UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA
FACULDADE DE ENGENHARIAS, ARQUITETURA E URBANISMO
CURSO DE ENGENHARIA QUÍMICA
ESTUDO DE FILMES DE CARBONO TIPO DIAMANTE CONTENDO ÓLEO DE CRAVO
Barbara Ferreira Camelo – 01210171 Larissa Cristina Sant’Ana da Cruz – 01210974
Profª. Drª. Lúcia Vieira Orientadora
RESUMO
Neste trabalho foi proposto o estudo da produção de filmes de carbono aderentes do tipo DLC (diamond-like carbon), contendo propriedades químicas do óleo essencial de cravo, o qual possui como substância majoritária o eugenol. A produção do filme de DLC neste trabalho foi feita com uso da técnica de deposição química na fase vapor assistido por plasma (PECVD). A caracterização dos filmes foi feito quanto a estrutura química do filme de DLC e quanto a presença de radicais de eugenol por meio de espectroscopia Raman. Quanto a análise da rugosidade e morfologia do filme de DLC, utilizou-se a técnica de perfilometria óptica e microscopia eletrônica de varredura (MEV), respectivamente.Estes filmes foram estudados para o uso como agentes de prevenção da formação de biofilmes de Candida albicans. Os biofilmes foram produzidos em erlenmeyer contendo amostras de poliuretano, com e sem o filme de DLC e com filme de DLC contendo oléo de cravo utilizando suspensões fúngicas de C.albicans, da ordem de 0,5 da escala de Mac Farland em caldo Sabouraud, cultivadas por 48 horas em shaker.Após este periodo as amostras foram analisadas comparativamente por meio da contagem de unidades formadoras de colônias (UFCs), para averiguar a inibição da formação do biofilme na superficie das amostras.Foi estudado também a concentração inibitória mínima (CIM) do óleo de cravo necessária para inibibir a proliferação da C.albicans e para isto realizou-se testes de difusão em disco, utilizando discos de papel filtro estéreis. Estes estudos indicam a concentração mínima necessária do óleo de cravo para que ocorra a inibição do crescimento de C.albicans. Os principais resultados observados foram nos testes de caracterização dos filmes utilizando a técnica de espectroscopia Raman, MEV e o teste de avaliação do crescimento de biofilme utilizando a contagem das UFCs. A partir dos resultados da espectroscopia Raman, pode-se concluir que o filme de DLC contendo óleo de cravo apresentou o radical do eugenol enquanto o teste do MEV mostrou a morfologia dos filmes de DLC produzidos e a redução do biofilme formado pela C.albicans. Os resultados obtidos para a contagem de UFCs, corroboram com os resultados encontrados na espectroscopia Raman e MEV, onde é possivel verificar que a amostra de C.albicans e filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano apresentou redução da contaminação de 54%.Portanto conclui-se que o filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano foi produzido de maneira eficiente e consequentemente obteve-se a aderência e ação preventiva de adesão de C.albicans conforme o objetivo proposto neste trabalho.
Palavras-chave: Filme de DLC. Candida albicans. Óleo de cravo.Deposição Química na Fase Vapor Assistido por Plasma – PECVD.
ABSTRACT
In this work the study of the production of adherent carbon films of the type DLC (diamond-like carbon) containing chemical properties of the essential clove oil, which has as major substance eugenol was proposed.The production of the DLC film was done using the technique of chemical deposition by plasma enhanced chemical vapour deposition (PECVD). The characterization of the films was done using the chemical structure of the DLC film and the presence of eugenol radicals by means of Raman spectroscopy. As for the analysis of the roughness and morphology of the DLC film, the technique of optical profilometry and scanning electron microscopy (SEM) were used, respectively. These films have been studied for using as agents to prevent the formation of biofilms of Candida albicans. The biofilms were produced in erlenmeyer flasks containing polyurethane samples, with and without the DLC film and with the DLC film containing clove oil using fungal suspensions of C. albicans, on the order of 0.5 Mac Farland scale in Sabouraud broth, cultivated for 48 hours in shaker. After this period the samples were analyzed comparatively by counting colony forming units (CFUs) to investigate the inhibition of biofilm formation on the surface of the samples. The minimum inhibitory concentration (MIC) of clove oil required to inhibit the proliferation of C. albicans was also studied and for this purpose disk diffusion tests were performed using sterile filter paper disks. These studies indicate the minimum concentration required of clove oil to inhibit C. albicans growth. The main results observed were at the characterization tests of the films using the Raman spectroscopy technique, SEM and the biofilm growth test using the CFU count. From the results of Raman spectroscopy, it can be concluded that the DLC film containing clove oil presented the eugenol radical while the SEM test showed the morphology of the films DLC produced and the reduction of the biofilm formed by C. albicans. The results obtained for the counting of CFUs corroborate with the results found in Raman and SEM spectroscopy. It was possible to verify that the sample of C. albicans and film DLC containing eugenol on polyurethane showed a reduction of 54% in contamination.Therefore, it is concluded that the film DLC containing eugenol on polyurethane was efficiently produced and consequently adhesion and preventive action of C. albicans adhesion was obtained according to the objective proposed in this study.
