ISSN 0103-4235 Alim. Nutr., Araraquara
v.20, n.4, p. 533-538, out./dez. 2009
IMOBILIZAÇÃO DE A
SPERGILLUS
SP
. POR ENCAPSULAÇÃO
EM ALGINATO DE CÁLCIO PARA PRODUÇÃO DE
POLIGALACTURONASE*
Márcia Cristina BUENO** Edwil Aparecida de Lucca GATTÁS***
* Trabalho elaborado com apoio fi nanceiro do PADC/FCF/UNESP.
** Programa de Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição – Curso de Mestrado – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP – 14801-902 – Araraquara – SP – Brasil.
*** Departamento de Alimentos e Nutrição – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP – 14801-902 – Araraquara – SP – Brasil. E-mail: gattas@fcfar.unesp.br.
RESUMO: Esporos de três linhagens de Aspergillus sp., isolados do solo, foram imobilizados em alginato de cálcio e crescidos em cultura submersa contendo pectina como única fonte de carbono para a produção de poligalacturo-nase (PG). O micélio imobilizado foi lavado e reutilizado até seis vezes em sistema de produção em batelada sem agitação. Foram estudados a infl uência da concentração do alginato de sódio e do cloreto de cálcio, a quantidade de esferas e tempo de duração de cada ciclo de fermentação. A melhor condição de produção de PG foi obtida usando a concentração de 3% de alginato, 2% de cloreto de cálcio e 10 unidades de esferas contendo 106 esporos/mL, em um tempo de 48 horas para cada ciclo de fermentação. A ati-vidade extracelular de poligalacturonase foi induzida pela pectina e dependente da linhagem do fungo. A máxima atividade da enzima (1,56U/mL) foi obtida no fi ltrado do crescimento do Aspergillus sp. CFCF-0492 após o 2º ciclo de fermentação.
PALAVRAS-CHAVE: Aspergillus; poligalacturonase; imobilização.
INTRODUÇÃO
A poligalacturonase (PG) é uma das enzimas do complexo pectinolítico. Enzimas pectinolíticas são ge-ralmente usadas no processamento industrial de sucos de fruta e vegetais por degradarem pectinas. Além da sua aplicação na redução da turvação em sucos de frutas e extratos vegetais, também são empregadas na extração de óleos e degomagem de fi bras. 4,6,7,13 Os complexos enzi-máticos podem ser usados em misturas contendo pectinas, celuloses e carboidratos em formulações de ração animal, facilitando a assimilação de nutrientes e até melhorando a sua digestibilidade. 1,15,16,17
As enzimas que degradam a molécula de pectina compreendem as hidrolases e as liases. A pectinametiles-terase e a poligalacturonase são enzimas do grupo das hi-drolases e a pectina liase compõe o segundo grupo, agindo
diferentemente sobre o polímero de pectina. A pectina-metilesterase atua especifi camente sobre a molécula de pectina e a poligalacturonase age sobre o ácido poligalac-turônico hidrolisando ligações glicosídicas α-1,4, e a pec-tina liase tem ação sobre a molécula de pecpec-tina altamente ramifi cada.
A produção de enzimas pectinolíticas é descrita para vários microrganismos utilizando fermentação com células livres 3,9 e células imobilizadas. 2,14
A imobilização de enzimas, células e organelas tem-se expandido grandemente nos últimos anos. Os processos de imobilização têm aplicações analíticas, em biotransfor-mação e na área médica em geral. 5 A imobilização de um material biológico é interessante pois substitui a utilização destes materiais na forma solúvel, evitando a necessidade de removê-los do meio da reação para posterior aplicação. Assim, a utilização de enzimas imobilizadas oferece redu-ção de custos, aumento na rapidez de transformaredu-ção e exa-tidão do processo. 5 A teoria do conhecimento e as vanta-gens da imobilização de enzimas num processo tecnológico podem ser aplicadas à imobilização de células. Pashova et al.14 estudaram a indução da produção de poligalacturona-se em Aspergillus niger utilizando sistemas imobilizados de células por oclusão, utilizando alginato de cálcio 3,5%. Os autores obtiveram maiores níveis de atividade de poli-metilgalacturonase do que de poligalacturonase utilizando pectina com alto grau de esterifi cação.
O estudo das condições de imobilização de esporos de fungos e a produção de PG em sistema submerso de cé-lulas imobilizadas com alginato de cálcio foram os objeti-vos deste estudo.
