CAMILA ZOGBI NOGUEIRA
Desenvolvimento dos Gonócitos e Espermatogônias Tronco em Ratos:
Proliferação, Distribuição e Morte Revisitadas.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências.
São Paulo
2011
CAMILA ZOGBI NOGUEIRA
Desenvolvimento dos Gonócitos e Espermatogônias Tronco em Ratos:
Proliferação, Distribuição e Morte Revisitadas.
Orientadora: Profª. Drª. Taiza Stumpp
Co-Orientadora: Profª. Drª. Sandra M.
Miraglia
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências.
São Paulo
2011
Zogbi, C.
Desenvolvimento dos Gonócitos e Espermatogônias Tronco em
Ratos: Proliferação, Distribuição e Morte Revisitadas. – São Paulo, 2011.
i-viii, 98.
Tese (Mestrado) Universidade Federal de São Paulo. Programa de
Pós-Graduação em Morfologia.
Título em inglês: Gonocyte Development and Spermatogonial Stem
Cell Formation in Rats: Death, Proliferation and Distribution Revisited.
1. Gonócitos
2. Espermatogônia tronco
3. Apoptose
Apresentação
Tese realizada pelo Programa de Pós-Graduação em Morfologia – Área de concentração Embriologia/Biologia do Desenvolvimento
Esta tese está apresentada de acordo com os novos padrões propostos pela Coordenação de Pós-Graduação em Morfologia da UNIFESP. A Tese está escrita de forma sucinta, dentro do possível, e a ela está anexado um artigo referente à dissertação de mestrado, o qual já foi enviado a uma revista científica. O envio desse artigo é pré-requisito para a obtenção do título de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Morfologia.
ii Dedico essa tese aos meus pais, Nilton e Tininha e ao meu irmão Murilo, pelo incentivo, apoio e amor incondicionais.
Agradecimentos
Agradeço a todos que de alguma forma participaram e contribuíram para a realização desse estudo. Agradeço também a Deus por sempre olhar por mim e iluminar o caminho das pessoas que amo.
À minha orientadora Profª. Drª. Taiza Stumpp pela dedicação, paciência e principalmente pelos valiosos ensinamentos que não me acrescentaram somente na realização desse estudo, mas que serão úteis durante toda a minha vida. A Profª. Drª. Sanda M. Miraglia pela oportunidade de realização do meu mestrado. À Giselly Encinas e Regina Cabral pela amizade e companheirismo durante esses anos. A toda equipe de alunos e funcionários da Disciplina de Biologia do Desenvolvimento que acompanharam e contribuíram para realização deste trabalho. Aos Departamentos de Morfologia e Genética e de Genética da Profª. Drª. Janete Cerutti, da Unifesp.
À minha família de quem recebi meus primeiros e mais importantes ensinamentos, aos meus amigos e especialmente, ao Leandro Parpinel, pelo incentivo, amor e carinho em muitos momentos da minha vida.
iv Resumo
As espermatogônias tronco são células responsáveis pela produção contínua dos gametas masculinos, os espermatozóides. Essas células se diferenciam a partir dos gonócitos, porém, pouco se sabe sobre sua biologia e sobre os processos pelos quais elas se diferenciam. Embora sejam células de grande importância, não há informações precisas sobre a dinâmica de formação dessas células a partir dos gonócitos nem sobre o número total e a distribuição das espermatogônias indiferenciadas nos testículos, o que dificulta a interpretação de estudos nessa área. A proposta deste trabalho foi analisar a proliferação, morte e distribuição dos gonócitos e pré-espermatogônias nos testículos de ratos no desenvolvimento embrionário e pós-natal, em períodos críticos do desenvolvimento testicular. Foram utilizados ratos com idades de 19dpc, 1, 3, 5, 8, 11 e 15dpp, cujos testículos foram analisados quanto à distribuição, proliferação e apoptose dos gonócitos e pré-espermatogônias durante o desenvolvimento testicular. A análise morfológica dos testículos, o método de TUNEL, a imunomarcação das proteínas p53 e caspase-3 clivada foram empregados para investigação de apoptose, enquanto a densidade numérica (Nv), quantificação de gonócitos, densidade de comprimento cordonal (Lv), comprimento cordonal total (L), volume total dos cordões seminíferos e estimativa do número total de gonócitos foram utilizados para investigação da distribuição dessas células. A citometria de fluxo foi empregada para avaliar a proliferação dos gonócitos através do uso do kit Guava Cell Cycle. Para identificar as espermatogônias indiferenciadas nas idades de 11 e 15dpc foi utilizada a imunomarcação da proteína OCT4. Durante a análise morfológica testicular observou-se que ocorre redução do número de gonócitos por seção testicular nos primeiros cinco dias após o nascimento e que as primeiras espermatogônias são observadas aos 8dpp. Foi observado aumento da Lv nos animais de 1dpp em relação aos de 19dpc. Dos 3 aos 11dpp, houve aumento progressivo da Lv, que voltou a diminuir aos 15dpp. Houve crescimento muito acentuado dos cordões seminíferos entre 19dpc e 1dpp. Após o nascimento, o crescimento continuou até os 15dpp, mas foi menos intenso. Já a Nv de gonócitos foi inversamente proporcional ao crescimento testicular, enquanto o número estimado de gonócitos foi cerca de quatro vezes maior aos 1dpp em relação aos de 19dpc. Isto explica os dados obtidos a partir da análise morfológica na qual a frequência de gonócitos por seção testicular diminuiu nos cinco primeiros dias após o nascimento. Após o nascimento, o número de gonócitos permaneceu estável até os 5dpp, sugerindo que não há morte ou proliferação dessas células nessas idades. Não foram detectados gonócitos em apoptose nas idades estudadas, embora corpos apoptóticos tenham sido observados. Esses corpos apoptóticos eram muito raros dos 19dpc aos 5dpp e começaram a se tornar mais frequentes aos 8dpp, atingindo sua frequência máxima aos 15dpp. Também aos 15dpp, células positivas para TUNEL e caspase 3 clivada foram observadas, mas essas células não puderam ser identificadas devido ao fato de sua morfologia já estar consideravelmente
alterada. Contudo, todos os gonócitos de 19dpc até 8dpp foram positivos ao emprego da caspase-3 clivada, embora apresentassem morfologia normal. Isto indica que a caspase-3 clivada pode ter outra função, que não seja apoptótica, no desenvolvimento dos gonócitos. A análise ao citômetro de fluxo nas idades de 19dpc a 5dpp mostrou que mais da metade dos gonócitos encontravam-se em fase G0/G1 do ciclo celular, indicando que muitas estão em quiescência nestas idades. Não houve marcação da proteína OCT4 nas espermatogônias, o que impossibilitou a quantificação dessas células nas idades de 8, 11 e 15dpp. Os dados do presente estudo sugerem que a diminuição da frequência de gonócitos por seção testicular nos primeiros dias após o nascimento não é consequência de apoptose dessas células, como tem sido sugerido na literatura, mas sim de sua redistribuição ao longo dos cordões seminíferos. Como não há indícios de que estas células estejam proliferando nessas idades, menos gonócitos são observados por seção testicular. Concluiu-se ainda que a proteína OCT4 não está presente nos testículos de rato nas idades pós-natais, diferentemente do observado em camundongo. Estudos estão sendo realizados para verificar quando os gonócitos retomam a proliferação, quando a população definitiva de espermatogônias tronco é formada e quais seriam os marcadores ideais para estudos das espermatogônias indiferenciadas no rato.