Keywords: Film of DLC. Candida albicans. Clove oil. Plasma Enhanced Chemical Vapour Deposition – PECVD.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 – HIBRIDIZAÇÕES SP3, SP2 E SP. ... 9
FIGURA 2- ESTRUTURA DO (A) GRAFITE, (B) DIAMANTE, (C) FULERENOS E (D) NANOTUBOS DE CARBONO DE PAREDE SIMPLES. ... 10
FIGURA 3- DESLOCAMENTO DA BANDA D E G. ... 11
FIGURA 4- VARIAÇÃO DO NÚMERO DE ONDA DO PICO G E DA RAZÃO I(D)/I(G) EM FUNÇÃO DO GRAU DE DESORDEM. ... 11
FIGURA 5- DIAGRAMA DE FASE TERNÁRIO PARA LIGAS DE CARBONO AMORFO, HIDROGÊNIO. ... 12
FIGURA 6- ESTRUTURAS DO Β-CARIOFILENO (A), DO EUGENOL (B), DO ISOEUGENOL (C) E DO ACETATO DE EUGENILA (D). ... 13
FIGURA 7- ESQUEMA DO FUNCIONAMENTO DO SISTEMA DE ESCLEROMETRIA. ... 14
FIGURA 8- REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DA MORFOLOGIA DE CANDIDA. ... 15
FIGURA 9- PROCESSO DE COLONIZAÇÃO DO BIOFILME. ... 17
FIGURA 10- SUBSTRATOS DE POLIURETANO. ... 18
FIGURA 11- DESENHO ESQUEMÁTICO DO PROCESSO DE DEPOSIÇÃO DO FILME DE DLC CONTENDO ÓLEO DE CRAVO VIA PECVD. ... 20
FIGURA 12- VARIAÇÃO DO NÚMERO DE ONDA DO PICO G E DA RAZÃO I(D)/I(G)EM FUNÇÃO DO GRAU DE DESORDEM. ... 24
FIGURA 13- MEV DA TRILHA OBTIDA PELA TÉCNICA DE ESCLEROMETRIA NA SUPERFÍCIE DO FILME DE DLC SOBRE POLIURETANO. ... 26
FIGURA 14- MORFOLOGIA E RUGOSIDADE DO POLIURETANO PURO, FILME DE DLC CONTENDO EUGENOL SOBRE POLIURETANO E FILME DE DLC SOBRE POLIURETANO EM 3D. ... 27
FIGURA 15- MORFOLOGIA DO DEGRAU DO FILME DE DLC SOBRE O POLIURETANO. ... 28
FIGURA 16- FOTOMICROGRAFIA OBTIDA POR MEV. ... 30
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- PARÂMETROS DE DEPOSIÇÃO DO FILME DE DLC ... 20 TABELA 2- AJUSTE DA DECONVOLUÇÃO DOS PICOS DO FILME DE DLC. ... 22 TABELA 3- DADOS REFERENTE AO COMPRIMENTO DE ONDA DO PICO G E A INTENSIDADE DO PICO D E
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1- DECONVOLUÇÃO DOS PICOS DO FILME DE DLC. ... 23 GRÁFICO 2- DESLOCAMENTO RAMAN DO POLIURETANO PURO E DO POLIURETANO CONTENDO FILME
DE DLC COM EUGENOL. ... 25 GRÁFICO 3- RESULTADO DAS UNIDADES FORMADORAS DE COLÔNIA (UFC/ML). ... 29
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS
DLC Diamond-like carbon
a-C Carbono amorfo
a-C:H Carbono hidrogenado ta-C Carbono amorfo tetraédrico
ta-C:H Carbono amorfo tetraédrico hidrogenado
PECVD Deposição Química na Fase Vapor Assistido por Plasma PVD Deposição física de vapor
CVD Deposição química em fase vapor C.albicans Candida albicans
UTI Unidades de Terapia Intensiva PTFE Politetrafluoretileno
PU Poliuretano
CLT Cateter venoso central mono lúmen CTDL Cateter venoso central duplo lúmen PICC Uni Lumen Biomedical®
CIM Concentração inibitória mínima FDA Food and Drug Administration
NCCLS National Committe for Clinical Laboratory Standards UNIVAP Universidade do Vale do Paraíba
MEV Microscopia eletrônica de varredura IP&D Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
PBS Tampão fosfato
UFC Unidade formadora de colônia
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 9
2. METODOLOGIA ... 18
2.1 Limpeza dos Substratos Poliméricos ... 18
2.2 Teste de Difusão em Disco ... 18
2.3 Processo de Deposição ... 19
2.4 Formação do Biofilme ... 21
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 22
4. CONCLUSÃO ... 32
9
1. INTRODUÇÃO
Os filmes de carbonodo tipoDLC (Diamond-like carbon) são classificados como carbono amorfo (a-C), carbono hidrogenado (a-C:H), carbono amorfo tetraédrico (ta-C) e como carbono amorfo tetraédrico hidrogenado (ta-C:H), os quais são considerados como sendo uma forma metaestável de carbono amorfo. O DLC contém uma fração de ligações sp3, e suas propriedades físicas e químicas são próximas as do diamante, como por exemplo, alta dureza mecânica, elevada resistência ao desgaste, estabilidade química, transparência óptica sendo também considerado ótimo semicondutor.[1,2]
Devido as diversas aplicabilidades, podemos formar através da técnica de deposição química na fase vapor assistido por plasma (PECVD) os filmes de DLC. Analisando a estrutura do filme de DLC formado, pode-se encontrar formas alotrópicas, sendo elas grafite, diamante, fulerenos, nanotubos de carbono e carbono amorfo.Isso acontece, pois, o carbono pode existir em três hibridizações diferentes sp3, sp2 e sp, o qual as ligações químicas entre
os átomos possuem diferentes ângulos e comprimentos que resultam em grande quantidade de estruturas, tanto cristalinas como amorfas. A Figura 1 apresenta as hibridizações sp3, sp2e sp e a Figura 2apresenta as diferentes formas alotrópicas. [1,2]
Figura 1 – Hibridizações sp3, sp2 e sp.
10 Figura 2 - Estrutura do (a) grafite, (b) diamante, (c) fulerenos e (d) nanotubos de carbono de parede
simples.
Fonte: BONADIMAN [3].
