UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA

(1)

ESTUDOS DA TOXICIDADE DA CEPA DE Microcystis aeruginosa RST9501

DA LAGOA DOS PATOS SOBRE CLADOCERA

NADE JANARA COIMBRA MONTEIRO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ecologia.

Área de concentração: Ecologia Aquática

Orientação: Profa. Dra. Maria Beatriz Bohrer-Morel

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA

ESTUDOS DA TOXICIDADE DA CEPA DE Microcystis aeruginosa RST9501

DA LAGOA DOS PATOS SOBRE CLADOCERA

NADE JANARA COIMBRA MONTEIRO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ecologia.

Área de concentração: Ecologia Aquática

Orientação: Profa. Dra. Maria Beatriz Bohrer-Morel

Co-orientação: Prof. Dr. João Sarkis Yunes Banca examinadora:

Profa. Dra. Odete Rocha Dra. Catarina Pedrozo

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AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal do Rio Grande do Sul e ao Programa de Pós graduação em Ecologia pelo apoio e infra estrutura.

À CAPES, pelo suporte financeiro através da bolsa de estudo.

À Professora Maria Beatriz Bohrer-Morel, pela orientação, amizade e confiança.

Ao Professor João Sarkis Yunes, pela dedicação e interesse.

À colega Laura Roberta Utz pela amizade e ajuda na obtenção da bibliografia.

Aos meus colegas e amigos Carina Portela, Lúcia Rodrigues, Marianna Pilla D’Incao, Régis Fontana, Ronaldo Padilha, pelo carinho, apoio e compreensão nas tantas horas que deixei de estar no laboratório. Em especial ao Alexandre Arenzon, pela paciência e pelas sugestões e ao Carlos Eduardo Güntzel pelas correções e pelas horas a mais trabalhadas na minha ausência.

À amiga e colega Aline Beatrici, pela dedicação e grande ajuda na realização deste trabalho.

À Isadora Melo e Lisiane Leal, pela ajuda nos cultivos e nas dosagens de Microcistina.

Ao colega Eudimar N. de Carvalho, pela amizade, troca de informações e de bibliografias.

Ao Dr. Pedro Zagatto, pelas sugestões na elaboração do projeto.

Ao Sandro, Yogui, Vilma e Paulo, pela troca de informações e sugestões.

Ao laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias (NPPN) da UFRJ, coordenado pela professora Sandra Azevedo, por ceder a Cepa NPJT-01, do seu banco de cultivos, e em especial ao Marcelo Manzi Marinho, pelo pronto apoio e troca de informações.

À minha mãe, pelo exemplo, e ao meu pai, pelo carinho e pelo avô maravilhoso que tem sido.

Aos meus filhos, Joana e Gustavo, pelo seu amor e por todas as horas que não estivemos juntos. Ao Celso, pelo carinho, compreensão e paciência e por ser também, de alguma maneira, responsável por tudo isso.

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SUMÁRIO LISTA DE TABELAS... v LISTA DE FIGURAS... vi

LISTA DE APÊNDICES... ix

RESUMO... xv

ABSTRACT... xvi

1 INTRODUÇÃO 1 2 OBJETIVOS 8 2.1 GERAL 8 2.2 ESPECÍFICOS 8 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 9 3.1 M. AERUGINOSA 9 3.1.1 FLORAÇÕES 10 3.1.2 FLORAÇÕES NA LAGOA DOS PATOS, RS 12 3.1.3 CONSEQÜÊNCIAS DA PRESENÇA DE FLORAÇÕES DE CIANOBACTÉRIAS 13 3.2 TESTES DE TOXICIDADE 16 3.2.1 ORGANISMOS-TESTE 17 3.2.1.1 Cladocera 17 4 MATERIAL E MÉTODOS 20

4.1 CULTIVO E MANUTENÇÃO DAS CULTURAS DE M. AERUGINOSA 20

4.1.1 ORIGEM 20

4.1.2 MANUTENÇÃO DAS CULTURAS 22

4.1.3 BIOVOLUME DAS CÉLULAS 22

4.2 CULTIVO E MANUTENÇÃO DOS ORGANISMOS-TESTE – D. SIMILIS E C. DUBIA 23

(5)

4.2.2 ÁGUA DE DILUIÇÃO 25

4.2.3 ALIMENTO 25

4.3 IMPLANTAÇÃO E OTIMIZAÇÃO DE CULTIVOS DE S. SERRULATUS - ESPÉCIE NATIVA 26

4.3.1 ORIGEM 27

4.3.3 ALIMENTO 27

4.3.5 REPRODUÇÃO E LONGEVIDADE 27

4.4 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE M. AERUGINOSA 28

4.4.1 PREPARO DA M. AERUGINOSA 28

4.4.2 DOSAGEM DE MICROCISTINA 28

4.4.3 PREPARO DOS ORGANISMOS PARA SEREM SUBMETIDOS AOS TESTES DE TOXICIDADE 29

4.4.4.1 Teste de viabilidade 30

4.4.5 TESTE DE SENSIBILIDADE 31

4.4.5.1 Determinação da Faixa de Sensibilidade de S. serrulatus ao Dicromato de Potássio e ao

Cloreto de Sódio 31

4.4.6 REALIZAÇÃO DOS TESTES DE TOXICIDADE DE M. AERUGINOSA 32

4.4.6.1 Preparo das soluções-teste 32

4.4.6.2 Teste preliminar 32

4.4.6.3 Testes definitivos 32

4.4.6.3.1 Toxicidade Aguda de M. aeruginosa para D. similis e S. serrulatus 32

4.4.6.3.2 Avaliação da Toxicidade Crônica de M. aeruginosa para C. dubia 33

4.4.6.4 Condições de realização dos testes 35

4.5 EXPERIMENTO COM D. SIMILIS EXPOSTAS A PRESENÇA DE M. AERUGINOSA COM

DIFERENTES DIETAS 36

4.5.1 REPRODUÇÃO E SOBREVIVÊNCIA DE D. SIMILIS 36

5 RESULTADOS 37

5.1 CONCENTRAÇÕES DE MICROCISTINA 37

(6)

5.3.1 TOXICIDADE AGUDA 38

5.3.2 REPRODUÇÃO E SOBREVIVÊNCIA DE D. SIMILIS EM PRESENÇA DE M. AERUGINOSA. 40

5.4 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE CRÔNICA DE M. AERUGINOSA PARA C. DUBIA. 44

5.4.1 CRESCIMENTO 44

5.4.2 REPRODUÇÃO 55

5.5 REPRODUÇÃO DE C. DUBIA EM RELAÇÃO À CONCENTRAÇÃO DE S. CAPRICORNUTUM 61 5.6 COMPARAÇÃO DOS EFEITOS CRÔNICOS (REPRODUÇÃO) DE C. DUBIA EXPOSTAS À DUAS

CEPAS DE M. AERUGINOSA E À CLOROFÍCEA S. CAPRICORNUTUM. 62

5.7 SENSIBILIDADE 63

5.8 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE M. AERUGINOSA PARA UM CLADOCERA NATIVO DE ÁGUA

DOCE - S. SERRULATUS 64

5.8.1 IMPLANTAÇÃO DOS CULTIVOS 64

5.8.2 REPRODUÇÃO E SOBREVIVÊNCIA 65

5.9 SENSIBILIDADE DE S. SERRULATUS ÀS SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIAS - K2CR2O7 E NACL 71

5.10 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE M. AERUGINOSA PARA S. SERRULATUS. 75

6 DISCUSSÃO 76

6.1 AVALIAÇÃO DO CONTEÚDO DE TOXINA DE M. AERUGINOSA 76

6.2 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE M. AERUGINOSA PARA D. SIMILIS 77

6.2.1 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA PARA D. SIMILIS 78

6.2.2 REPRODUÇÃO E SOBREVIVÊNCIA DE D. SIMILIS EXPOSTAS M. AERUGINOSA 81

6.3 C. DUBIA – REPRODUÇÃO E CRESCIMENTO EM PRESENÇA DE M. AERUGINOSA 82

6.3.1 CRESCIMENTO 83

6.3.2 REPRODUÇÃO 85

6.4 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE M. AERUGINOSA PARA O CLADOCERA NATIVO DE ÁGUA

DOCE S. SERRULATUS (KOCH, 1841) 87

6.5 MECANISMO DE AÇÃO DE M. AERUGINOSA SOBRE ZOOPLÂNCTON 89

6.6 IMPORTÂNCIA DA PRESENÇA DE MICROCISTINA PARA ZOOPLÂNCTON 92

7 CONCLUSÕES 96

(7)