vi Abstract
Spermatogonial stem cells (SSC) are responsible for the constant production of the male gamete. These cells differentiate from the gonocytes, but little is known about its biology and about the mechanisms of their differentiation. Despite the importance of these cells, the information about the dynamic of formation of these cells from the gonocytes or about the total number and distribution of the undifferentiated spermatogonia is not precise, causing problems to the interpretation of the studies in this area. The goal of this study was to analyze the proliferation, death and distribution of the gonocytes and pre-spermatogonia in the rat testis in embryonic and postnatal life. Rat testes were collected at 19dpc and at 1, 3, 5, 8, 11 and 15dpp for the analysis of the distribution, proliferation and apoptosis of the gonocytes and pre-spermatogonia during key periods of testicular development. To investigate gonocyte apoptosis, four methods were used: morphological analysis, TUNEL method and immunostaining of p53 and cleaved caspase 3. The number of gonocytes was investigated using the numerical density (Nv) and an estimative of the total number of these cells was obtained. These data were associated with the seminiferous cord length density (Lv), the total cordonal length (L) the total volume of the seminiferous cords and the total estimated number of gonocytes were used to investigate the distribution of these cells. Guava flow citometry was used to evaluate the proliferation of the gonocytes. To identify the undifferentiated spermatogonia at 11 and 15dpp, OCT4 labeling was used. During testicular morphological analysis it was observed a reduction of the number of the gonocytes per testicular section during the first five days after birth and the first spermatogonial cells were seen at 8dpp. The Lv increased in the 1dpp rats in relation to 19dpc rats. From 3 to 11dpp, Lv increased progressively and subsequently decreased at 15dpp. There was very accentuated growth of the seminiferous cords (L) between 19dpc and 1dpp. The growth progressed until 15dpp, although it was less intense. The gonocyte Nv was inversely proportional to the seminiferous cord growth, while the total estimated number of gonocytes was about four times higher at 1dpp in relation to the 19dpc embryos. This explains the data obtained from morphological analysis, in which the frequency of gonocytes per testicular section decreased in the first days after birth. The number of gonocytes remained stable from 1 to 5dpp, suggesting that the gonocytes do not die or proliferate in this period. Apoptotic gonocytes were not detected in all ages, although apoptotic bodies were observed. These apoptotic bodies were rare between 19dpc and 5dpp, and at 8dpp they became more frequent, and reached the highest frequency at 15dpp. Also at 15dpp, TUNEL positive-cells and cleaved caspase3-positive cells were observed, although these cells could not be indentified due to the fact that their morphology was already changed. Nevertheless, all gonocytes between 19dpc and 8dpp were positive to cleaved caspase-3, although they presented normal morphology. This suggests that cleaved caspase-3 could have other
function that not apoptotic in gonocytes development. The flow citometry analysis between 19dpc and 5dpp showed that more than half of the gonocytes was at G0/G1 phase of the cell cycle, proving that lots of them are quiescent in these ages. There were no OCT4-positive spermatogonia, what impaired the quantification of these cells at 8, 11 and 15dpp. The data of this study suggest that the decrease in the frequency of gonocytes per testicular section in the first days after birth is not due to apoptosis, as has been suggested in the literature, but rather to their redistribution throughout the seminiferous cords. Since there is no evidence that these cells are proliferating in these ages, less gonocytes are seen per testicular section. It has also been concluded that OCT4 protein is not present in rat testis in postnatal ages, differing from what is observed in the mouse testis. Further studies are been performed to verify when gonocytes resume its proliferation, when the final SSC population is established and which markers could be useful to study undifferentiated spermatogonia in the rat.
viii Lista de Abreviaturas
CGP: Célula Germinativa Primordial CTA: Célula Tronco Adulta
CTE: Célula Tronco Embrionária DBA: Dolichos Biflorus Aglutinin Dpc: Dias-pós-coito
Dpp: Dias-pós-parto
GDNF: Glial cell-derived neurotrophic factor GFRα1: GDNF Receptor α-1
MVH: Mouse Vasa Homologue NANOS2: Nanos Homolog 2 Ngn: Neurogenin
OCT4: Octamer-Binding Transcription Factor 4 PDGFR: Platelet-derived growth factor receptor PLZF: Promyelocytic leukaemia zinc finger Protein SOX: SRY (sex determining region Y)-box 9 UCHL1: Ubiquitin C-terminal hydrolase L1 UTF: Unicode Transformation Format
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 1
1.1. A diferenciação do testículo ... 2
1.2. A origem das espermatogônias tronco ... 3
1.3. Apoptose dos Gonócitos ... 4
1.4. Controle da proliferação e da diferenciação dos gonócitos e das espermatogônias tronco ... 5
1.4.1. Genes envolvidos na proliferação e diferenciação dos gonócitos e espermatogônias tronco. ... 7 2. OBJETIVOS ... 12 2.1- Objetivo Geral ... 12 2.2- Objetivos específicos ... 12 3. JUSTIFICATIVA ... 13 4. MÉTODO ... 15 4.1. Coleta do material: ... 15
4.2. Análise morfológica testicular:... 15
4.3. Densidade Numérica de Gonócitos e Espermatogônias: ... 16
4.4. Densidade de Comprimento Cordonal (Lv), Densidade de Volume dos cordões seminíferos (Vv), Volume Cordonal Total (Vct) e Comprimento Cordonal Total (L): ... 17
4.5. Estimativa do Número Total dos Gonócitos ... 17
4.6. Apoptose dos Gonócitos: ... 18
4.7. Citometria de fluxo – Guava Cell Cycle ... 19
4.7.1. Análise da pureza das amostras ... 20
4.7.2. Citômetro Guava ... 20
4.8. Evidenciação da lectina pelo DBA (Dolichos Biflorus Aglutinin): ... 20
5. RESULTADOS ... 22
5.1. Análise morfológica testicular... 22
5.2. Análise Estereológica ... 24
5.2.1- Densidade Numérica (Nv) de Gonócitos/Espermatogônias: ... 24
5.2.2- Densidade de Comprimento Cordonal (Lv) e Comprimento Cordonal Total (L): ... 24
5.2.3- Volume Total dos Cordões Seminíferos (Vct): ... 25
5.2.4- Estimativa do Número Total de Gonócitos: ... 25
5.3. Investigação de Morte Celular por Apoptose ... 38
5.4. Detecção de lectina nas células germinativas através de DBA ... 51
5.5. Detecção de células OCT4-positivas ... 60
5.6. Detecção de gonócitos/espermatogônias MVH-positivos ... 60
6. DISCUSSÃO ... 69
7. CONCLUSÃO ... 81
8. REFERÊNCIAS ... 82
1. INTRODUÇÃO
A espermatogênese é um processo altamente dinâmico e contínuo, através do qual o gameta masculino, o espermatozóide, é gerado. Este processo depende da proliferação das espermatogônias e da diferenciação destas em espermatócitos, os quais sofrem meiose e formam as espermátides, que, por sua vez, originam os espermatozóides. Assim, a espermatogênese envolve complexos processos de diferenciação celular, os quais ocorrem concomitantemente com os processos de divisão (meiose e mitose) das células germinativas masculinas. A mitose das espermatogônias é fator fundamental na determinação do número de espermatozóides gerados, de forma que alterações na divisão dessas células podem afetar a concentração de espermatozóides. Da mesma forma, a meiose envolve inúmeros processos minuciosamente controlados, como a formação do complexo sinaptonêmico, por exemplo, do qual participam proteínas específicas que garantirão a geração de células haplóides.
A manutenção da espermatogênese e da produção constante de gametas masculinos é possível graças à presença de espermatogônias indiferenciadas, que proliferam e diferenciam-se em tipos subseqüentes de espermatogônias (espermatogônias diferenciadas), até que essas, após sua última divisão mitótica, se diferenciem em espermatócitos pré-leptóteno e iniciem a meiose. Os tipos de espermatogônias indiferenciadas e diferenciadas variam de acordo com a espécie. Nos camundongos e ratos, as espermatogônias são divididas, basicamente, em três tipos: A, Intermediária e B. As espermatogônias do tipo A, por sua vez, são subdivididas, por critérios morfológicos, em A isoladas (Ai), A pareadas (Ap), A alinhadas (Aal), A1, A2, A3 e A4. Embora esta classificação tenha sido inicialmente baseada na forma como estas espermatogônias se apresentam no epitélio seminífero após cada divisão (Russell et al., 1990), atualmente, associa-se esta classificação ao seu grau de diferenciação, de forma que as espermatogônias Ai seriam as menos diferenciadas e as A4 as mais diferenciadas dentre as espermatogônias do tipo A. Por serem menos diferenciadas que as demais, as espermatogônias Ai foram consideradas as espermatogônias tronco (Huckins, 1971), ou seja, as responsáveis pela manutenção da produção de espermatozóides. As espermatogônias Ap e Aal foram denominadas espermatogônias proliferativas, enquanto as espermatogônias A1 a A4 foram classificadas como em diferenciação, enquanto as intermediárias e B foram classificadas como diferenciadas (Russell et al., 1990).