A proporção de ligações sp2 e sp3 influenciam diretamente as propriedades finais do filme de DLC, desta forma o filme de DLC terá propriedades mecânicas, como por exemplo dureza e módulo de elasticidade melhoradas com o aumento do número de carbonos com hibridizações sp3. A origem da dureza do filme de DLC não se deve somente a ligações do tipo sp3, deve-se levar em consideração as proporções de ligações sp, sp2 e sp3, quantidade de hidrogênio, a natureza e a energia das ligações entre as diferentes espécies. [2] .
O filme de DLC pode apresentar duas contribuições, denominadas de banda D e G. O deslocamento da banda D, denomidado desordem, quando se deslocada para a esquerda indica o aumento da desordem das ligações sp, sp2 e sp3 e a banda G, denominada grafite quando desloca-se para a direita indica o aumento dos aglomerados de cadeias abertas.[1] A Figura 3, apresenta uma imagem do deslocamento das bandas D e G.
11 Figura 3 - Deslocamento da banda D e G.
Fonte: ROBERTSON [1].
Analisando as frações das ligações sp, sp2 e sp3, verifica-se conforme a Figura 4 que a redução da fração de ligações sp2resulta em uma maior desordem cristalina, originando o aumento da fração de ligações sp3. De acordo com o deslocamento da banda D e G, pode-se obter a relação entre o número de ondas do pico G e a razão da intensidade do pico D e G, esta relação é calculada atravéz da expressão I(D)/I(G), o que caracteriza o grau de amorfização
do carbono amorfo.[4]
Figura 4 - Variação do número de onda do pico G e da razão I(D)/I(G) em função do grau de desordem.
Fonte: FERRARI, ROBERTSON [4].
Segundo o diagrama de fase ternário proposto por Jacob e Moller, é possivel verificar em que faixa encontram-se os filmes de DLC, de acordo com a quantidade de ligações sp2 e
12 sp3 e da quantidade de hidrogênio. A presença de hidrogênio nos filmes de DLC é decorrente ao precursor gasoso utilizado no processo de fabricação. Quantidades elevadas de hidrogênio podem formar um filme polimérico, o qual pode a vir prejudicar as propriedades mecanicas do filme de DLC. [2] A Figura 5apresenta o diagrama ternário proposto po Jacob e Moller.
Figura 5 - Diagrama de fase ternário para ligas de carbono amorfo, hidrogênio.
Fonte: DUFRÈNE [2].
Os filmes de DLC podem ser obtidos por meio de várias técnicas e estão classificadas em dois grupos, sendo eles, a deposição física de vapor (PVD) e deposição química em fase vapor (CVD).
A técnica de Deposição química em fase vapor pode ser assistida a plasma (PECVD), sendo o plasma considerado como o quarto estado da matéria, porém esta definição não é adequada, porque a passagem de um gás para a forma de plasma não ocorre através de uma transição de fase bem definida. Os gases contêm íons, elétrons e espécies neutras, o que denomina-se plasma. O mecanismo do plasma acontece quando a adição de calor ou de outra forma de energia faz com que o número significante de átomos libere alguns ou todos os seus elétrons. Estes átomos que perdem os elétrons separados de seus átomos ficam livres para se mover pelo gás, desta forma interagindo com os outros átomos e elétrons. [5] Sendo assim é possível obter os filmes contendo compostos orgânicos ou inorgânicos.
Esta técnica reveste ou modifica a superfície dos materiais melhorando as propriedades sem alterar as características do mesmo.Os reatores da técnica de PECVD são compostos de uma câmara de vácuo, contendo um eletrodo interno e um anodo e a amostra é posicionada sobre o eletrodo interior. [6]
As propriedades físicas dos filmes, podem variar com relação a alguns parâmetros como, potência, pressão de trabalho e temperatura de deposição. O resultado final é
13 influenciado pelos parâmetros utilizados, pois as condições de deposição permitem selecionar as propriedades físicas do filme para a aplicação desejada. [6,7]
O filme de DLC pode ser funcionalizado com a adição de substâncias, como por exemplo, óleo de cânfora[8], dióxido de titânio[9]e também com óleo de cravo, o qual possui ação preventiva da adesão de cepas da espécie C.albicans[10], conforme já descrito na literatura.
O óleo de cravo é proveniente de um botão floral seco, que é originário da árvore Syzygium aromaticum, pertencente da família das mirtáceas (Myrtaceae), a árvore apresenta copa alongada que pode atingir uma média de 8 a 10 metros de altura, com folhas de características ovais, aromáticas e de 7 a 11 cm de comprimento, a cor ideal para coleta das suas flores é a cor avermelhada [11].
A cor do óleo de cravo pode variar de levemente amarelada a incolor e no momento em que o óleo é extraído a sua molécula não apresenta estabilidade na presença da luz, do calor, do ar e da umidade. Por se tratar de uma mistura de compostos orgânicos, uma substância está presente em maior quantidade, no caso do óleo de cravo este componente majoritário é o 4-alil-2-metoxifenol, também conhecido como eugenol. A Figura 6 apresenta as estruturas moleculares dos componentes do óleo de cravo. [11]
Figura 6 - Estruturas do β-cariofileno (A), do eugenol (B), do isoeugenol (C) e do acetato de eugenila (D).
Fonte: AFFONSO [11].
Após a formação de um filme de DLC funcionalizado com óleo de cravo, a superfície deve ser analisada quanto a aderência, estrutura química e quanto a espessura do filme
14 formado, podendo-se utilizar as técnicas de Esclerometria (scratching test), Espectroscopia Raman e Perfilometria Óptica.
