. (2014) isolaram 12 estirpes de rizóbio de diferentes localizações, destas, dez foram capazes de crescer a 40º C. XAVIER et al. (2007) sugerem que características associadas com o local de origem do micro-organismo podem estar relacionadas com adaptação de pressões específicas do ambiente.

Diversidade de rizóbio

Com os resultados obtidos a partir da caracterização cultural, tolerância à salinidade, resistência intrínseca a antibióticos e tolerância à temperatura elevadas, foi possível construir um dendrograma de similaridade (FIGURA 6), e considerando uma similaridade de 64 % foi possível a formação de nove grupos.

O grupo I e II apresentaram estirpes sensíveis a maioria dos antibióticos testados, quase todas as estirpes foram capazes de crescer até 41° C, 10 g de NaCl/L, e com um representante do grupo I capaz de crescer a 50 g de NaCl/L. O grupo III apresentou estirpes resistentes a quatro antibióticos, que cresceram até 20 g de NaCl/L e até 41° C, uma estirpe cresceu a 45° C. O grupo IV apresentou uma única estirpe com resistência a dois antibióticos, com crescimento até 50 g de NaCl/L e sem crescimento a 39° C. O grupo V aprese ntou estirpes com resistência entre dez e 11 antibióticos, todos com crescimento até 10 g, um até 30 g de NaCl/L, redução de crescimento na temperatura de 39° C. O g rupo VI apresentou estirpes com resistência entre nove e 13 antibióticos, somente uma cresceu até 10 g de NaCl/L e crescimento reduzido em 39° C. O grupo VI I apresentou estirpes com resistência entre 12 e 14 antibióticos, todos com crescimento a 10 g de NaCl/L, uma até 20 g, todas cresceram a 45° C. O grupo VIII apr esentou estirpes com resistência

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₅₂ entre sete e nove antibióticos, uma com crescimento até 3 g de NaCl/L e 43° C, e outra com crescimento até 20 g de NaCl/L e 45° C.

O grupo IX apresentou uma única estirpe com resistência a seis antibióticos, com crescimento até 10 g de NaCl/L e inibida a 39° C. A caracterização fenotípica fornece dados que são necessários para o conhecimento das estirpes nativas, principal recurso para o trabalho na área de biotecnologia (CHAGAS JÚNIOR et al., 2010). O agrupamento facilita o desenvolvimento das etapas seguintes, como a seleção de rizóbio eficiente para a fixação do nitrogênio em diversas leguminosas (CHAGAS JÚNIOR et al., 2009).

FIGURA 6: Dendrograma de caracterização cultural, resistência intrínseca a antibióticos, tolerância à salinidade e temperatura das estirpes de rizóbio gerado a partir do agrupamento de 29 estirpes oriundas de nódulos radiculares de feijão-caupi e as estirpes padrões BR 3471, BR 3486, BR 3301, BR 3302, BR 3267, BR 3262, BR 2003 e BR 2801, método de agrupamento UPGMA.

De todas as estirpes nativas avaliadas, a maioria formou grupos em que apresentaram respostas positivas para resistência ou tolerância em geral para um dos parâmetros avaliados, algumas estirpes apresentaram desempenho positivo para mais de um dos parâmetros testados, o que as torna interessante para estudos

ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014 ₂₁₅₃ posteriores. As estirpes LAMAB-86 e LAMAB-93 foram capazes de crescer a 45° C, toleraram a concentração de 10 g de NaCl/L e foram resistentes a pelo menos 12 antibióticos.

CONCLUSÃO

Dentre as 29 estirpes obtidas, as estirpes LAMAB-86 e LAMAB-93 destacaram-se por apresentar tolerância e resistência aos parâmetros avaliados, demonstrando melhor adaptação a importantes estresses abióticos existentes na região Nordeste.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem aos órgãos de fomento pelos recursos obtidos através do Edital Chamada CNPq/ICMBio - Nº 13/2011 - Seleção Pública de Propostas para a pesquisa sobre o manejo, uso e conservação da biodiversidade e a proteção do patrimônio cultural e dos recursos naturais em unidades de conservação federais e seu entorno no bioma Caatinga.

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