No homem foram descritas espermatogônias dos tipos A clara (Ac), A escura (Ae) e B, não estando presentes as espermatogônias intermediárias. Alguns estudos indicam que as espermatogônias Ac seriam as células tronco do epitélio seminífero (Schulze, 1979).
Embora a presença das espermatogônias tronco tenha sido relatada há quarenta anos (Huckins, 1971), pouco ainda se sabe sobre a biologia dessas células e mesmo sobre
2 a biologia das células que as originam, os gonócitos. Importantes estudos referentes à caracterização molecular das espermatogônias tronco vêm sendo realizados recentemente (Grisanti et al., 2009; Wiebe et al., 2010; Zheng et al., 2009; Gassei et al., 2009; Luo et al., 2009; He et al., 2009; Kokkinaki et al., 2010; Dann et al., 2008; van Bragt et al., 2008; Seandel et al., 2007; Yoshida et al., 2004 e 2006; Ballow et al., 2006; Saga et al., 2009; Suzuki et al., 2009; Hobbs et al., 2010). Esses estudos têm tentado caracterizar essas células e identificar a célula tronco da linhagem germinativa masculina.
Vem sendo demonstrado que, embora as espermatogônias tronco sejam classificadas como células tronco adultas (CTA), elas expressam genes comuns às células tronco embrionárias (CTE), como os genes Oct4 (Dann et al., 2008) e Tex19 (Ollinger et al., 2008), por exemplo. Isto sugere que elas são um tipo especial de células tronco. Atualmente, estudos vêm indicando que as espermatogônias tipo tronco são células intermediárias entre as células tronco adultas e embrionárias (Izadyar et al., 2008; Guan et al., 2006; Kanatsu-Shinohara et al., 2004).
Além da escassez de informações sobre a biologia das espermatogônias tronco, não se sabe ao certo o número de espermatogônias tronco presentes nos testículos de ratos, camundongos e humanos, bem como a forma pela qual elas estão distribuídas ao longo dos túbulos seminíferos. Há divergências também com relação ao momento em que essas espermatogônias se diferenciam a partir dos gonócitos e sobre o período de proliferação e migração dos gonócitos para a base dos cordões seminíferos (Clermont e Perey, 1957; McGuinesess e Orth, 1992; Nagano et al., 2000; Yoshida et al., 2004; Culty, 2009). Este fato representa um empecilho à otimização da coleta e transplante de espermatogônias tronco além de dificultar a interpretação de resultados obtidos em estudos sobre a atuação de drogas e outros agentes danosos sobre a espermatogênese, conforme discutido posteriormente.
1.1. A diferenciação do testículo
A formação dos testículos tem início durante a fase embrionária. Durante esta fase, a carga cromossômica XY do indivíduo do sexo masculino determinará o desenvolvimento testicular durante a determinação sexual masculina (Uzumcu et al., 2002). Morfologicamente, a diferenciação dos testículos é caracterizadas pela formação dos cordões seminíferos, que darão origem aos túbulos seminíferos. Estudos in vitro mostraram que a diferenciação das células de Sertoli (Magre e Jost, 1984) e a migração de células mesonéfricas (Buehr et al., 1993) são essenciais para a formação dos cordões. Nos cordões seminíferos, as células de Sertoli circundam as células germinativas (gonócitos) e estabelecem contato físico com elas. A relação entre as células de Sertoli e as células
germinativas persiste ao longo do desenvolvimento pós-natal, quando essas desempenham papel fundamental na espermatogênese (Nel-Themaat, 2009).
1.2. A origem das espermatogônias tronco
A especificação da célula germinativa ocorre no início da fase embrionária. Estudos realizados em camundongos demonstraram que as células germinativas primordiais (CGP), precursoras dos gonócitos e, portanto, das espermatogônias, têm origem em torno dos 7dpc na região posterior do epiblasto, próximo ao alantóide (Lawson e Hage, 1994). Após sua especificação, essas células migram para a base do alantóide, passam pelo intestino posterior e por seu mesentério dorsal e atingem a gônada em formação (Molyneaus e Wylie, 2004). Nos camundongos, a colonização das gônadas pelas CGP inicia-se aos 10,5 dias pós-coito (dpc) e termina aos 11,5dpc. Em ratos, a origem das CGP ainda não foi demonstrada, mas sabe-se que elas começam a colonizar as gônadas aos 13dpc a essa colonização termina entre os 15 e os 16dpc (Encinas, 2010). Cerca de 3 dias após o fim da migração, as CGP passam a ser chamadas de gonócitos (Culty, 2009). Os gonócitos sofrem mitose até os 16dpc em camundongos, e até os 19 ou 20dpc em ratos, quando se tornam quiescentes (Boulogne et al., 1999; Vergouwen et al., 1991). A mitose dos gonócitos é retomada após o nascimento. Em camundongos, os gonócitos se diferenciam em duas populações diferentes de espermatogônias, estabelecidas de acordo com a expressão de proteínas características de cada população (Yoshida et al., 2006): uma população de células Ngn3-positivas e outra de células Ngn3-negativas. Os mesmos autores demonstraram que estes dois tipos de espermatogônias apresentam diferença na expressão de outros genes e na sua disposição nos cordões seminíferos: as espermatogônias Ngn3-posititvas não expressam c-kit e se localizam em determinados segmentos dos cordões seminíferos, enquanto as espermatogônias Ngn3-negativas expressam c-kit e se localizam em outros segmentos desses cordões. A expressão de c-kit nos gonócitos de camundongos recém-nascidos parece estar relacionada com a migração dessas células em direção à membrana basal (McGuiness e Orth, 1992; Orth et al., 1997). Por outro lado, vON
Schonfeldt e colaboradores mostraram que, em camundongos recém-nascidos, a proteína c-kit é detectada tanto em gonócitos que ainda estão localizados na região central dos cordões seminíferos, quanto naqueles que já migraram para a base desses cordões; entretanto, populações de gonócitos c-kit-negativas também estão presentes (vON
Schonfeldt et al., 2004). Enquanto Yoshida e colaboradores (2006) observaram a presença de duas populações de espermatogônias se diferenciando nos testículos de camundongos recém-nascidos e que essas populações podem ser diferenciadas pela expressão de c-kit e Ngn3, Orwig e colaboradores (2002), mostraram que o testículo de ratos recém-nascidos possui duas populações de gonócitos que podem ser diferenciadas pela sua morfologia:
4 uma população de células redondas e outra de células com pseudópodos (Orwig et al., 2002). De acordo com os autores deste trabalho, os gonócitos com pseudópodos dão origem às espermatogônias tronco, enquanto os gonócitos redondos degeneram (Orwig et al., 2002; MCLean et al., 2003). Os gonócitos contendo pseudópodos migram para a região basal do cordão seminífero, onde interagem com as células de Sertoli e com a membrana basal dos cordões, os quais contribuem para formação do nicho das espermatogônias tronco. Segundo Orth e colaboradores (1996), os gonócitos contendo pseudópodos expressam c-kit. Outro estudo sugere que, conforme os gonócitos retomam sua proliferação (chamados gonócitos mitóticos), eles começam a se diferenciar em espermatogônias, passando por um estágio de transição denominado pré-espermatogônias (Hilscher et al., 1974) ou células em transição (Beaumont e Mandl, 1963), as quais, por sua vez, se diferenciam em dois tipos diferentes de espermatogônias, denominadas espermatogônias T1 e T2 (Hilscher et al., 1974). Segundo esses autores, as pré-espermatogônias T1 sofrem mitose e originam as pré-pré-espermatogônias T2, que, por sua vez, originam as espermatogônias do tipo A.
1.3. Apoptose dos Gonócitos
Durante a fase de quiescência, o número de gonócitos não muda (Beaumont e Mandl, 1963; Hilscher et al., 1974), pois estes permanecem estagnados na fase G1 do ciclo celular. Entretanto, a análise dos testículos durante este período, revela que há uma redução visual no número de gonócitos por seção testicular (Beaumont e Mandl, 1963). Os estudos iniciais sobre a dinâmica dos gonócitos no final da fase gestacional e início da fase pós-natal sugeriram que essas células diminuem em número entre 1 e 5dpp (Beaumont e Mandl, 1963; Roosen-Runge e Leik, 1968).
