ANÁLISE GENÔMICA NA AVICULTURA: RESULTADOS E PERSPEC TIVAS Mônica Corrêa Ledur e Giovani Rota Bertani
Genética e Melhoramento Animal
Embrapa Suínos e Aves, Caixa Postal 21, 89700-000, Concórdia – SC, Brasil email: mledur@cnpsa.embrapa.br
Introdução
Ao contrário da pré-suposição de que características quantitativas são influenciadas por muitos genes de pequeno efeito, Lande (1981) sugeriu que poucos genes poderiam explicar uma proporção relativamente grande da variação genética para características quantitativas. Esses loci são conhecidos como loci que influenciam características quantitativas (QTL). Uma das maiores metas da pesquisa genômica de aves tem sido a identificação e mapeamento de QTL. A detecção de QTL pode ser feita através da análise de todo o genoma, utilizando-se microssatélites (Anderson et al.,1994) ou através de genes candidatos (Short et al., 1997). Vantagens e limitações do uso de genes candidatos e análise de ligação foram discutidas por Rothschild e Soller (1999). Resultados obtidos através da utilização desses procedimentos em aves são descritos por Ledur (2001). Pesquisas ainda são necessárias antes que essas informações possam ser utilizadas na prática. Há um vasto campo de investigação sobre o genoma de aves ainda inexplorado. O objetivo deste trabalho é descrever estudos que vêm sendo realizados em análise genômica de aves no Brasil e suas perspectivas de aplicação em programas de melhoramento.
Mapeamento do genoma
A disponibilidade de um mapa do genoma da galinha, rico em informações sobre marcadores, permite a análise sistemática da natureza da variação genética de características economicamente importantes. Um consenso dos mapas de ligação do genoma de aves existentes foi publicado por Groenen et al. (2000). Nesse mapa, o genoma da galinha apresenta um total de 1889 loci distribuídos em 3800 cM. Uma versão atualizada do mapa de consenso foi publicada por Schmid et al. (2000), contendo 1965 marcadores. Atualmente (13/03/2002) estão incluídos 3236 marcadores no mapa de ligação da galinha (ARKdb: http://www.thearkdb.org/; Hu et al., 2001).
Projeto Brasileiro de Genoma do Frango
A Embrapa Suínos e Aves, juntamente com a ESALQ/USP, estão liderando um esforço nacional para a formação de um Projeto do Genoma do Frango, cujo objetivo inicial é o mapeamento de QTL para várias características de importância econômica. Para isso foram desenvolvidas populações específicas para estudos de mapeamento do genoma avícola. Poucas são as populações para estudos de QTL em aves no mundo.
Populações referência da Embrapa e resultados preliminares
O projeto de análise genômica de aves iniciou em 1999, com a formação de populações F2, a partir do cruzamento recíproco de linhagens divergentes de corte (TT) e postura (CC). Essas populações estão sendo utilizadas para identificar marcadores associados a características de crescimento, consumo, eficiência alimentar e composição e rendimento de carcaça. Antes de formar a população F2, foi realizado um experimento com as linhagens puras TT e CC e os F1 TC e CT, com o objetivo de obter médias e desvios-padrão dos grupos genéticos quando criados como frangos de corte. Essas informações foram utilizadas na decisão de quais características medir na F2. Neste experimento várias características de importância econômica foram medidas, tanto de crescimento quanto de carcaça. Análises bromatológicas foram realizadas para determinação do teor de gordura, proteína, matéria seca e água. Resultados de peso dos órgãos e hematócrito são apresentados na Tabela 1 e os de rendimento de carcaça, peito e gordura na Tabela 2.
Tabela 1. Médias estimadas e erros-padrão para peso corporal aos 41 dias de idade (PC41), do pulmão (PP) e coração (CO) e valores de hematócrito para os diferentes grupos genéticos. Fonte: Ledur et al. (2000b).
