UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período : Agosto/2014 a Julho/2015
( ) PARCIAL (X) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: Engenharia biológica de microalgas e cianobactérias: da prospecção de linhagens à produção de bioenergia.
Nome do Orientador: Evonnildo Costa Gonçalves Titulação do Orientador: Doutor
Faculdade : Universidade Federal do Pará Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas Laboratório: Laboratório de Tecnologia Biomolecular
Título do Plano de Trabalho: Prospecção de aminoácidos tipo micosporinas de cianobactérias de água doce da Amazônia
Nome do Bolsista: Thiago Tavares Lopes Tipo de Bolsa:
(x) PIBIC/ CNPq ( ) PIBIC/CNPq – AF
( )PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador ( ) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/UFPA – AF ( ) PIBIC/ INTERIOR ( )PIBIC/PARD ( ) PIBIC/PADRC ( ) PIBIC/FAPESPA ( ) PIBIC/ PIAD ( ) PIBIC/PIBIT
2 1 INTRODUÇÃO
As cianobactérias possuem uma vasta distribuição ao longo do globo, colonizando ecossistemas de água doce, marinhos e terrestres, e nos quais possui uma grande importância ecológica no ciclo do carbono e como fixadoras de nitrogênio. Recentemente, as cianobactérias têm despertado interesse na área de bioenergia, sendo alvo de diversos projetos para a produção de biodiesel, bioetanol e biohidrogênio (ERDRICH et al., 2014; KÄMÄRÄINEN et al., 2012).
As cianobactérias apresentam vantagens sobre as atuais tecnologias e matérias-primas utilizadas, pois não competem com solos agriculturáveis e possuem grande capacidade para converter dióxido de carbono em lipídios ricos em carbono e etanol, por exemplo. O estado do Pará possui uma grande diversidade de cianobactérias em diferentes corpos d’água como o reservatório da hidrelétrica de Tucuruí, de uma lagoa salina localizada no município de Bragança ou dos reservatórios de abastecimento de Belém (BARAÚNA et al., 2013, DALL’AGNOL et al.,2012, GRAÇAS et al.,2011, PUREZA et al.,2013). Com base nos estudos do grupo de pesquisa do proponente, que identificou, em algumas linhagens cianobacterianas, os genes responsáveis pela produção de hidrogênio molecular (hidrogenases e nitrogenases), bem como codificantes de lipases com potencial aplicação no processo de transesterificação para produção de biodiesel.
Nesse sentido, a natureza dos projetos de bioenergia de microalgas e/ou cianobactérias requer uma abordagem multidisciplinar envolvendo engenheiros, biólogos e químicos, isto é, enquanto os engenheiros têm foco na projeção de aparatos para a otimização de cultivo, os biólogos e químicos focam na seleção de espécies e linhagens, na caracterização molecular das vias metabólicas de produção de biocombustíveis e na manipulação genética tanto destas vias como naquela de fixação e armazenamento de carbono (LIMA et al., 2014).
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As cianobactérias são microrganismos fotossintetizantes de morfologia unicelular ou filamentosa, que colonizam uma grande variedade de ambientes, como oceanos, corpos de água doce, rochas, desertos, placas de gelo, bem como apresentam relação simbiótica com plantas, liquens e protozoários (ABED et al. ,2009). Elas realizam fotossíntese na presença de luz e, em sua ausência, a fermentação. Devido à diversidade de hábitats onde se encontram, seu metabolismo adaptou-se de modo a produzir uma gama de substâncias com potencial biotecnológico.
Neste contexto, dentre outras aplicações as cianobactérias têm sido utilizadas na biorremediação de áreas degradadas por vazamento de petróleo, na produção de biocombustíveis e bioplásticos (ABED, 2009; RASTOGI & SINHA, 2009) e na produção de aminoácidos capazes de absorver a radiação ultravioleta, isto é os MAAs (SHINA, 2008). Os MAAs, encontrados em muitos microrganismos aquáticos e em alguns poucos terrestres, como fungos, algas eucarióticas e cianobactérias, são substâncias solúveis em água caracterizadas por um anel aminociclohexenimina ligado a um aminoácido, aminoálcool ou aminogrupo (BANDARANAYAKE, 1998). O anel geralmente tem uma subunidade de glicina no terceiro carbono.