MATERIAL E MÉTODOS Microrganismos
Os fungos utilizados (Aspergillus sp. CFCF-0492, Aspergillus sp. CFCF-HC1 e Aspergillus sp. CFCF-CC1) foram isolados de solo e pertencem ao Laboratório de Tecnologia de Fermentação da FCF, UNESP. 10 Os fungos
foram cultivados por 7 dias a 30° em meio PDA (potato/ dextrose/ágar - Difco). Seus esporos foram submetidos a contagens realizadas em câmara de Neubauer tipo “impro-ved” para serem utilizados no processo de imobilização. Imobilização dos Esporos
Os esporos (da ordem 106 por mL) foram imobi-lizados utilizando-se alginato de sódio segundo metodo-logia modifi cada de Pashova et al.14 O alginato de sódio de concentração fi nal 3% (p/v) foi suspenso em solução tampão fosfato 1M pH 7,0 aquecido a 95°C e em seguida, resfriada a 40°C. A seguir, 5mL da suspensão de esporos (para uma concentração fi nal de 106 esporos/mL) foram adicionados em 15mL da suspensão de alginato de sódio. A pasta (esporo e gel de alginato) foi transferida para uma seringa de volume de 20mL e a seguir, foi gotejada so-bre uma solução de CaCl2 2,0% (p/v), permanecendo em repouso por 2 horas a 4°C. Após 3 sucessivas lavagens das esferas de polímero de alginato de cálcio/esporos com água destilada estéril, mediu-se o volume corresponden-te a 10 esferas imobilizadas e procedeu-se sua adição ao meio de cultivo, conforme Figura 1.
Condições de Cultura
O meio de cultivo continha 0,2g de MgSO4.7H2O, 0,2g de (NH4)2SO4, 0,05g de KH2PO4 e 2% (m/v) de pec-tina cítrica (Tipo 8105 – Alto metoxil, Citrus Colloids, Limeira, SP.) 2% (m/v). O valor do pH do meio foi ajus-tado a 4,5 e a esterilização realizada por 15min, a 120oC. Um mililitro contendo 10 unidades de esferas de esporos imobilizados foi transferido para um volume fi nal de 50mL de meio. O crescimento foi efetuado em Erlenmeyers de 250mL, sem agitação. Os ensaios da análise de reutilização
das células foram realizados em ciclos de 48 horas, seguido de lavagem com água e as células imobilizadas foram re-alimentadas com novo meio esterilizado. Ao fi nal de cada ciclo de 48 horas, o meio de cultivo foi fi ltrado a vácuo e determinou-se o valor do pH fi nal, teor de proteína total e atividade da poligalacturonase.
Ensaio de Proteínas
O teor de proteínas foi determinado pelo método de Lowry modifi cado11 utilizando-se albumina de soro bovino como padrão.
Ensaio Enzimático da Poligalacturonase
A atividade da poligalacturonase foi determinada nos fi ltrados das culturas de Aspergillus sp. CFCF–0492, CFCF-HC1 e CFCF-CC1 por determinação do conteúdo dos grupos redutores após reação com ácido dinitrosalicí-lico.12 A mistura da reação continha 2,4mL de tampão ci-trato/fosfato, 0,2M, pH 5,0, 0,1mL de extrato de enzima e 2,5mL de pectina cítrica parcialmente metoxilada, 0,25% (Sigma, P-9135). A pré-incubação foi realizada a 35°C por 10 minutos. A reação foi iniciada pela adição do extrato de enzimas e no ensaio controle adicionou-se água no lugar do substrato. Uma unidade de atividade foi considerada como sendo a quantidade de enzima capaz de gerar 1μmol de áci-do galacturônico, por minuto, 35°C.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na primeira fase deste estudo foram avaliadas as concentrações dos reagentes de polimerização e o tempo de repouso das esferas a 4°C. O acompanhamento do ensaio
FIGURA 1 – Tubo de ensaio apresentando o fungo Aspergillus sp CFCF-HC1 com 7 dias de crescimento em meio PDA (A), Imobilização da suspensão de alginato de sódio e esporos misturando-se à solução de cloreto de cálcio (B) ; 8 e (C) esferas sem contato com o meio de cultivo (0 horas) e esferas após 48 horas em meio de cultivo.
foi realizado através de leituras visuais e microscópicas do desenvolvimento de hifas na superfície do meio ao fi nal de 48 horas. Três diferentes concentrações de alginato de sódio (% m/v) foram testadas na presença de 2% e 2,5% (m/v) de cloreto de cálcio (Tabela 1). Alginato de sódio 3% (m/v) e cloreto de cálcio 2% (m/v) representaram as meno-res concentrações dos reagentes com ausência de hifas na superfície do gel após 48 horas de fermentação. Portanto, os ensaios a seguir foram assim realizados. Os ensaios de padronização a seguir foram realizados com o fungo CFC HC1. A presença de hifas foi identifi cada por comparação visual e o símbolo (+++) representa grande quantidade de hifas na superfície do gel enquanto, o símbolo (-) indica ausência de hifas na superfície do gel. Proporcionalmente, nas demais tabelas, o símbolo (+) indica pequena quantida-de quantida-de hifas formadas.