Grupos Genéticos PC41 (g) PP (g) CO (g) Hematócrito (%) CC 513,7 ± 37,9 a 9,63 ± 0,54 a 9,19 ± 0,41 32,25 ± 0,50 a TT 2399,0 ± 38,5 b 12,19 ± 0,53 c 8,17 ± 0,40 33,74 ± 0,52 b CT 1573,4 ± 38,2 c 10,94 ± 0,32 b 8,44 ± 0,24 31,40 ± 0,52 a TC 1193,3 ± 38,2 d 11,39 ± 0,33 bc 8,58 ± 0,26 32,52 ± 0,49 ab Médias 1470,3 10,97 8,59 32,12
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente (P>0,05). O PP e o CO foram maiores nos grupos genéticos que tiveram maiores PC41, sendo o PC41 altamente significativo para o peso desses órgãos. Quando o PP e o CO foram ajustados para PC41, houve diferença significativa somente para PP entre os grupos genéticos (Tabela 1). Os valores de hematócrito diferiram entre os grupos genéticos, mas o PC41 não influenciou significativamente essa característica.
Tabela 2. Médias estimadas de peso corporal aos 41 dias de idade (PC41) e rendimentos de carcaça (RC), peito (RP) e gordura (GOR). Fonte: Ledur et al. (2000a).
Grupo Genético PC41 (g) RC (%) RP (%) GOR (%)
CC 513,7 a 64,2 a 14,2 a 0,16 a
TT 2395,4 b 74,6 b 20,4 b 2,41 b
CT 1573,4 c 70,9 c 18,3 c 1,92 c
TC 1193,3 d 70,0 c 17,3 d 1,51 d
Média 1472,6 70,0 17,4 1,65
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente (P>0,05). Os grupos genéticos diferiram significativament e para todas as características avaliadas. TT pesou quase 5 vezes mais que CC aos 41 dias e apresentou maiores RC, RP e GOR. Na Tabela 2 observa-se que CT pesou cerca de 380 g mais que seu recíproco TC. Apesar de não haver diferença significativa no RC entre CT e TC, estes diferiram quanto ao RP e GOR.
Populações F2 (frangos de corte): seis machos da linhagem de postura CC foram cruzados com seis fêmeas da linha macho de corte TT, e seis machos TT foram cruzados com seis fêmeas CC, para produzir populações F1 CT e TC. Um macho e três fêmeas de cada uma das seis famílias de irmãos completos foram usados para gerar animais F2. Cada macho foi acasalado com 3 fêmeas de famílias diferentes, produzindo um total de 100 aves por família de mãe, em cada população, em várias incubações, perfazendo um total de 3600 aves F2. Estas foram criadas como frangos de corte. Médias e desvios-padrão para algumas características avaliadas nos F2 são apresentados na Tabela 3. Estes dados podem ser relacionados com os da Tabela 4, que mostra o peso corporal médio e a conversão alimentar aos 42 dias, de lotes das linhagens parentais TT e CC e de F1s TC e CT.
Tabela 3. Médias e desvios -padrão (DP) para várias características avaliadas nas populações F2 – frango de corte CT (1693 aves) e TC (2012 aves).
CT TC
Características Média D P Média D P
PC42 (g) 1019,59 178,29 1007,03 177,55 Fígado (g) 26,45 4,84 26,99 5,00 Coração (g) 6,46 1,61 6,67 1,61 Moela (g) 25,99 4,49 25,18 4,66 Intestino (cm) 160,94 14,56 156,80 15,67 Rend. carcaça (%) 67,21 3,58 67,41 2,87 Rend. peito (%) 16,23 1,53 16,11 1,26 Rend. coxa (%) 21,27 1,48 21,47 1,29 Rend. gordura (%) 1,53 0,64 1,66 0,63 GP35-41 229,21 63,87 226,56 65,54 CA35-41 2,79 0,74 2,81 0,75
Tabela 4. Peso corporal médio aos 42 dias de idade (P42) e conversão alimentar (CA) de lotes das linhagens parentais TT e CC e de F1s TC e CT.
TT CC TC CT
P42 (g) 2443 521 1210 1517
CA 1,72 2,66 1,93 1,68
Fonte: Zanella et al., 2000.
Genes candidatos: para a análise de genes candidatos foram escolhidos inicialmente genes que atuam no desenvolvimento muscular (MyoD, Myf5, miogenina, miostatina e MRF4), com a finalidade de identificar polimorfismos entre as linhagens parentais, CC e TT. Polimorfismos no gene miostatina foram encontrados (Baron et al., 2002) e estão sendo investigados. O passo seguinte será estudar a associação desses polimorfismos com as características fenotípicas.