A técnica de esclerometria foi descrita pelo geólogo alemão Friedrich Mohs em 1812 e a introdução da ponta de diamante Rochwell C com cone de 120º, foi introduzido por Perry em 1891. Para analisar a dureza dos materiais utilizando a escala de Mohs, faz-se ranhuras com o material mais duro sobre um material mais macio. O teste de ranhuras consiste em ser um processo rápido e eficaz para a medição de cargas críticas, com o intuito de determinar as propriedades de adesão dos revestimentos, bem como o comportamento em aplicações tribológicas. [12]A Figura 7 (a) apresenta uma imagem do microscópio óptico e a ponta do diamante Rockwell C e a Figura 7 (b) apresenta uma imagem esquemática da ponta do diamante Rockweel C, o sensor de emissão acústica e a direção da ranhura.
Figura 7 - Esquema do funcionamento do sistema de esclerometria.
Fonte: VIEIRA [12].
A Espectroscopia Raman, técnica utilizada para avaliar a estrutura química de filmes de DLC, foi descrita pelo físico Chandrasekhara Venkata Raman em 1928 que descobriu os fenômenos de espalhamento inelástico da luz, mais conhecido como efeito Raman. [13]
15 O efeito Raman utiliza a luz dispersa para adquirir conhecimento sobre as vibrações moleculares, as quais podem fornecer informações sobre a estrutura, simetria e ligação da molécula, permitindo assim a análise quantitativa e qualitativa dos componentes de diferentes tipos de materiais. Este efeito ocorre quando o estado vibracional da molécula é alterado, transferindo sua energia, a partir do fóton para a molécula ou vice-versa, desta forma o processo torna-se inelástico. [13]
Esta técnica apresenta diversas vantagens como, por exemplo, não requer a preparação de amostras, sendo assim resulta em economia de custos, consiste em uma técnica não invasiva, é capaz de estudar pequenas partículas, as quais compõem medicamentos formulados com micro cristais e possui curto tempo de análise. [13]
Por meio da técnica de perfilometria óptica é possível medir a rugosidade superficial das amostras, profundidade dos poros e a área superficial de diferentes materiais, sendo uma técnica de não contato, aliada a uma lente interferométrica. [14]
O princípio de funcionamento da perfilometria consiste em um feixe de luz ser dividido em duas partes, sendo que uma parte incide sobre o detector, enquanto a outra parte é direcionada para a amostra e posteriormente para o detector, produzindo então a imagem de interferência, que trará as características sobre a morfologia da superfície referente a amostra analisada. [15]
Conforme a literatura [16] o fungo do gênero Candida ocasiona severas infecções hospitalares. A formação do filme de DLC funcionalizado com o óleo de cravo tende a prevenir a adesão do biofilme proveniente da Candida albicans em dispositivos médicos.[16]
O gênero Candidafaz parte do reino Fungi, filo Eumycota, classe dos Deuteromicetos e apresenta-se em diferentes morfologias como, leveduriforme, pseudo-hifa ou hifa segundo ilustrado na Figura 8. [17]
Figura 8 - Representação esquemática da morfologia de Candida.
16 Microscopicamente a C. albicans apresenta-se na forma unicelular, porém ao invadir tecidos apresenta-se na forma de pseudo-hifa. As colônias podem apresentar aspecto liso ou rugoso, são cremosas e branco-amareladas. Seu crescimento é favorecido em temperaturas que variam entre 20ºC a 38ºC e pH entre 2,5 até 7,5. [16,18]
A C. albicans faz parte da microbiota do ser humano, como o aparelho digestivo, respiratório, mucosa vaginal, oral e tegumento cutâneo, sem causar nenhum dano, porém quando há uma ruptura no balanço normal da microbiota ou do sistema imunológico, aC. Albicans apresenta manifestações agressivas, tornando-se patogênica. [19,20]
As infecções hospitalares por fungos têm aumentado significativamente nas últimas décadas, constituindo um grave problema de saúde pública, sendo o fungo de maior incidência a espécie C.albicans. [21]A infecção por este fungo é considerada grave, visto que a formação de biofilme confere resistência a antifúngicos e ao sistema imunológico do hospedeiro. [22]
O biofilme é uma comunidade microbiana caracterizada pela organização de células, a fase inicial da formação do biofilme denomina-se adesão primária uma vez atingida a distância critica maior que 1 nm, caracterizada pela aproximação do micro-organismo à superfície de adesão. Em um estado mais avançado de adesão um conjunto de fenômenos caracteriza a adesão secundária, onde os micro-organismos fracamente aderidos concluem o processo de adesão produzindo polissacarídeos extracelulares, os quais podem estar ligados a superfície da C.albicans ou são excretados para o meio. [23] E por último, quando as células começam a se confluírem promovendo então um crescimento tridimensional ocorre o processo de maturação do biofilme. [22,23]
Após o processo de maturação, o biofilme apresenta uma massa crítica onde ocorre um equilíbrio dinâmico no qual o crescimento de células está relacionado com a liberação de células com menor possibilidade de locomoção, porém estas encontram-se disponíveis para a colonização de outras superfícies, sendo este o seu principal mecanismo de virulência.
17 Figura 9 - Processo de colonização do biofilme.
Fonte: BIXLER[25].
O biofilme pode aderir em diversas superfícies como tecidos vivos, ambientes industriais em um substrato ou interface e nos dispositivos médicos, os quais são impregnados em uma matriz extracelular de substâncias poliméricas que as próprias células produzem. [18].
O cateter venoso central é um dispositivo médico utilizado em Unidades de Terapia Intensiva (UTI) para a administração de medicamentos, nutrição parental e monitorar os parâmetros fisiológicos dos pacientes, tendo a função de preservar a integridade venosa. Mesmo tendo grandes benefícios para os pacientes, o uso constate do cateter pode apresentar algumas complicações como o risco de infecções locais e sistêmicas. [26]
Os diferentes tipos de cateter levam em consideração os números de lúmens existentes, podendo ter diâmetros diferentes e classificação a partir da sua distância do coração [27]. Os cateteres podem ser fabricados de Politetrafluoretileno (PTFE), Poliuretano (PU) ou Silicone.