Tabela 1 – Variação da concentração de alginato de sódio e cloreto de cálcio e exame visual da presença de hifas sobre as esferas imobilizadas após crescimento por 48 horas.
Concentração (% p/v)
Presença de hifas na superfície do gel após 48 horas
de fermentação Alginato de sódio Cloreto de cálcio
2,0 2,0 ( +++ ) 2,5 ( +++ ) 3,0 2,0 (-) 2,5 (-) 5,0 2,0 (-) 2,5 (-)
A Tabela 2 mostra a variação do tempo de repouso a 4°C das esferas contendo esporos do fungo CFCF HC1 imobilizados. A ausência de hifas na superfície do meio de crescimento mostra a manutenção do sistema imobiliza-do. A manutenção das esferas de imobilização por 2 horas a 4ºC na presença de cloreto de cálcio foi sufi ciente para impedir o crescimento de hifas na superfície do meio de fermentação.
Tabela 2 – Variação do tempo de repouso das esferas imobi-lizadas a 4°C e exame visual da presença de hifas na super-fície do meio de crescimento do fungo CFCF HC1.
Tempo de repouso das esferas de imobilização a 4°C (horas) Presença de hifas na Superfície do Meio 0,5 ( + ) 1,0 ( + ) 2,0 ( - )
A manutenção de integridade das esferas de imobi-lização no ensaio de fermentação foi dependente do tempo (Tabela 3) e da adição de cloreto de cálcio no meio (Tabela 4). Angelova et al. 2 utilizaram 0,01% de cloreto de cálcio no meio de cultivo de Aspergillus niger a fi m de conseguir a manutenção das esferas de gel de cloreto de cálcio durante a fermentação em culturas agitadas. A Tabela 4 mostra que adição de 0,02% de cloreto de cálcio no meio de fermenta-ção possibilitou a manutenfermenta-ção da integridade das esferas de imobilização com ausência de hifas na superfície do gel por até 6 ciclos de 48 horas de fermentação.
Tabela 3 – Variação do tempo de fermentação e exame vi-sual da presença de hifas sobre a superfície do meio de fer-mentação. Tempo de Fermentação (horas) Presença de hifas na Superfície do Meio 12 ( - ) 24 ( - ) 36 ( - ) 48 ( - ) 72 ( + )
Diferentes quantidades de esferas foram experi-mentadas para a produção de poligalacturonase em meio contendo pectina cítrica a 2% (m/v) como única fonte de carbono. A presença de hifas na superfície do meio de fer-mentação indicou falta de efi ciência da malha do polímero em conter o excesso de esporos, conforme dados da Tabela 5. Frascos de fermentação, contendo 10 esferas de fungos imobilizados, permanecem por até 48 horas sem apresentar
Tabela 4 – Efeito da concentração de cloreto de cálcio no meio de fermentação e exame visual da presen-ça de hifas na superfície do meio de crescimento do fungo CFCF HC1 após ciclos de fermentação de 48 horas.
Adição de cloreto de cálcio
% (p/v)
Número de ciclos de fermentação(a)
ciclo 1 ciclo 2 ciclo 3 ciclo 4 ciclo 5 ciclo 6 ciclo 7
0,00 ( - ) ( + ) ( + ) ( + ) ( + ) ( + ) ( + )
0,01 ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) ( + ) ( + ) ( + )
hifas na superfície do meio. Os ensaios a seguir foram rea-lizados a 35C.
Neste estudo foi possível realizar até seis ciclos de fermentação de 48 horas cada com reaproveitamento das células imobilizadas. Após cada ciclo de fermentação foram analisadas a evolução do pH fi nal do meio, da proteína total e da atividade da poligalacturonase extracelular. A Figura 2 mostra a evolução do pH fi nal e proteína total das fermentações dos três fungos. Todos os ensaios foram iniciados com pH igual a 4,5 atingindo valores fi nais na faixa de 3,4 - 3,6 após o sexto ciclo. A diminuição do pH fi nal do meio, após cada ciclo de fermentação, signifi ca que as culturas estavam ativas. Nossos resultados mostram que a síntese protéica é crescente até o 5°ciclo de fermentação para 02 fungos; exceção está mostrada na linhagem de Aspergillus sp. CFCF-0492, que apresentou uma ligeira queda na síntese protéica após o 4° ciclo de fermentação (Figura 2).
