Revista da FZVA.
LIPÍDIOS NO FÍGADO
A CLINICAL METHOD OF LIVER FAT VALUATION
Carlos Augusto Rigon Rossi1, Sergio Henrique Mioso Cunha2; Mirela Noro3; Marcelo Cecim4
RESUMO
A Lipidose hepática é uma importante desordem metabólica que afeta vacas leiteiras de alta produção. O objetivo do presente estudo foi induzir vários graus de acúmulo de gordura no fígado de camundongos e avaliar um método simples, baseado na flutuação de fragmentos de fígado em soluções com diferentes concentrações de cloreto de sódio (NaCl), para o diagnóstico e quantificação da lipidose hepática. Cento e noventa e cinco camundongos foram alimentados com diferentes dietas energéticas e tratados com dexametasona conjuntamente a um período de restrição alimentar que antecedeu o sacrifício. Foram realizadas quantificações histológicas e bromatológicas dos fígados e análise plasmática da alanina aminotransferase. Os fragmentos hepáticos foram submetidos a flutuação em soluções de NaCl com concentrações variando de 4 a 18 %. Somente os animais mais velhos tornaram-se obesos e mostraram sinais macroscópicos de acúmulo de gordura no fígado, flutuando na menor concentração de solução de NaCl. A coloração do fígado teve correlação direta com a quantificação bromatológica de gordura (r=0,7168; p<0,001); a correlação entre a curva de flutuação e a curva bromatológica (r= -0,7573; p<0,0001). Ao exame histológico, os fragmentos hepáticos que flutuaram nas concentrações 6 e 16 % de soluções de NaCl, representam maior e menor quantidade de gordura, respectivamente. No entanto, o método histológico para quantificação de gordura hepática se mostrou ser uma análise muito subjetiva. Em conclusão, o método desenvolvido oferece uma opção rápida e barata na triagem de enfermidades hepáticas.
Palavras-chave: lipidose hepática, flutuação, camundongo, dieta.
1
. Méd. Vet. MSc, Pós-graduação em Medicina Veterinária. UFSM.
2
Méd. Vet. Ph.D., Prof. Adj. – Dpto Clínica, CCR, UFSM. E-mail: mcecim@lince.hcv.ufsm.br
3
Méd. Vet. MSc., Prof. – Hospital Veterinário, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, UPF.
4
ABSTRACT
Fatty liver is an important metabolic disorder that affects overconditioned dairy cows. The objective of the present study was to induce various degrees of fat accumulation in livers of mice, and to develop a method based on the flotation of liver fragments for the estimation of liver fat content. One hundred and ninety five mice were fed different diets with high fat content and treated with dexametasone during fast prior to sacrifice. Livers were classified according to color. Liver samples were collected for hystometry, biochemical analysis, and flotation in saline solutions of different concentrations. Plasma was saved for determination of alanine aminotransferase activity. Only older mice became obese. Liver fragments floated between 6 and 16% NaCl solutions. Liver color correlated with fat content (r=0,7168; p<0,001) as did the flotation test with fat content. (r= -0,7573; p<0,0001). To the analysis hystometry, the flotation liver fragments in saline solutions of concentrations 6 and 16 %, to represent over and least fat amount. However, the method hystometry to liver fat quantification may be8 ineffective and subjective. Thus, it is concluded that it is possible to induce hepatic lipidosis with changes in diet, and that the test developed can be an aid in the field diagnosis of the disease.
Key words: fatty liver, diagnosis, mice, diet. INTRODUÇÃO
A intensificação nos sistemas de produção animal tem levado a um maior risco de apresentação de alterações metabólicas nos rebanhos, pois o desafio imposto pela grande demanda produtiva favorece o desequilíbrio entre a ingestão de nutrientes, a capacidade para metabolizar esses componentes e os níveis de produção alcançados (GONZÁLEZ et al., 2000).
