FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

ESTUDO DA PRODUÇÃO DE XILITOL EM HIDROLISADO

HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR:

EFEITQ DO pH E DA AERAÇÃO

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca examinadora:

Dr. Silvio Silvério da Silva (presidente) Ora. Maria das Graças A. Felipe

Ora. Francisca Pessoa de França

Estudante:

Tihany Alves Morita

Lorena- SP-Brasil 1998

ESTUDO DA PRODUÇÃO DE XILITOL EM HIDROLISADO

HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR:

EFEITO DO pH E DA AERAÇÃO

Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora

Dr. Silvio Silvério da Silva

Orientador e Presidente da Banca Examinadora

Lorena- SP-Brasil 1998

~~'~

pelo apoio financeiro.

Ao Prof. Sílvio, que além da função de orientador, tornou-se um amigo estimado. Pela confiança em mim depositada e pela orientação recebida.

À Graça e Inês, pelas sugestões e esclarecimentos valiosos, fundamentais para a conclusão deste trabalho.

Aos pesquisadores e amigos Márcio e João Batista, pelos ensinamentos e auxílio constante.

À Rita e Paulinho, pessoas tão especiais, pela inestimável ajuda no trabalho experimental.

Ao grande amigo Ernesto, pelas infindáveis retiradas de amostra, por tantas outras colaborações e pela alegria de, simplesmente viver.

A todos os amigos do GPF, Andréa, Eliana, Flávia, Ely, Francislene,

Sílgia, Luciane, Rodrigo, Lourdes, Denise, Zéa, João Dimas, Nicamor,

Robertinho, Walter, Luciano, Carla, Irene e Pillar, pelos ensinamentos de vida e momentos compartilhados.

A todos os funcionários do DEBIQ que, de um modo ou de outro, são parte deste trabalho e também ao Luís e Osnil, matérias-primas para a obtenção do hidrolisado.

A DEUS, razão de nossa existência e força essencial para a caminhada da vida, sem o qual nada seria possível.

Estudo da Produção de Xilitol em Hidrolisado Hemicelulósico de Bagaço de Cana-de-Açúcar: Efeito do pH e da Aeração. Tihany Alves Morita. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Sílvio Silvério da Silva. (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12.600-000, Lorena, SP, Brasil).

A capacidade da levedura Candida guilliermondii FTI 20037 em fermentar a xilose presente no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana- de-açúcar à xilitol foi avaliada sob diferentes condições de aeração e pH, especificadas segundo um planejamento experimental estatístico. Os experimentos foram conduzidos em reator de bancada BIOFLO Ili com volume útil de 1,25 L à 30 ºC e agitação de â.00 rpm.

Utilizando a metodologia de superfície de resposta foi possível verificar que o fator kLa e a interação entre o kLa e o pH foram significativos sobre o fator de rendimento em xilitol (Y P,s) a um nível de 95 % de confiança. Entretanto, o efeito do controle do pH durante as fermentações não se mostrou significativo sobre o Y Pts- O modelo matemático obtido para essa bioconversão é representado pela equação:

O valor do fator de rendimento em xilitol previsto pelo modelo proposto (y) em condições de P-_Hjoicial 4,6_ não controlado durante o processo e kLa=20 h-1 foi de 0,69 g/g. Para a confirmação da validade do modelo foi

Mestrado. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Sílvio Silvério da Silva. (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12.600-000, Lorena, SP, Brasil).

The capacity of the yeast Candída guíllíermondíi FTI 20037 to ferment the xylose present in sugar cane bagasse hemicellulosic hydrolysate to xylitol was evaluated under different conditions of aeration and pH, according to a statistical factorial design. The experiments were performed in a bench scale fermentar BIOFLO Ili with a volume of 1.25 L, at 30 ºC and agitation of 300 rpm.

Utilizing the response surface methodology made it possible to verify that the effects of the kLa and of the interaction between kLa and pH were significant on the xylitol yield factor (Yp1s) at 95 % confidence level. However,

the effect of pH contrai during the batch fermentations was not significant on the Y Pts- The mathematical model obtained for this bioconversion is represented by the equation:

y

The xylitol yield factor value predicted through the proposed model (y) at initial pH 4.6 not controlled during the process and kLa=20 h" was 0.69 g/g. To confirm the model validity an experiment was performed under these conditions of pH and aeration.

LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS NOMENCLATURA 1- INTRODUÇÃO ---1 2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

---~

-

_---~

2.2.3- Compostos presentes no hidrolisado de bagaço de cana-

-de-açúcar _

2.2.4-Fatores que influenciam

a

2.2.4.1- Concentração inicial de xilose ---

2.2.4.2- Temperatura

_---

2. 2 .4. 3- Fonte de nitrogênio ---

2.2.4.4- Presença de outros açúcares no meio de fermentação _ 2.2.4.5- Idade do inóculo

_---

_---

2.2.4.8- pH _

3- MATERIAIS E MÉTODOS

---

3.1- Preparo do bagaço de cana-de-açúcar para a hidrólise 23

3.2- Obtenção

e

3.6- Meio

e

3.7- Delineamento experimental

_---

3. 8- Pureza das fermentações 27

3.9- Métodos analíticos

_---

3.9. 1- Determinação da concentração de açúcares, xilitol e ácido acético _ 27 3.9.2-Determinação da concentração de furfural e hidroximetilfurfural __ 30

3.9.3- Determinação da concentração celular 30 3. 9. 4- Determinação do coeficiente volumétrico de transferência de

oxigênio (KLa) 30

3.9.5- Determinação dos parâmetros fermentativos 31

4-RESULTADOS E DISCUSSÃO 32

4.1- Caracterização do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-

açúcar 32

4.2- Efeito do pH

e

bagaço de cana-de-açúcar 34

4.3- Análise estatística do efeito do pH

e

hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar 53

5- CONCLUSÕES

---

TABELA 1- Composição(%) de resíduos agrícolas e de madeira (KUHAD,

SINGH, 1993). 5

TABELA 2- Características e propriedades físico-químicas do xilitol (HYVÔ-

NEN et ai., 1982, BAR, 1986) 8

TABELA 3- Fatores e níveis avaliados no planejamento estatístico 28

TABELA 4- Delineamento experimental realizado segundo o planejamento

fatorial 23 28

TABELA 5- Delineamento experimental realizado segundo o planejamento fatorial completo 22 com face centrada 29

TABELA 6- Composição parcial do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar anteriormente (A) e posteriormente (8) à

etapa de concentração 33

TABELA 7-Variação da concentração de glicose e arabinose nas fermenta- ções do hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar em

diferentes condições experimentais 36

TABELA 8- Produção de xilitol e concentração celular das fermenta- ções do hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar em

diferentes condições experimentais 46

TABELA 9- Consumo de ácido acético e pH inicial e final das fermenta- ções do hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar em

diferentes condições experimentais 52

para o fator de rendimento em xilitol segundo o planejamento

fatorial 23 55

TABELA 12-Análise de variância do planejamento fatorial 23 para o

fator de rendimento em xilitol 57

TABELA 13-Análise de variância de regressão para o modelo linear 58

TABELA 14- Fator de rendimento (YP1s) e produtividade volumétrica (Qp) em xilitol de fermentações realizadas segundo o planejamento

fatorial 22 com face centrada 58

TABELA 15- Estimativa dos efeitos, erros-padrão e teste t de "Student" para o fator de rendimento em xilitol segundo o planejamento

fatorial 22 com face centrada 59

TABELA 16-Análise de variância do planejamento fatorial 22 com face

centrada 59

TABELA 17- Coeficientes de regressão, erros-padrão, teste t de "Student" e nível de significância para o modelo representativo do

fator de rendimento em xilitol 60

TABELA 18-Análise de variância de regressão para o modelo represen-

FIGURA 1- Obtenção de xilitol por via química (HYVÔNEN et ai., 1982) 9

FIGURA 2-Via metabólica utilizada na fermentação de xilose por leveduras (GONG, 1983, JEFFRIES, 1983a, PRIOR etal., 1989, TAYLOR

et ai., 1990) 11

FIGURA 3- Reator BIOFLO Ili com 1,25 L de capacidade volumétrica 26

FIGURA 4- Concentração de glicose(-•-) e arabinose (-T-) das fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar nas condições experimentais:

(A)- pH=S,5, kLa=22,5

n:',

(C)- pH=S,5, kLa=22,5 h-1, CC; (D)- pH=S,5, kLa=22,5 h", CC;

(E)- pH=7,0, kLa=10 h-1, SC; (F)- pH=7,0, kLa=35 h-1, SC;

(G)- pH=7,0, ~a=10 h-1, CC; (H)- pH=7,0, kLa=35 h-1, CC;

(1)- pH=7,0, kLa=22,5 h-1, SC; (J)- pH=S,5, kLa=10 h", SC;

(K)- pH=S,5, ~a=35 h", SC; (L)- pH=4,0, ~a=1 O h-1, SC;

(M)- pH=4,0, kLa=35 h-1, SC; (N)- pH=4,0, kLa=10

n:',

(0)- pH=4,0, kLa=35 h-1, CC; (P)- pH=4,0, ~a=22,5 h", SC; __ 37

FIGURA 5- Concentração de células (-o-), xilose (-•-) e xilitol (-o-) das fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar nas condições experimentais:

(A)- pH=4,0, kLa=1 O h", SC; (8)- pH=4,0, ~a=35 h", SC;

(C)- pH=4,0, kLa=10 h-1, CC; (D)- pH=4,0, kLa=35 h", CC;

(E)- pH=S,5, ~a=22,5 h-1, SC; (F)- pH=S,5, ~a=22,5 h-1, SC;

(G)- pH=S,5, kLa=22,5 h", CC; (H)- pH=S,5, kLa=22,5 h", CC;

(1)- pH=4,0, ~a=22,5 h", SC; (J)- pH=7,0, kLa=22,5 h-1, SC;

(K)- pH=7,0, kLa=10 h-1, SC; (L)- pH=7,0, kLa=35 h", SC;

(M)- pH=7,0, ~a=10 h", CC; (N)- pH=7,0, kLa=35 h-1, CC;

(O)- pH=S,5, kLa=10 h",

sc;

,sc

FIGURA 6- Concentração de xilose (-•-), ácido acético (-A-) e pH (-e-) das fermentações do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar nas condições experimentais:

(K)- pH=5,5, ~a=22,5 h-1, SC; (L)- pH=5,5, kLa=22,5 h", CC; (M)- pH=5,5, kLa=22,5 h-1, CC; (N)- pH=4,0, kLa=22,5 h", SC;

(0)- pH=7,0, ~a=22,5 h-1, SC; (P)- pH=5,5, ~a=10 h-1, SC. _48

FIGURA 7- Diagrama de interpretação do efeito de interação entre o

~a e o pH para planejamento fatorial 23 56

FIGURA 8- Superfície de resposta e curvas de nível descritas pelo modelo que representa o fator de rendimento em xilitol de fermentações conduzidas por C. guilliermondíí

em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar 62

FIGURA 9- Concentração de glicose (-11-), xilose (-•-), arabinose (--..-) e ácido acético (-A-) da fermentação descontínua do

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar

em pH inicial 4,6 e ~a= 20 h" 63

FIGURA 10- Concentração de células (-o-) e de xilitol (-o-) e pH (-e-) da fermentação descontínua do hidrolisado hemicelulósico de

Símbolo Definição Unidade kLa Coeficiente volumétrico de transferência de h-1

oxigênio

YP/S Fator de rendimento em xilitol g/g

Qp Produtividade volumétrica em xilitol g/L.h C* Concentração de oxigênio dissolvido na %

saturação

Co2 Concentração de oxigênio dissolvido em % da %

saturação CV Causa de variação

-

-

-

-

-

Os resíduos lignocelulósicos, provenientes da exploração florestal e agrícola, constituem a biomassa mais abundante disponível na terra e sua importância como fonte de energia renovável tem crescido com o aumento dos problemas de poluição ambiental. Devido ao fato da cana-de-açúcar apresentar uma produção da ordem de 286 milhões de toneladas por safra no Brasil, este resíduo, rico em carboidrato, é matéria-prima adequada para ser utilizada em processos tecnológicos para a obtenção de inúmeros produtos de alto valor econômico, como o xilitol.

O xilitol é um poliálcool de cinco carbonos cujos métodos de produção e purificação tem sido estudados devido as suas importantes propriedades como anti-cariogenicidade, alto poder adoçante, ação endotérmica e uso por pacientes portadores de diabetes e deficientes da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase. Devido a essas peculiaridades o xilitol tem sido utilizado em diversos segmentos da indústria nacional e internacional.

A presença de duas enzimas- xilose redutase e xilitol desidrogenase- em microrganismos como a levedura Candida guilliermondii FTI 20037 torna

possível a conversão microbiológica da xilose à xilitol. Dentre os métodos de

obtenção do xilitol como extração a partir de frutas e vegetais e hidrogenação catalítica da xilose purificada obtida de materiais lignocelulósicos, a via biotecnológica é um processo alternativo uma vez que não forma compostos tóxicos e não necessita de prévia purificação da xilose.

A xilose, açúcar precursor para a produção de xilitol, é facilmente

recuperada da fração hemicelulósica dos materiais lignocelulósicos através de

hidrólise ácida, porém, o principal problema em utilizar esses hidrolisados é a

presença de sub-produtos da hidrólise, como furfural, hidroximetilfurfural e ácido acético, os quais são compostos tóxicos inibitórios da atividade

fermentativa. Entretanto, esta inibição tem sido minimizada com tratamentos no hidrolisado previamente à fermentação.

Visando contribuir para o aperfeiçoamento do processo de obtenção do xilitol e complementar o trabalho de pesquisa do Grupo de Processos Fermentativos do Departamento de Biotecnologia (DEBIQ) da FAENQUIL, esse trabalho buscou verificar o efeito do pH e da aeração bem como o efeito da interação entre estes em condições controladas e não controladas de pH, na produção de xilitol por via biotecnológica a partir do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar. Os experimentos que permitiram a avaliação desses efeitos foram baseados em métodos estatísticos, como planejamento fatorial e metodologia de superfície de resposta.

2.1- RESÍDUOS LIGNOCELULÓSICOS

A escassez antecipada de reservas de combustíveis fósseis e o aumento dos problemas de poluição ambiental (MONIRUZZAMAN et ai., 1997) tem atraído atenção para a importância da biomassa oriunda de resíduos agrícolas e florestais. Esta biomassa é a fonte de compostos orgânicos mais abundante presente na biosfera, com uma produção anual de aproximadamente 2 x 1011 toneladas (matéria-seca) (SUBBARAO, BANERJEE,

1986) e apresenta grande potencial para a obtenção de produtos de valor agregado como químicos e combustíveis líquidos (KERN et ai., 1998).

Os materiais lignocelulósicos são compostos por três principais componentes: a celulose (30-50 %), a hemicelulose (20-50 %) e a lignina (15- 35 %) (PEREGO et ai., 1990). A celulose, o componente mais abundante da parede celular dos vegetais, é um polímero linear formado por unidades repetidas de glicose em ligações 13(1-4). A lignina é uma macromolécula composta de arranjos tri-dimensionais de álcoois aromáticos (WHISTLER, RICHARDS, 1970) que atuam como suporte para as fibras de celulose (FENGEL, WEGENER, 1989, KUHAD, SINGH, 1993), porém, não é convertida em açúcares fermentescíveis (LADISCH, 1979). Diferentemente da celulose, a hemicelulose apresenta variabilidade na estrutura e na composição. É um polímero heterogêneo composto principalmente por duas pentoses (xilose e arabinose) e três hexoses (glicose, manose e galactose), juntas com ácidos urônicos (KUHAD, SINGH, 1993). Devido ao fato da hemicelulose ser a segunda fração mais abundante encontrada na natureza, perfazendo até 40 % do material da parede celular dos vegetais (BISARIA, GHOSE, 1981, TAYLOR

matéria-prima de baixo custo para a bioconversão dos açúcares em vários produtos úteis (GONG etal., 1981, MAGEE, KOSARIC, 1985, PARISI, 1989).