Segundo Pashova et al.,14 o crescimento de células imobilizadas em alginato ocorre em condições de micro en-volvimento e pode determinar diferentes respostas fi sioló-gicas quando comparado com sistemas que utilizam células livres. Culturas de fungos crescidos em sistemas livres pro-duzem normalmente quatro enzimas pectinolíticas: PMG
(endopoligalacturonase), PG (exopoligalacturonase), PE (pectinesterase) e PL (pectinaliase), enquanto que micélios imobilizados são capazes de sintetizar apenas as poligalac-turonases, e estas modifi cações, do ponto de vista fi sioló-gica são devido a limitação de difusão de nutrientes que se aplica no sistema imobilizado.
Crescimentos destes mesmos fungos utilizando esporos livres no meio de fermentação mostraram baixa atividade enzimática na presença de 2% (m/v) de pectina como única fonte de carbono. 6 Pashova et al. 14 também relatam o efeito repressivo da pectina sobre a síntese de enzimas pectinolíticas obtidas de Aspergillus niger imobilizado. Segundo estes autores a pectina exerce efeito repressivo quando sua concentração excede a capacidade de absorção pelo fungo, mostrando que existe um balanço entre repressão e indução catabólica. A manutenção da atividade extracelular é indicador do efeito indutivo exercido pela pectina sobre os três fungos.
A síntese da poligalacturonase apresenta ligeiro aumento até o 5° ciclo de fermentação nos fungos Aspergillus sp. CFCF-HC1 e Aspergillus sp. CFCF-CC1. O fungo Aspergillus sp. CFCF-0492 apresenta diminuição da síntese da enzima após o 2º ciclo de fermentação, como mostra a Figura 3. 1 2 3 4 5 6 0,0 3,0 3,2 3,4 3,6 p H Fi nal Número de Ciclos 1 2 3 4 5 6 0,00 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 Pr ot eí na To ta l (m g/ m L ) Número de Ciclos
FIGURA 2 – Variação do pH fi nal do meio e variação da proteína total em função do número de ciclos de fer-mentação utilizando esporos imobilizados e crescidos na presença de pectina 2%. (■) Aspergillus sp CFCF-HC1, (●) Aspergillus sp CFCF-CC1 e (▲) Aspergillus sp CFCF-0492.
Tabela 5 – Efeito do número de esferas contendo esporos imo-bilizados no meio de fermentação e exame visual da presença de hifas sobre a superfície do meio em função do tempo de fer-mentação.
N° de esferas Imobilizadas por frasco
Tempo de fermentação (h) 24 48 72 10 ( - ) ( - ) ( + ) 20 ( - ) ( + ) ( + ) 50 ( - ) ( + ) ( ++ ) 70 ( - ) ( + ) ( ++ ) + de 100 ( - ) ( + ) ( ++ )
CONCLUSÕES
A otimização das concentrações dos reagentes de imobilização e das condições de cultivo possibilitaram a reutilização das células imobilizadas durante 288 horas de fermentação, com seis ciclos de 48 horas cada. A máxima atividade da enzima (1,56U/mL) foi apresentada no 2° ciclo de fermentação para o Aspergillus sp. CFCF-0492. A ma-nutenção da produção da poligalacturonase pelos três fun-gos, durante os seis ciclos de fermentação, signifi ca plena atividade das células nos meios de produção desta enzima. O sistema submerso que utiliza esporos imobilizados per-mitiu um acúmulo de enzima da ordem de 7,0 unidades/mL para os três fungos estudados. O total de acúmulo de ativi-dade da poligalacturonase após os 6 ciclos de fermentação, além de novos estudos de composição de meio de cultivo destes fungos imobilizados, representam boas perspectivas na continuação desta investigação.
BUENO, M. C.; GATTÁS, E. A. L. Immobilization of Aspergillus sp. for production of polygalacturonase. Alim. Nutr., Araraquara, v.20, n.4, p. 533-538, out./dez. 2009. ABSTRACT: Spores of three soil isolates strains of Aspergillus sp. were immobilized in calcium alginate for the production of extracellular polygalacturonase (PG) grown in submerged cultivation containing pectin only carbon source. The immobilized growing mycelium reused in static back mode during six times. The infl uence of alginate and calcium chloride concentration, spore concentration, and duration of the fermentation cycle on enzyme activity and mycelium growth are reported. The best conditions of PG was reached with 3% (p/v) alginate concentration, 2% (p/v) of calcium chloride ten units of beads containing
106 spores/ml each, and a fermentation cicle time of 48 h. Polygalacturonase production was induced by pectin in the medium, and depending on the fungus strain. The maximum activity of enzyme (1.56U/ml) was in the culture fi ltrates by Aspergillus sp. CFCF 0492 after 2º cicle of fermentation. KEYWORDS: Aspergillus; polygalacturonase; immobilization.