A lipidose hepática é comum em vacas leiteiras no final da gestação e início da lactação (BRUSS, 1993). Esta enfermidade ocorre em 20-60% das vacas leiteiras de alta produção, como resultado
da diminuída função hepática, do baixo consumo voluntário de alimentos, da menor resistência e recuperação à doenças (HOCQUETTE & BAUCHART et al., 1999).
Vacas leiteiras de alta produção acumulam gordura no tecido adiposo durante o período seco, e seu catabolismo inicia anterior ao parto, aumentando significativamente após este (RUKKWAMSUK et al., 2000). A mobilização de gordura corporal é conseqüência do menor consumo de alimentos nos últimos dias da gestação, levando a um grande aporte de gordura para o fígado, órgão encarregado de transformar
Revista da FZVA. esta gordura em energia (glicose) MELLO
JÚNIOR (s.d.) para o crescimento do feto e produção de leite (BREUKING & WENSING, 1997). Como existe uma relação direta entre o consumo alimentar no período pré e pós-parto, após o parto, a maioria das vacas leiteiras de alta produção não conseguem ingerir a quantidade de energia que precisam para atender suas necessidades nutricionais, desenvolvendo o chamado período de balanço negativo (NEB) (MELLO JÚNIOR, s.d.). Quando a vaca não consegue gerar quantidade suficiente de glicose, ou quando ocorre um déficit de energia no organismo, a gordura armazenada nos depósitos é mobilizada (lipólise) através da enzima lipase hormônio sensível (LHS), a qual é ativada pelo glucagon e hormônio do crescimento. As gorduras provenientes da lipólise, são convertidas em ácidos graxos livres não esterificados (NEFA) e glicerol. O glicerol pode ser usado, no fígado, para produzir glicose ou ser reesterificado com os ácidos graxos livres (FFA) para formar triacilgliceróis (TAG). Estes são depositados nos hepatócitos ou liberados no sangue como lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) (BREUKING & WENSING, 1997). Quando as concentrações de gordura aumentam muito rapidamente, como resultado da intensa lipólise, o fígado não consegue aumentar a
produção de VLDL. Como conseqüência, ocorre o acúmulo de grandes quantidades de gordura no fígado desenvolvendo o quadro de lipidose hepática (RUKKWAMSUK et al., 1999).
De maneira geral, a lipidose hepática tem difícil percepção a campo e limita a produção animal através da baixa rentabilidade da empresa pecuária. Além de acometer várias espécies animais, como ovinos, eqüinos, felinos e bovinos, em vacas leiteiras de alta produção provoca a diminuição da produção leiteira, redução do ganho de peso e condição corporal, aumento do intervalo parto/concepção, diminuição da fertilidade e ocasionalmente a morte.
Dessa forma, buscamos induzir o acúmulo de gordura no fígado de camundongos e desenvolver um método, baseado na flutuação de fragmentos hepáticos, para o diagnóstico e quantificação da lipidose hepática.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 195 camundongos da linhagem suiço-albina, machos, com cerca de 25 dias de idade, pesando entre 25 e 28 gramas, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Santa Maria. Os animais foram alojados em gaiolas plásticas em número de 10 animais
por gaiola, recebendo água e ração Supralab1 ad libitum.
Os camundongos foram divididos em 3 grupos: o grupo 1 (75 animais), foi suplementado com óleo de soja; o grupo 2 (25 animais), recebeu ração comercial imersa em óleo de soja, por 30 dias e aplicação de dexametasona2 (1,6 mg/animal/1Xdia/SC) por 3 dias, juntamente com o período de restrição alimentar e sacrifício com intervalos de 24, 48 e 72 horas. O grupo 3 (95 camundongos) recebeu o mesmo tratamento do grupo 2, passando por restrição alimentar nas 24, 48, 72 e 96 horas e recebendo a administração de dexametasona (2,0 mg/animal/1Xdia SC), por 4 dias, sendo então sacrificados.