Alguns MAAs também contêm ésteres de sulfato ou ligações glicosídicas através dos substituintes iminas. Diferenças nos espectros de absorção dos MAAs ocorrem devido às variações nos grupos laterais e nos substituintes do nitrogênio. Um número de MAAs tem seu máximo de absorção na região da radiação UV-B enquanto outros absorvem na UV-A. Sua forte absorção entre os comprimentos de onda 310 a 360 nm, seu alto coeficiente de extinção molar (€=28,100-50,000 M-1cm-1) (KLISCH, 2008) e fotoestabilidade em água doce ou salgada apoiam a ideia de que eles apresentam papel fotoprotetor, visto que estes compostos podem dissipar a radiação absorvida como calor sem produzir espécies reativas de oxigênio.
Enquanto os MAAs conferem proteção aos organismos que possuem a via do chiquimato. As cianobactérias produtoras de MAAs são abundantes em ambientes hipersalinos. Dois MAAs foram obtidos de uma linhagem de
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Euhalothece sp. que crescia, sob luminosidade intensa, em uma crosta de
gesso em uma lagoa hipersalina, um tendo máximo de 331 e outro de 362 nm. O primeiro, deles, identificado como micosporina-2-glicina, foi pela primeira vez descrito em cianobactérias, e o segundo foi identificado como Euhalothece-362, o que se fazia inferir que Euhalothece sp. utiliza micosporina-2-glicina e Euhalothece-362 para proteger sua maquinaria celular dos efeitos danosos da radiação.
Na cianobactéria Synechocystis sp. PCC 6803 também foram identificados três MAAs: o desidroxi-usujireno e o M-343, que são induzíveis por radiação UV-A, e M-tau, induzidos tanto pela radiação UV-A como pela UV-B (ZHANG, 2007). Os MAAs asterina-330, chinorina, palitinol e micosporina-glicina têm sido descrito como tendo um papel fotoprotetor em cianobactérias epilíticas (que crescem em rochas) de água doce (SOMMARUGA, 1999). Adicionalmente, chinorina e porphyra-334 já foram observadas em Microcystis aeruginosa, o que talvez explique sua habilidade de desenvolver e manter florações superficiais mesmo em grandes quantidades de radiação solar (LIU, 2004). Uma colônia de
Leptolygbya da antártica foi significantemente inibida sob UV-B suplementar
enquanto a inibição de Phormidium foi menos proeminente devido seu conteúdo 25 vezes maior de MAAs que em Leptolygbya.
A indução da síntese de MAAs dependente de UV-B em Anabaena sp., Nostoc
commune e Scytonema sp. resulta na síntese de chinorina somente. A
localização exata dos MAAs nas cianobactérias não é exatamente conhecida, porém, em Nostoc commune é extracelular e ligada a oligossacarídeos da bainha. Os MAAs são osmoticamente ativos. Isto se deve ao fato de que populações halotolerantes de cianobactérias acumulam altas concentrações de MAAs.
O câncer de pele têm se tornado um problema de saúde pública. Segundo a Organização mundial de saúde ocorrem anualmente, 2 a 3 milhões de casos de câncer de pele do tipo não-melanoma e 132,000 casos do tipo melanoma. Com a diminuição da camada de ozônio, a atmosfera perde sua proteção filtrante e uma maior quantidade de radiação UV alcança a superfície da terra. Estima-se
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que uma diminuição de 10% nos níveis de ozônio resultará em 300.000 casos adicionais de câncer de pele do tipo não-melanoma, e 4.500 casos do tipo melanoma. A incidência global do melanoma continua a aumentar. Entretanto, os principais fatores que predispõe ao desenvolvimento do melanoma parecem estar associados à exposição recreacional ao sol e a história de queimaduras solares (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2013).