Genotipagem seletiva: 27 indivíduos F1 foram genotipados para 102 microssatélites, sendo a média de heterozigosidade para esses marcadores de 0,659 e as do conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) acima de 0,5, indicando que pelo menos 50% dos loci são informativos (Baron et al., 2001). Animais F2 serão selecionados dos extremos de cada família, baseados no peso corporal ajustado para efeitos ambientais, e genotipados para os marcadores mais informativos. Os marcadores associados com as características avaliadas e seus adjacentes serão utilizados para genotipar o restante da população.
População F2 (características reprodutivas ): parte das aves F2 (80 machos e 570 fêmeas; CT e TC) foram criadas como matrizes para avaliação de características reprodutivas, tais como produção de ovos, fertilidade, eclodibilidade, nascimento e características seminais (volume, motilidade, concentração, viabilidade e morfologia), entre outras. Tecidos foram coletados para análises de expressão gênica e características ósseas.
População F3 (problemas metabólicos): aves F3, oriundas da população CT, foram utilizadas em um teste de desafio para problemas metabólicos, com o objetivo de verificar a possibilidade de identificar QTLs para resistência a ascite. O peso corporal foi avaliado ao nascer e aos 14, 35 e 49 dias. Aos 49 dias, o hematócrito e o índice cardíaco foram avaliados.
População F3 (coccidiose) : aves F3 das populações TC e CT foram produzidas para estudos de identificação e mapeamento de QTL para resistência a coccidiose. As aves foram inoculadas com oocistos de E. acervulina aos 7 e 21 dias de idade. Os pesos inicial, aos 7, 14, 21 e 28 dias de idade, produção de oocistos, escore macroscópico e microscópico de lesões, e hematócito aos 28 dias de idade foram mensurados.
População F3 (propriedades funcionais): aves F3 da população TC foram produzidas para avaliação das propriedades funcionais da carne de frango. As aves foram pesadas aos 42 dias, abatidas e o pH da carcaça medido 15 min. após o abate. O peito foi desossado e acondicionado em temperatura de 4°C até 24 post mortem, quando foram realizadas as análises físico-químicas (pH, cor, e capacidade de retenção de água).
Estudos de expressão gênica
Estudos de expressão gênica com as linhagens da Embrapa Suínos e Aves envolveram genes específicos. Genes como MyoD, miogenina e miostatina desempenham papel importante na determinação e diferenciação muscular e foram escolhidos para investigar a possibilidade da existência de diferenças na sua expressão entre as linhagens CC (postura), TT (corte) e LLc (linhagem de corte não selecionada). Neste estudo, diferenças de expressão gênica (à nível de mRNA) durante o desenvolvimento embrionário foram identificadas. Os resultados obtidos foram compatíveis com a função dos genes estudados quando relacionados com o padrão de crescimento muscular das linhagens (Alvares, 2001). Para fortalecer os estudos de expressão gênica e melhor caracterizar os genes expressos nos tecidos das aves, bibliotecas de cDNA foram construídas. Estas bibliotecas possibilitarão o estudo de expressão gênica em grande escala, quando utilizadas para a construção de microarranjos. Isso contribuirá com o projeto de identificação de QTLs que está em andamento, facilitando a dissecação de características poligênicas. Foram construídas bibliotecas de cDNA de somitos, membros, e musculatura peitoral de embriões de aves e será construída a da pituitária. Esta etapa está sendo conduzida em colaboração com o Prof. Luiz Lehmann Coutinho (ESALQ/USP).
Colaboradores e Financiadores
Colaboram com a Embrapa Suínos e Aves no projeto de análise genômica, além da ESALQ/ USP, a Universidade Estadual de Londrina (UEL), a Agroceres S.A., o US Poultry Genome Project, na coordenação do Dr. J. Dodgson, com doação de microssatélites para genotipagem, a Embrapa Gado de Leite e Purdue University. O projeto recebe financiamento do Plano Sul de Pesquisa e Pós -Graduação (CNPq), Prodetab, Embrapa, FAPESP (bolsas de Mestrado e Doutorado) e CNPq (bolsas de Iniciação Científica, Apoio Técnico e Recém-Doutor). Espera-se que mais instituições passem a participar desse esforço para a consolidação de um Projeto Brasileiro do Genoma do Frango, já que o Brasil é um dos maiores produtores e exportadores desse produto em nível mundial.