LISTA DE TABELAS

Tabela 5-1 - Concentração de toxina da cepa RST9501 de M. aeruginosa nas amostras utilizadas no estudo...37 Tabela 5-2 – Concentração de toxina da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa nas amostras utilizadas no estudo...38 Tabela 5-3 – Avaliação da toxicidade aguda da cepa RST9501 de M. aeruginosa para D.

similis, teor de microcistina e avaliação da sensibilidade de D. similis...39

Tabela 5-4 – Avaliação da toxicidade aguda da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para D.

similis, teor de microcistina e avaliação da sensibilidade de D. similis...39

Tabela 5-5 - Sobrevivência de D. similis à cepa RST9501 de M. aeruginosa em diferentes concentrações e combinações de alimento no 15° dia ...42 Tabela 5-6 - Equações da reta obtidas através da transformação de Ford-Walford e valores de r para C. dubia expostas a diferentes concentrações da cepa RST9501 de M. aeruginosa. 46 Tabela 5-7 - Equações da reta obtidas através da transformação de Ford-Walford e valores de r para C. dubia expostas a diferentes concentrações da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa. .47 Tabela 5-8 - Equações de von Bertalanffy e valores dos respectivos parâmetros para C. dubia expostas a diferentes concentrações da cepa RST9501 de M. aeruginosa. ...48 Tabela 5-9 - Equações de von Bertalanffy e valores dos respectivos parâmetros C. dubia expostas a diferentes concentrações da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa...49 Tabela 5-10 – Crescimento médio (mm) de C. dubia em sete dias de exposição a diferentes concentrações de S. capricornutum e duas cepas de M. aeruginosa. ...50 Tabela 5-11 – Avaliação da toxicidade crônica (reprodução) das cepas RST9501 e NPJT-01 de

M. aeruginosa sobre C. dubia...56

Tabela 5-12 - Número total de neonatas produzidas por fêmea ao longo de todo o período de vida de S. serrulatus em 6 diferentes cultivos realizados. ...65 Tabela 5-13 - Dados biológicos de S. serrulatus obtidos a partir do cultivo de lotes de fêmeas jovens, em quatorze dias (* Mortalidade maior que 20%). ...70 Tabela 5-14 - Avaliação da toxicidade aguda das cepas RST9501 e NPJT-01 de M. aeruginosa para S. serrulatus. ...76

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LISTA DE FIGURAS

Figura 4-1 – Foto de células de M. aeruginosa, cepa RST9501, em forma unicelular em

processo de reprodução. (Aumento 10 X 40). ...21

Figura 4-2 – Fotos de M. aeruginosa, cepa RST9501, em forma colonial. (Aumento 6,3 X 40). ...21

Figura 4-3 - Foto de fêmea embrionada de D. similis. Aumento: 10 x 1,6. ...24

Figura 4-4 - Foto de fêmea embrionada de C. dubia. Aumento: 10 x 2,5...24

Figura 4-5 - Foto de fêmea embrionada de S. serrulatus. Aumento: 6,3 x 2,5...26

Figura 4-6 - Comprimento total do corpo de C. dubia. Fêmea ovada. Aumento: 10 x 2,5. ...33

Figura 5-1 – Gráfico controle da sensibilidade de D. similis ao dicromato de potássio no período de 18 de maio de 1999 a 17 maio de 2000 destacando-se os lotes utilizados nos testes de toxicidade aguda com M. aeruginosa. ...40

Figura 5-2 – Reprodução média de D. similis expostas por 21 dias a cepa RST9501 de M. aeruginosa em diferentes concentrações e combinações de alimento...41

Figura 5-3– Sobrevivência de D. similis expostas por 21 dias a M. aeruginosa em diferentes concentrações e combinações de alimento. (Experimento 1 e Experimento 2)...43

Figura 5-4 – Curvas médias de crescimento de C. dubia expostas a diferentes concentrações da cepa RST9501 de M. aeruginosa e controle (Teste 1)...51

Figura 5-8 – Curvas médias de crescimento de C. dubia expostas a diferentes concentrações da cepa NPJT –01 de M. aeruginosa e controle (Teste 2)...53

Figura 5-9 – Curvas médias de crescimento de C. dubia expostas a diferentes concentrações da cepa NPJT –01 de M. aeruginosa e controle (Teste 3)...53

Figura 5-10 – Curvas médias de crescimento de C. dubia expostas a diferentes concentrações da cepa NPJT –01 de M. aeruginosa e controle (Teste 4). ...54

(9)

Figura 5-11 – Curvas médias de crescimento de C. dubia expostas a diferentes concentrações de S. capricornutum e controle. ...54 Figura 5-12 – Percentual médio de redução no crescimento de fêmeas de C. dubia em relação ao controle em duas cepas M. aeruginosa e uma de S. capricornutum, em diferentes concentrações...55 Figura 5-13 – Número médio de neonatas produzidos por fêmea de C. dubia em 7 dias de exposição a diferentes concentrações da cepa RST9501 de M. aeruginosa (Teste 1). ...57 Figura 5-14 – Número médio de neonatas produzidos por fêmea de C. dubia em 7 dias de exposição a diferentes concentrações da cepa RST9501 de M. aeruginosa (Teste 2). ...57 Figura 5-15 – Número médio de neonatas produzidos por fêmea de C. dubia em 7 dias de exposição a diferentes concentrações da cepa RST9501 de M. aeruginosa (Teste 3). ...58 Figura 5-16 – Número médio de neonatas produzidos por fêmea de C. dubia em 7 dias de exposição a diferentes concentrações da cepa RST9501 de M. aeruginosa (Teste 4). ...58 Figura 5-17 – Número médio de neonatas produzidos por fêmea de C. dubia em 7 dias de exposição a diferentes concentrações da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa (Teste 1). ...59 Figura 5-18 – Número médio de neonatas produzidos por fêmea de C. dubia em 7 dias de exposição a diferentes concentrações da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa (Teste 2). ...59 Figura 5-19 – Número médio de neonatas produzidos por fêmea de C. dubia em 7 dias de exposição a diferentes concentrações da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa (Teste 3). ...60 Figura 5-20 – Número médio de neonatas produzidos por fêmea de C. dubia em 7 dias de exposição a diferentes concentrações da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa (Teste 4). ...60 Figura 5-21 - Número médio de neonatas produzidos por fêmea de C. dubia em 7 dias de exposição a diferentes concentrações da clorofícea S. capricornutum...61 Figura 5-22 – Percentual médio de neonatas produzidas por fêmea de C. dubia em relação ao controle em duas cepas de M. aeruginosa e uma de S. capricornutum, em diferentes concentrações...63 Figura 5-23 – Sensibilidade de C. dubia ao NaCl no período de 25 de maio de 1999 a 17 maio de 2000, destacando-se os lotes utilizados nos oito testes de toxicidade crônica com M.

aeruginosa...64

(10)

Figura 5-25 - Número médio de neonatas produzidos por fêmea e sobrevivência de S.

serrulatus cultivados em água de fonte natural com dureza entre 40 e 48 mg.L-1 CaCO3, a

20°C em diferentes cultivos. ...67 Figura 5-26 - Número médio de neonatas produzidos por fêmea e sobrevivência de S.

20°C em diferentes cultivos. ...68 Figura 5-27 - Número médio de neonatas produzidos por fêmea e sobrevivência de S.