Estudos realizados com camundongos mostraram que durante seu desenvolvimento inicial e no início da fase pós-natal, as células germinativas têm seu número controlado por apoptose (Coucouvanis e Jones, 1993; Mori et al., 1997; Wang et al., 1998), que ocorre entre os 13 e os 17dpc na fase embrionária. A idade em que a mitose é retomada após o período de quiescência varia de 4 a 8dpp, de acordo com o autor (Hilscher et al., 1974; Mori et al., 1997; Wang et al., 1998). O pico de apoptose é observado entre 7 e 13dpp (Wang et al., 1998), coincidindo com a primeira onda espermatogênica. Segundo Boulogne e colaboradores (1999), a apoptose das células germinativas de rato segue o mesmo padrão e ocorre em gonócitos tanto antes do período de quiescência, como quando eles retomam a mitose. Nos testículos de rato, células germinativas apoptóticas são observadas aos 8dpp (Billig et al., 1995; Vigueras-Villaseñor et al., 2006; Culty et al., 2009;), mas, de acordo com Billig e colaboradores (1995), o pico de apoptose das células germinativas é observado entre 16 e 32dpp, período em que a primeira onda espermatogênica ocorre nesta espécie.
As vias e os mecanismos da apoptose vêm sendo largamente abordados na literatura, mas muitos aspectos estão ainda incompreendidos (Shaha et al., 2010). Neste aspecto, o testículo é um órgão especial, pois é de organização muito complexa, sendo composto por diferentes tipos celulares que dependem uns dos outros para se manterem. O grande desafio é identificar a relevância funcional dos reguladores intra e intercelulares da apoptose das células germinativas. As caspases, por exemplo, são fundamentais para o controle da apoptose das células germinativas durante a primeira onda da espermatogênese em camundongos e ratos (Moreno et al., 2006; Zheng et al., 2006). Outro importante aspecto que vem sendo estudado mais recentemente é o fato de que os miRNAs possuem papel importante na apoptose das células germinativas. Desta forma, é essencial identificar os vários miRNAs e suas funções para que se possa obter mais informações sobre os mecanismos controladores da morte apoptótica das células germinativas.
Estudos indicam que as células que sofrem apoptose são os gonócitos redondos, ou seja, aqueles que não dão origem a espermatogônias tronco (Orwig et al., 2002). Esta população de gonócitos representa 42,6% da população total dessas células (Orwig et al., 2002). A definição do período em que os gonócitos começam a sofrer apoptose varia entre os autores (Boulogne et al., 1999; de Miguel et al., 1997; McGuinness e Orth, 1992; Orwig et al., 2002; Prépin et al., 1994; Wang et al., 1998). Diferentes métodos foram utilizados, mas os resultados não se confirmam, de forma que estudos ainda são necessários para que o momento em que esses fenômenos ocorrem sejam precisados. Os fatores locais determinantes de apoptose de células germinativas masculinas parecem depender do estágio de desenvolvimento do animal e do ciclo do epitélio seminífero (Shaha, 2010). Assim, estudos sobre as fases em que os gonócitos sofrem apoptose associados à aplicação dos conhecimentos sobre os mecanismos e os componentes moleculares envolvidos na apoptose, além de sua associação com a dinâmica das células de Sertoli, são fundamentais para a compreensão da dinâmica da apoptose das células germinativas.
1.4. Controle da proliferação e da diferenciação dos gonócitos e das espermatogônias tronco
As células germinativas primordiais, assim que são estabelecidas nas gônadas embrionárias de camundongos, proliferam por um período máximo de 5 dias e tornam-se quiescentes, dando origem aos gonócitos (Vergouwen et al., 1991). Sua proliferação é retomada logo após o nascimento e, concomitantemente, os gonócitos começam a se diferenciar nas pré-espermatogônias e estas em espermatogônias. Segundo Boulogne e colaboradores (1999) a retomada da proliferação dos gonócitos após o período de quiescência no rato, coincide com a onda de morte dessas células por apoptose, que atinge seu pico aos 7dpp. Da mesma forma que a apoptose, a definição do período em que os
6 gonócitos retomam a mitose também varia entre os autores (Boulogne et al., 1999; de Miguel et al., 1997; McGuinness e Orth, 1992; Orwig et al., 2002; Prépin et al., 1994; Wang et al., 1998). Também aqui, diferentes métodos foram utilizados mais estudos ainda são necessários para que este aspecto do desenvolvimento das células germinativas seja definido.
Os períodos específicos de cada evento do desenvolvimento das CGP e dos gonócitos foram muito menos estudados nos ratos do que nos camundongos, de forma que os dados referentes à idade exata em que as CGP são originadas, quando se encontram em fase de migração e quando interrompem a mitose são ainda menos precisos. Recentemente, o desenvolvimento dos gonócitos em camundongos, ratos e humanos foi revisado por Culty (2009). Segundo este autor, nos ratos, o período de migração das CGP e colonização da gônada está entre 8 e 13dpc, quando essas células transformam-se em gonócitos. Entre os 13 e os 18dpc os gonócitos proliferam e em torno dos 19dpc entram em estado de quiescência, retomando a mitose após o nascimento. Embora este trabalho de revisão mencione todos esses dados, os estudos que os comprovam não são citados, de forma que não é possível confirmar as etapas do desenvolvimento dos gonócitos nele mencionadas.
A diferenciação dos gonócitos em espermatogônias vem sendo demonstrada através de estudos que utilizam transplante de gonócitos de camundongos de idades diferentes. Estes estudos demonstraram que os gonócitos de recém-nascidos (0-3dpp) são capazes de colonizar testículos de animais recipientes, mas não são capazes de promover a espermatogênese (McLean et al., 2003; Shinohara et al., 2000). Por outro lado, gonócitos de camundongos com 4-5dpp demonstram capacidade de promover a espermatogênese após transplante. Entretanto, a partir dos 12dpp, essa capacidade é significantemente reduzida (McLean et al., 2003).
Em humanos, os gonócitos se diferenciam em pré-espermatogônias logo após a 12a semana de gestação, ou seja, mais cedo do que em ratos e camundongos, nos quais essa diferenciação só ocorre apos o nascimento. Esses gonócitos são interconectados por pontes citoplasmáticas (Wartenberg, 1976). Conforme o feto se desenvolve, o número de gonócitos diminui, ocorrendo aumento do número de espermatogônias fetais (Fukuda et al., 1975). É importante também levar em consideração que, ao mesmo tempo em que os gonócitos estão se multiplicando e/ou morrendo, os testículos estão sofrendo crescimento rápido devido ao aumento do número de células de Sertoli e de células intersticiais (Vergowen et al., 1993), de forma que é possível que haja a necessidade de controles específicos para este período, no que se refere ao estabelecimento das espermatogônias. Assim, deve-se levar em conta o desenvolvimento das células somáticas durante esta importante fase do desenvolvimento. Há indícios de que as células de Sertoli começam a demonstrar diferenças na expressão de galectina 1 ao longo dos cordões seminíferos já na
primeira semana de vida, em camundongos (Timmons et al., 2002). Isto indica que estas células já estão estabelecendo o ciclo do epitélio seminífero nesta fase e que este fato parece influenciar o desenvolvimento das células germinativas (Timmons et al., 2002). Yoshida e colaboradores (2006) sugeriram que a disposição das espermatogônias em camundongos de 3, 4 e 5dpp varia de acordo com a expressão de galectina 1 (Yoshida et al., 2006). Segundo esses autores, as espermatogônias kit-positivas tendem a se localizar em regiões dos cordões ricas em galectina 1, enquanto as espermatogônias Ngn3-positivas tendem a se localizar em regiões onde a expressão de galectina 1 é média, indicando uma distribuição não-aleatória dos gonócitos (Yoshida et al., 2006). No entanto, mais estudos a este respeito são necessários para confirmar esta hipótese.