Perspectivas de aplicação em programas de melhoramento
Estudos de QTL e genes candidatos têm sido bastante explorados em relação a características de produção e qualidade. Marcadores para os genes do hormônio do crescimento (GH) e seu receptor (GHR ) foram associados com mudanças no peso corporal (Feng et al., 1997) e taxa de postura (Kuhnlein et al., 1997). Nagaraja et al. (2000) identificaram um marcador próximo ao gene IGF -I (insuline-like growth factor I) associado com diferenças no peso do ovo e na espessura da casca. Sourdioux et al. (1999) verificaram associação de polimorfismos de genes envolvidos no metabolismo de lipídios com variabilidade na deposição de gordura em perus. Li et al. (2002) verificaram associação significativa entre polimorfismos nos genes da família TGF-beta com várias características de crescimento e desenvolvimento em galinhas. Van Kaam et al. (1999a) identificaram quatro QTLs: 3 deles associados com consumo de ração e outro com consumo de ração ajustado para peso corporal. Van Kaam et al. (1999b) identificaram um QTL com efeito na porcentagem de carcaça e outro que afeta a coloração da carne. Oito QTLs diferentes foram relacionados com qualidade do ovo, produção de ovos, peso corporal e maturidade sexual em poedeiras (Honkatukia et al.,
2000). Tatsuda e Fujinaka (2001) localizaram 2 QTLs relacionados com peso corporal às 13 e 16 semanas de idade.
Em relação a resistência a doenças, o Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC), associado a resposta imune, é um dos poucos exemplos em que a genética molecular e quantitativa têm sido integradas em programas de melhoramento (Dodgson et al, 2000). Com os avanços no mapeamento do genoma avícola, análises de QTL e expressão gênica, muitas descobertas vêm sendo feitas no sentido de identificar e quantificar genes relacionados a resistência às principais doenças em aves.
A salmonela é uma das maiores causas de infecção alimentar em humanos. Ovos e carne estão freqüentemente envolvidos. No melhoramento de aves, esforços vêm sendo feitos para identificar diferenças genéticas para salmonela. Mutações do gene NRAMP1 (natural resistance-associated macrophage protein 1) foram associadas com susceptibilidade a salmonelas (Hu et al, 1997), porém explica apenas uma pequena parte das diferenças observadas. Um novo locus, SAL1, também foi associado a resistência a salmonela (Mariani et al., 2001). A doença de Marek (DM), caracterizada pelo desenvolvimento de tumores, causa perdas econômicas nos sistemas de produção. Diferentes regiões do genoma foram relacionadas a resistência à DM (Vallejo et al., 1998). Neste estudo foram encontrados 5 QTLs relacionados à resistência a Marek. Yonash et al. (1999) encontraram 14 QTLs, sendo que cada QTL explicou cerca de 2 a 10% da variação na resistência a DM. No cromossomo 1 foi identificado um locus associado à resistência a DM, designado MDV1 (Bumstead, 1998). Estudos de expressão gênica também foram incorporados na investigação da resistência a DM (Liu et al. 2001).
A coccidiose impõe um impacto econômico significante na indústria avícola causando perda de peso e mortalidade. Pesquisas vêm sendo realizadas no intuito de identificar QTL para resistência a Coccidiose. Um locus foi associado com produção de oocistos e três outros com crescimento (Zhu et al., 2001). Aspectos genéticos da resposta imune também foram investigados. Yonash et al. (2001) encontraram 3 marcadores associados com a resposta imune contra hemáceas de carneiro e Newcastle (ADL0146), Newcastle (ADL0290) e E. coli (ADL0298). Marcadores ligados a resposta de anticorpos para Salmonela também foram identificados (Kaiser et al., 2002). O grupo de Wageningen vem desenvolvendo estudos visando o mapeamento de loci envolvidos na resistência à ascite. Para tal, avaliaram 12 características relacionadas ao desenvolvimento de ascite em 4433 animais F3 (Groenen et al, 2001). Foram detectados 3 QTLs significativos que afetam várias das características avaliadas.