Atualmente a melhor forma de minimizar esses efeitos da radiação ultra-violeta, consiste no uso de produtos cosméticos contendo filtros solares, em especial os de origem natural como é o caso do Helioguard®, que contem um extrato da alga eucariótica vermelha Porphyra sp. que é rico em MAAs. Assim, dada sua condições climáticas as cianobactérias da região amazônica apresentam grande potencial para a produção de MAAs que possam vir a ser utilizados na formulação de novos produtos com atividade fotoprotetora.
3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral
Prospectar aminoácidos tipo micosporinas em extratos de cianobactérias da região amazônica.
3.2 Objetivos Específicos
- Otimizar um protocolo de obtenção de extratos de cianobactérias;
- Otimizar método LC/MS para análise das MAAs nos extratos das cianobactérias;
- Identificar MAAs produzidos por linhagens cianobacterianas da região amazônica.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
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As amostras utilizadas constaram das linhagens CACIAM 14, CACIAM 53, CACIAM 54 e CACIAM 57 da Coleção Amazônica de Cianobactérias e Microalgas (CACIAM) do Laboratório de Tecnologia Biomolecular/UFPA, isoladas de água doce. As linhagens foram cultivadas em meio BG-11 (ALLEN, 1968) em estufa de fotoperíodo com a programação de 13 horas claro e 11 horas escuro, com uma temperatura de 28ºC, durante 49 dias.
4.2 Obtenções de Extratos
As culturas dedicadas à análise de metabólitos foram centrifugadas em condições estéreis numa rotação de 5500 rpm por 45 minutos a 20°C. Após desprezo do sobrenadante, à biomassa precipitada foi, então, adicionado 5 mL de metanol. Esta mistura foi sonicada com uso do sonicador Unique DES500 por 60 segundos e armazenada a 4°C por 12 h. Em seguida, após centrifugação durante 5 minutos e 5500 rpm a 20°C o sobrenadante foi retirado e monitorado espectrofotometricamente entre 310 e 360 nm, com uso do espectrofotômetro Biospectro SP-220. À biomassa foi adicionado um novo volume de 5 ml de metanol (grau HPLC), seguida de mistura em vórtex por 1 min. Após nova centrifugação por 5 minutos e 5500 rpm a 20°C, o sobrenadante foi novamente monitorado como descrito acima. Estas extrações com metanol foram repetidas até a não absorção espectrofotométrica. Os volumes de sobrenadante coletados foram misturados até um total de 50 mL de extrato bruto. Esse extrato bruto (50 mL) foi particionado líquido-líquido de acordo com a seguinte proporção: 50 mL de extrato bruto, 20 mL de metanol, 60 ml de clorofórmio, e 30 mL de água ultrapura. Com auxílio de um funil de decantação, a fase superior foi transferida para um novo frasco Erlemeyer. À fase inferior (do funil de decantação) foram adicionados mais 60 mL de clorofórmio, 40 mL de metanol e 10 mL de água. Essa mistura foi mais uma vez particionada, com recolhimento da fase superior, que foi adicionada àquela coletada anteriormente. As amostras obtidas foram secas em speedvac a 30°C e redissolvidas em 1 mL de ácido acético 0,02%. 4.3 Análises de MAAs por Espectrometria de massas
Uma análise preliminar foi feita por infusão direta num espectrômetro de massas AB Sciex QTRAP 5500 com analisador triplo quadrupolo, de baixa resolução.
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Tal espectro MS1(figura 1) foi obtido e apresenta uma faixa de varredura de relação m/z 300 a 600. A fonte de ionização utilizada foi a de electrospray. Na configuração das condições de fonte, foram testadas utilizadas voltagem de cone no valor de 35 e 40 eV, e a voltagem do spray de 3500 e 4000 V.