Além das variações de resultados obtidos por diferentes estudos, existe, também, grande variação entre espécies e entre linhagens de uma mesma espécie, como é o caso de camundongos e ratos. Por exemplo, a presença de duas populações de gonócitos morfologicamente distintas observada no rato, não foi observada em camundongos, os quais possuem, segundo critérios morfológicos, somente uma população de gonócitos semelhantes aos gonócitos redondos. Entretanto, os camundongos possuem populações de gonócitos c-kit-positivo e c-kit-negativo, o que define essas populações funcionalmente (Culty, 2009).
1.4.1. Genes envolvidos na proliferação e diferenciação dos gonócitos e espermatogônias tronco.
A proliferação e a diferenciação dos gonócitos dependem de diferentes fatores produzidos pelas células vizinhas, especialmente pelas células de Sertoli, e pelos próprios gonócitos e espermatogônias. O PDGFR- (Platelet Derived Growth Factor Receptor – ), expresso pelos gonócitos, foi identificado, em camundongos, como fator importante para a proliferação dos gonócitos (Basciani et al., 2008). Os ligantes deste receptor (PDGF-B e PDGF-D) são produzidos pelas células de Sertoli e funcionam como fatores quimiotáticos para os gonócitos, controlando, além de sua proliferação, sua migração para a base dos cordões seminíferos nesta espécie (Basciani et al., 2008). Embora estudos indiquem que já existe um pré-estabelecimento do ciclo do epitélio seminífero nas células de Sertoli de camundongos, não se sabe, com certeza, se há nichos específicos nos quais os gonócitos que originarão as espermatogônias tronco têm sua proliferação e diferenciação controladas. Por outro lado, parece claro que a proliferação das espermatogônias tronco/progenitoras depende do seu nicho. Em ratos e camundongos, a molécula GDNF, um dos principais fatores produzidos pelo nicho das espermatogônias, influencia a auto-renovação das espermatogônias tronco/progenitoras in vitro (Kubota et al., 2004; Ryu et al., 2005). Recentemente, He e colaboradores demonstraram que a proliferação das espermatogônias
8 tronco depende da via de sinalização controlada pelo gene Nodal, de forma autócrina, através da ativação das Smads 2/3 e do Oct-4 (He et al., 2009). Além da via de sinalização Nodal, a via Wnt também atua na proliferação das espermatogônias tronco/progenitoras (Golestaneh et al., 2009).
Uma das características apontadas como fundamentais das espermatogônias tronco, é sua divisão assimétrica, de forma que uma célula progride para promover a espermatogênese enquanto a outra permanece como célula tronco (Luo et al., 2009). Embora esta seja uma característica fundamental de muitas células tronco adultas, como as neuronais (Matsukazi, 2000; Shen et al., 2004; Sun et al., 2005), as musculares (Kuang et al., 2007), as da pele (Koster e Roop, 2005; Lechler e Fuchs, 2005) e as sanguíneas (Faubert et al., 2004), os mecanismos pelos quais isto acontece permanecem obscuros. Um dos fatores que parece influenciar esta assimetria é a distribuição também assimétrica das proteínas UCHL1 (Ubiquitin C-terminal hydrolase L1), uma enzima que promove a desubiquitinação de proteínas no cérebro, testículos e ovários (Wilkinson et al., 1989) e Plzf, proteína fundamental para a manutenção das espermatogônias tronco (Costoya et al., 2004). No epitélio seminífero, ambas proteínas são expressas exclusivamente pelas espermatogônias (Luo et al., 2006). Segundo Luo e colaboradores (2009), as proteínas Plzf e UCHL1 são segregadas de forma assimétrica durante a formação das espermatogônias Apr tanto in vivo como in vitro, mas não se sabe se isso acontece também nas divisões subseqüentes dessas espermatogônias para a formação das espermatogônias Aal. Além da UCHL1 e da Plzf, o fator de transcrição Oct4 (também conhecido por Pou5f1) também é fundamental para a manutenção das espermatogônias tronco (Chew et al., 2005). Em embriões masculinos, as células germinativas expressam a proteína Oct4 ao longo de todo o desenvolvimento fetal. Após o nascimento, a expressão da proteína Oct4 continua nos gonócitos e nas espermatogônias indiferenciadas (Pesce et al., 1998; Tadokoro et al., 2002).
Conforme mencionado anteriormente, a expressão do gene c-kit parece estar envolvida na segregação de populações de gonócitos para posterior diferenciação das espermatogônias em camundongos. O gene c-kit é expresso pelas células germinativas primordiais (Høier et al., 2005; Matsui et al., 1990) e por alguns gonócitos (vON Schonfeldt et al., 2004; Orth, Jester e Qiu, 1996). A interação deste gene como o seu ligante é fundamental para a migração das células germinativas primordiais até a gônada (Runyan et al., 2006). Após o nascimento, os gonócitos continuam a expressar o c-kit (Orth et al., 1996), de forma que este deixa de ser expresso quando esses gonócitos se transformam em espermatogônias tronco, e volta a se expressar nas espermatogônias diferenciadas (Schrans-Stassen et al., 1999). Após a formação das espermatogônias, o c-kit é expresso somente nas espermatogônias em diferenciação, ou seja, nas espermatogônias A1 a A4, intermediárias e B (Manova et al., 1990; Schrans-Stassen et al., 1999).
Em camundongos, o RNAm da proteína Oct4 está presente desde a clivagem inicial nos blastômeros, porém os níveis da proteína OCT4 caem, até que ela se torna indetectável após o 3.5dpc (Schöler et al., 1990; Palmieri et al., 1994). Na fase de gastrulação, a proteína OCT4 fica restrita a um grupo pequeno de células epiblásticas que dará origem às células germinativas primordiais (Schöler et al., 1990; Yeom et al., 1996). As células germinativas primordiais expressam Oct4 ao longo de sua proliferação e migração, até atingirem as cristas genitais em formação. No sexo masculino, as células germinativas, agora gonócitos, continuam a expressar o Oct4. Quando estes se diferenciam em espermatogônias, a expressão é mantida, mas somente nas espermatogônias indiferenciadas. Além do Oct4, as CGP expressam outros genes relacionados à manutenção da pluripotência, também de maneira sexo-específica, como Nanog e Sox2. A função desses genes na diferenciação das células germinativas é incerta; porém, sabe-se que são fundamentais para a sobrevivência das células germinativas (Western et al., 2010).
Sada e colaboradores (2009) demonstraram que a proteína NANOS2 é fundamental para a manutenção das espermatogônias tronco (Sada et al., 2009) e está presente nas espermatogônias Ai (Suzuki et al., 2009). Camundongos deficientes em NANOS2 sofrem depleção das espermatogônias tronco/progenitoras, enquanto aqueles que super-expressam essa proteína mostram acúmulo de espermatogônias tronco/progenitoras (Sada et al., 2009). Assim como o NANOS2, os genes Ngn3 e Gfr -1 estão presentes nas espermatogônias Ai (Suzuki et al., 2009), que são as mais prováveis candidatas a serem espermatogônia tronco. Entretanto, estudo recente sugere que a população de espermatogônias isoladas é heterogênea, de forma que cada população expressa uma combinação desses três genes (Suzuki et al., 2009). Este mesmo estudo mostra que há “clusters” de espermatogônias indiferenciadas conectadas por pontes citoplasmáticas que expressam genes diferentes. Isto sugere que esteja ocorrendo divisão assimétrica das espermatogônias (Suzuki et al., 2009), conforme descrito anteriormente. Entretanto, neste caso, os autores sugerem que o gene expresso de maneira diferencial e que determina a manutenção da espermatogônia dentro do cluster é o Gfr -1 (Suzuki et al., 2009).