A degradação das principais frações poliméricas da lignocelulose em moléculas mais simples é um pré-requisito para a utilização integrada dessa fonte (PARAJÓ et ai., 1997b). A hemicelulose presente na biomassa lignocelulósica pode ser convertida em monossacarídeos por métodos como extração com soluções alcalinas (du TOIT et ai., 1984) ou hidrólise ácida (LADISCH, 1979), enzimática (PARAJÓ et ai., 1997a) e biológica (BISARIA, GHOSE, 1981 ). Segundo JEFFRIES, (1983a) e MAGEE, KOSARIC, (1985), a hidrólise da fração hemicelulósica é facilitada devido à estrutura heterogênea e ao relativo baixo grau de polimerização que esta fração apresenta.

O aumento do custo dos combustíveis energéticos, a necessidade de se controlar a poluição ambiental e a mudança dos valores sociais e culturais do mundo tem alertado todos os países a usar, de modo eficiente, as fontes renováveis e também a intensificar os esforços em reciclar as perdas orgânicas tradicionais (KUHAD, SINGH, 1993). É necessário, portanto, desenvolver novas tecnologias que façam uso dessas fontes de modo econômico e produtivo, sem agredir o meio ambiente.

O emprego da biotecnologia é uma maneira de fazer com que a biomassa agrícola e florestal, rica fonte de carboidratos (MOHANDAS et ai., 1995), se torne um substrato importante para a produção de insumos úteis como fertilizantes (OLIVEIRA, 1980), butanodiol (FRAZER, McCASKEY, 1989), proteína microbiana (MEYER et ai., 1992), etanol (ROBERTO et ai., 1991), furfural (RIPOU et ai., 1990), acetona, ácido acético, butanol (SADDLER et ai.,

1983) e xilitol (FELIPE et ai., 1993).

A composição de alguns dos resíduos lignocelulósicos encontra-se na TABELA 1. Dentre essa diversa biomassa lignocelulósica, o bagaço de cana- da-açúcar, resíduo fibroso obtido após a extração do açúcar da cana-de- açúcar (DOMÍNGUEZ et ai., 1996), atrai particular atenção já que o Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo (ROBERTO et ai., 1995) e que, para cada tonelada de cana processada, obtém-se de 180 à 280 kg de bagaço (SANTANA, SOUZA, 1984). Grande parte desse bagaço é utilizada como

de toneladas por ano (SURGI, 1988).

TABELA 1- Composição(%) de resíduos agrícolas e de madeira (~UHAD,

SINGH, 1993)

Resíduos Hexosanas Pentosanas Lignina Cinzas

Bagaço de cana-de- 33 30 29_ 4 açúcar Palha de cevada 40 20 15 11 Madeira de vidoeiro 40 33 21 4 ("Birch") Sabugo de milho 42 39 14 2 / Talo de milho 35 15 19 5 Casca de amendoim 38 36 16 5 Palha de aveia 41 16 11 12 Madeira de pinheiro 41 10 27 8 Palha de arroz 32 24 13 12 Casca de arroz 36 15 19 20 Serragem 55 14 21 5 Palha de sorgo 33 18 15 10 Palha de trigo 30 24 18 10

2.2- XILITOL

2.2.1- PROPRIEDADES E APLICAÇÕES

O xilitol é um álcool pentahídrico de ocorrência natural em uma ampla variedade de frutas, vegetais e cogumelos (WASHÜTILE et ai., 1973, MAKINEN, SÓDERLING, 1980) e também um metabólito intermediário no metabolismo de humanos (EMODI, 1978), cujas características e propriedades físico-químicas estão apresentadas na TABELA 2. Entre as inúmeras propriedades que o tem tornado importante nos segmentos alimentício e farmacêutico estão a ação endotérmica (EMODI, 1978), poder adoçante superior ao dos poliois comuns (PEPPER, OLINGER, 1988) e igual ao da sacarose (MAKINEN, 1976) e valor calórico reduzido (2,4 cal/g). A molécula de xilitol não apresenta grupos aldeídices ou cetônicos e, portanto, não participa das reações de escurecimento de Maillard (MANZ et ai., 1973). Além dessas características, esse poliol pode ser utilizado por diabéticos e pacientes deficientes da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase, uma vez que a regulação de seu metabolismo não envolve insulina e nem a enzima glicose 6- fosfato desidrogenase (YLIKAHRI, 1979). Resultados preliminares de trabalhos conduzidos por MAKINEN, (1976) indicaram que o consumo de xilitol aumentou a atividade da enzima lactoperoxidase na saliva, a qual desempenha importante papel na defesa do corpo humano contra organismos patogênicos.

No entanto, a propriedade mais importante do xilitol é a anti- cariogenicidade. Estudos realizados por MAKINEN (1976) demonstraram que o uso de uma dieta contendo xilitol reduziu a formação de cáries em aproximadamente 90 % quando comparado a uma dieta com sacarose.

Verificou-se também que, em alguns indivíduos, as lesões superficiais provocadas pelas cáries foram cicatrizadas, indicando uma remineralização ou efeito curativo ( os quais podem ser explicados pelos altos níveis de íons cálcio e fosfato encontrados na saliva secretada durante e depois do consumo de xilitol). Essas qualidades terapêuticas do xilitol são explicadas pelo fato desse

.

(MAKINEN, 1976).

Devido a essas inúmeras propriedades, o xilitol é um composto adequado para ser utilizado em produtos alimentícios com baixas calorias e também na produção de fármacos (PEPPER, OLINGER, 1988).

2.2.2- VIAS DE OBTENÇÃO

Além de ocorrer naturalmente em frutas e vegetais e fazer parte do metabolismo humano, o xilitol poder ser produzido por via química (FIGURA 1 ). Neste processo a solução de xilose purificada é hidrogenada à xilitol em presença de catalisador níquel (JAFFE et ai., 1974, MELAJA, HAMALAi"NEN, 1977), como o níquel Raney (HEIKKILA et ai., 1991 ), resultando em uma mistura de xilitol com outros açúcares e paliais, o que torna necessário extensos passos de separação para remoção destes compostos. Além do mais, o rendimento e a qualidade do xilitol obtido estão relacionados com a pureza da solução inicial de xilose e, portanto, requer passos de purificação complexos desta pentase (SILVA et ai., 1996). A utilização de altas pressões (50 atm) e temperaturas (80-140°C) (HALBORN et ai., 1994), o uso de catalisador de custo elevado e a necessidade de passos de separação e purificação para a remoção de sub-produtos formados no processo químico (MEINANDER et ai., 1994) tornam esta via de obtenção de xilitol um processo de custo elevado, fazendo com que novos métodos de obtenção desse poliol sejam desenvolvidos.

TABELA 2- Características e propriedades físico-químicas do xilitol (HYVÕNEN et ai., 1982, BAR, 1986)

Propriedades Características ou valores Peso molecular Aparência Odor Ponto de fusão Ponto de ebulição pH de uma solução 5 % Densidade de soluções à 1 O e 60 % Solubilidade à 30 ºC Viscosidade de soluções à 1 O e 60 % à 20ºC Calor de dissolução

Índice de refração de solução à 1 O % à25°C

H igroscopicidade

152, 15 g/mol

Pó cristalino de cor branca Nenhum 92-96 ºC 216 ºC 5-7 1 O %: 1,3 g/cm3; 60 %: 1,23 g/cm3 68 g/100 g solução 1 O %: 1,23 cP; 60 %: 20,63 cP -36,6 cal/g 1,3471

Em elevada umidade relativa o xilitol é mais higroscópico do que a sacarose e menos higroscópico do que o sorbitol

r ...

r- - - -

.----1

A descoberta de leveduras fermentadoras de xilose por SCHNEIDER et

ai. (1981) e SLININGER et ai. (1982) no início da década de 80, fez crescer o

interesse nos processos de bioconversão desta pentase. A conversão microbiológica da xilose é um processo seletivo que se mostra promissor para a produção de xilitol, pois além de vários microrganismos serem capazes de converter a xilose presente nos hidrolisados diretamente à xilitol sem prévia purificação da xilose (NIGAM, SINGH, 1995, SILVA et ai., 1996), não há formação de compostos tóxicos (OJAMO et ai., 1988). Deve-se, também, considerar o baixo custo que os hidrolisados hemicelulósicos, substratos para a produção de xilitol, apresentam (NOLLEAU etal., 1995).