REFERÊNCIAS
ANGELES, C. S. C. Comparison of two commercial 1.
cultures (Saccharomyces cerevisiae) on ruminal fermentation and digestion in sheep fed on cornstover diet. Small Ruminant Res., v. 31, p. 45-50, 1988. ANGELOVA, M.; SHEREMETSKA, P.; LEKOV, M. 2.
Enhanced polymethylgalacturonase production from Aspergillus niger 26 by calcium alginate immobilization. Proc. Biochem., v. 33, n. 3, p. 299-305, 1998.
ANTIER, P. et al. Pectinase-hiperproducing mutants of 3.
Aspergillus niger C28B25 for solid state fermentation of coffee pulp. Enz. Microb. Technol., v. 15, p. 254-260, 1993.
BACARAT, M. C. et al. Growth condictions of a 4.
pectinolytic Aspergillus fulmigatus for degumming of natural fi bres. Biotechnol. Lett., v. 13, p. 693-696, 1991.
BICKERSTAFF, G. F. (Ed.)
5. Immobilization of
enzymes and cells. New Jersey: Humana, 1997. 367p. BUENO, M. C.; PERES, M. F. S.; GATTÁS, E. A. L. 6.
Produção de poligalacturonase por três linhagens de Aspergillus sp. isolados do solo. Alim. Nutr., v. 16, n. 3, p. 253-257, 2005. 1 2 3 4 5 6 0,0 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 A ti v id a d e d a P G (U /m L ) Número de Ciclos 1 2 3 4 5 6 0,0 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 A ti v id a d e d a P G (U /m g ) Número de Ciclos
FIGURA 3 – Variação da atividade (U/mL) e da atividade específi ca (U/mg) da poligalacturonase em função do nú-mero de ciclos de fermentação em meio contendo 2% de pectina. (■) Aspergillus sp. CFCF-HC1, (●) Aspergillus sp. CFCF-CC1 e (▲) Aspergillus sp. CFCF-0492.
DINU, D. et al. Enzymes with new biochemical 7.
properties in the pectinolytic complex produced by Aspergillus niger MIUG 16. J. Biotechnol., v. 131, p. 28-137, 2007.
FRASER, J. E.; BICKERSTAFF, G. F. Entrapment 8.
in calcium alginate. In: BICKERSTAFF, G. F. (Ed.) Immobilization of enzymes and cells. New Jersey: Humana, 1997. 367p.
GALIOTOU-PANAYOTOU, M.; KAPANTAI, M.; 9.
KALANTZI, O. Growth conditions of Aspergillus sp. ATHUM-3482 for polygalacturonase production. Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 47, p. 425-429, 1997. GATTÁS, E. A. L.; CANGUÇU, U. M.; RAMOS, 10.
W. S. Isolamento de fungos produtores de enzimas pectinolíticas. Rev. Ciênc. Farm., v. 24, n. 1, p. 33-37, 2003.
LAYNE E. Spectrophotometric and turbidimetric 11.
methods. In: COLOWICK, S. P.; KAPLAN, N. O. (Ed.) Methods in enzymology. New York: Elsevier Academic, 1957. v. 3, p. 447-450.
MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for 12.
determination of reducing sugars. Anal. Chem., v. 31, p. 4266-4268, 1959.
PANDA, T.; NAIR, R. S.; KUMAR, M. P. Regulation 13.
of synthesis of the pectolytic enzymes of Aspergillus niger. Enz. Microb.Technol., v. 34, p. 466-473, 2004. PASHOVA, S. et al. Induction of polymethylgalactu-14.
ronase biossyntesis by immobilized cells of Aspegillus niger 26. Enz. Microb. Technol., v. 24, p. 535-540, 1999.
TARI, C.; GOGUS, N.; TOKATLI, F. Optimization of 15.
biomass, pellet size and polygalacturonase production by Aspergillus sojae ATCC 20235 using response surface methodology. Enz. Microb. Tecnol., v.40, p. 1108-1116, 2007.
USTOK, F. I.; TARI, C.; GOGUS, N. Solid-state 16.
production of polygalacturonase by Aspergillus sojae ATCC 20235. J. Biotechnol., v. 127, p. 322-334, 2007. YADAV, S. et al. Purifi cation and characterization of 17.
an alkaline pectin lyase from Aspergillus fl avus. Proc. Biochem., v. 43, p. 547-552, 2008.