Todas essas informações, bem como as provenientes de pesquisas que vêm sendo realizadas nesse sentido, serão essenciais para incorporação em programas que visem melhorar a produção e qualidade do produto final. Entretanto, Spelman e Bovenhuis (1998) salientam que para a utilização de QTLs em programas de melhoramento seria importante combinar informações obtidas em diferentes populações ou conduzir estudos de validação destes QTLs. As populações da Embrapa permitem, além de validar QTLs identificados em outras populações, elucidar possíveis diferenças na expressão desses QTLs, uma vez que nossa população é única no Hemisfério Sul, onde as condições de clima e manejo são diferentes das demais populações. Nossas populações foram delineadas para permitir estudos de imprinting. A identificação de loci com efeito de imprinting abre novas perspectivas para cruzamentos, especialmente em espécies que utilizam linhas macho e fêmea em seus esquemas de cruzamento, como em suínos e aves.
Comentário: A doença de Marek (DM) é linfoproliferativa e atinge aves causando grandes perdas econômicas nos sistemas de produção. Está é uma doença causada por um vírus e resulta no desenvolvimento de tumores. Há evidências de que parte da resistência/susceptibilidade é devido à genética dos animais. Diferentes regiões do genoma das aves foram relacionadas a resistência à DM em um estudo de QTL. Neste estudo, duas linhagens de aves foram cruzadas, uma endogâmica DM resistente 63 e uma DM
suscetível 72. Aves F2 com
uma semana de idade foram desafiadas com uma cepa moderadamente patogênica (MDV JM). Quatro diferentes regiões do genoma fora m relacionadas a resistência a DM, sendo que duas destas o efeito foi significativo e em outras foi sugestivo de QTL. Este estudo foi o primeiro a identificar regiões do genoma fora do MHC, que estivesse
relacionada com a resistência a DM (Vallejo et al. 1998).
Considerações Gerais
A aplicação da genética molecular em programas de melhoramento depende do desenvolvimento da genética molecular, da detecção de QTL, da avaliação genética e da seleção assistida por marcadores (MAS). O sucesso da implementação de estratégias para a MAS dependente da ação conjunta dessas áreas (Dekkers, 1999). Será necessária a estimação dos efeitos do QTL em populações comercias, estimação dos efeitos do marcador e QTL dentro de família, bem como a reestimação desses efeitos periodicamente. Mesmo quando o próprio gene for identificado, haverá a necessidade de reestimar seus efeitos regularmente para evitar possíveis associações negativas com outras características, com efeitos ambientais e com a própria composição genética do indivíduo.
Outro passo importante que vem sendo pesquisado é quanto a melhor maneira de incorporar essa informação nas avaliações genéticas para a obtenção do melhor preditor linear não viesado (BLUP) para o valor genético aditivo do QTL identificado e do efeito coletivo dos outros genes de um indivíduo. Dekkers e Chakraborty (2001) derivaram estratégias otimizadas para seleção simultânea sobre um QTL e os efeitos poligênicos. Respostas a seleção após 10 gerações foram comparadas utilizando-se 4 estratégias de seleção: 1) seleção com peso 1 para o QTL, 2) seleção otimizada para o QTL, 3) seleção otimizada para o QTL a cada geração e 4) seleção fenotípica. A seleção otimizada sobre um QTL identificado pode resultar em maiores respostas à seleção, mas o ganho extra tende a ser limitado em certas situações, como por exemplo, a seleção sobre um QTL para uma característica observada em ambos os sexos. Embora a MAS tenha sido bastante avaliada em estudos de simulação, pouca ou nenhuma evidência experimental de sua eficiência tem sido demonstrada em animais de produção (Dekkers et al., 2001).
Avanços na genômica estrutural e funcional, no mapeamento comparativo dos genes de diferentes espécies e na genética quantitativa irão acelerar o processo de descobrimento da função dos genes. A utilização do conjunto dessas informações auxiliará grandemente para o descobrimento dos genes envolvidos no controle de características poligênicas, podendo mudar o paradigma da seleção genética. Isso aumentará as chances de otimizar o ganho genético com o uso da seleção assistida por marcadores em programas de melhoramento, através da avaliação de características fenotípicas não tradicionalmente utilizadas na seleção genética.
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