A bioconversão xilose-xilitol ocorre pela ação das enzimas intracelulares xilose redutase e xilitol desidrogenase (HEIKKILA et ai., 1991, ROSEIRO et ai., 1991, WEBB, LEE, 1992, NOLLEAU et ai., 1993), induzidas na presença de xilose em microrganismos fermentadores dessa pentase. HOFER et ai. (1971) observaram que nesses microrganismos o xilitol é formado como um produto intermediário metabólico da xilose por duas maneiras: a xilose é isomerizada à D-xilulose pela enzima xilose isomerase e a D-xilulose é então reduzida à xilitol pela xilitol desidrogenase dependente de NAD+ ou através da via de óxido-redução, na qual a xilose é diretamente convertida em xilitol pela ação da xilose redutase dependente de NADPH+. A via de óxido-redução (FIGURA 2) é a mais comum para essa conversão (CHIANG, KNIGHT, 1960) e procede inicialmente através da redução da xilose em presença da enzima xilose redutase dependente de NADPH à xilitol. O xilitol, pela ação da xilitol desidrogenase dependente de NAD, é oxidado à D-xilulose (VANDESKA et ai., 1995a), a qual é então fosforilada à D-xilulose 5-P pela xilulose quinase (LEE

et ai., 1996). A D-xilulose 5-P entra na via das fosfopentoses (NOLLEAU et ai.,

1993) e em conexão com a via glicolítica gera os coenzimas exigidos nas etapas iniciais do metabolismo da xilose.

XRlJLOSE

!

l

/1~

XILULOSE 5-P RIBOSE 5-P DLULOSE 5-P

~ ~~TULOSE~~GLUf:°

:X...

fc.::;~~

rNADPH+----·-

·---+

FIGURA 2- Via metabólica utilizada na fermentação de xilose por leveduras (GONG, 1983, JEFFRIES, 1983b, PRIOR

et ai.,

et ai.,

As espécies de levedura do gênero Candída sp, tais como C. pellículosa

(KITPREECHSVANICH et ai., 1984, NISHIO et ai., 1989),

e.

(VANDESKA et ai., 1995a), C. guíl/íermondíí (BARBOSA et ai., 1988, LEE et ai.,

1988, MEYRIAL et ai., 1991) e C. tropícalís (HORITSU et ai., 1992), a levedura

Pachysolen tannophílus (LEE et ai., 1988) e também alguns fungos e bactérias

como Petromyces albertensís (DAHIYA, 1991), Enterobacter líquefacíens

(YOSHITAKE et ai., 1976), Corynebacteríum sp (YOSHITAKE et ai., 1971) e

Mycobacteríum smegmatis (IZUMORI, TUZAKI, 1988) apresentam potencial

para a produção de xilitol. Entretanto, em trabalho realizado por BARBOSA et

ai. ( 1988) com 44 leveduras, as espécies C. guilliermondii e C. tropícalís se

mostraram as melhores produtoras de xilitol e em função destes resultados, escolheu-se a levedura Candida guílliermondii para conduzir este trabalho.

2.2.3- COMPOSTOS PRESENTES NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

Durante a realização da hidrólise ácida, vários componentes indesejáveis são formados (LADISCH, 1979), os quais, dependendo das condições de fermentação e da concentração em que se encontram, podem inibir a fermentação dos açúcares liberados (LEE, McCASKEY, 1983, WATSON et ai., 1984). Dentre estes componentes estão o furfural e o ácido acético, gerados na degradação da fração hemicelulósica (FRAZER, Me CASKEY, 1989), o hidroximetilfurfural (HAJNY, 1981 ), íons de metais pesados, provenientes da corrosão dos equipamentos, e a lignina solúvel (MAGEE, KOSARIC, 1985).

O ácido acético é um produto derivado dos grupos acetil presentes nos açúcares (TRAN, CHAMBERS, 1985) e o efeito inibitório deste ácido depende de sua concentração e da composição do meio de fermentação (FELIPE et ai., 1997a). Mesmo sendo considerado inibidor do crescimento microbiano e da

A formação de furfural ocorre através da degradação das pentases (HAHN-HAGERDAL et ai., 1991) e é minimizada reduzindo-se a dosagem de ácido e utilizando-se condições brandas de hidrólise (KIM, LEE, 1987). De acordo com SANCHÉZ, BAUTISTA (1988), a toxicidade desse composto depende de sua concentração no meio de cultivo. Em concentrações de até 0,5 g/L, SILVA et ai. (1997c) constataram que o furfural não influenciou a performance fermentativa da levedura C. guilliermondii e em concentrações de 1 g/L de furfural em pH 3,0 e 5,2, LEE, McCASKEY, (1983) verificaram um estímulo no crescimento de P. tannophilus. No entanto, na presença de 0,7 g/L de furfural, a velocidade de consumo de xilose por Candida parapsilosis decresceu duas vezes e a produção celular aumentou nessa mesma proporção em detrimento à produção de xilitol e etanol (PREZIOSI-BELLOY et ai., 1997).

O hidroximetilfurfural, outro composto formado durante a hidrólise, encontra-se geralmente em baixas concentrações nos hidrolisados hemicelulósicos devido ao fato de ser muito reativo. Sob condições favoráveis para sua formação ocorrem reações subsequentes, resultando na formação de outros compostos (HARRIS et ai., 1960). PREZIOSI-BELLOY et ai. (1997) observaram que a presença de 1 ,5 g/L de hidroximetilfurfural em meio contendo uma mistura de açúcares (glicose, manose e xilose) exerceu efeito estimulatório na produção de xilitol e não afetou o tempo total de fermentação. Estes autores também puderam constatar uma rápida adaptação da levedura C. parapsilosis ao ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural individualmente,

já que os mesmos não foram detectados no período de 25 à 50 horas após o início do crescimento. A rápida adaptação desta levedura ao ácido acético, ao furfural e ao hidroximetilfurfural presentes no meio de cultivo separadamente,

sugere a ação cumulativa dos mesmos na inibição da fermentação. Segundo PREZIOSI-BELLOY et ai. (1997), esta inibição verificada em hidrolisados hemicelulósicos, ocorre, provavelmente, através da interferência no consumo dos açúcares e de outros elementos essenciais, uma vez que esses

compostos testados individualmente não explicam a falta de atividade metabólica observada nestes hidrolisados.

Uma maneira de contornar a inibição causada pelos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados é tratá-los, visando eliminar ou reduzir a concentração dos mesmos. Dentre os diversos tratamentos utilizados, os quais tem sido eficientes na remoção dos compostos inibitórios, estão a alteração do pH dos hidrolisados (ROBERTO et ai., 1995), utilização de peneiras moleculares, resinas trocadoras de íons ou carvão (TRAN, CHAMBERS, 1985, GONG et ai., 1993) e a adaptação dos microrganismos ao meio de cultivo (SENE et ai., 1998).