20°C em diferentes cultivos. ...69 Figura 5-28 - Sensibilidade de S. serrulatus ao NaCl, quando cultivado com água de fonte natural com dureza entre 40 e 48 mg.L-1 CaCO3, à 20 (± 2) °C e fotoperíodo de 16

horas-luz...71 Figura 5-29 - Sensibilidade de S. serrulatus ao dicromato de potássio, quando cultivado com água de fonte natural com dureza entre 40 e 48 mg.L-1 CaCO3, à 20 (± 2) °C e

fotoperíodo de 16 horas-luz. ...72 Figura 5-30 - Sensibilidade de S. serrulatus e D. similis ao dicromato de potássio nas condições de cultivo descritas...74 Figura 5-31 – Sensibilidade de S. serrulatus e C. dubia ao NaCl nas condições de cultivo descritas...75

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APÊNDICE

Apêndice 1 – Tabela mostrando a quantidade de toxina da cepa RST9501 e da cepa NPJT-01 avaliados por imunoensaio através de um “Kit” para determinação de microcistinas. ...113 Apêndice 2 - Registro da dureza, potencial hidrogeniônico, oxigênio dissolvido e condutividade iniciais da água de diluição e da origem e quantidade de toxina das cepas RST9501 e NPJT-01 de M. aeruginosa avaliadas em testes de toxicidade aguda para D.

similis. ...114

Apêndice 3 - Avaliação da cepa RST9501 de M. aeruginosa para D. similis através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 1)...114 Apêndice 4 - Avaliação da cepa RST9501 de M. aeruginosa para D. similis através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 2)...115 Apêndice 5 - Avaliação da cepa RST9501 de M. aeruginosa para D. similis através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 3)...115 Apêndice 6 - Avaliação da cepa RST9501 de M. aeruginosa para D. similis através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 4)...115 Apêndice 7 - Avaliação da cepa RST9501 de M. aeruginosa para D. similis através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 5)...116 Apêndice 8 - Avaliação cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para D. similis através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 1)...116 Apêndice 9 - Avaliação da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para D. similis através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 2)...116 Apêndice 10 - Avaliação da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para D. similis através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 3)...117 Apêndice 11 - Avaliação da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para D. similis através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 4)...117 Apêndice 12 - Número de neonatos produzidos por fêmea sobrevivente de Daphnia similis expostas por 21 dias a cepa RST9501 de M. aeruginosa em diferentes concentrações e combinações de alimento...118 Apêndice 13 – Percentagem de sobrevivência de Daphnia similis expostas por 21 dias a cepa

(12)

Apêndice 14 - Comparação da sobrevivência de D. similis à cepa RST9501 de M. aeruginosa em diferentes concentrações e combinações de alimento no 15° dia, através do teste de TUKEY. ...120 Apêndice 15– Valores de incremento médio no crescimento (µm) de C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da Lagoa dos Patos avaliados através de 4 testes de toxicidade...121 Apêndice 16 - Comparação entre as médias do incremento do crescimento de C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de BENFERRONI...122 Apêndice 17 – Valores de incremento médio no crescimento de C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa NPJT-01, proveniente do Rio de Janeiro, avaliados através de 3 testes de toxicidade...123 Apêndice 18 - Comparação entre as médias do incremento do crescimento de C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa NPJT-01 proveniente do Rio de Janeiro, através do teste de BENFERRONI. (As médias estão em negrito; diferenças significativas estão indicadas por um asterisco). ...123 Apêndice 19 – Valores de incremento médio no crescimento de C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da alga S. capricornutum, avaliados através de 4 testes de toxicidade. ...124 Apêndice 20 - Comparação entre as médias do incremento do crescimento de C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da alga clorofícea S.

capricornutum, através do teste de DUNNETT. ...124

Apêndice 21- Planilha de registro de dados de teste de avaliação da toxicidade crônica da cepa RST9501 de M. aeruginosa para C. dubia. (Teste1) ...126 Apêndice 22 – Comparação da mortalidade de C. dubia observada ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de FISHER...128 Apêndice 23 – Comparação entre as médias do número de neonatas produzidas por fêmea de

C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de STEEL...129

(13)

Apêndice 24 – Planilha de registro de dados de teste de avaliação da toxicidade crônica da cepa RST9501 de M. aeruginosa para C. dubia. (Teste2)...130 Apêndice 25 – Comparação da mortalidade de C. dubia observada ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de FISHER...133 Apêndice 26 - Comparação entre as médias do número de neonatas produzidas por fêmea de

C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de STEEL. ...133 Apêndice 27 - Planilha de registro de dados de teste de avaliação da toxicidade crônica da cepa RST9501 de M. aeruginosa para C. dubia. (Teste3)...134 Apêndice 28 – Comparação da mortalidade de C. dubia observada ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de FISHER...137 Apêndice 29 - Comparação entre as médias do número de neonatas produzidas por fêmea de

C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de STEEL...137 Apêndice 30 - Planilha de registro de dados de teste de avaliação da toxicidade crônica da cepa RST9501 de M. aeruginosa para C. dubia. (Teste4)...138 Apêndice 31 – Comparação da mortalidade de C. dubia observada ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de FISHER...141 Apêndice 32 - Comparação entre as médias do número de neonatas produzidas por fêmea de

C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de STEEL...141 Apêndice 33 - Planilha de registro de dados de teste de avaliação da toxicidade crônica da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para C. dubia. (Teste1)...142 Apêndice 34 – Comparação da mortalidade de C. dubia observada ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de FISHER...144

(14)

Apêndice 35 – Comparação entre as médias do número de neonatas produzidas por fêmea de

C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de STEEL. ...144 Apêndice 36 – Planilha de registro de dados de teste de avaliação da toxicidade crônica da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para C. dubia. (Teste2)...145 Apêndice 37 – Comparação da mortalidade de C. dubia observada ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de FISHER...148 Apêndice 38 - Comparação entre as médias do número de neonatas produzidas por fêmea de

C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de STEEL...148 Apêndice 39 - Planilha de registro de dados de teste de avaliação da toxicidade crônica da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para C. dubia. (Teste3)...149 Apêndice 40 – Comparação da mortalidade de C. dubia observada ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de FISHER...152 Apêndice 41 - Comparação entre as médias do número de neonatas produzidas por fêmea de

C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de STEEL. ...152 Apêndice 42 - Planilha de registro de dados de teste de avaliação da toxicidade crônica da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para C. dubia. (Teste4)...153 Apêndice 43 – Comparação da mortalidade de C. dubia observada ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de FISHER...156 Apêndice 44 - Comparação entre as médias do número de neonatas produzidas por fêmea de

C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da cepa RST9501, da lagoa dos Patos, através do teste de DUNNETT. ...156 Apêndice 45 - Planilha de registro de dados de teste de avaliação da toxicidade crônica de S.

(15)

Apêndice 46 – Comparação da mortalidade de C. dubia observada ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da alga S. capricornutum, através do

teste de FISHER...161

Apêndice 47 - Comparação entre as médias do número de neonatas produzidas por fêmea de C. dubia ao final de sete dias de exposição a diferentes concentrações (células.mL-1) da alga S. capricornutum, através do teste de DUNNETT...161

Apêndice 48 - Comparação entre as médias de reprodução de C. dubia em todos os tratamentos avaliados em diferentes concentrações (células.mL-1) da alga S. capricornutum e das cepas RST9501 e NPJT-01 de M. aeruginosa, através do teste de TUKEY ...162

Apêndice 49 - Sobrevivência e número de neonatos produzidos por fêmea de S. serrulatus cultivados em água de fonte natural com dureza entre 40 e 48 mg.L-1 CaCO3, a 20°C. Experimento 1...165

Apêndice 52 - Variáveis físicas e químicas naturais da água de fonte utilizada na manutenção dos experimentos realizados com S. serrulatus. ...168

Apêndice 53 - Teste de sensibilidade de S. serrulatus para o NaCl. ...169

(16)

Apêndice 63 - Teste de sensibilidade de S. serrulatus para o Dicromato de potássio...174 Apêndice 64 - Teste de sensibilidade de S. serrulatus para o Dicromato de potássio...174 Apêndice 65 - Teste de sensibilidade de S. serrulatus para o Dicromato de potássio...175 Apêndice 66 - Registro da dureza, potencial hidrogeniônico, oxigênio dissolvido e condutividade iniciais da água de diluição e da origem e quantidade de toxina das cepas RST9501 e NPJT-01 de M. aeruginosa avaliadas em testes de toxicidade aguda para D.

similis. ...175

Apêndice 67 - Avaliação da cepa RST9501 de M. aeruginosa para S. serrulatus através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 1)...176 Apêndice 68 - Avaliação da cepa RST9501 de M. aeruginosa para S. serrulatus através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 2)...176 Apêndice 69 - Avaliação da cepa RST9501 de M. aeruginosa para S. serrulatus através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 3)...177 Apêndice 70 - Avaliação da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para S. serrulatus através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 1)...177 Apêndice 71 - Avaliação da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para S. serrulatus através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 2)...178 Apêndice 72 - Avaliação da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para S. serrulatus através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 3)...178 Apêndice 73 - Avaliação da cepa NPJT-01 de M. aeruginosa para S. serrulatus através de testes de toxicidade aguda em 48 horas. (Teste 4)...179