4.4 Análises de MAAs por Cromatografia líquida de Alta Eficiência.
Cem microlitros da amostra obtida foram diluídos para 1 mL de ácido acético 0,02% em Metanol. As amostras foram analisadas com auxilio de um HPLC Agilent 1200 series com bomba capilar binária, injetor automático e coluna em temperatura ambiente (17°C). A programação da fase móvel constou de um sistema isocrático com tempo de corrida de 20 minutos, sendo o solvente A solução de ácido acético na concentração de 0,02% e o solvente B, metanol. Utilizou-se uma coluna Zorbax 300SB-C8 150 x 0,3 com tamanho de partícula de 3,5 micrômetros. O fluxo utilizado foi de 10 μL/min.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Extrações de MAAs
Em sua maioria os métodos descritos na literatura mostram extrações de cianobactérias com metanol. Foram descritos extrações com metanol 20% em água (FERRONI et al., 2010; KEDAR; KASHMAN; OREN, 2002) e metanol 100% (BALSKUS; WALSH, 2010; SINGH et al., 2008b, 2010; SINHA et al., 2003) e em diferentes temperaturas (SINGH et al., 2008b, 2010; SINHA et al., 2003, KEDAR; KASHMAN; OREN, 2002, BALSKUS; WALSH, 2010; FERRONI et al., 2010). Os trabalhos de extração também envolvem extração líquido-líquido (SINGH et al., 2008b, 2010), filtração em MWCO (KEDAR; KASHMAN; OREN, 2002) e Centrifugação (SINHA et al., 2003).
O método de preparo de amostra, para análises em HPLC capilar, neste trabalho foi baseado em Cardozo (2006) e Whitehead (2002) com pequenas alterações que se mostraram eficientes para mais um possível método de obtenção de extratos de cianobactérias.
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Os valores de voltagem do Ionspray e da voltagem de cone para os experimentos de MS1 que resultou em melhor intensidade de ionização foi voltagem de cone de 40 eV, e a voltagem de Ionspray é de 4000V. A faixa de varredura de relação m/z 300 a 600 foi escolhida numa tentativa de encontrar MAAs sem a necessidade de fragmentação dos mesmos. Neste experimento de MS1 não foram observados íons de relação massa/carga sugestiva de MAAs (Tabela 01). Contudo, a presença de íons mais concentrados pode mascarar a de íons menos concentrados.
Tabela 01: Relações massa/carga a serem monitoradas
MAA Peso molecular [MH+]
Micosporina-glicina 246 Palitina 245 Palitinol 303 Asterina-330 289 Chinorina 333 Porphyra-334 347 Paliteno 286 Ácido Palitênico 329
Figura 01: Espectro de massas modo full scan (MS1) dos metabólitos da linhagem CACIAM 14(Cyanobium sp.)
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Para o experimento de MS2 os valores da voltagem do ionspray foram de 4000 V, alta pressão de colisão, voltagem de cone de 60 eV e energia de colisão de 20 eV. As aquisições dependentes de informação selecionaram cinco dos íons mais abundantes que excederam a intensidade de 10000. Os valores de massa analisadas foram os valores protonados de palitina, micosporina-glicina, paliteno, asterina-330, palitinol, chinorina, ácido palitênico e porphyra-334, conforme a tabela 01.
O espectrograma de MS2 (Figura 02) foi obtido e foi possível observar um padrão de fragmentação que indica a presença do MAA Chinorina que possui a relação m/z de 333(Ver Tabela 01). Outros indícios que apontam a presença da Chinorina são os íons de fragmentos entre ele, o fragmento de m/z 186(Tabela 02), o qual de acordo com Whitehead & HEDGES (2002) é diagnóstico da presença de MAAs. Além de fragmentos de m/z 255, 241, 230 e 211(Tabela 02), também reportados por Whitehead & Hedges (2002), que reforçam a presença de chinorina.
Figura 02: Espectro de fragmentação (MS2) dos íons m/z 333 observados no experimento de infusão direta dos metabólitos da linhagem cianobacteriana CACIAM 14 (Cyanobium sp.).
Tabela 02: Dados espectrais de massa em Whitehead (2002).