2.2.4- FATORES QUE INFLUENCIAM A BIOCONVERSÃO XILOSE-XILITOL

Para que a exploração comercial / industrial do xilitol seja viável, é de fundamental importância aumentar as taxas de sua produção, o que pode ser conseguido através da otimização dos parâmetros de obtenção desse produto. Entre os vários fatores reguladores da produção de xilitol por via bioteconológica estão a concentração inicial de xilose e a temperatura (GONG

et ai., 1981 ), a fonte de nitrogênio (BARBOSA et ai., 1988), a presença de

outros açúcares no meio de fermentação (BICHO et ai., 1988, SILVA et ai.,

1997c), a idade do inóculo (PFEIFER et ai., 1996), a concentração celular inicial (FELIPE etal., 1997a), a taxa de aeração (FURLAN etal., 1991, FELIPE

et ai., 1996a, SILVA et ai., 1997a), a agitação (PARAJÓ et ai., 1995) e o pH (SLININGER et ai., 1990, SILVA et ai., 1997c).

2.2.4.1- Concentração inicial de xilose

A concentração inicial de xilose no meio de fermentação exerce grande influência na produção de xilitol. Elevadas concentrações de xilose no meio de cultivo promovem o consumo desse açúcar e consequentemente intensificam a produção de xilitol (SILVA, AFSCHAR, 1994), porém o microrganismo deve ser

xilitol por C. boidiníí aumentou significativamente quando a concentração inicial de xilose aumentou de 20 para 150 g/L. Por outro lado, elevando-se a concentração para 200 g/L, esses autores observaram decréscimo na produção de xilitol. Um acréscimo gradual no fator de rendimento em xilitol à

concentrações iniciais de xilose crescentes foi também observado por

MEYRIAL et ai. (1991) em cultivo com C. guilliermondíí, por GONG et ai. (1981) com C. tropicalis HXP2 e D. hansenii e por SLININGER et ai. (1985) com C.

shehatae, P. tannophilus

e

A relação entre a concentração inicial de xilose e o acúmulo de xilitol pode ser consequência da redução do oxigênio causada por altas densidades celulares originadas a partir de altas concentrações de substrato. A pressão osmótica, exercida por concentrações de xilose acima de 30 % (OJAMO et ai., 1988, SILVA, AFSCHAR, 1994), e a repressão das enzimas que participam do metabolismo da xilose (NIGAM, SINGH, 1995) também podem explicar a interferência de altas concentrações iniciais de xilose na produção de xilitol.

2.2.4.2-Temperatura

A temperatura ótima de cada processo depende das características das linhagens dos microrganismos, do substrato a ser utilizado e da concentração de açúcar (SLININGER et ai., 1990). Em trabalhos conduzidos por GONG et ai. (1981) verificou-se que a temperatura ideal para a produção de xilitol a partir de xilose por leveduras do gênero Candida sp foi de 30 ºC. BARBOSA et ai. (1988) verificaram um máximo acúmulo em xilitol e maiores fatores de

rendimento desse produto à 30 ou 35 ºC para a levedura C. guilliermondii

cultivada em meio semi-sintético. Em fermentações conduzidas por du PREEZ

et ai. (1986) com C. shehatae CBS 2779 em meio semi-sintético, a produção

2.2.4.3- Fonte de nitrogênio

A importância das fontes de nitrogênio na produção de xilitol por algumas espécies de levedura foi relatada por BARBOSA et ai. (1988). Segundo estes autores, a utilização de uréia individualmente e adicionada com ácido casamino por C. guillíermondií resultou em um aumento no fator de rendimento em xilitol, como posteriormente observado por VANDESKA et ai.

(1995b) em experimentos conduzidos com C. boidinií.

O efeito do uso de diferentes fontes de nitrogênio em hidrolisado hemicelulósico de palha de arroz em função do pH foi avaliado por ROBERTO

et ai. (1996), os quais verificaram que o uso de uréia à pH 4,5 proporcionou um

aumento de 25 % na formação de xilitol quando comparado aos experimentos

em que sulfato de amônio foi utilizado como fonte de nitrogênio. Esse

comportamento pode estar relacionado com o aumento no pH devido à

liberação de amônia e dióxido de carbono durante a hidrólise da uréia (PHAFF

et ai., 1978). Esses autores também observaram que os maiores fatores de rendimento em xilitol foram obtidos em diferentes condições de pH e fonte de nitrogênio: esses valores foram 0,68 glg para sulfato de amônio à pH 5,3 e

0,66 g/g para uréia em pH 4,5. Apesar dos resultados similares, a maior

produtividade volumétrica em xilitol foi obtida quando sulfato de amônio foi utilizado como fonte de nitrogênio. Entretanto, SILVA et ai. (1994) observaram que o tipo de fonte de nitrogênio utilizada não afetou a quantidade de xilitol produzida por C. guil/iermondií em meio semi-sintético. Segundo ROBERTO et

ai. (1996) a composição do meio de fermentação possivelmente deve ter

contribuído para os diferentes efeitos observados por eles em meio complexo e

por SILVA et ai. (1994) em semi-sintético.

2.2.4.4- Presença de outros açúcares no meio de fermentação

A habilidade das leveduras fermentadoras de xilose em converter

(PANCHAL et ai., 1988, BICHO et ai., 1988, LEE, 1992), porém, não só a presença de glicose no meio pode afetar a assimilação da xilose, mas também outras hexases como manose, galactose e frutose.

PREZIOSI-BELLOY et ai. (1997) observaram que quando glicose, xilose e manose estão presentes no meio de cultivo, a glicose é consumida rapidamente, enquanto a xilose e manose são utilizadas simultaneamente, após o término da glicose. Observações similares sobre o consumo de xilose foram verificadas por PANCHAL et ai. (1988) para P. stipitis e Candida steatolytica e por VANDESKA et ai. (1996) para C. boidinii.

Em estudos conduzidos por SILVA et ai. (1997c) com a levedura C.

guilliermondii FTI 20037 em meio semi-sintético, verificou-se que a glicose

inibiu fortemente a produção de xilitol quando proporções de xilose: glicose de 6:1, 5:2 e 4:3 foram utilizadas. Por outro lado, PFEIFER et ai. (1996) e YAHASHI et ai. (1996) verificaram que em baixas concentrações de glicose ocorreu o favorecimento do consumo da xilose.

Embora a literatura forneça resultados de pesquisas conflitantes quanto ao efeito inibitório da glicose, pode-se dizer que o grau de repressão da glicose difere para cada linhagem de levedura (PANCHAL et ai., 1988) e que a inibição por esta hexase depende de sua concentração e do meio de cultivo utilizado.

2.2.4.5- Idade do inóculo

As conversões de substrato em produto, são, de um modo geral, caracterizadas pela atividade metabólica das células e, segundo PFEIFER et

ai. ( 1996) a idade da cultura está relacionada a esta atividade. Esses mesmos autores observaram que os melhores resultados em produtividade volumétrica em xilitol (0,66 gll.h) foram encontrados em inóculos obtidos de células de C. guilliermondii com 24 horas de incubação, devido a uma fermentação mais

rápida. Também constataram que as melhores taxas de fermentação não foram obtidas em 15 horas de incubação, provavelmente porque as mudanças metabólicas necessárias para a fermentação da xilose ainda não tivessem ocorrido nesse período de tempo. Por outro lado, em culturas com 72 horas de

incubação PFEIFER et ai. (1996) verificaram a presença de organismos com atividades metabólicas diferentes das culturas jovens, o que retardou o consumo de xilose, ocasionando em uma formação de xilitol mais lenta e menos produtiva. SREENATH et ai. (1986) também reportaram que a atividade metabólica das células de Candída shehatae mudou apreciavelmente com a idade das mesmas.

2.2.4.6- Concentração celular inicial

O efeito da concentração celular inicial foi estudado por FELIPE et ai. (1997b) com culturas de C. guíllíermondíí crescidas durante um período de 24 horas. Observou-se consumo total de glicose em todas as concentrações celulares iniciais avaliadas após 22 horas de cultivo. O consumo total de xilose ocorreu após 45 horas de fermentação com 3,0 gil de inóculo e o fator de rendimento e a produtividade volumétrica em xilitol decresceram em 58 e 50

%, respectivamente, quando a concentração de inóculo aumentou de 3,0 para 6,0 gil. De acordo com NOLLEAU et ai. (1993) esta perturbação no metabolismo da levedura pode estar relacionada com o oxigênio dissolvido no meio, que se torna limitante com o aumento da concentração celular e segundo FELIPE et ai. (1997b) este efeito torna o metabolismo da xilose incompleto e causa acúmulo de ácido acético no meio de cultivo.