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RESUMO

Este estudo avalia a toxicidade da cepa RST 9501 de Microcystis aeruginosa, isolada da Lagoa dos Patos, para três espécies de Cladocera. Para comparação de seus efeitos foi utilizada a cepa não tóxica de M. aeruginosa NPJT-01. A toxicidade aguda foi avaliada para

Daphnia similis e Simocephalus serrulatus, comparando-se a sobrevivência de organismos

expostos a diferentes concentrações da cianobactéria com um grupo controle, não alimentado. O efeito crônico foi estimado a partir da avaliação da reprodução e crescimento de

Ceriodaphnia dubia em concentrações crescentes de M. aeruginosa, sendo que para todos os

tratamentos foi disponibilizado alimento alternativo a base de Selenastrum capricornutum mais ração de artêmia. A reprodução e sobrevivência de D. similis foram avaliadas através de um experimento usando a cepa tóxica RST9501 de M. aeruginosa sozinha e em uma mistura com Selenastrum capricornutum e/ou ração de Artemia fermentada. Ambas as cepas avaliadas (RST 9501 e NPJT-01) não apresentaram efeito letal para D. similis e S. serrulatus nas concentrações avaliadas, independentemente da presença ou não de microcistinas. A presença de M. aeruginosa foi capaz de inibir a reprodução e o crescimento de C. dubia, e este efeito foi incrementado com o aumento na concentração de células de ambas as cepas. Em D. similis, a reprodução foi fortemente reduzida na concentração de 1 x 106 células.mL-1, independente da qualidade de alimento fornecido como alternativa, ao passo que na concentração de 1 x 105 células.mL-1 o aumento na quantidade e qualidade de alimento alternativo foi capaz de reduzir o impacto da cianobactéria sobre o número de filhotes produzidos.

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ABSTRACT

The present study evaluates acute and chronic toxic effects of Microcystis aeruginosa (RST 9501 strain, isolated from the Patos Lagoon, RS) on three Cladocera species: Daphnia similis,

Simocephalus serrulatus and Ceriodaphnia dubia. In order to compare the effect of a toxic to

a non-toxic strain, M. aeruginosa NPJT-01 was used for all species tested. M. aeruginosa acute toxicity was investigated to D. similis and S. serrulatus comparing the mortality at different concentrations of the cyanobacteria to a control group, without any alternative food. The effect of M. aeruginosa on the reproduction and survivorship of D. similis was investigated experimentally using the strain RST9501 alone, and combined with Selenastrum

capricornutum and/or a mixture of ground dried Artemia salina and yeast. No lethal effect was

observed for D. similis and S. serrulatus for both strains (RST 9501 and NPJT-01) at all tested concentrations. On the other hand, the reproduction of D. similis, was greatly reduced at 1 x 106 cells/mL concentration, independent of the quality of the offered food as an alternative to cyanobacterium. At a lower concentration (1 x 105 cells/mL), the increase in quality and quantity of the alternative food (S. capricornutum and/or A. salina and yeast) was able to reduce the impact of M. aeruginosa on the daphnid’s reproduction. The chronic effect of M.

aeruginosa on the growth and reproduction of C. dubia was estimated using standardized

toxicity tests. Reproduction and growth of C. dubia was greatly affected by the presence of M.

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1 INTRODUÇÃO

As cianobactérias, antigamente classificadas como algas azuis, estão mais próximas das bactérias do que de algas (LEE, 1989). Na sua maioria são cosmopolitas, principalmente de água doce, com poucas espécies marinhas. A Classe Cianophyceae possui cerca de 150 gêneros e 2000 espécies reconhecidas (SKULBERG et al., 1993).

O grande sucesso de cianobactérias, principalmente em ambientes lacustres eutróficos, pode estar associado a alguns aspectos da sua fisiologia. Segundo REYNOLDS (1988), as cianobactérias apresentam baixa relação superfície/volume com baixas taxas de crescimento e respiração. Possuem grande tolerância a condições de estresse por temperatura, baixa razão N/P, alta pressão de herbivoria e deficiência de nutrientes. Algumas espécies ainda são capazes de armazenar fósforo intrabioticamente, fixar N2 livre dissolvido sob condições

anaeróbias, podendo regular sua altura na coluna d’água pelo controle da densidade. Além disso, cianobactérias têm saturação baixa para ingestão de gás carbônico, com vantagens em períodos de baixas concentrações de CO2 e valores altos de pH.

Episódios de envenenamento com cianobactérias vem sendo registrados a mais de dois séculos (FRANCIS, 1878, BROLATTO, 1994; YOO et al., 1995; STEFFENSEN, 1999). Muitas espécies deste grupo incluem cepas tóxicas que, com uma maior disponibilidade de nutrientes e sob condições ambientais propícias podem desenvolver florações em lagos, rios, lagoas e represas. Assim, com o aumento progressivo da eutrofização nos ecossistemas aquáticos ao longo de todo mundo, estas florações de cianobactérias têm se tornado cada vez mais freqüentes. No Brasil, o Ministério da saúde, através da portaria número 1469 de 2000 estabelece critérios para o controle da qualidade da água para consumo humano, exigindo controle quali-quantitativo da presença de cianobactérias e de suas toxinas específicas nos pontos de captação de água (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2000).

Embora a presença de cianobactérias esteja associada a episódios de envenenamento, são poucos os representantes deste grupo capazes de produzir toxinas. Segundo SKULBERG

et al. (l993), cerca de 40 espécies de cianobactérias são toxigênicas. CODD et al. (1989) e

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Lynglrya, Microcystis, Nodularia e Oscillatoria como os mais comuns. Ultimamente,

florações de Cylindrospermopsis vem assumindo grande projeção no Brasil, sendo que um dos episódios mais importantes internacionalmente envolveu a morte de 148 pessoas, conforme registrado por BYTH (1980), na Austrália. A substância responsável por estes efeitos tóxicos foi identificada por OHTANI et al. (1992) e consiste de um alcalóide tóxico, cylindrospermopsina, capaz de produzir uma dose letal (DL50) para camundongo de 0,2

mg.kg-1 .

No Brasil, as florações de Cylindrospermopsis são abundantes em corpos de água doce de Norte a Sul do país e a sua toxicidade tem sido determinada no Estado de São Paulo (LAGOS et al., 1997), Rio Grande do Sul (CONTE et al., 2000) e Minas Gerais (JARDIM et

al., 2000). As toxinas mais abundantes nas florações do Brasil são as saxitoxinas e seus

derivados tóxicos.

As toxinas produzidas por cianobactérias de água doce estão divididas em três categorias: neurotoxinas, hepatotoxinas e lipopolissacarídeos (PEARSON, 1990). CARMICHAEL (1994) descreve como as mais perigosas, as neurotoxinas, que agem no sistema nervoso, podendo causar a morte por paralisia dos músculos respiratórios. As hepatotoxinas, por sua vez atuam no fígado de mamíferos danificando a estrutura do citoesqueleto dos hepatócitos e provocando hemorragias, enquanto que as lipopolissacarídeos são conhecidas por toxina irritantes ao contato, causando irritações na pele e transtornos gastrointestinais.

O grupo de toxinas melhor conhecido e mais extensivamente estudado são as hepatotoxinas produzidas por M. aeruginosa e conhecidas por microcistinas (FASTNER et al. 1998; FALCONER, 1999). Segundo STEFFENSEN (1999), a mais comum entre mais de 50 variantes descritas para esta hepatotoxina é a microcistina-LR. Conforme WATANABE et al. (1992) e ROHRLACK et al. (1999c), estas variantes podem estar presentes em composições e concentrações diferentes, dependendo de cada cepa.

A produção de toxinas por unidade de biomassa de cianobactéria é altamente variável (CODD & BELL, 1985) . Segundo LAMPERT (1982), em um mesmo ambiente é possível encontrar cepas tóxicas e não tóxicas de uma mesma espécie de cianobactéria.

Ainda não estão claros os mecanismos envolvidos na regulação da produção de toxinas. De acordo com VAN DER WESTHUIZEN et al. (1986), fatores ambientais têm

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grande influência na toxicidade. O autor chama atenção, no entanto, que uma condição que estimula o crescimento não terá necessariamente o mesmo efeito ou a mesma intensidade sobre a produção de toxinas. YUNES (1996a) não observou correlação entre a intensidade da floração, determinada a partir de densidade (quantidade de clorofila) e a sua toxicidade. Ao contrário, a amostra mais tóxica de Microcystis observada por este autor foi coletada em uma das menores concentrações de células por litro.