MAA Peso molecular Fragmentos Referências Micosporina-glicina 245 [MH+] 246, 228, 210, 200, 182, 168, 146 Palitina 244 [MH+] 245, 230, 209, 199, 186, 184, 162, 155, 150, 137 (WHITEHEAD; HEDGES,
10 Palitinol 302 [MH+] 303, 288, 243, 231, 199, 197, 186, 168, 150, 137. 2002) Asterina-330 288 [MH+] 289, 273, 243, 230, 213, 199, 197, 186, 168, 150, 137 Chinorina 332 [MH+] 333, 255, 241, 230, 211, 197, 186, 185, 168, 137 Porphyra-334 346 [MH+] 347, 303, 243, 231, 199, 197, 186, 168, 151, 137 Paliteno 284 [MH+] 285, 241, 223, 205, 197, 195, 193, 179, 166, 149, 137 Ácido Palitênico 328 [MH+] 329, 314, 296, 283, 268, 251, 241, 237, 225, 197, 193, 182, 175, 150, 138 5.2.1 Análise cromatográfica
O cromatograma (Figura 03) mostra o resultado da análise preliminar cromatográfica do extrato obtido para a linhagem CACIAM 14, sendo este um cromatograma de íons totais. A identificação de MAAs por cromatografia concentrou-se primeiramente em íons precursores com relação m/z 333 (Chinorina), resultantes do experimento de MS1. Contudo, pela falta de um padrão de identificação de injeção capilar de MAAs não foi possível identificar a presença da chinorina.
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Em relação aos íons precursores do experimento MS2 revela a presença de isóbaros que pode ser confirmada pela detecção de vários íons de m/z 333 em diferentes tempos de retenção (Figura 04) na análise cromatográfica. No presente estudo, estes íons fragmentos (m/z= 186 e 197) apareceram no mesmo tempo de retenção de m/z 333 (Figura 05), sugerindo a produção de chinorina, cuja m/z = 333, pela linhagem CACIAM 14 (Cyanobium sp.).
Figura 04: Seleção de íons precursores de m/z 333. CACIAM (Cyanobium sp.).
Na figura 05 têm-se o extrato de fragmentos oriundos dos íons de m/z 333, no tempo de retenção 9 minutos, é possível observar os fragmentos 186 e 197, que tanto Whitehead & Hedges (2002) quanto Cardozo (2006) sugerem como diagnóstico para a presença de MAAs.
Figura 05: Seleção de íons filho (mz/ 186 em azul e 197 em vermelho) dos íons precursores de m/z 333. CACIAM14(Cyanobium sp.).
6 PUBLICAÇÕES
Até o fim da execução deste projeto não foi gerada nenhuma publicação relativa a esses resultados.
12 7 CONCLUSÃO
O meio de cultivo BG-11 para cianobactérias foi baseado em Allen (1968), e mostrou-se eficiente tanto para o crescimento das linhagens como para a produção de biomassa. O método de extração também se mostrou eficiente, porém há necessidade de realizar otimizações na extração para minimizar a quantidade de contaminantes interferentes nas amostras. A cromatografia capilar é uma técnica que pode ser utilizada para análise de MAAs especialmente acoplada a espectrometria de massas com fonte de ionização de Electrospray, devido sua alta sensibilidade, e também por necessitar de pouquíssima quantidade de amostra.
Os dados até então obtidos nos levam a creditar que a cianobactéria CACIAM 14 (Cyanobium sp.) é um potencial alvo para a produção de MAAs. Devido ter sido isolada do ambiente regional, possui adaptação para as condições locais o que facilitaria sua utilização em aplicações biotecnológicas que gerem produtos de alto valor agregado e ao mesmo tempo valorizem a biodiversidade amazônica de maneira sustentável.
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15 DIFICULDADES: Houveram problemas técnicos relacionados ao LC/MS que
atrasaram as análises dos espectros preliminares dos MAAs, porém os mesmos foram resolvidos permitindo identificação preliminar de alguns dos componentes.
PARECER DO ORIENTADOR: O Thiago realizou suas atividades com
interesse e responsabilidade e considero seu desempenho excelente.
DATA : 10/08/2015
_________________________________________ ASSINATURA DO ORIENTADOR
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