De acordo com o trabalho realizado por FELIPE et ai. (1997b), pode-se verificar, ainda, que a utilização de inóculo com concentrações iniciais de O, 1 e 3,0 gil de células cultivadas durante 24 horas, permitiu obter valores de produtividade volumétrica e fator de rendimento em xilitol semelhantes.

A bioconversão de xilose à xilitol é facilitada através da aeração do meio

fermentativo (GONG et ai., 1981), pois a presença do oxigênio neste meio é

necessária para o crescimento do microrganismo (BRUINENBERG et ai.,

1984), para o transporte de açúcares (BARNETT, 1976, HÔFER, NASSAR,

1987) e parece ser necessária para a função mitocondrial (LIGTHELM et ai.,

1988). Segundo VANDESKA et ai. (1995b) a disponibilidade de oxigênio no

meio determina a utilização da xilose para a formação de produtos ou para o

crescimento celular. NOLLEAU et ai. (1995) verificaram que sob condições

anaeróbias a xilose não é assimilada porque o NADH produzido não pode ser regenerado através da fosforilação oxidativa, o que reduz as taxas de

produção de xilitol e impede o crescimento celular. Em condições de aeração

elevada a fermentação é direcionada para a produção de biomassa e o

rendimento em xilitol decresce (GÍRIO et ai., 1989, 1990). Uma quantidade

menor de xilitol é acumulada porque o oxigênio oxida o NADH à NAD+ e uma alta relação NAD+ I NADH leva à oxidação do xilitol à xilulose.

Um suprimento limitado de oxigênio favorece a fermentação da xilose, provavelmente devido a sua função como aceptor final de elétrons, o qual é necessário para atenuar o desbalanço parcial de óxido-redução nos dois passos iniciais do metabolismo da xilose (BRUINENBERG et ai., 1984). OJAMO et ai. (1988) observaram que à taxas específicas de consumo de

oxigênio decrescentes, o sistema de transferência de elétrons não é capaz de

reoxidar todo o NADH2 produzido por respiração e I ou fermentação. Como

consequência, o nível de NADH2 intracelular aumenta, reduzindo a velocidade

de reação da enzima xilitol desidrogenase dependente de NAD, o que causa acúmulo de xilitol no meio de cultivo (RIZZI et ai., 1989a, 1989b). A limitação de oxigênio conduz, portanto, a melhores níveis de NADH e devido ao

equilíbrio entre xilose e xilitol, maiores rendimentos em produto são obtidos.

SILVA et ai. (1997a) verificaram que, entre os fatores que influenciam a taxa de transferência de oxigênio para o meio de cultivo estão, a agitação e o

coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (k.a), A importância do kLa

suprindo, dessa maneira, informações para o escalonamento de processos que requerem oxigênio. De acordo com SILVA et ai. (1997b), quando esse parâmetro é mantido constante, outras variáveis podem ser determinadas e utilizadas em escalas maiores, baseadas em correlações empíricas já desenvolvidas. KIM et ai. (1997) verificaram que o aumento do kLa de 20 h-1

para 85 h-1 propiciou aumento no crescimento celular e que a máxima

produção em xilitol (35,8 g/L) foi obtida em kLa de 30 h-1· Por outro lado, a

máxima produtividade em xilitol (0,667 g/l.h) foi obtida em kLa de 45 h-1 e na

faixa de kLa de 45 à 85

h' o fluxo de carbono presente na xilose foi desviado

Pesquisando a influência da velocidade de agitação na produção de xilitol por D. hansenii em três diferentes níveis (100, 200 e 300 rpm), DOMÍNGUEZ et ai. (1997) concluíram que 200 e 300 rpm seriam velocidades ideais para a produção de xilitol e que, à 300 rpm a xilose presente no meio foi consumida rapidamente, fornecendo 99,67 g/L de xilitol. SILVA et ai. (1997a) verificaram que a máxima produção em xilitol e a máxima produtividade volumétrica (41,76 g/L e 0,87 g/l.h, respectivamente) foram obtidas em fermentações do hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar por C. guilliermondii

FTI 20037 em kLa=27 h-1 e velocidade de agitação de 400 rpm. Entretanto à

300 rpm e kLa de 18 h" foram observados valores similares de concentração final e fator de rendimento em xilitol.

Embora as condições ótimas de oxigenação para a produção de xilitol difiram de um microrganismo para outro (NOLLEAU et ai., 1995), pode-se dizer que condições de limitação de oxigênio são as mais favoráveis para a obtenção desse poliol (GÍRIO et ai., 1994).

2.2.4.8- pH

A eficiência e a taxa do metabolismo da xilose são fortemente afetadas por parâmetros fisiológicos como pH e aeração (NOLLEAU et ai., 1995). A necessidade de se estudar o efeito do pH reside no fato do mesmo ser

membrana, o pH pode determinar a solubilidade de alguns componentes do meio. Uma modificação no pH pode, por exemplo, levar à precipitação de alguns micronutrientes, tornando impossível sua assimilação.

O efeito inibitório do ácido acético no crescimento de vários microganismos (KUSUMEGI et ai., 1998) e no metabolismo da xilose (JEFFRIES, 1985, van ZYL et ai., 1988, FERRARI et ai., 1992) é primariamente função de sua concentração na forma não dissociada e, portanto, dependente do pH. Nesta forma, o ácido acético difunde-se para o interior do citoplasma e dissocia-se (GANCEDO, SERRANO, 1989), causando um decréscimo no pH intracelular. Como resultado, o gradiente de prótons na membrana não pode ser mantido, a produção de energia é desacoplada e o transporte de vários nutrientes é prejudicado (HERRERO et ai., 1985). Na levedura S. cerevísíae (VALLEJO, SERRANO, 1989), assim como em C.

guillíermondíí (FELIPE et ai., 1995), tem sido postulado que a inibição é

causada pela penetração do ácido acético nas células, resultando na acidificação intracelular.

FELIPE et ai. (1997a) verificaram produção de xilitol, assimilação de ácido acético e aumento no pH do hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar em pH inicial maior ou igual a 4,5 e na presença de 4,5 g/L de ácido acético. Em valores de pH inferiores a 4,5 esses autores verificaram inibição no consumo dos açúcares e na produção de xilitol, embora SILVA, (1994) tenha observado crescimento e consumo de xilose pela levedura C. guillíermondíí em meio sintético, sem ácido acético, em pH 2,5. Por outro lado, FERRARI et ai. (1992) não constataram produção de xilitol e nem consumo de ácido acético em fermentações conduzidas em hidrolisado de eucalipto por P. stípítís em pH

igual a 5,0 e na presença de 1 O g/L de ácido acético.

A inibição da fermentação em valores baixos de pH pode ser devido a alta quantidade de ácido acético não dissociado no meio de cultivo (PAMPULHA, LOUREIRO, 1989). O ácido acético em sua forma não- dissociada aumenta as exigências para a manutenção das funções celulares,

altera a morfologia celular (MAIORELLA et ai., 1983) e pode modificar o controle da glicólise (PAMPULHA, LOUREIRO-DIAS, 1990). Entretanto, FELIPE et ai. (1995) observaram que, pequenas quantidades de ácido acético favoreceram a formação de xilitol, já que na presença de 1,0 g/L a concentração de xilitol foi maior do que a detectada em meios de cultivo ausentes deste ácido. Esse comportamento sugere a estimulação da fermentação de xilose à xilitol por C. guilliermondíí na presença de baixas

concentrações de ácido acético, fato anteriormente observado por LEE, McCASKEY (1983) durante fermentações conduzidas com a levedura P.

tannophilus.