Além das características específicas de cada espécie e da heterogeneidade das cepas, as condições ambientais e a presença de predadores têm importante papel na produção de toxinas (LAMPERT, 1981; VAN DER WESTHUIZEN et al., 1986; CODD et al., 1989; LAWTON et

al., 1994; YUNES et al., 1996a). Alguns autores entendem a sua presença como o possível

resultado de um processo evolutivo que beneficia a diminuição do consumo (BENDORF & HENNING, 1989; ROHRLACK et al., 1999a; 1999b). Segundo LAMPERT (1981), a população colonizadora precisa ter a capacidade de inibir a atuação de seus predadores para poder se desenvolver e formar grandes concentrações.

No ambiente aquático, a produção de toxinas pode ser extremamente nociva ao plâncton e algumas espécies de peixes, estando associadas a redução da diversidade local das populações fitoplanctônicas e zooplanctônicas (LAMPERT, 1981; PAERL, 1988). A mortalidade de peixes, freqüentemente está associada a florações de cianobactérias tóxicas. Apesar da forte suspeita de ligação entre estes acontecimentos, a relação direta não está claramente estabelecida (PEARSON, 1990; TENCALLA et al., 1994; BURY et al., 1996).

Em relação ao zooplâncton, a presença de florações de cianobactérias tem sido associada a alterações no comportamento, na composição e na estrutura das comunidades (FULTON & PAERL, 1987; LAMPERT, 1987; FORSYTH et al., 1990; BERTHON & BROUSSE, 1995).

FULTON & PEARL (1987) descreveram a existência de uma variedade de mecanismos para herbívoros zooplanctônicos coexistirem com M. aeruginosa. Alguns representantes do grupo Rotifera demonstraram resistência à sua presença, utilizando suas células na alimentação (STARKWEATHER & KELLAR, 1983); copépodos evitaram totalmente seu consumo e cladóceros tiveram suas taxas de alimentação fortemente reduzidas. Estudos realizados por GILBERT (1990) e FULTON & JONES (1991) enfatizam que na

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acabando substituídos pelos menores, e também por rotíferos e copépodos. Além da presença de toxinas, os efeitos de cepas tóxicas e não tóxicas na sobrevivência, crescimento e reprodução de zooplâncton tem sido atribuída à interferência mecânica e ao baixo valor nutricional destas espécies de cianobactérias (HANAZATO & YASUNO, 1987; LAMPERT, 1987; GILBERT, 1990; DEMOTT, 1991; REINIKAINEN, 1995b).

Alguns estudos avaliando a utilização das cianobactérias como recurso alimentar pelo zooplâncton mostram que o tamanho da colônia é um fator determinante, principalmente na taxa de ingestão. GLIWICZ & SIEDLAR (1980) observaram que Daphnia é capaz de estreitar a abertura entre as valvas da carapaça, de forma a reduzir a ingestão de colônias e filamentos tóxicos de cianobactérias. Além de interferir no processo de filtração, reduzindo a quantidade de alimento ingerido, LAMPERT (1987) salienta que a presença de grandes colônias ao serem evitadas ou rejeitadas, podem aumentar o gasto energético dos indivíduos, diminuindo o seu desempenho. JARVIS et al.(1987); FULTON & PEARL (1987); HANAZATO & YASUNO (1987) salientam que colônias de pequeno tamanho, alguns filamentos e células isoladas podem ser ingeridos pelos herbívoros. Uma vez ingeridas, no entanto, as células de cianobactérias podem ser, segundo LAMPERT (1987), pobremente digeridas ou assimiladas, além de não apresentarem os nutrientes essenciais.

Para LEE (1989), a baixa digestibilidade está relacionada a presença de uma bainha de mucilagem, normalmente presente no ambiente, que tem a função de dar aderência e proteger as células principalmente contra o ataque de vírus e fungos. Conforme DEMOTT & MÜLLER-NAVARRA (1997), algumas cianobactérias possuem baixa quantidade de lipídios considerados essenciais ao desenvolvimento do zooplâncton, resultando em deficiência nutritiva quando estes animais tem disponíveis dietas exclusivas de cianobactérias.

Os efeitos de natureza tóxica e, principalmente, a importância da presença de microcistinas têm sido muito discutidos por diferentes autores (DEMOTT et al. 1991, JUNGMANN, 1992; REINIKAINEN, 1994; OBEREMM, 1999). Além da inibição da taxa de filtração, a morte de indivíduos de diferentes espécies zooplanctônicas em presença de concentrações baixas de cianobactérias tóxicas tem sido registrada em poucas horas de exposição, evidenciando uma alta toxicidade (HANAZATO & YASUNO, 1987; GILBERT, 1990; DEMOTT et al., 1991).

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NIZAN et al. (1986) observaram a morte de indivíduos da espécie Daphnia magna quando expostas a diferentes cepas de M. aeruginosa. A mortalidade observada nestes experimentos não foram atribuídas a falta de alimento, uma vez que indivíduos da mesma espécie aos quais não foram disponibilizados qualquer tipo de alimento foram capazes de sobreviver por um período maior. O autor observou ainda que a cepa capaz de bloquear completamente a ingestão de alimento não provocou mortalidade. LAMPERT (1982) avalia a inibição das taxas de filtração como um mecanismo de defesa dos dafinídeos contra a presença de florações. Em outros trabalhos (NIZAN et al. 1986; ROHRLACK et al. 1999a), foi observado que diferentemente da mortalidade, o efeito na inibição de alimentação não estava relacionado ao conteúdo de microcistinas das cepas avaliadas. A reversibilidade do processo de inibição levaram ROHRLACK et al. (1999b) a levantarem a hipótese desse efeito ser resultado da presença de algum outro fator, que não o envenenamento por toxinas.

O mecanismo exato de ação das cianobactérias sobre os invertebrados, ainda não são conhecidos detalhadamente e os resultados obtidos em experimentos laboratoriais para avaliar o seu efeito tem sido bastante controversos.

É possível observar que cada espécie ou clone é capaz de apresentar uma sensibilidade natural a presença de cianobactérias, além disso, a intensidade do efeito sobre o zooplâncton varia com as características da espécie ou cepa de cianobactéria avaliada e com a maneira como ela é disponibilizada para os indivíduos. FULTON & PAERL (1988) observou que

Bosmina longirostris foi mais resistente a cianobactéria tóxica do que Daphnia parvula e Moina micrura. LAMPERT (1982) testou o efeito de Microcystis em treze espécies diferentes

de Cladocera e verificou redução significante na taxa de filtração em todos os organismos. A intensidade com que as espécies foram afetadas, no entanto, foi variável. O autor salienta a importância do tamanho dos organismos expostos, sendo que espécies menores, como

Ceriodaphnia sp. e Bosmina sp., foram menos afetadas. DE BERNARDI (1981) observou que Daphnia obtusa e Daphnia hyalina cresceram e se reproduziram bem quando alimentadas com Microcystis.

A avaliação, o monitoramento e a quantificação das toxinas de cianobactérias têm, tradicionalmente, dependido de testes intraperitoniais com camundongos (CARMICHAEL, 1981; CODD & POON, 1988; CAMPBELL et al., 1994). Apesar deste ainda ser o teste

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sido desenvolvidos, como ensaios citotoxicológicos (ERIKSSON et al., 1994) e imunoensaios (CHU et al., 1989; RIVASSEAU et al., 1999; STEFFENSEN et al.; 1999). Com a necessidade de identificar as toxinas contidas nas diferentes cepas de cianobactérias e de quantificá-las, foram implementados métodos químicos específicos que complementam estes ensaios. A cromatografia, mais especificamente, a líquida de alta performance (HPLC), tem sido muito utilizada na detecção e quantificação de hepatotoxinas (WATANABE, 1988; PEARSON, 1990).

Conforme TENCALLA (1994), apesar de rápidos e muito sensíveis, os ensaios intraperitoniais não refletem a situação de estresse para os organismos aquáticos e, por isso, não possuem representatividade em comprovar a toxicidade em condições naturais. O uso de organismos aquáticos em testes de toxicidade com cianobactérias permite uma avaliação qualitativa e quantitativa dos efeitos tóxicos de uma determinada cepa, permitindo um maior entendimento do seu impacto no ambiente natural e dos mecanismos relacionados a regulação da toxicidade.