Os cateteres que utilizam poliuretano são os cateteres venosos, pois esse material pode ficar mais tempo no paciente e permite a mobilidade das articulações. [28] Pode-se classificar o cateter venoso central como, curta permanência podendo ser do tipo mono ou duplo lúmen (CLT ou CTDL), cateter para hemodiálise ou cateter balão fluxo dirigido e como cateter de longa permanecia sendo semi ou totalmente implantáveis, utilizados em terapia endovenosa prolongada. [27]
Quando o cateter venoso central apresenta contaminação, faz-se necessário realizar a troca do dispositivo médico, isto gera um gasto excessivo, ou seja, utiliza-se uma quantidade que não havia sido programa. Desta forma ocasiona um aumento de custo para a saúde pública. Contudo, para aumentar o tempo de vida dos dispositivos médicos, novas
18 tecnologias vêm sendo estudadas, como por exemplo, o recobrimento de superfícies com filmes de DLC funcionalizados com a adição de substâncias que possuem ação preventiva da adesão de fungos.
O objetivo do presente trabalho corresponde a formação do filme de DLC aderente em superfície de poliuretano contendo eugenol que é o principal constituinte do óleo de cravo, bem como analisar a estrutura química, aderência do filme de DLC com o óleo de cravo e a propriedade de inibição de adesão dos micro-organismos.
2. METODOLOGIA
2.1 Limpeza dos Substratos Poliméricos
Foram utilizados segmentos transparentes de poliuretano na dimensão de 20 mm2com espessura de 2mm adquiridas comercialmente pela empresa 3R Plásticos, que são do tipo daquelas usadas para produzir cateteres PICC - Uni Lumen Biomedical®.
As amostras foram limpas com detergente multienzimático da marca 3M, com a finalidade da remoção de qualquer contaminação presente na amostra. A Figura 10 apresenta uma imagem dos substratos de poliuretano antes da deposição, podendo-se observar que o substrato é transparente e possui uma leve coloração amarelo claro.
Figura 10 - Substratos de poliuretano.
Fonte: O autor.
2.2 Teste de Difusão em Disco
Utilizou-se o óleo essencial de cravo da marca comercial “Phytoterápica”, extraído por meio da destilação por arraste a vapor, isento de impurezas, cor amarelo claro e densidade a 20ºC de 1,046 g/cm3.
19 Para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do óleo essencial de cravo em leveduras de C. albicans foi utilizado o teste de difusão em disco, teste aceito pelo FDA (Food and Drug Administration) e estabelecido como padrão pelo NCCLS (National Committe for Clinical Laboratory Standards). [29]
Para tanto, o óleo de cravo foi diluído em 0,08 % de emulsificante Tween 20 e testado nas seguintes concentrações: 0,6%; 0,7%; 0,8%; 0,9%; 1,0% e 1,1%.
Leveduras de C. albicans foram incubadas por cinco horas a 37°C em caldo Sabouraud, preparado de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante “Kasvi”. Imediatamente antes dos experimentos a viabilidade celular foi determinada por contagem de células coradas com azul de metileno, em câmara de Neubauer. A concentração celular da suspensão fúngica foi ajustada para 107 leveduras por ml.
Placas de Petri estéreis, contendo 20 ml de ágar Sabouraud, previamente testadas para verificação de esterilidade a 37°C por 24 horas, foram semeadas com 100 µL da suspensão fúngica (106 leveduras) e com 150 µl de caldo Sabouraud para facilitar o espalhamento. Em
seguida, discos de papel filtro estéreis com 6 mm de diâmetro foram colocados sobre a superfície do meio, previamente semeado, e a eles foram adicionados 10 µL das diferentes concentrações do óleo essencial. Como controle da viabilidade das leveduras foi utilizado 10 µL da solução de Tween 20 na concentração de 0,08%. As placas foram incubadas a 37°C. Realizou-se a leitura dos halos de inibição com tempo de incubação de 24 e 48 horas.
Os resultados foram avaliados a partir da mensuração dos diâmetros dos halos de inibição de crescimento fúngico em milímetros. Os ensaios foram realizados em triplicata, sendo considerada a média aritmética dos valores obtidos. [30]
2.3 Processo de Deposição
O reator de plasma utilizado foi PECVD, com fonte DC pulsada, que se encontra instalado no Laboratório de Nanotecnologia e Processos a Plasmas do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP).
A deposição do filme de DLC nas amostras de poliuretano ocorreu por meio de duas etapas, na primeira etapa foi realizado o processo da remoção de camadas de óxidos existentes na superfície, essa remoção é realizada utilizando o gás argônio. Na segunda etapa, o processo de deposição iniciou-se com a utilização do gás acetileno para a formação do filme de DLC e o óleo essencial de cravo foi introduzido através da evaporação de uma solução contendo 50% de hexano e 50% de óleo essencial de cravo utilizando um dispositivo de vidro acoplado ao reator.
20 O vapor de hexano contendo o óleo de cravo se dá pela diferença de pressão entre o frasco de vidro e o reator, controlado por um conjunto de válvulas esféricas e agulha. Essa mistura de gases ionizados dentro do reator ao entrar em contato com a amostra forma-se o filme de DLC, conforme mostrado na Figura 11.
Figura 11 - Desenho esquemático do processo de deposição do filme de DLC contendo óleo de cravo via PECVD.
Fonte: O autor.
A Tabela 1 apresenta os parâmetros de fluxo de gás, tempo de deposição, pressão e potência utilizado para a realização da deposição do filme DLC.