PARAJÓ et ai. (1997b) verificaram que as fermentações de hidrolisados concentrados são mais rápidas e menos afetadas pelo efeito inibitório do ácido acético quando é fornecida ao meio de fermentação uma aeração mais alta. Segundo esses autores, a fermentação do hidrolisado de bagaço de cana-de- açúcar foi desfavorecida sob condições limitadas de oxigênio e na presença de 1 O g/L de ácido acético, uma vez que a xilose foi utilizada vagarosamente, reduzindo a produtividade em geral e a máxima velocidade específica de crescimento celular.

Dados relacionados ao efeito do ácido acético na bioconversão xilose- xilitol levam à conclusão de que o efeito inibitório deste composto depende da composição e origem do meio de cultura empregado (FELIPE et ai., 1997a). No entanto, o perfil de consumo de ácido acético muda quando se trata de microrganismos adaptados. SENE et ai. (1998) observaram que em pH 5,3 e concentração de 5,8 g/L de ácido acético a levedura C. guilliermondíí FTI 20037 adaptada consumiu 96 % desse ácido.

Conclui-se portanto que, de todos os parâmetros fermentativos, o pH e a aeração são fatores fundamentais em se tratando, principalmente, de fermentações de hidrolisados. Estes parâmetros devem ser controlados para reduzir os efeitos inibitórios de compostos presentes nos hidrolisados hemicelulósicos e para que a conversão xilose-xilitol seja favorecida.

3.1- PREPARO DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PARA A HIDRÓLISE O bagaço de cana-de-açúcar, proveniente da Usina Santa Bárbara (Santa Bárbara d'Oeste- S.P), foi exposto ao sol durante 5 dias para secagem e após esta etapa calculou-se o teor de umidade do mesmo através de secagem em estufa à 105 ºC até peso constante.

3.2- OBTENÇÃO E CONCENTRAÇÃO DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

O bagaço de cana-de-açúcar, umedecido em água, foi introduzido no reator previamente carregado com uma solução de ácido sulfúrico 98 % de pureza (1 L de ácido para 180 L de água) em uma proporção líquido : sólido (ácido sulfúrico: matéria-seca) de 1 :10.

O hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar foi obtido após a realização de operações de hidrólise ácida à 121 ºC/1 O min. em reator de aço-inox AISI 316 com capacidade total de 250 L. O hidrolisado obtido foi submetido à centrifugação, em centrífuga industrial, para remoção de partículas sólidas. Com a finalidade de aumentar em 3 vezes a concentração de xilose presente neste hidrolisado, o mesmo foi concentrado em evaporador a vácuo ( capacidade de 4 L) à 70 ºC e em seguida foi armazenado em bombonas plásticas e estocado em câmara fria à 8 ºC.

3.3- TRATAMENTO DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE- AÇÚCAR

Para cada experimento realizado o hidrolisado concentrado foi submetido a um tratamento que consistiu na adição de óxido de cálcio comercial até pH 7,0, redução do pH com ácido fosfórico P.A até 5,5 e posterior adição de 2,4 % de carvão ativo. A mistura obtida foi submetida a agitação em agitador rotatório (New Brunswick Scientific Co., lnc- Edison- New Jersey- USA) à 30 ºC/200 rpm durante 1 hora. À cada alteração de pH e após agitação por 1 hora, o hidrolisado foi filtrado para remover o precipitado formado e eliminar o carvão ativo. O hidrolisado tratado foi então, autoclavado

à 111 ºC/15 min.

3.4- MICRORGANISMO

Candida guilliermondíi FTI 20037 obtida da cultura-estoque do DEBIQ e mantida em ágar-malte à 4 ºC.

3.5- PREPARO DO INÓCULO

O cultivo da levedura foi realizado em frascos Erlenmeyer de 125 ml contendo 50 ml de meio semi-sintético composto de 30 g/L de xilose, 5 g/L de sulfato de amônia ((NH4)2$Q4), O, 1 g/L de cloreto de cálcio (CaCb) e 1 O g/L de extrato de farelo de arroz. As soluções de (NH4)2SQ4 (10 %) e CaCb (1 %) foram esterilizadas à 121 ºC/20 mine a solução de xilose (30 %) autoclavada à 111 ºC/15 min. O extrato de farelo de arroz (1 O %) foi preparado adicionando- se 100 g de farelo de arroz em 1000 ml de água destilada. Essa solução foi autoclavada à 111 ºC/15 min e centrifugada à 800 x g para obtenção do extrato de farelo de arroz (sobrenadante).

foi centrifugado assepticamente à 1700 x g, as células foram lavadas com água destilada estéril, centrifugadas novamente e suspensas em 30 mL de

água destilada. Um volume em torno de 10-15 mL da suspensão celular foi

inoculado no reator de bancada, de modo a fornecer uma concentração celular

inicial no fermentador de _Sl-2_? g/L.

3.6-MEIO E CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO

Os experimentos foram conduzidos em fermentador BIOFLO Ili (New

Brunswick Scientific Co., lnc.- Edison- New Jersey- USA) (FIGURA 3) com

capacidade volumétrica total de 1,25 L, equipado com bombas peristálticas para controle de pH, eletrodo de pH (METTLER TOLEDO) e de oxigênio dissolvido (METTLER TOLEDO), termopar e agitador com 1 pá tipo "flat- blade".

Utilizou-se 1 L de meio de cultivo composto por hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar concentrado, tratado e acrescido

dos mesmos nutrientes utilizados no preparo do inóculo, exceto a xilose, e nas

mesmas concentrações citadas no item 3.5. As fermentações foram realizadas em sistema descontínuo à 30 ºC, agitação de 300 rpm e nas condições de pH, aeração e controle de pH especificadas na TABELA 3 e definidas nos

planejamentos experimentais (TABELAS 4 e 5). O controle de pH foi realizado

com o bombeamento automático de hidróxido de sódio e ácido sulfúrico,

O objetivo da utilização de métodos estatísticos nesse projeto de pesquisa foi reduzir o número de experimentos, avaliar quais dos fatores em estudo foram significativos sobre a bioconversão xilose-xilitol e modelar esse processo na região em estudo através do emprego de planejamento experimental fatorial e da metodologia de superfície de resposta. Os fatores avaliados e seus respectivos níveis encontram-se na TABELA 3 e a matriz dos planejamentos fatoriais 23 e 22 nas TABELAS 4 e 5, respectivamente.

3.8- PUREZA DAS FERMENTAÇÕES

A pureza das fementações foi avaliada através do teste de coloração de Gram, descrito por PELCZAR et ai. (1981 ).

3.9- MÉTODOS ANALÍTICOS

3.9.1- DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES, XILITOL E ÁCIDO ACÉTICO

As amostras a serem analisadas foram diluídas apropriadamente, filtradas em filtro SEP PAK C18 (MILLIPORE) e injetadas no sistema cromatográfico. Glicose, xilose, arabinose, xilitol e ácido acético foram quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência utilizando os cromatógrafos SHIMADZU- LC10 AD e WATERS e detectores de índice de refração RI D-6A e WATERS 41 O Differential Refractometer, respectivamente. Os sistemas foram equipados com colunas BIO-RAD AMINEX HPX-87H (300 x 7,8 mm) mantidas à 45 ºC, nas quais utilizou-se uma solução de ácido sulfúrico 0,01 N (previamente filtrada em membrana HAWP 0,45 um (MILLIPORE) e degaseíficada em banho de ultrassom por 30 minutos) como eluente para separação dos compostos à uma vazão de 0,6 ml/min.