Devido ao grande envolvimento de cianobactérias em episódios de envenenamento registrados, à dificuldade em prever a intensidade destes acontecimentos e também ao grande número de fatores que podem interferir na produção das toxinas e na maneira como elas podem interferir no desenvolvimento dos organismos expostos à sua presença, muitos pesquisadores tem realizado trabalhos nesta área. Diferentes enfoques e resultados tem sido obtidos, com o objetivo de avaliar diferenças no comportamento e na sensibilidade de organismos aquáticos quando em presença de diferentes espécies e cepas de cianofíceas, além da sua capacidade de utilizar este grupo com sucesso na sua alimentação.

Com o presente trabalho pretendeu-se, portanto, avaliar o efeito para dafinídeos de uma cepa de M. aeruginosa (RST9501) isolada em outubro de 1995, durante as investigações na Lagoa dos Patos descritas por YUNES (1996a). De acordo com TORGAN (1989), o Taxa Cyanophyta, seguido de Crysophyta, constituem os principais componentes das florações algais registrados nesta Lagoa, à semelhança do que ocorre em outras regiões do mundo.

Segundo YUNES et al. (1996a), diversas florações de M. aeruginosa foram registradas nos últimos 15 anos na Laguna dos Patos, RS. Num dos episódios observados, uma extensa massa algácea (9.000 µg clorofila. L-1) estendeu-se por 45 milhas náuticas ao longo do

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estuário. Estas florações foram associados com pH maior ou igual a 8,0, temperatura da água maior que 20°C, baixa salinidade e balanço de nutrientes com razão N/P igual a 13:1.

A toxicidade da cepa de M. aeruginosa RST9501 foi avaliada para camundongos produzindo uma DL50 de 44,19 mg/kg, sendo seu conteúdo de hepatotoxinas determinado por HPLC-DAD, resultando em um valor de 1,64 µg.mg-1 peso seco. Além de testes com camundongos, a toxicidade da cepa RST9501 também foi avaliada em testes agudos para

Artemia, apresentando uma CL50-18h de 4,73 de mg mL-1 e para juvenis do camarão-rosa

Penaeus paulensis, com uma CL50-24h de 2,96 mg mL-1 (YUNES et al., 1996b; YOGUI et

al., 1998). Para o tanaidáceo Kalliapseudes schubartii, a CL50-96h variou de 1,41 a 1,50

mg.mL-1 (MONTAGNOLI et al., 2000).

Culturas da cepa RST9501 quando avaliadas por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fotodiodo (“HPLC-DAD”), revelaram que a mais abundante variante de microcistina presente trata-se de uma forma inédita [D-Leu1] MCLR, no qual o aminácido principal é a leucina e não alanina como ocorrem nas outras cepas de Microcystis (MATTHIENSEN et al., 2000), no entanto, os seus níveis de toxicidade são similares aos das outras formas de microcistinas.

Extratos semi purificados da mesma cepa com e sem a toxina microcistina-LR pura, adicionada foram completadas a amostras de água do estuário da Lagoa dos Patos. A degradação bacteriana destas microcistinas foram detectadas como também a sua biotransformação a outras formas não degradáveis que ainda mantém atividade típica inibitória (MATTHIENSEN, 1999).

A cepa M. aeruginosa também foi cultivada sob o efeito de salinidades crescentes. A produção de toxinas (microcistinas) foi inibida pelo gradiente de salinidade (SALOMON, 1999) e uma mudança nos tipos de variantes também foi detectada na presença de concentrações mais altas de sal (MATTHIENSEN, 1999).

Ao avaliar o grau de toxicidade da cepa RST9501 para Cladocera, um grupo representativo de organismos que vivem na coluna d’água e um dos mais importantes elos entre os produtores e os níveis superiores da cadeia alimentar, este trabalho pretende colaborar para o entendimento da importância para a comunidade aquática das florações de M.

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2 OBJETIVOS

2.1 GERAL

• Investigar os efeitos letais e subletais de uma cepa comprovadamente tóxica de M.

aeruginosa para dafinídeos, através de testes de toxicidade com organismos padronizados

e nativos.

2.2 ESPECÍFICOS

• Avaliar a toxicidade aguda da cepa RST9501 de M. aeruginosa para Daphnia similis e comparar o efeito com os resultados obtidos para uma cepa não tóxica;

• Avaliar a toxicidade crônica de M. aeruginosa na reprodução e sobrevivência de D. similis e comparar o efeito interativo com o alimento, em qualidade e quantidades comprovadamente eficientes para estes organismos;

• Avaliar a toxicidade crônica da cepa RST9501 de M. aeruginosa no crescimento e reprodução de Ceriodaphnia dubia e comparar o efeito com os resultados obtidos para uma cepa não tóxica;

• Implantar o cultivo de Simocephalus serrulatus, espécie nativa, e realizar estudos sobre reprodução e longevidade;

• Determinar a sensibilidade de S. serrulatus à substâncias de referência: Dicromato de Potássio e Cloreto de Sódio;

• Avaliar a toxicidade aguda da cepa RST9501 de M. aeruginosa para S. serrulatus, um dafinídeo coletado na mesma região de ocorrência.

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3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 M. aeruginosa

M. aeruginosa (CHROOCOCCALES; CROOCOCCACEAE) é uma cianobactéria

cosmopolita, exclusiva de ambientes de água doce capaz de produzir toxinas. Tem sido envolvida em diversos incidentes com envenenamento de animais domésticos e seres humanos (VAN DER WESTHUIZEN et al., 1986; PEARSON, 1990; TENCALLA, 1994; HOFFMANN, 1996). Conforme BRANCO (1959), pertence ao gênero mais citado como causador de efeitos tóxicos em águas continentais. No ambiente, M. aeruginosa pode apresentar-se na forma unicelular ou colonial, neste caso com uma camada de mucilagem que cria um microambiente especializado ao redor das células no qual os nutrientes essenciais se concentram e se mantém (LANGE, 1976). Para LEE (1989), esta capa tem a função de proteger e dar aderência as células, na formação da colônia.

Segundo REYNOLDS et al. (1981), a variabilidade em tamanho, forma e arranjo de células de Microcystis resultou por longo tempo em um problema taxonômico. Este autor agrupa as diversas formas em “status” coloniais relacionando-as com diferentes fases de crescimento do seu ciclo de crescimento anual em lagos temperados. Nestes ambientes, têm um ciclo de ocorrência onde populações planctônicas geralmente desenvolvem-se na primavera ou no início do verão e tornam-se dominantes no final do verão ou início do outono, e em seguida desaparecem da coluna d’água para sobreviverem ao inverno no sedimento, que servindo como inóculo para a primavera do ano seguinte. De acordo com o autor, este conjunto de características proporciona a M. aeruginosa uma capacidade biológica para resistir a ciclos térmicos e estratificações químicas, o que pode estar relacionado, juntamente com sua habilidade de secretar metabólitos capazes de inibir o crescimento e as atividades de competidores e predadores, com a sua grande persistência em lagos eutróficos.

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3.1.1 Florações

Com o aumento da eutrofização, as comunidades fitoplanctônicas diminuem em diversidade e ocorre a dominância de espécies de cianobactérias, resultando na formação de florações (DOMINGOS et al., 1999). Conforme VASCONCELOS & ARAÚJO (1994), os “blooms”, ou florações se caracterizam pela alta concentração de células acumuladas, principalmente em ambientes com águas calmas, baixas velocidades de ventos, altas cargas de nutrientes, temperaturas elevadas e alta luminosidade.

Vários aspectos da fisiologia das cianobactérias têm sido levantados como possíveis causas para sua maior eficiência em relação aos demais componentes fitoplanctônicos em ambientes eutrofizados. Devido a capacidade de flutuar das cianobactérias, providas pela presença de vesículas gasosas, elas se acumulam na superfície, formando verdadeiras “natas”. Segundo IBELINGS et al. (1991), a capacidade de M. aeruginosa em formar colônias, proporciona a habilidade de se acumular na camada superior da zona de mistura, aumentando sua permanência na zona eufótica. Esta característica, além da habilidade em evitar foto-oxidação fazem delas dominantes em lagos rasos no verão. A competição com os demais organismos fitoplanctônicos é evitada pelo fato de possuírem a capacidade de adquirir fósforo do sedimento (PETTERSON et al.,1993).