Tabela 1 - Parâmetros de deposição do filme de DLC Parâmetros de Deposição de DLC Limpeza Fluxo de Argônio 0,55(sccm) Tempo 20(minutos) Pressão 0,3 a 0,4 (Pa) Potência 24(W) Filme de DLC Acetileno 16(sccm)
Óleo de Cravo da Índia: abertura da
válvula agulha 8,7 (microns)
Tempo 2(horas)
Pressão 0,9 (Pa)
Potência 70(W)
21
2.5 Caracterização do filme de DLC
Para caracterização da amostra, por espectroscopia Raman utilizou-se o equipamento da marca Horiba Scientific com um laser iônico de argônio (λ = 514,5 nm), contendo geometria de retroespalhamento, aplicou-se uma potência de aproximadamente 0,6 mW sobre a amostra e a área do laser foi de aproximadamente 10 µm2, o deslocamento do Raman foi calibrado utilizando o pico do diamante em 1332 cm-1.
A partir da técnica de perfilometria óptica, foi possível medir a rugosidade da amostra tridimensional, utilizando-se um perfilômetro óptico Veeco® modelo NT9100, localizado no Laboratório Associado de Sensores e Materiais do Instituto Nacional de Pesquisas EspaciaisLAS/ INPE.
Para a realização de imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV), as amostras de poliuretano foram colocas em um porta amostras (“stub”) e para auxiliar na condutividade dos elétrons foi realizada a metalização da superfície com banho de ouro na metalizadora modelo K550X (Emitech), em seguida procedeu-se à análise em MEV, o qual consiste em ser um equipamento capaz de reproduzir imagens de alta resolução da superfície de uma amostra. O modelo do equipamento utilizado foi EVO MA 10 (Zeiss) do Laboratório de Microscopia Eletrônica de Varredura do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP).
O ensaio de esclerometria foi realizado utilizando um tribômetro multifuncional da marca Bruker, com uma ponta de diamante do tipo Rockwell C. Para realizar a medição da aderência do filme de DLC, utilizou-se um sensor do tipo strain-gauge, projetado para medir a força normal e a força lateral. A força normal aplicada foi de 0,5 até 5 N, com distância de 10 mm e velocidade de 0,1 mm/s.
2.4 Formação do Biofilme
Para a realização do teste da formação do biofilme, preparou-se suspensões fúngicas de C.albicans, da ordem 0,5 da escala de Mac Farland em caldo Sabouraud.
Posterior ao processo de deposição do filme de DLC, as amostras foram introduzidas em erlenmeyers, com 15 ml das suspensões e incubados a 37ºC por 48 horas, sob agitação constante de 110 rpm em incubadora shaker modelo MA 420 (Marconi). As amostras foram removidas e transferidas do erlenmeyers para tubos contendo tampão fosfato (PBS pH 7,2 ± 0,1) para remover as células não aderidas.
Em seguida, as amostras de poliuretano foram colocadas em novos tubos, contendo 5 ml de PBS, e realizou-se o desprendimento do biofilme, utilizando agitador de tubo tipo vórtex,
22 por 2 minutos e0,1 ml desta suspensão foi semeada em ágar Sabouraud-Dextrose, pela técnica de espalhamento, e incubadas a 37ºC por 48 horas, para a determinação das unidades formadoras de colônia (UFC/ml).
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Para obter características referentes à estrutura química do filme de DLC produzido, faz-se necessário obter o gráfico da deconvolução dos espectros Raman. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 2.
Através das informações obtidas dos ajustes do gráfico da deconvolução foi possível observar as bandas características do filme de DLC, como a banda D, referente à desordem das hibridizações sp,sp2 e sp3está centrada em 1383,41 cm-1 e a literatura indica para a localização da banda D o comprimento de 1350cm-1.A banda G denominada grafite, correspondente ao alongamento das ligações sp2, está centrada em 1545,24cm-1 e a literatura indica para a localização da banda G o comprimento de 1580cm-1.O valor referente ao
segundo harmônico da desordem da banda G é obtido dividindo o valor 2856,89 cm-1por dois,
obtendo-se o comprimento de 1428, 45 cm-1. Portanto de acordo com a Figura 12 é possível
justificar através do valor do comprimento de onda da banda G, que na estrutura química do filme de DLC produzido encontram-se moléculas com características grafíticas.
Tabela 2 - Ajuste da deconvolução dos picos do filme de DLC.
Picos Área Centro COD (R^2)
1 73956,66 1545,24
0,93999
2 104430,64 1383,41
3 8026,74 2856,89
Fonte: O autor.
Os resultados dos valores obtidos na deconvolução dos picos do filme de DLC são apresentados no Gráfico 1. Pode-se observar os picos da banda G apresentado em azul, a banda D apresentado em verde e o segundo harmônico da desordem da banda G em vermelho.
23 Gráfico 1 - Deconvolução dos picos do filme de DLC.
1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 0 100 200 300 400 500 600 700 In te n si d a d e (u .a .) Deslocamento Raman (cm-1) Banda G - Grafite Banda D - Desordem 20 Harmônico do Grafite D G 20 Harmônico do Grafite Fonte: O autor.
Os dados obtidos na Tabela 3 correspondem às informações do gráfico do filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano, pode-se calcular a relação docomprimento de onda da banda G e a razão da intensidade da banda D e G. Esta relação é calculada através da expressão I(D)/I(G), o que caracteriza o grau de amorfização do carbono amorfo, conforme a
literatura.[4]A partir da relação I(D)/I(G) obtém-se o resultado de 1,1, o qualcorresponde ao
aumento da quantidade de ligações sp3 no filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano. Tabela 3 - Dados referente ao comprimento de onda do pico G e a intensidade do pico D e G.
Pico Área Centro COD(R^2)
1 320009,81 1422,72
0,91643
2 134729,8 1559,54
Fonte: O autor.
Através da razão I(D)/I(G) em função do grau de desordem foi possivel identificara
estrutura que os filmes de carbono produzidos se classificam, conforme ilustrado na Figura 12.