TABELA 3- Fatores e níveis avaliados no planejamento estatístico

FATORES

Níveis pH kLa (h"1j Controle de pH

Inferior (-1) 4,0 10

se

Superior (+1) 7,0 35

ee

Ponto central (O) 5,5 22,5

se

se:

ee:

TABELA 4: Delineamento experimental realizado segundo o planejamento fatorial 23

Nº do experimento pH Aeração (kLa) Controle de pH

1 -1 -1 -1 2 +1 -1 -1 3 -1 +1 -1 4 +1 +1 -1 5 -1 -1 +1 6 +1 -1 +1 7 -1 +1 +1 8 +1 +1 +1 9

o

o

o

o

o

o

o

o

Nº do experimento pH Aeração (kLa) Controle de pH

1

-1

-1

-1

2

+1

-1

-1

3

-1

+1

-1

4

+1

+1

-1

5

-1

-

1

+1

6

+1

-1

+1

_-1

₊₁

+1

+1

+1

+1

o

o

_-1

10

o

o

-1

11

o

o

+1

12

o

o

+1

13

-1

o

-1

14

+1

o

-1

15

o

-1

-1

16

o

+1

-1

3.9.2- DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FURFURAL E HIDROXIMETILFURFURAL

As amostras a serem analisadas foram diluídas e filtradas em membrana MINISART 0,22 µm (SARTORIUS) e então injetadas automaticamente no sistema cromatográfico. A determinação da concentração de furfural e hidroximetilfurfural foi também efetuada por cromatografia líquida de alta eficiência em cromatógrafo SHIMADZU- LC1 O AD , porém com coluna HEWLETT-PACKARD RP 18 (200 mm) mantida à 25 ºC, detector de ultra- violeta SPD-1 OA UV-VIS e solução de acetonitrila I água (1 :8) com 1 % de ácido acético ( degaseificada em banho de ultrassom por 15 minutos) e fluxo de 0,8 ml/min.

3.9.3- DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR

A concentração celular foi determinada pela relação entre a leitura da absorbância da amostra à 600 nm utilizando-se espectrofotômetro BECKMAN- DU 6408 e a massa seca das células (g/L) através de uma curva de calibração.

3.9.4- DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE VOLUMÉTRICO DE TRANSFERÊNCIA DE OXIGÊNIO (kLa)

O coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio foi determinado pela metodologia do "gassing-out", segundo PIRT, (1975). Inicialmente o meio de fermentação, isento de células, foi desaerado com nitrogênio até que a concentração de oxigênio dissolvido fosse reduzida à zero. O meio líquido foi agitado à 300 rpm e aerado de acordo com vazão de ar desejada. O aumento da concentração de oxigênio dissolvido em função do tempo foi monitorado com eletrodo de oxigênio e os dados obtidos foram aplicados na equação 1 em sua forma integrada. O valor de kLa (s-1) foi determinado como sendo o inverso

3.9.5-DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATIVOS

Os parâmetros fator de rendimento e produtividade volumétrica em xilitol foram calculados da seguinte forma:

- Fator de rendimento em xilitol YP,s (g/g):

A inclinação da reta obtida pela regressão linear de .L\P e L\S forneceu o valor

de YP,s.

L\P= y P/S * L\S

-Produtividade volumétrica em xilitol Qp (g/L.h):

4- RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1- CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

O hidrolisado hemicelulósico obtido por hidrólise ácida do bagaço de cana-de-açúcar e posteriormente concentrado em três vezes a sua concentração original foi caracterizado quanto ao teor de açúcares, ácido acético, furfural, hidroxímetilfurfural e ao pH. As características do hidrolisado anteriormente e posteriormente à etapa de concentração encontram-se na TABELA 6. Observa-se nesta tabela que, pela realização da hidrólise, obteve- se um hidrolisado composto de glicose, arabinose e xilose, sendo este último o carboidrato predominante, como constatado por du TOIT et ai. (1984). Nota-se também a presença de compostos tóxicos inibitórios à atividade fermentativa como ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural, como já verificado em hidrolisados hemicelulósicos de bagaço de cana-de-açúcar (RODRIGUES, 1997, RAMOS, 1998), de palha de arroz (ROBERTO et ai., 1996) e de eucalipto (PARAJÓ et ai., 1996).

De acordo com a TABELA 6 verifica-se um aumento na concentração dos açúcares e de hidroximetilfurfural em diferentes proporções. Enquanto os açúcares aumentaram proporcionalmente ao fator de concentração do hidrolisado, o aumento na concentração de hidroximetilfurfural não foi proporcional a este fator. Um aumento proporcional ao fator de concentração do hidrolisado também não foi verificado para o ácido acético, uma vez que este é um composto volátil e perdas ocorrem devido as condições de concentração do hidrolisado (WINDHOLZ, 1983). A concentração deste inibidor no hidrolisado de bagaço foi inferior à encontrada por FELIPE et ai.

(1996b) em hidrolisado de eucalipto, o que pode favorecer a conversão da xilose presente no hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar à xilitol. A

empregadas (LEE, McCASKEY, 1983).

Com relação ao furfural, nota-se que sua concentração no hidrolisado concentrado foi 62,5 % menor do que a observada no hidrolisado anteriormente à etapa de concentração (TABELA 6). Uma vez que o ponto de ebulição deste composto sob pressão reduzida é de 54-55 ºC (VOGUEL, 1971 ), acredita-se que as condições de concentração a vácuo (temperatura de 70 ºC) tenham sido responsáveis pela redução da concentração do mesmo no hidrolisado.

Observa-se também na TABELA 6 que a etapa de concentração propiciou um decréscimo no pH do hidrolisado, fato que está relacionado com o aumento da concentração de íons H\ provenientes do ácido sulfúrico utilizado na hidrólise (CORREA et ai., 1995).

TABELA 6- Composição parcial do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar anteriormente (A) e posteriormente (8) à etapa de concentração

Componentes (g/L) e pH Hidrolisado A Hidrolisado B

Glicose 1,30 3,91 Xilose 18,92 53,56 Arabinose 1,94 5,40 Ácido acético 3,05 4,93 Furfural 0,16 0,06 Hidroximetilfurfural 0,04 0,17 pH 1, 18 0,68

4.2- EFEITO DO pH E DA AERAÇÃO SOBRE A FERMENTAÇÃO DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

Os experimentos foram realizados com a finalidade de avaliar o efeito do pH e da aeração sobre a produção de xilitol pela levedura Candida

guilliermondii FTI 20037 a partir de hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar

em fermentador de bancada.

De acordo com os resultados pôde-se constatar que, independentemente das condições de aeração e pH utilizadas, a glicose foi totalmente consumida (TABELA 7). Consumo total de glicose também foi verificado por PREZIOSI-BELLOY et ai. (1997) e SENE et ai. (1998) em diferentes hidrolisados hemicelulósicos. Observou-se que, independentemente do controle do pH, nas primeiras 16 horas de cultivo já havia ocorrido um consumo total de glicose em fermentações conduzidas em pH 5,5 e 7,0 (FIGURA 4 A-K), enquanto que em pH 4,0 (FIGURA 4 L-P) este tempo foi de até 48 horas. ROBERTO et ai. (1996) também verificaram o favorecimento do consumo de glicose por C. guilliermondii em condição de pH mais alta, tendo sido observado o tempo de 40 horas para pH 4,5 e de 15 horas para pH igual a 5,3 e 6,0. O lento consumo de glicose em baixos valores de pH sugere a necessidade de uma fase de adaptação da levedura devido à presença de ácido acético no hidrolisado (ROBERTO et ai., 1996), cujo efeito está relacionado não somente à sua concentração na forma não dissociada, mas também à forte acidez do meio (FERRARI et ai., 1992).

Quanto a influência da aeração sobre o consumo de glicose verificou-se que, em pH 7,0 e 4,0 (FIGURA 4 E, G, 1 e L, N, P), a utilização de menores taxas de aeração (kLa= 10 e 22,5 h-1) favoreceu o consumo desta hexose.

Entretanto, em experimentos conduzidos em pH 5,5 (FIGURA 4 A-D, J, K), não há evidências da influência da disponibilidade de oxigênio.

Embora a glicose tenha sido apontada como inibidora da fermentação de xilose (BICHO et ai., 1988), no presente trabalho não foi possível observar a existência desta inibição devido ao fato dos experimentos terem sido realizados em diferentes condições de pH e aeração e em um meio complexo