Muitos estudos sobre o desenvolvimento dos gonócitos e das espermatogônias vêm sendo realizados in vitro (Boulogne et al., 1999; Li et al., 1997; Livera et al., 2000; Orth et al., 2000). Entretanto, embora o sistema de estudos in vitro permita maior controle do meio no qual as células se desenvolvem, esse sistema acaba causando modificações no grau de diferenciação das células, influenciando suas características normais de desenvolvimento, o que faz com que os dados obtidos forneçam informações que nem sempre refletem os mecanismos e eventos naturais do desenvolvimento dessas células. A despeito disso, os estudos das espermatogônias e gonócitos realizados in vitro são de grande importância para a investigação da atuação de drogas e de diferentes substâncias sobre a proliferação e a diferenciação dessas células. No entanto, a investigação do desenvolvimento dos gonócitos
10 e das espermatogônias in situ pode fornecer dados mais precisos sobre a relação entre as características dessas células e sua localização, sobre sua distribuição e sobre o seu desenvolvimento em relação ao desenvolvimento testicular como um todo. Além disso, os estudos in situ podem ser mais precisos no que se refere à resposta dessas células a agentes tóxicos externos, aspecto bastante atual dos estudos sobre fertilidade masculina. Estudos demonstraram, por exemplo, que as espermatogônias participam ativamente da mediação de danos testiculares ocasionados por variados agentes, como radiação (Asakawa et al., 2007; Dubrova et al., 1998; Forand et al., 2009) e quimioterápicos (Celinkler et al., 2007; Howell e Shalet, 2005). Entretanto, pouco se sabe sobre a forma como esses agentes atuam sobre essas células ou sobre suas células precursoras, os gonócitos. Isto se deve ao fato de os dados sobre o desenvolvimento e a diferenciação dessas células ainda não serem suficientes. Devido à falta de informações sobre o estabelecimento, número, proliferação e diferenciação das espermatogônias, nem sempre é possível precisar quais tipos são lesados por agentes tóxicos e como se dá a evolução dessas células após a administração desses agentes. Isto tem dificultado a interpretação dos efeitos desses agentes sobre a espermatogênese como um todo, principalmente em estudos a longo prazo. Essas dificuldades vêm sendo observadas por nosso grupo de pesquisa, que vem realizando estudos sobre os efeitos do quimioterápico etoposide sobre o epitélio seminífero de ratos tratados na fase pré-púbere e sacrificados na fase púbere e adulta (Stumpp et al., 2004, 2006 e 2008; Okada et al., 2009). Nesses estudos observamos que o etoposide tem efeitos deletérios sobre o epitélio seminífero de ratos tratados na fase pré-púbere e que esses efeitos são permanentes, ou seja, são observados também em diferentes períodos da vida adulta. Alguns dados sugerem que este quimioterápico age nas espermatogônias tronco (Marchetti et al., 2006; Marcon et al., 2010; Palo et al., 2005; Okada et al., 2009). Contudo, conforme mencionado anteriormente, a falta de informações sobre o desenvolvimento dessas células, principalmente nos ratos, tem dificultado a interpretação e mesmo a realização de novos estudos a esse respeito. O conhecimento das características das espermatogônias tronco in situ é importante para que se compreenda a cinética do desenvolvimento dessas células juntamente com o desenvolvimento das células de Sertoli, as quais são fundamentais para a manutenção das espermatogônias tronco e da espermatogênese.
Desta forma, baseando-se na importância das espermatogônias tronco para a fertilidade masculina e para a restauração da espermatogênese em casos de infertilidade, bem como no fato de que poucos dados conclusivos sobre o desenvolvimento dessas células a partir dos gonócitos foram obtidos até o momento, o objetivo desse estudo foi associar, em um único estudo, as análises morfológica e estereológica do desenvolvimento dos gonócitos e espermatogônias com análises de diferentes marcadores para essas células e para apoptose, buscando homogeneizar os dados referentes ao desenvolvimento
dessas células. Este estudo auxiliará em estudos futuros que vimos buscando desenvolver, os quais objetivam compreender a dinâmica das espermatogônias tronco de ratos, bem como sua caracterização molecular.
12 2. OBJETIVOS
2.1- Objetivo Geral
O objetivo geral deste trabalho é associar dados estereológicos testiculares aos dados morfológicos e imuno-histoquímicos sobre o desenvolvimento dos gonócitos e das espermatogônias, com o intuito de contribuir para a compreensão da dinâmica do desenvolvimento dos gonócitos e da geração das espermatogônias tronco no rato.
2.2- Objetivos específicos
- Quantificar os gonócitos e as espermatogônias nos testículos de ratos nas fases embrionária e neonatal, respectivamente;
- Avaliar a morte celular, por apoptose, dos gonócitos e das espermatogônias nas fases embrionária e neonatal, respectivamente;
- Reavaliar a proliferação dos gonócitos no fim da fase embrionária e no período neonatal;
- Reavaliar o crescimento dos cordões seminíferos no período entre o final da fase embrionária e o início da fase pós-natal.
3. JUSTIFICATIVA
O microambiente testicular é mantido por inúmeras interações entre os diferentes tipos celulares e fatores, característicos deste órgão. A rede de intercomunicação das células germinativas e somáticas testiculares e a ação de hormônios nos testículos são responsáveis pela manutenção da espermatogênese e das características sexuais secundárias masculinas. Todas essas interações e a complexidade com que elas ocorrem, tornam difíceis os estudos sobre os mecanismos pelos quais células e fatores influenciam uns aos outros, de forma que muitos estudos ainda são necessários pra compreendê-las.
Dentre os diversos aspectos da biologia dos testículos e da espermatogênese que vêm sendo estudados, destaca-se a busca pela definição das células tronco da linhagem germinativa masculina, ou seja, das espermatogônias tronco. Recentemente, principalmente nos últimos três anos, diferentes estudos vêm buscando definir as espermatogônias tronco através da descrição de marcadores que permitam identificá-las de forma precisa. Estes marcadores estão relacionados às características de pluripotência e determinam a manutenção do estado indiferenciado e a proliferação das espermatogônias tronco, fatores fundamentais para a manutenção da espermatogênese. Entretanto, ainda não foi possível encontrar uma característica que seja exclusiva da espermatogônia tronco, ou seja, que não esteja presente nas espermatogônias progenitoras.
Os gonócitos, células que originam as espermatogônias tronco, também são células pouco estudadas. Os gonócitos começam a se diferenciar em pré-espermatogônias poucos dias após o nascimento (McLean et al., 2003; Clermont e Perey, 1957). Porém, pouquíssimo se sabe sobre a forma pela qual os gonócitos e espermatogônias se distribuem pelos cordões e/ou túbulos seminíferos e o que determina essa distribuição que culminará com a formação dos nichos definitivos no testículo adulto. Também pouco se sabe sobre o número total dessas células nos testículos e sobre seu grau de proliferação e morte em períodos críticos do desenvolvimento. No que se refere à morte dos gonócitos, os dados são controversos, não havendo consenso sobre as idades em ela ocorre e sobre os mecanismos e vias envolvidos nesses processos. Junta-se a isso o fato de poucos estudos terem sido realizados em ratos em comparação a camundongos e de que a associação do estabelecimento das espermatogônias tronco com a diferenciação testicular vem sendo negligenciada. Ao mesmo tempo em que o número de espermatogônias está sendo estabelecido, as células de Sertoli estão proliferando, os cordões seminíferos estão sendo formados e as células de Leydig estão se diferenciando. É possível que todas essas modificações estejam influenciando a distribuição dos gonócitos e das espermatogônias tronco e a possível formação dos nichos pelos testículos.
Embora algumas características importantes das espermatogônias tronco/progenitoras venham sendo descritas, ainda não se conhece muito sobre a biologia
14 dessas células, sobre sua distribuição ao longo dos túbulos seminíferos e sobre sua origem e diferenciação ou até mesmo sobre o número dessas células presentes nos testículos. O conhecimento aprofundado sobre as espermatogônias tronco é fundamental para que se garanta a possibilidade de utilizá-las em terapia gênica e celular e também para que se possa interpretar de forma adequada a ação de agentes tóxicos sobre estas células. Em trabalhos prévios realizados por nosso grupo, observou-se que o tratamento de ratos pré-púberes com o quimioterápico etoposide causa diminuição da fertilidade nos adultos (Okada et al., 2009; Stumpp et al., 2004). Os resultados por nós observados sugerem que as espermatogônias tronco foram afetadas (Okada et al., 2009). Para verificar esta hipótese de forma mais completa, percebemos a necessidade de dispor de mais conhecimento sobre as espermatogônias tronco de ratos e sobre as células que as originam, os gonócitos, uma vez que os dados encontrados na literatura ainda não esclareceram esses pontos. Portanto, além de ser necessário para utilização em terapias contra a infertilidade, o conhecimento sobre as espermatogônias tronco também pode contribuir para a interpretação da ação de agentes tóxicos sobre os testículos. Assim, propõe-se no presente estudo descrever o desenvolvimento dos gonócitos e das espermatogônias tronco/progenitoras durante o período crítico para a diferenciação destas células, bem como para a diferenciação testicular.