Observa-se que a partir dos resultados obtidos na Tabela 2 e 3, o filme de DLC sobre poliuretano apresentou um resultado para a razão I(D)/I(G)de 0,89 já o filme de DLC contendo
24 eugenol sobre poliuretano apresentou uma razão I(D)/I(G) de1,1. Analisando os dois resultados
com base na Figura 12, pode-se observar que os filmes de DLCproduzidos apresentam as mesmas caracteristicas referentes a estrutura do filme de DLC sendo classificados comofilme de carbono amorfo com cadeiais abertas e aneis fechadoscom um aumento na quantidade de ligações sp3.
Figura 12 - Variação do número de onda do pico G e da razão I(D)/I(G) em função do grau de desordem.
Fonte: FERRARI, ROBERTSON [4].
Os resultados da espectroscopia Raman, são apresentados no Gráfico 2, onde foi possível visualizar o espectro da banda G, da banda D, do filme de DLC, do poliuretano puro, do eugenol e do filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano. Observa-se que foi possível comprovar a presença do eugenol através da formação de um ombro, pois o mesmo não foi encontrado no espectro com a presença somente do filme de DLC.
O filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano obteve uma razão de I(D)/I(G)
de1,1,como apresentado nos resultados da Tabela 3. Pode-se observar no espectro um alargamento da banda Dcorrespondente a desordem, o que apresenta uma tendência para o aumento da dureza, devido a formações de filme de carbono amorfo com cadeiais abertas e aneis fechados. Também foi possível verificar no espectro que entorno da região de 3000 cm
-1, pode-se observar um alargamento do pico referente ao 2º harmônico da banda G, o que é
justificado pela contribuição do eugenol no filme de DLC produzido. Na literatura os picos característicos do eugenol se encontram na região entre 700 cm-1 a 1700 cm-1. [31]
25 Gráfico 2 - Deslocamento Raman do poliuretano puro e do poliuretano contendo filme de DLC com
eugenol. 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 0 500 1000 1500 2000 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Deslocamento Raman (cm-1) Banda G Banda D DLC PU- Puro Eugenol DLC+EU+PU Fonte: O autor.
Com o intuito de determinar as propriedades de adesão do filme de DLC contendo eugenol sobre o poliuretano, a Figura 13 apresenta a imagem da trilha obtida pela técnica de esclerometria, onde pode-se verificar que após a realização da ranhura o filme de DLC sofreu a ação da força aplicada pela ponta de diamante Rochwell C na superfície do poliuretano, porém o mesmo não foi removido da superfície. Portanto pode-se comprovar a aderência do filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano.
26 Figura 13 - MEV da Trilha obtida pela técnica de esclerometria na superfície do filme de DLC sobre
poliuretano.
Fonte: O autor.
Os resultados de perfilometria óptica referente a morfologia e a rugosidade do poliuretano puro, filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano e filme de DLC sobre poliuretano são apresentadas na Figura 14.A barra que acompanha os resultados de perfilometria é uma variação de cores de azul e vermelho, onde o azul corresponde ao vale e o vermelho corresponde ao topo, com escala em micrometros.
Nas imagens obtidas observa-se o valor da rugosidade média quadrática (Rq), sendo ela referente ao valor quadrático de todos os desvios obtidos para o perfil de rugosidade R da reta média dentro do comprimento de medição da área avaliada pelo equipamento. [24]
Comparando o resultado de perfilometria óptica do poliuretano puro coma perfilometria ópticado filme de DLC sobre poliuretano, nota-se uma diferença entre as rugosidades, sendo de aproximadamente três vezes maior.Já no comparativo entre o poliuretano puro e o filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano a rugosidade foi duas vezes maior.
Pode-se observar em um comparativo da rugosidade obtida para o filme de DLC sobre poliuretano com o filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano que a presença do eugenol propiciou a redução da rugosidade em 1,5 vezes. Esta redução favoreceu a formação de um filme mais liso, menos propicio a aderência ou incrustação de micro-organismo, conforme indicado na literatura. [25]
27 Figura 14 - Morfologia e rugosidade do poliuretano puro, filme de DLC contendo eugenol sobre
poliuretano e filme de DLC sobre poliuretano em 3D.
Fonte: O autor.
Pode-se observar na Figura 15 duas imagens sendo a imagem (a) referente à morfologia da superfície entre o degrau do poliuretano e do filme de DLC e a imagem (b) apresenta o espectro do degrau da diferença de altura entre o poliuretano e o filme de DLC formado. Observa-sena imagem (a) que a região que contém a presença do filme de DLC resulta em uma rugosidade entre 1 e 2 µm, o que compõem a região com maior rugosidade com aglomerados de filme de DLC e na Figura (b) pode-se observar o resultado obtido de 4,14 µm
28 de espessura, referente à altura conhecida como degrau indicado na lateral da figura, representado pela letra Z circulado em azul.
Figura 15 - Morfologia do degrau do filme de DLC sobre o poliuretano.
Fonte: O autor.
As amostras de poliuretano puro, filme de DLC e Eugenol, foram analisadas em relação as UFCs, conforme apresentado no Gráfico 3, composto pelo eixo Y correspondente a uma escala logarítmica em função das amostras analisadas e no lado direito do gráfico tem-se a sobreposição relativa as porcentagens de redução.
Pode ser visto no Gráfico 3 que o filme de DLC sobre poliuretano teve uma redução de 25% das UFCs enquanto o Eugenol teve uma redução de 54% das UFCs. Esta redução pode
Fil m e de DL C
29 ser atribuida a baixa rugosidade conforme observado nas imagens de perfilometria óptica e pela presença do eugenol conforme detectado pela espectroscopia Raman.