O aumento da capacidade de flutuação, de acordo com PAERL & USTACH (1982) está relacionada ao aumento do pH. Em seus experimentos, altos valores de pH, evidenciaram o aparecimento de densas natas que se tornam reversíveis com a diminuição do potencial hidrogeniônico. PAERL & USTACH (1982) salientam que em águas alcalinas, com altos valores de pH, a habilidade de cianobactéria em usar CO2, mesmo em níveis muito baixos, as

tornam capazes de dominar as algas eucariontes.

Segundo CARMICHAEL (1992), as cianobactérias possuem pigmentos que permitem utilizar intensidade luminosas baixas pela absorbância à luz sob uma faixa ampla de espectro visível, podendo, desta maneira, crescer em profundidades maiores que as demais algas.

STEINBERG & HARTMANN (1988) salientam que, com turbulência freqüente ou permanente, profundidade de mistura menores que a zona eufótica, razões N|P baixas e altas temperaturas da água, além de altos valores de pH (maiores que 9) e baixa disponibilidade de luz, as cianobactérias são capazes de crescer mais que as “r” estrategistas. Conforme

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REYNOLDS (1986), Microcystis pertence ao grupo de espécies raras que crescem em pH superior a 10. O autor caracteriza este gênero como “k” estrategista, de crescimento lento.

De acordo com REYNOLDS & WALSBY (1975), a temperatura ótima para crescimento de M. aeruginosa é maior que 20°C. Nesta temperatura esta espécie apresenta desempenho melhor que as demais espécies fitoplanctônicas, possuem requerimentos luminosos mais baixos e são favorecidas por baixas razões NT/PT, além de poderem regular sua flutuabilidade, movendo-se verticalmente em ambientes estáveis e otimizando, desta maneira, sua atividade fotossintética, relacionada com a distribuição vertical de nutrientes e energia luminosa.

NOGUEIRA (1997) observou no Lago das Garças (São Paulo) o sucesso de M.

aeruginosa com florações na primavera, em temperaturas entre 22°C e 24°C, diminuição dos valores de transparência, baixas razões NT/PT (%) e grande capacidade desta espécie em permanecer nas camadas iluminadas.

PEARSON (1990) salienta que florações de cianobactérias tem sido registrados em 16 países da Europa. Alguns destes episódios, conforme registrado por HOCHMAN et al., (1985) são bastante freqüentes. VEZIE et al. (1996) estudando 29 locais, incluindo rios, lagos e reservas na Inglaterra, observaram a presença de cianobactérias em 25 deles. A maioria das amostras coletadas em florações eram dominadas por M. aeruginosa. Mais do que 70% das amostras coletadas continham microcistinas, principalmente a variedade LR.

CARMICHAEL (1992) considera Microcystis o grupo mais freqüente nos episódios de florações, sendo muito comuns em ambientes eutrofizados de água doce. KOMÁREK, (1991) descreve o gênero Microcystis como o mais importante dentre as cianobactérias capazes de formar florações. LEE et al. (1999) registrou pela primeira vez a presença de M. aeruginosa em Taiwan. De um total de nove amostras isoladas, seis delas continham microcistinas LR e RR. PAKA & RAO (1997) observaram a presença de florações constantes de M. aeruginosa em um lago indiano (Saroor Nagar lake) associando sua presença com a eutrofização.

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3.1.2 Florações na Lagoa dos Patos, RS

Diversos gêneros de cianobactérias têm sido registrados na Lagoa dos Patos e regiões adjacentes como o delta do Guaíba e região estuarina da lagoa no Estado do Rio Grande do Sul (COUTINHO, 1982; YUNES et al., 1994: 1996; 1998a; CARVALHO, 1999; MATTHIENSEN, 1999). No entanto, na Lagoa dos Patos, densas florações de cianobactérias tóxicas ou não, só foram observadas para a espécie M. aeruginosa (ODEBRECHT et al., 1987; YUNES et al., 1996a; YUNES et al. 1998).

Em trabalhos realizados por YUNES et al. (1998b), foi registrada a presença de M.

aeruginosa, em diferentes estágios de crescimento, ao longo de 213 milhas náuticas, desde o

Guaíba até o estuário da Lagoa dos Patos. A maior concentração observada foi de 500 colônias.L-1. Foram registradas concentrações de microcistinas, avaliadas por HPLC entre 0,01 e 0,12 µg.mg-1 de peso seco de células. No estuário, a quantidade de toxinas presentes em florações ocorridas durante três verões seguidos apresentaram níveis de microcistinas de 0,276 a 0,469 µg.mg-1 de peso seco de células, e quantidades que chegaram a 289 µg.L-1, livres na água.

A presença de M. aeruginosa no estuário da Lagoa dos Patos, mesmo que em concentrações reduzidas, foi registrada por MATTHIENSEN et al. (1999) em todos os meses estudados, entre 1995 e 1996, sendo que as maiores concentrações de células registradas foram de 0,5 e 1,5 x 106 células.L-1. As concentrações de toxinas na água variaram de 0,64 a 244,8 µg.L-1. Nas células, foram observadas concentrações de microcistinas que variaram entre 0,161 e 1,121 µg.mg-1 de peso seco. Para camundongos, foram registrados valores de DL50:24h (Dose letal para 50% dos organismos em 24 horas) entre 141,4 mg/Kg e 35,5 mg.Kg-1. Mais recentemente, entre 1997 e 1998, a mesma dosagem foi realizada e níveis celulares entre 0,4 x 106 céls.L-1 e 1,4 x 106 céls.L-1, com níveis de microcistinas entre 0 e 265,1 µg.L-1.

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3.1.3 Conseqüências da presença de florações de cianobactérias

As principais conseqüências do desenvolvimento e degradação de florescências de cianobactérias, segundo descrito por TORGAN (1989) e VASCONCELOS & ARAÚJO (1994) são alterações das características da água, com modificação da transparência e alterações do gosto, odor e desoxigenação, que podem levar à morte dos diferentes organismos que nela vivem, além da possibilidade de produzir e liberar toxinas.

Existem diversos registros de episódios de envenenamento envolvendo cianobactérias. Para o homem, os efeitos mais graves são atribuídos a presença de hepatotoxinas, que segundo PEARSON (1990) atuam no fígado, provocando efeitos que podem ser letais. Registro de hepatotoxinas como peptídeos foi feito em M. aeruginosa por BISHOP et al. (1959). BELL & CODD (1994) reconhecem que pelo menos 60 toxinas de cianobactérias já foram descritas. No Brasil, AZEVEDO et al. (1998) fizeram os primeiros registros de microcistinas hepatotóxicas, com presença das variantes LR e LF.

Os organismos aquáticos, para estarem expostos ao efeito das toxinas de Microcystis precisam se alimentar das suas células (LAMPERT, 1981 e GILBERT, 1990). De acordo com PEÑALOZA et al. (1990), a toxina de Microcystis é um componente intracelular que pode ser liberado quando ingerido por Daphnia. Segundo PEARSON (1990), as toxinas podem ser liberadas para o meio somente quando as células se rompem, no momento da morte dos indivíduos. Na fase exponencial de crescimento de uma floração, conforme PARK et al. (1998), a concentração intracelular de toxinas em Microcystis é entre 24 e 26 vezes maior que a concentração no meio. A concentração de microcistina só é maior no meio, quando o floração estiver com suas células na fase de senescência.

Muitos experimentos têm sido realizados enfocando o potencial tóxico de cianobactérias para organismos zooplanctônicos. Os resultados, no entanto, têm sido contraditórios (DE BERNARDI & GIUSSANI, 1990; REINIKAINEN et al., 1994). LAMPERT (1987), atribui estas diferenças às propriedades específicas de cada cepa. LAMPERT (1982) e DE MOTT et al. (1991) salientam que diferentes organismos podem apresentar sensibilidade e comportamento diferentes quando em presença de cianobactérias.

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experimento não observaram efeito algum para Moina macrocopa, que foi capaz de se reproduzir normalmente em uma dieta exclusiva desta mesma cianobactéria (HANAZATO, 1984). BOHRER (1995), por outro lado, observou estas duas espécies nas lagoas de estabilização do Pólo Petroquímico do Rio Grande do Sul e associou a predominância de M.

micrura com presença de clorofíceas, enquanto M. macrocopa foi mais abundante na presença

de cianobactérias (Anabaena, Anacystis e Oscillatoria). NANDINE & RAO (1998) avaliaram a toxicidade de M. aeruginosa para diferentes espécies de Cladocera e observaram que enquanto Ceriodaphnia cornuta, Scaphoteberis kingi e Simocephalus vetulus foram capazes de se alimentar normalmente de suas células, M. macrocopa e Daphnia carinata foram extremamente suscetíveis a sua toxina.