Os animais foram sacrificados por decapitação, o sangue foi colhido através de um funil com EDTA, para obtenção de plasma e fígados por necropsia. O plasma obtido foi utilizado para análise bioquímica da enzima alanina aminotransferase3 (ALT). Os fígados colhidos, foram classificados de acordo com a coloração apresentada (de amarelado, marrom claro e marrom avermelhado), dividindo-os em escore numérico 1, 2 e 3, respectivamente. As amostras hepáticas foram posteriormente acondicionadas em formol tamponado para avaliação de gordura através de análise histológica pela coloração de SUDAN III. Para avaliação
bromatológica, amostras de fígado foram congeladas para análise com extrator de Soxhlet e utilizadas para análise de flutuação em diluições com diferentes concentrações de cloreto de sódio (NaCl). Em torno de 0,2 a 0,4cm3 das amostras de fígado foram submetidas ao teste de flutuação em soluções de cloreto de sódio nas concentrações de 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18%. Diferentes fragmentos hepáticos foram completamente imersos em diferentes diluições e registrado em qual concentração, mais baixa de cloreto de sódio, o fragmento hepático flutuou. Para tanto, foram compostos 6 grupos de acordo com as flutuações nas diferentes concentrações das soluções NaCl.
Para análise estatística da presença de gordura, flutuação, dosagem de ALT e coloração do fígado, foram utilizados estudos de regressão linear e correlação de Pearson, através do programa computacional “Statistica” versão 6.0.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Utilizou-se a dexametasona para que esta mimetizasse a demanda energética de vacas leiteiras em pico lactacional, aumentando a mobilização de gordura para o fígado.
Os fígados do escore numérico 1 (Figura 2), flutuaram nas concentrações de cloreto de sódio de 6 e 8% (figura 1); os
Revista da FZVA. que flutuaram nas concentrações de 10 e
12% tinham um escore 2 e os que flutuaram nas concentrações de 14 e 16% tinham um escore 3, sendo classificados como sadios, (r=0,9348; p<0,0001). Os fígados, de acordo com os respectivos escores, quando comparados com a análise bromatológica pelo método com extrator de Soxhlet, apresentaram uma correlação de r= 0,7168 (p<0,001) (Figura 3).
De acordo com os resultados obtidos pela dosagem de alanina aminotransferase (ALT), não houve dano hepático. Optou-se por dosar ALT, pois esta enzima é melhor correlacionaria com dano hepático em camundongos, no entanto, os valores encontrados nos grupos 1, 2 e 3 não diferiram dos do grupo controle.
Soluções [NaCl] em porcentagem
(g % ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
FIGURA 1 - Valores correspondentes ao comparativo dos testes de flutuação (Soluções [NaCl] em porcentagem) e análise bromatológica pelo método com extrator de Soxhlet (g%).
Soluções [NaCl] em porcentagem
E s c o re n u m é ri c o 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
FIGURA 2 - Valores correspondentes ao comparativo dos testes de flutuação (Soluções [NaCl] em porcentagem) e coloração hepática (escore numérico).
Escore numérico (g % ) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,2
FIGURA 3 - Valores correspondentes ao comparativo dos testes de coloração hepática (escore numérico) e análise bromatológica pelo método com extrator de Soxhlet (g%).
As lâminas histológicas, onde os fragmentos hepáticos flutuaram nas concentrações de 6 e 16% de soluções de cloreto de sódio, apresentaram uma maior e menor quantidade de gordura (difusa e centro lobular), respectivamente. Nas lâminas histológicas, onde os fragmentos hepáticos flutuaram nas concentrações de 8, 10, 12 e 14% de soluções de cloreto de sódio, a gordura não estabeleceu um padrão de infiltração e acúmulo de gordura no fígado, tornando o processo de avaliação muito difícil. Fígados contendo grandes quantidades de gordura apresentaram coloração amarelada e ou mais pálida e freqüentemente maiores do que o normal.
O método histológico para quantificação de gordura hepática se mostrou um tanto quanto ineficaz, devido
ao fato de ser uma análise muito subjetiva e de acordo com a citação de COLLINS & REID (1980) o exame histológico se torna dispensável quando é necessário caracterizar o tipo de gordura envolvida.