Conforme a literatura[32] o eugenol possui ação preventiva da adesão de biofilmea partir da interação com sua hidrofobicidade, permitindo agir sobre os lipídeos da parede, membrana celular e a mitocôndria alterando a permeabilidade, causando distúrbios nestas estruturas.Desta maneira o eugenol ocasiona fraturas deixando as membranas expostas e extremamente solúveis, bem como o núcleo.[32]
Gráfico 3 - Resultado das unidades formadoras de colônia (UFC/ml).
1 10 100 1000 10000 100000
Poliuretano Puro Filme de DLC Eugenol
Lo g (UFC/m l) 0 20 40 60 80 100 Bio fil m e (%) Fonte: O autor.
Apresenta-se na Figura 16 as imagens das amostras analisadas utilizando a técnica de MEV,a Figura (a) corresponde a amostra de poliuretano puro, a Figura (b) corresponde a amostra de filme de DLC sobre poliuretano, a Figura (c) corresponde a amostra de C. albicans sobre poliuretano,a Figura (d) corresponde a amostra de C. albicans e filme de DLC sobre poliuretano e a Figura (e) corresponde a amostra de C. albicans e filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano.
Pode-se observar na Figura (a) que a superficie do poliuretano encontra-se totalmente limpa e sem contaminação. Nota-se na Figura (b) a modificação da superficie do poliuretano com o total recobrimento pela formação do filme de DLC, sendo possivel visualizar o aumento da rugosidade, quando comparado com a Figura (a).
30 A Figura (c) apresenta a imagem de C.albicans sobre poliuretano, pode-se observar a formação do biofilme na superficie do poliuretano, quando comparado com a Figura (d) correspondente a C.albicans e filme de DLC sobre poliuretano, nota-se uma diminuição da contaminação por C.albicans, uma vez que o próprio filme de DLC pode adquirir efeito fúngicida, como já descrito na literatura.[33]
A Figura (e) apresenta a imagem deC.albicans e filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano pode-se verificar a redução da contamição sobre a superficie do poliuretano, conforme já visto na litertura que o eugenol possui poder de inibir a adesão de C.albicans.
[8]Desta maneira, as imagens do MEV corroboram com os resultados obtidos nas contagens de
UFCs, onde é possivel verificar que o filme de DLC sobre poliuretano, apresentou uma redução de 25% da contaminação por C.albicans e C.albicans e filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano a redução da contaminação foi de 54%. Portanto, confirma-se a eficiência do eugenol como agente preventivo da adesão de C.albicans.
Figura 16 - Fotomicrografia obtida por MEV.
31
(a)
(b)
Realizou-se o teste de difusão em disco para determinar a CIM, como apresentado na Figura 17. A Figura (a) corresponde aos halos formados a partir do óleo essencial de cravo, a esquerda encontra-se o halo obtido para a concentração do óleo essencial de cravo a 25% e a direita encontra-se o halo obtido para o óleo essencial de cravo puro. A Figura (b) apresenta a imagem das placas de petri com os resultados dos testes de difusão em disco, realizados para determinar a CIM.
Pode-se verificar que houve a formação do halo de inibição para todas as concentrações estudadas, a finalidade foi determinar a concentração mínima de inibição do crescimento da C.albicans. Baseando-se na literatura considera-se como CIM dos óleos essenciais, halos de inibição que apresentam diâmetros maiores ou iguais a 8mm. [34]
Portanto para comprovar de fato o diâmetro indicado na literatura, mediu-se os diâmetros dos halos de inibição utilizando o software ImageJ, onde foi possível comprovar que a concentração de 0,7% apresentou um diâmetro de 8,2mm.
Figura 17 - Teste de difusão em disco.
32
4. CONCLUSÃO
Este trabalho de conclusão de curso estudou a formação do filme de DLC em superfície de poliuretano contendo eugenol, onde a aderência, a estrutura química e a propriedade de inibição de adesão dos micro-organismos foram comprovadas a partir dos testes de esclerometria, perfilometriaóptica, MEV, espectroscopia Raman e UFCs.
A partir dos resultados obtidos utilizando as técnicas de esclerometria, perfilometria óptica e MEV, conclui-se que o filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano apresentou-se de maneira aderente, devido a redução da rugosidade obtida, produzindo uma superfície lisa a qual dificulta a adesão da formação do biofilme por C.albicans.
No tocante a estrutura química estudada no teste de espectroscopia Raman, comprova-se a existência do radical eugenol na amostra de filme de DLC contendo óleo de cravo sobre poliuretano, o qual ocasionou um alaragemtno na banda D, que caracteriza o aumento da dureza no filme de DLC produzido, contribuindo na aderência desejada.
Definidas as condições de produção do filme de DLC sobre poliuretano e filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano, analisou-se as amostras quanto a adesão dos micro-organismos, onde comprova-se uma melhora na redução da adesão de C.albicans no filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano, uma vez que este resultado evidencia a ação preventiva do radical eugenol presente no óleo essencial de cravo, conforme a literatura.
Outro aspecto importante observado está relacionado com a CIM necessária para que o óleo essencial de cravo apresente atividade antimicrobiana frente a C.albicans. O teste realizado para a determinação da CIM comprovou a ação antimicrobiana do óleo, porém durante a execução dos testes foi possível observar que o mesmo apresentou-se instável para algumas concentrações testadas, sendo necessário desenvolver estudos mais aprofundados relacionados com a dificuldade de difusão dos óleos essenciais de cravo.
Ainda que exista grande número de pesquisas realizadas com revestimento de DLC sobre superfícies de materiais metálicos, pouco se conhece sobre os revestimentos de DLC em superfícies de materiais poliméricos, como por exemplo o poliuretano. Contudo pode-se concluir que a produção de filme de DLC contendo eugenol sobre poliuretano foi eficiente quanto o objetivo proposto no presente trabalho.
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