4. MÉTODO
Para este estudo foram utilizados embriões do sexo masculino com 19 dias pós-coito (dpc) e ratos machos com idades de 1, 3, 5, 8, 11 e 15 dias pós-parto (dpp). Para cada idade foram utilizados cinco machos. Essas idades foram escolhidas com base em observações feitas por nosso grupo (dados não publicados) e que representam momentos em que as células germinativas passam de mitoticamente inativas (19dpc e 1dpp) para mitoticamente ativas (a partir de 4dpp).
Os animais foram obtidos a partir do acasalamento de machos e fêmeas provenientes do Centro para Desenvolvimento de Modelos Experimentais (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Os animais foram mantidos no Biotério da Disciplina de Biologia do Desenvolvimento, onde foram realizados os acasalamentos. Os animais foram mantidos em gaiolas contendo marvalha, água e ração fornecidas ad libitum, e sob controle de temperatura e luminosidade (21 a 23ºC; 12/12h claro/escuro).
4.1. Coleta do material:
Ao atingirem as idades acima propostas, os animais foram sacrificados por inalação de CO2. No caso dos embriões de 19dpc, as mães foram submetidas à inalação de CO2, após, os embriões foram coletados e colocados em placa de Petri contendo solução salina 0,9% e sobre gelo, até que não demonstraram mais resposta ao toque. Os testículos direito e esquerdo dos animais foram coletados e fixados em líquido de Bouin por diferentes períodos de tempo, de acordo com o tamanho do órgão. Os testículos foram processados para inclusão em parafina para a realização das seguintes análises: a) imuno-marcação de proteínas específicas para gonócitos e espermatogônias; b) mensuração da densidade de comprimento e de volume dos cordões seminíferos (Lv e L, respectivamente); c) quantificação e densidade numérica dos gonócitos/espermatogônias (N e Nv, respectivamente), conforme descrito a seguir.
4.2. Análise morfológica testicular:
Para melhor compreender o desenvolvimento dos gonócitos e das espermatogônias, foi realizada a análise morfológica testicular. Para isto, foram obtidos cortes com 6µm de espessura os quais foram submetidos à reação histoquímica do Tricrômico de Mallory, que evidencia a heterocromatina típica dos gonócitos e espermatogônias. Os diferentes tipos de espermatogônias foram identificados de acordo com Russell (1993). Além da descrição das características normais, foi analisada a presença de possíveis células que apresentaram características específicas de apoptose.
16 4.3. Densidade Numérica de Gonócitos e Espermatogônias:
Para identificar e quantificar os gonócitos e as espermatogônias indiferenciadas, cortes dos testículos dos animais de todas as idades estudadas foram submetidos à imuno-marcação do fator de transcrição OCT4 e da proteína MVH, que são marcadores específicos para estas células. O protocolo utilizado para a imuno-marcação está descrito a seguir. Embora o OCT4 seja um bom marcador para espermatogônias indiferenciadas de camundongos, o mesmo não foi observado para rato conforme descrito no capítulo Resultados. Assim, somente a marcação da MVH foi utilizada para quantificar os gonócitos e as espermatogônias. Como esta proteína está presente nas células germinativas desde a fase de espermatogônia indiferenciada até espermatócito, a quantificação nas idades de 11 e 15dpp levou em consideração somente as células localizadas junto à membrana basal, que consistem nas espermatogônias indiferenciadas e diferenciadas.
Para a quantificação dos gonócitos e das espermatogônias cada seção testicular foi totalmente percorrida e foram analisados campos alternados. Assim, a quantidade de campos variou de acordo com a idade, uma vez que o tamanho dos testículos é bem diferente em cada idade. A quantidade de campos analisada em cada idade foi: 3 campos aos 19dpc, 4 campos aos 1, 3 e 5dpp, 5 campos aos 8 e 11dpp e 6 campos aos 15dpp. Em todas as idades foram analisados quatro cortes por testículo. O número de células obtido em cada idade foi dividido pela área total analisada para obtenção da densidade numérica (Nv) de gonócitos ou espermatogônias. Os testículos foram analisados com o auxílio de programa de análise de imagem Leica QWin V3 (Cambridge, Reino Unido).
- Protocolo utilizado para imuno-marcação das proteínas OCT4 e MVH
A partir de cada testículo incluído em parafina, foram obtidos quatro cortes transversais com 6 m de espessura por animal. Os cortes foram depositados sobre lâminas silanizadas, desparafinados, hidratados e submetidos à recuperação do antígeno através de calor, em tampão citrato (pH 6,0), por 15 minutos. Após isso, a peroxidase endógena foi inativada utlizando peróxido de hidrogênio 3%, por 15 min. Os cortes foram lavados em PBS (0,05M - pH 7,2) e então, tratados com BSA 5% por 10 minutos, após o que foram submetidos à incubação com o anticorpo anti-OCT4 (1:300 - Abcam) por 12h (“overnight”) ou anti-MVH (1:200 – Santa Cruz). Os cortes histológicos foram lavados com PBS, incubados com o anticorpo secundário biotinilado (DAKO) por 30 min. e lavados com PBS novamente. Feito isto, os cortes foram incubados com estreptavidina conjugada à peroxidase (DAKO) por 30 min., lavados em PBS e submetidos ao tratamento com DAB para revelação da reação.
4.4. Densidade de Comprimento Cordonal (Lv), Densidade de Volume dos cordões seminíferos (Vv), Volume Cordonal Total (Vct) e Comprimento Cordonal Total (L):
Conforme previamente mencionado, os gonócitos passam por um período de quiescência, que tem início em torno dos 18dpc e termina em torno dos 3dpp no rato (Culty, 2009). Durante este período os testículos estão em crescimento bastante acentuado (Gaytan et al., 1986). Assim, é provável que haja redistribuição dos gonócitos durante este período. Para verificar esta hipótese, foram obtidos a densidade de comprimento cordonal (Lv), o comprimento cordonal total (L) e o volume total dos cordões seminíferos (Vct). Para a obtenção da Lv, foram analisados seis cortes transversais dos testículos em todas as idades estudadas, nos quais foram contadas as seções transversais de cordões seminíferos observadas em cada campo analisado. A quantidade de campos varia de acordo com a idade devido à diferença no tamanho dos testículos, conforme mencionado anteriormente. Entretanto, essa diferença não influencia nos resultados obtidos, uma vez que o que será obtida é a densidade de comprimento cordonal (Lv). Para o cálculo desta densidade, o número de seções de cordões seminíferos contados, foi dividido pela área total analisada, segundo a fórmula Lv= 2 x cordões contados/área analisada (Mandarim-de-Lacerda, 2003). Para a obtenção da Vv dos cordões seminíferos, a área desses cordões foi medida utilizando o programa de análise de imagens Leica QWin V3 e seu valor foi dividido pela área total analisada. O valor da Lv foi utilizado para obtenção do valor do comprimento total dos cordões seminíferos (L) nas idades de 19dpc, e 1, 3 e 5dpp, segundo a fórmula: L= Lv x Volume total dos cordões seminíferos (Mandarim-de-Lacerda, 2003). Para obtenção do volume total dos cordões seminíferos os testículos dos animais de 19dpc, e 1, 3 e 5dpp foram totalmente secionados e os cortes seriados tiveram sua área medida utilizando o programa de análise de imagens Leica QWin V3. A área obtida foi multiplicada pela espessura do corte (6µm) para que se obtivesse o volume total testicular. Uma vez que a Vv dos cordões seminíferos também foi previamente obtida, pôde-se calcular o volume total dos cordões seminíferos (Vct) em cada idade baseando-se nos valores do volume testicular total e da Vv dos cordões seminíferos. Devido à necessidade dos testículos serem completamente secionados para obtenção do Vct, esta análise foi realizada somente nas idades de 19dpc, e 1, 3 e 5dpp.