Conforme as figuras 2 e 3, a comparação do teste de flutuação, análise bromatológica e coloração hepática, apresentaram uma estreita correlação, demonstrando que fragmentos hepáticos com grandes quantidades de gordura, apresentaram coloração amarelada e flutuaram em soluções de cloreto de sódio em menor concentração. Estudos realizados por HERDT et al., (1983) relatam que é possível quantificar a gordura no fígado bovino, pelo método de flutuação de fragmentos, obtidos através de biópsias hepáticas, em soluções de sulfato de cobre e
Revista da FZVA. água quando as amostras são classificadas,
contendo mais de 34%, entre 25 e 34%, entre 25 e 13% e menos de 13% de gordura acumulada.
Através do modelo proposto, foi possível estimar a gordura no fígado através do teste de flutuação, porém, HERDT et al., (1983) relatam quatro concentrações de soluções e o experimento utilizou oito diluições com diferentes concentrações de cloreto de sódio, evidenciando-se uma maior sensibilidade por avaliação (Figura 1).
CONCLUSÕES
O uso de ração comercial para roedores, imersa em óleo vegetal e a dexametasona, induzem lipidose hepática por via metabólica em camundongos sadios. A coloração do fígado apresenta correlação direta com a análise bromatológica da gordura, sendo útil em necropsia. A correlação entre a flutuação e a análise bromatológica, indica que a primeira, tem sensibilidade suficiente para uso clínico em triagem de enfermidades hepáticas a campo.
FONTES DE AQUISIÇÃO 1
SUPRA LAB – Alisul Ind. Alimentos Ltda., São Leopoldo, RS
2
DEXACORT – Marcolab Ind. de Produtos Veterinários Ltda. Rua C n.º 35 - Jardim Primavera - Duque de Caxias - RJ.
3
BIOCLIN – Rua Teles de Menezes, 92 – fone: (0xx31) 441-5454 – Belo Horizonte – MG.
REFERÊNCIAS
BREUKINK, H.J. & WENSING, T. Pathophysiology of the liver in high yielding dairy cows and its consequences for health and production. Israel Journal
of Veterinary Medicine, Utrecht, the
Netherlans, v. 52, p. 66-71, 1997.
COLLINS R.A., REID I.M. A correlated biochemical and stereological study of periparturient fatty liver in the dairy cow.
Research Veterinary Science, v. 28, p
373-376, 1980.
GONZÁLEZ, F.H.D., BARCELLOS, J., PATIÑO, H.O., et al. Perfil metabólico em
ruminantes- seu uso em nutrição e doenças nutricionais. Porto Alegre, UFRGS. 2000, 106p.
HERDT T.H., GOEDERS L., LIESMAN J.S., EMERY R.S. Test for estimation of bovine hepatic lipid content. Journal
American Veterinary Medical
HOCQUETTE, J.F., BAUCHART, D. Intestinal absorption, blood transport and hepatic and muscle metabolism of fatty acids in preruminant and ruminant animals.
Reproduction Nutritional Development.,
v. 39, p. 27-48, 1999.
MELLO JÚNIOR, C.do A. Manejo nutricional do período de transição para vacas de alta produção. Anais do I simpósio de nutrição animal- bovinos leiteiros.
Revista de Medicina Veterinária e Zootecnia. Online. Capturado em 02 de
julho de 2001. Disponível na internet http://www.creupi.br/revistaveterinária/volu me1/vacas_de_alta_produção.htm
RUKKWSMSUK, T., KRUIP, A.M., MEIJER, G.A.L., et al. Hepatic fatty acid composition in periparturient dairy cows with fatty liver induced by intake of a high energy diet in the dry period. Journal of
Dairy Science, v. 82, p. 280-287, 1999.
RUKKWAMSUK, T., WENSING, T., GEELEN, M.J.H. Effect of overfeeding during the dry period on regulation of adipose tissue metabolism in dairy cows during the periparturient period. Journal of