REINEKAINEN et al. (1994), verificaram que pequenas quantidades de M. aeruginosa eram suficientes para causar mortalidade em D. pulex. Observaram uma diminuição na sensibilidade, quando em presença de uma fonte alternativa de alimento e em estágios mais jovens de vida. REINEKAINEN et al., (1995b) compararam os efeitos de M. aeruginosa para

D. pulex entre diferentes clones e para outra espécie de Daphnia e observaram sobrevivência

consideravelmente diferente. Diferentemente de D. pulex, D. longispina foi capaz de sobreviver e de se reproduzir em altas concentrações de Microcystis. Avaliando a importância intraespecífica, o autor verificou diferenças significativas no tempo para primeira reprodução, no tamanho da prole e no tamanho dos neonatos quando comparou dois diferentes lotes de D.

pulicaria.

GILBERT (1990) observou diferenças na sobrevivência de dois clones de D. pulex quando expostos a cianobactéria, sugerindo que clones de Daphnia podem se adaptar em lagoas com presença de cianobactéria. REINIKAINEN et al. (1994), compararam duas cepas de D. pulicaria coletadas antes e depois da ocorrência de uma fase de forte dominância de cianobactérias e não observaram diferenças significativas, na taxa de crescimento intrínseco populacional.

Em relação a toxicidade, STANGENBERG (1968) chama atenção para o fato de que células intactas não tiveram efeito sobre Daphnia longispina, enquanto que as células quando deterioradas e suas toxinas liberadas, provocaram redução na sobrevivência. O efeito da toxina quando liberada no meio foi também avaliada por PEÑALOZA et al. (1990). Os autores purificaram, parcialmente, as toxinas extraídas de fitoplâncton dominado por Microcystis e

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observaram seu efeito sobre cladóceros, rotíferos e peixes, constatando níveis de sensibilidade semelhantes nos três grupos.

Avaliando a importância do tamanho da colônia na taxa de ingestão e na utilização das cianobactérias como recurso alimentar pelo zooplâncton, JARVIS et al. (1987) verificaram que cladóceros pequenos, como M. micrura e Ceriodaphnia reticulata, filtraram ineficientemente colônias de Microcystis em todas as faixas de tamanho (de 5 a 100 µm) enquanto os de grande porte como D. pulex foram incapazes de filtrar colônias acima de 100

µm. HANAZATO & YASUNO (1987) verificaram que quando M. micrura era alimentada com grandes colônias não conseguiam reproduzir, mas quando estas colônias eram decompostas em tamanho menor do que 40 µm, essa espécie era capaz de utilizá-las e de manter boa taxa de reprodução.

GILBERT (1990), por sua vez, observou inibição no crescimento populacional de sete espécies de cladóceros quando em presença de filamentos de Anabaena affinis, verificando relação com o maior tamanho dos organismos. Apesar de facilmente relacionado com efeito mecânico, o autor salienta que a mesma relação foi observada quando os organismos eram submetidos à presença destes filamentos rompidos em tamanho variados, que seriam de fácil ingestão por estas espécies.

Além das diferentes sensibilidades atribuídas a diferentes espécies, das características específicas de cada cepa e dos diferentes mecanismos pelos quais as cianobactérias podem interferir no desenvolvimento de organismos aquáticos, outros aspectos podem influenciar na toxicidade das cianobactérias para o zooplâncton.

DEMOTT & MOXTER (1991) observaram que para copépodos, a ingestão de células de cianobactérias depende do estado de nutrição dos indivíduos como do tempo que o animal permaneceu sem alimento antes de ser exposto à presença de cianobactérias. Estes autores demonstraram que a espécie Diaptomus birgei ingeriu mais células da cianobactéria Anabaena

inequalis quanto maior o tempo em que estes animais foram deixados sem alimentação. O

efeito “fome”, portanto, pode levar o animal a ingerir mais cianobactérias tóxicas do que seria seguro, em uma situação de limitação alimentar. GILBERT (1990), avaliando a toxicidade de uma cepa de Anabaena para Rotifera e Cladocera observou que a suscetibilidade de Cladocera foi consideravelmente incrementada da primeira para a segunda geração. O autor atribui esta

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lipídicas de nutrientes, além da possibilidade de a toxina se acumular nos tecidos. LAMPERT (1987) discute a importância do estágio de crescimento da cianobactéria avaliada, salientando que Microcystis na fase estacionária seria mais tóxica que este mesmo cultivo na fase de crescimento exponencial. Da mesma maneira NIZAN (1986) descreve como mais tóxica a fase em que as culturas estão mais velhas.

3.2 Testes de toxicidade

Testes de toxicidade são métodos utilizados na detecção e avaliação da capacidade inerente de um agente em produzir efeitos deletérios nos organismos vivos. Consistem na exposição de organismos vivos padronizados a diferentes concentrações de substâncias químicas, ou qualquer outro tipo de material (formulação, efluentes líquidos e água) que se pretende avaliar, em um determinado período de tempo, e na quantificação dos organismos afetados em cada concentração (GHERARDI-GOLDSTEIN et al., 1990).

Os testes de toxicidade, dependendo de sua aplicação, permitem uma avaliação quantitativa e qualitativa dos efeitos tóxicos de diferentes contaminantes sobre os organismos aquáticos. A escolha de testes com organismos com metodologia padronizada aumenta a sua precisão, incrementa a validade dos dados, permite a repetibilidade do teste e o intercâmbio entre laboratórios.

No ambiente os organismos podem ser expostos a uma substância tóxica de maneira rápida e severa ou de modo contínuo, envolvendo até mesmo períodos que abranjam parte ou todo o seu ciclo de vida. É possível simular estas situações ambientais através de testes para avaliação da toxicidade aguda, onde o organismo é exposto a um agente tóxico durante um curto período de tempo em relação ao seu ciclo de vida; ou através de testes para avaliação da toxicidade crônica, onde um organismo é exposto a diferentes concentrações de um agente tóxico por um longo período de tempo, envolvendo uma parte significativa do seu ciclo de vida ou até várias gerações do mesmo.

Em um teste agudo, o efeito está geralmente associado à morte do organismo ou a alguma outra manifestação do organismo relacionada a ela, como a imobilidade. Para avaliar este tipo de efeito, em geral, utiliza-se a concentração efetiva que causou imobilidade a 50% dos organismos, representada por CE50. No teste crônico, os efeitos nem sempre estão

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associados a mortalidade, relacionando-se a outros aspectos da biologia, tais como desenvolvimento de ovos, crescimento, maturação, reprodução e alterações no comportamento. Os resultados no teste crônico referem-se a concentração do agente tóxico que não causa o efeito observado, representado por CENO (Concentração do Efeito Não Observado) (CETESB, 1992; EPA, 1994).

3.2.1 Organismos-teste

A escolha da espécie a ser utilizada como organismo-teste deve obedecer a critérios específicos. Dentre eles, EPA (1989, 1991) salienta a disponibilidade no ambiente ao longo do tempo, facilidades de coleta, transporte e/ou manutenção no laboratório; tamanho adequado, possibilidade de obtenção de lotes geneticamente estáveis, numerosos e homogêneos, além de representatividade ecológica. A espécie deve, ainda, ter a faixa de sensibilidade determinada para alguma substância de referência.

RAND & PETROCELLI (1985) sugerem a utilização de organismos de um grupo representativo do ecossistema que receberá o impacto. Quanto a isto, a CETESB (1992) recomenda que, sempre que possível, deva-se utilizar espécies autóctones, o que algumas vezes exige adequações nas condições dos testes padronizados, como também a otimização prévia dos cultivos em laboratório.

Os organismos pertencentes ao grupo Cladocera vivem na coluna d'água e são sensíveis a muitos contaminantes. Por este motivo, organismos desta ordem tem sido amplamente utilizados em testes de toxicidade aguda e crônica (CETESB, 1986).

3.2.1.1 Cladocera

Os organismos da Ordem Cladocera são planctônicos apresentando tamanho reduzido e capacidade de locomoção limitada. Vivem quase que exclusivamente em água doce e constituem, juntamente com outros microorganismos, a unidade básica da produção secundária dos ecossistemas aquáticos, formando um importante elo entre o fitoplâncton e os