4.5. Estimativa do Número Total dos Gonócitos
O número total dos gonócitos foi obtido nas idades de 19dpc, 1dpp, 3dpp e 5dpp. Esta análise não foi realizada nas demais idades devido ao fato de espermatogônias já
18 estarem presentes e sua distinção dos gonócitos e pré-espermatogônias não ter sido possível através do uso de marcadores. O número total dos gonócitos foi obtido segundo o método de Abercrombie (Abercrombie e Johnson, 1946) modificado. Para obtenção deste dado, o volume cordonal total (Vct) e a densidade numérica de gonócitos (Nv) foram utilizados da seguinte maneira: sabendo que a Nv consiste no número de gonócitos em determinado volume de cordão seminífero, calculou-se o número total estimado dessas células no volume total de cordão seminífero (Vct) através da fórmula
O No. parcial de gonócitos e a área parcial referem àquelas medidas realizadas para a obtenção da Nv de gonócitos.
4.6. Apoptose dos Gonócitos:
Para investigar quando os gonócitos morrem por apoptose, foi empregado o método TUNEL, utilizando-se o kit ApopTag Plus Peroxidase (Millipore), a imunomarcação da proteína p53 e da caspase -3 clivada. Foi realizada também a análise morfológica das células, conforme descrito no item 3.2. Os testículos dos embriões de 19dpc e dos animais com 1, 3, 5, 8, 11 e 15dpp foram avaliados quanto a este parâmetro.
TUNEL
Para realização do método TUNEL, a partir dos blocos de parafina, foram obtidos quatro cortes (6 m de espessura) por animal, os quais foram colocados sobre lâmina silanizada, desparafinados, hidratados e submetidos ao tratamento com proteinase K (25 g/ml) por 10 minutos, a temperatura ambiente. Os cortes foram lavados em tampão fosfato (PBS, pH 7,4) e submetidos ao tratamento com tampão de equilíbrio (fornecido pelo fabricante do kit) por 10 minutos. O tampão foi desprezado e os cortes foram incubados com a enzima TdT em tampão de reação (fornecido pelo fabricante do kit) a 37 C, em câmara úmida por 60 minutos. Os cortes foram lavados e incubados com a anti-digoxigenina associada a peroxidase por 30 minutos, após o que, foram lavados e submetidos ao tratamento com DAB (3,3-diaminobenzidina) para revelação da reação. Os núcleos foram contra-corados com Hematoxilina de Harris.
No. Gonócitos =
Vct x No. Parcial Gonócitos
Imunomarcação da Proteína p53
Para a imunomarcação da proteína p53 foram obtidos quatro cortes testiculares transversais com 6 m de espessura por animal. Os cortes foram depositados sobre lâminas silanizadas e foram desparafinados, hidratados e submetidos à recuperação do antígeno por calor em tampão citrato (pH 6,0), por 12 minutos. Após isso, foi realizada a inativação da peroxidase endógena em peróxido de hidrogênio 3%, por 15 min. Os cortes foram, então, tratados com BSA 15% por 10 minutos, após o que foram submetidos à incubação com o anticorpo primário anti-p53 (Santa Cruz) à temperatura ambiente por 60 minutos. Os cortes foram lavados em PBS (0,05M - pH 7,2) e incubados com o anticorpo secundário biotinilado (DAKO) por 30 min. e lavados com PBS novamente. Feito isto, os cortes foram incubados com estreptavidina conjugada à peroxidase (DAKO) por 30 min., lavados em PBS e submetidos ao tratamento com DAB para revelação da reação. Os núcleos foram contracorados com Hematoxilina de Harris.
Imunomarcação da Caspase 3 clivada
Foram obtidos quatro cortes testiculares transversais, com 6 m de espessura, por animal. Os cortes foram depositados sobre lâminas silanizadas e foram desparafinados, hidratados e submetidos à recuperação do antígeno através de calor em tampão citrato (pH 6,0), por 15 minutos. Após isso, foi realizada a inativação da peroxidase endógena em peróxido de hidrogênio 3%, por 15 min. Os cortes foram, então, tratados com BSA 8% por 30 minutos, após o que foram submetidos à incubação com o anticorpo primário anti-caspase 3 clivada (Cell Signaling, 1:200) por 12 horas (“overnight”) a 4ºC. Os cortes foram lavados em PBS (0,05M - pH 7,2), incubados com o anticorpo secundário biotinilado (DAKO) por 30 min. e lavados com PBS novamente. Feito isto, os cortes foram incubados com estreptavidina conjugada à peroxidase (DAKO) por 30 min., lavados em PBS e submetidos ao tratamento com DAB para revelação da reação. Os núcleos foram contracorados com Hematoxilina de Harris.
4.7. Citometria de fluxo – Guava Cell Cycle
Com o objetivo de avaliar a porcentagem de gonócitos em proliferação e em quiescência, os testículos dos animais de 19dpc, 1ddp, 3dpp e 5dpp foram coletados para realização de citometria de fluxo, através do método Guava® (GE), utilizando-se o reagente Guava Cell Cycle (GE). Para isso, os testículos dos animais nas idades acima citadas foram coletados e colocados em tubos de 1,5mL contendo BSA 1%. Após a coleta dos testículos de todos os animais, o BSA 1% foi descartado e 1mL de tripsina 5x (Sigma) e 1 L de Pluronic® (Sigma) foram adicionados aos tubos e, logo após, os tubos foram incubados a 37ºC por 5 min. Para os animais com idade a partir de 3dpp os testículos foram
20 descapsulados em câmara de fluxo laminar, ou seja, tiveram sua túnica albugínea removida. Após esse tempo, os testículos foram dispersos com auxílio de micropipeta e centrifugados por 1 min. a 3400 rpm. O líquido foi descartado, o pellet diluído em meio de cultura DMEM e a suspensão de células foi depositada em placas de 24 poços previamente cobertas com gelatina (Sigma). Cada testículo foi depositado em um poço individual. As placas foram mantidas em incubadora a 37oC por 1h e 30 min para adesão das células somáticas à gelatina. O sobrenadante contendo as células germinativas (gonócitos) foi coletado e fixado em álcool 70% mantidos a -20ºC até o momento da análise. Uma amostra de cada testículo de cada idade foi coletada em cada procedimento para que se avaliasse a pureza das amostras a serem analisadas.
4.7.1. Análise da pureza das amostras
Para avaliar a pureza das amostras analisadas no citômetro Guava, uma amostra de cada testículo em todas as idades foi colocada em câmara de Neubauer. Os gonócitos, que são muito maiores do que as células somáticas foram contados e definiu-se a pureza das amostras, que ficou em tono de 70%. A quantificação do número total de células também foi realizada para que se utilizasse amostra compatível com a quantidade de células que o citometro Guava é capaz de ler (1x105 a 2x105 partículas).
4.7.2. Citômetro Guava
Após a quantificação das células, as amostras foram incubadas com o reagente Guava Cell Cycle por 20 min. No escuro, de acordo com instruções do fabricante. O volume específico, de acordo com a concentração de células obtidas em cada idade, de cada amostra foi colocado no citômetro Guava e a os valores correspondentes à fase específica do ciclo celular (G0/G1, S ou G2/M) foram obtidos.
4.8. Evidenciação da lectina pelo DBA (Dolichos Biflorus Aglutinin):
Os animais de 8dpp, 11dpp e 15dpp foram submetidos à técnica de marcação da lectina pelo Dolichus biflorus Aglutinin (DBA). A DBA (Vector) foi usada com objetivo de evidenciar as espermatogônias indiferenciadas. A partir de cada testículo incluído em parafina, foram obtidos quatro cortes transversais com 6 m de espessura por animal. Os cortes foram depositados sobre lâminas silanizadas, desparafinados, hidratados e tiveram a peroxidase endógena inativada em peróxido de hidrogênio 3% por 10 min. Os cortes foram lavados em PBS (0,05M - pH 7,2) e então, tratados com BSA 1% por 10 minutos, após o que foram submetidos à incubação com DBA (1:500) por 2h a 4ºC. As lâminas foram
lavadas com PBS, incubadas com streptavidina conjugada à peroxidase por 30 min., lavadas em PBS e submetidas ao tratamento com DAB para revelação da reação.
